PAULO ROBERTO CAVALCANTI CARVALHO€¦ · Carvalho, Paulo Roberto Cavalcanti Estudo da atividade...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ESTUDO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DOS GLICOSÍDEOS ISOLADOS

DA Herissantia crispa L. (Brizicky) e Sidastrum paniculatum L. (Fryxell)

Malvaceae.

PAULO ROBERTO CAVALCANTI CARVALHO

RECIFE

2009

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ESTUDO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DOS GLICOSÍDEOS ISOLADOS

DA Herissantia crispa L. (Brizicky) e Sidastrum paniculatum L. (Fryxell)

Malvaceae.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas, na área de Fisiologia, Farmacologia e Química Medicinal.

Orientadora: Profa Dra Silene Carneiro do Nascimento Co-orientadora: Profa Dra Teresinha Gonçalves da Silva

RECIFE 2009

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Carvalho, Paulo Roberto Cavalcanti Estudo da atividade farmacológica dos glicosídeos isolados

da Herissantia crispa L. (Brizicky) e Sidastrum paniculatum

(Fryxell) Malvaceae / Paulo Roberto Cavalcanti Carvalho .

Recife : O Autor, 2009.

95 folhas : il., fig., tab., quadros

Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB.

Ciências Biológicas, 2009.

Inclui bibliografia 1. Ciências biológicas - Farmacologia. 2. Fisiologia –

Química biológica. 3. Glicosídeos isolados – Atividade farmacológica I. Título.

615.012 CDU (2.ed.) UFPE 615.9 CDD (22.ed.) BC - 2009 - 018

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais Djalma Carvalho e Cecília Maria Cavalcanti Carvalho pelo apoio e forças que sempre estiveram me dando para superar meus limites e vencer mais uma etapa de minha vida profissional.

A minha esposa Marizélia Maciel Carvalho e

minhas filhas Anna Letícia Maciel Carvalho e Larissa Lavínia Maciel Carvalho pelos momentos perdidos de convívio durante a construção desta tese.

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“A vida não é um corredor reto e tranqüilo que nós percorremos livres e sem empecilhos, mas um labirinto de passagens, pelas quais nós devemos procurar nosso caminho, perdidos e confusos, de vez em quando presos em um beco sem saída. Porém, se tivermos fé, uma porta sempre será aberta para nós, não talvez aquela sobre a qual nós mesmos nunca pensamos, mas aquela que definitivamente se revelará boa para nós.” (A.J.Cronin)

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AGRADECIMENTOS

A Deus pela força física e espiritual que estava ao meu lado durante esta

etapa da minha vida.

A Profa Dra Silene Carneiro do Nascimento pela orientação desse trabalho,

pelos conhecimentos transmitidos e pela enorme influência na minha vida

científica e acadêmica.

A Profa Dra Teresinha Gonçalves da Silva, minha enorme gratidão pela

preciosa orientação e confiança em meu trabalho.

A Profa Dra Maria de Fátima Vanderlei Souza do Laboratório de Tecnologia

Farmacêutica da Universidade Federal da Paraíba pelo fornecimento dos

produtos que foram estudados nesta tese.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação de Ciências Biológicas,

pela paciência e dedicação nas disciplinas.

A Profa Dra Maria Teresa Jansen de Almeida Catanho pela colaboração

prestada para a realização dos testes de atividade biológica.

A Profa Dra Paloma Lyz Medeiros pelo apoio e colaboração na

interpretação dos exames histopatológicos.

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A Maria Susete Mendonça, Maria D. Rodrigues e Maria Suely R. Cavalcanti

pelo apoio, contribuição e amizade.

Ao professor Jorge Rocha de Carvalho e professores do Departamento de

Educação Física da UFPE pelo apoio, ajuda e atenção dedicada.

Aos amigos Jaciana Aguiar, Tiago Lins e Lins e Lina pelas valiosas ajudas

e ensinamentos neste trabalho.

Aos amigos e colegas de turma do Doutorado. Aos colegas do Laboratório de Bioensaios para Pesquisa de Fármacos do

Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco.

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SUMÁRIO

1- Introdução 11 2- Objetivos 14 2.1- Geral 14 2.2- Específicos 14 3- Revisão de Literatura 17 3.1- Câncer 17 3.2- Inflamação 21 3.3- Dor 27 3.4- Plantas medicinais como fonte de novos fármacos 30 3.5- Família Malvácea: Características da Família Malvácea 35 3.6- Aspectos quimiotaxonômicos, etnobotânicos e etnofarmacológicos da família Malvácea 39 3.7- Considerações botânicas sobre o gênero Herissantia 44 3.8- Herissantia crispa L. (Brizicky) 45 3.9- Sidastrum paniculatum L. (Fryxell) 46 4- Referências 54 5- Artigo 1 69 6- Artigo 2 79 7- Conclusão 96

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LISTA DE FIGURAS

1- Figura 1. Distribuição de espécies de Malvácea no Mundo 36

2- Figura 2. Caracteres morfológicos mais evidentes em espécies de Malváceas 38 3- Figura 3. Herissantia crispa L. (Brizicky) 45 4- Artigo 1: Figura 1– Efeitos drogas sobre tumores Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich 73 6- Artigo 1: Figura 2 - Fotomicrografias de órgãos (fígado e rins) e tumor (Sarcoma 180) de camundongos sob ação do tilirosídeo 74

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LISTA DE TABELAS

1- Artigo 1: Tabela 1. Atividade citotoxica de substâncias isoladas da Herissantia crispa frente às células KB, NCI-H292 e HEp-2 72 2- Artigo 2: Tabela 2. Atividade citotóxica de substâncias isoladas de Sidatrum paniculatum frente às linhagens KB, NCI-H292 e HEp2 90 3- Artigo 2: Tabela 3 – Atividade Antiinflamatória

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RESUMO A busca por novas terapias para a cura do câncer, tratamentos do processo inflamatório e da dor, são ainda objetos de intensas investigações. Acredita-se que os produtos naturais em geral são importantes fontes de substâncias químicas biologicamente ativas com potencial e aplicabilidade terapêutica, sendo estas uma fonte de diversidade em termos de estrutura, propriedades físico-químicas e atividades biológicas. Sendo assim o presente trabalho teve como objetivo realizar o estudo citotóxico e farmacológico (atividade antitumoral, antiinflamatória e analgésica) de glicosídeos isolados das espécies Herissantia crispa L. Brizicky e Sidastrum paniculatum L. Fryxell (Malvaceae). As plantas foram coletadas na Pedra da boca, no município de Araruma – PB, e destas foram isoladas quatro substâncias identificadas como 3,7-di-O-α-L-raminosideo (diraminosídeo), 3-O-β-D-(6”-E-P-cumaroil)glicosídeo (tilirosídeo) e as misturas glicosilada e não glicosilada do β-sitosterol e estigmasterol. Os produtos foram testados quanto a atividade antitumoral sobre linhagens células neoplásicas (in vitro) e tumores murinos (in vivo). Para o estudo in vitro, fora utilizados células das linhagens NCI-H292 (carcinoma de pulmão humano), HEp-2 (carcinoma epidermóide de laringe humana) e KB (carcinoma epidermóide de boca), através do método do MTT. Na avaliação da citotoxicidade o diraminosídeo e o tilirosídeo não apresentaram resultados significativos em relação ao controle. Nos experimentos in vivo, os produtos foram testados em animais portadores do Sarcoma 180, onde o tilirosídeo, as misturas glicosilada e não glicosilada apresentaram resultado bastante promissores. O tilirosídeo foi testado frente ao e Carcinoma de Ehrlich e também inibiu significativamente o crescimento tumoral.O diraminosídeo não inibiu o crescimento tumoral. Na avaliação histopatólogica dos tumores e órgãos do grupo controle e grupos tratados, observou-se que os animais tratados com o tilirosídeo apresentaram leves alterações renais. No teste de air pouch induzido por carragenina e contorções abdominais induzidas por ácido acético o tilirosídeo, diraminosídeo e a mistura de esteróides glicosilados apresentaram atividade antiinflamatória e analgésica promissoras. Os resultados obtidos demonstraram que os produtos testados apresentam atividades antitumoral, antiinflamatória e antinociceptiva, justificando a continuidade de estudos aprofundados para investigação do mecanismo de ação. Palavras-Chave: Atividade Biológica; Produto Natural; Glicosídeos isolados.

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ABSTRACT The search for new therapies to cure the cancer, treatment of the inflammatory process and pain, are still objects of intensive investigations. It is believed that the natural products in general are important sources of biologically active chemicals with therapeutic potential and applicability, which are a source of diversity in structure, physicochemical properties and biological activities. Therefore this study aimed to carry out the study and cytotoxic drug (antitumor activity, anti-inflammatory and analgesic) of glycosides isolated from species Herissantia crispa L. Brizicky and Sidastrum paniculatum L. Fryxell (Malvaceae). Plants were collected at the mouth of the Pedra, municipality of Araruma - CP, and these were isolated four substances identified as 3,7-di-O-α-L-raminosideo (diraminosídeo), 3-O-β-D-( 6 "-EP-cumaroil) glycoside (tilirosídeo) and mixtures of glycosylated and non -sitosterol and stigmasterol. The products were tested forβglycosylated antitumor activity on tumor cells (in vitro) and murine tumors (in vivo). To study in vitro, was used for cell lines NCI-H292 (human lung carcinoma), HEp-2 (squamous cell carcinoma of human larynx) and KB (carcinoma of the pharynx) by the method of MTT. In the evaluation of the cytotoxicity diraminosídeo and tilirosídeo showed no significant results and the control. In experiments in vivo, the products were tested in animals bearing the sarcoma 180, where the tilirosídeo, mixtures glycosylated and non glycosylated showed very promising results. The diraminosídeo did not inhibit tumor growth. The tilirosídeo and was tested against the Ehrlich carcinoma and also significantly inhibited tumor growth. In the histopathological evaluation of tumors and organs of the control group and treated groups, it was observed that animals treated with tilirosídeo had mild renal changes. The testing of air pouch induced by carrageenan and contorções abdominal induced by acetic acid to tilirosídeo, diraminosídeo mixture of steroidal glycosides and showed promising analgesic and antiinflammatory activity. The results showed that the products tested have antitumor activity, anti-inflammatory and antinociceptive, justifying the continuation of studies to investigate the mechanism of action. Words-Key: Biological activities; Natural Products; Glycosides isolated.

Carvalho, P. R. C.

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10Estudo da atividade farmacológica dos...

INTRODUÇÃO

Estudo da atividade farmacológica dos... 11

1- INTRODUÇÃO

As plantas medicinais são utilizadas pela humanidade desde tempos

imemoriais. A busca por alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas e folha

talvez tenha sido uma das formas mais importantes de utilização dos produtos

naturais na vida do homem, e estas sempre exerceram um verdadeiro fascínio ao

longo de toda a história da humanidade em muitas pessoas sensíveis à influência

da natureza. A história do desenvolvimento das civilizações Oriental e Ocidental é

rica em exemplos da utilização de recursos naturais na medicina, no controle de

pragas e nos mecanismos de defesa, merecendo destaque à civilização Egípcia,

Greco-romana e Chinesa (CECHINEL-FILHO; YUNES, 2001; VIEGAS et al,

2006).

Entre as primeiras civilizações como os sumérios e os povos babilônicos,

as plantas como a canela e o coentro já eram utilizadas para fins medicinais na

forma de infuso, vinho e emplastro. Desde as civilizações mais antigas as

pessoas confiam nas plantas como arsenal profilático ou terapêutico na

recuperação e manutenção da saúde (ANDRADE et al., 2007).

Hoje se tem certeza que os produtos naturais em geral são importantes

fontes de novas substâncias químicas biologicamente ativas com potencial e

aplicabilidade terapêutica, sendo estas uma fonte de diversidade em termos de

estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas (VEIGA-JÚNIOR;

PINTO,2005; ANDRADE et al., 2007).

O emprego de plantas medicinais hoje em dia ainda é uma das fontes mais

interessantes e exploradas para o desenvolvimento de novas drogas

quimioterápicas, antiinflamatórias e analgésicas (RATES, 2001), onde estas

Carvalho, P. R. C.

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podem representar uma alternativa menos tóxica aos medicamentos comerciais.

Além disso, sua utilização tem papel vital para sanar as necessidades básicas de

saúde nos países em desenvolvimento. Isto gera grande interesse na realização

de screening dessas plantas, para avaliar seu potencial medicinal, comparando os

resultados de estudos científicos com os propagados pela medicina popular

(AWAD et al., 2001).

O presente trabalho tem por objetivo contribuir para a pesquisa científica no

que se refere à investigação farmacológica de produtos isolados da Herissantia

crispa L. (Brizicky) e Sidastrum paniculatum L. (Fryxell) Malvaceae, em modelos in

vitro e in vivo, na perspectiva de encontrar novos agentes terapêuticos.

Carvalho, P. R. C.

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OBJETIVOS

Carvalho, P. R. C.

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2. OBJETIVOS:

2.1. GERAL

• Realizar o estudo citotóxico, farmacológico (atividades antitumoral,

antiinflamatória e analgésica) de glicosídeos isolados da espécie

Herissantia crispa L. (Brizicky) e Sidastrum paniculatum L. (Fryxell)

Malvaceae.

2.2. ESPECÍFICOS

• Avaliar a atividade citotóxica dos glicosídeos isolados da Herissantia crispa

L. Brizicky e Sidastrum paniculatum L. Fryxell (Malvaceae) em linhagens

celulares NCI-H292 (carcinoma de pulmão), HEp-2 (carcinoma de laringe) e

KB (carcinoma epidermóide de boca);

• Avaliar a atividade antitumoral dos glicosídeos tilirosídeo, diraminosídeo,

da mistura β-sistosterol+estigmasterol glicosilados e não glicosilado em

tumor sólido Sarcoma 180 e Carcinoma de Ehrlich;

• Avaliar a atividade antiinflamatória dos glicosídeos isolados das espécies

de Malvaceae através dos testes de Air pouch induzido por carragenina;

• Avaliar o efeito analgésico dos glicosídeos das espécies de malvaceae

através do teste de contorção abdominal;

Carvalho, P. R. C.

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• Avaliar a histopatologia de tumores e órgãos de animais tratados com os

glicosídeos isolados das espécies da família Malvaceae.

Carvalho, P. R. C.

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REVISÃO DA LITERATURA

Carvalho, P. R. C.

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3- REVISÃO DA LITERATURA

3.1. CÂNCER

Durante a vida de um animal as divisões celulares são rigorosamente

controladas, de modo a garantir o bom funcionamento do organismo. Ao longo do

desenvolvimento embrionário e das fases jovens da vida, as divisões celulares

devem sobrepujar a morte das células, para que os diversos órgãos se formem e

cresçam até atingir seu tamanho definitivo. Na fase adulta, o ritmo das divisões

celulares diminui, passando a ocorrer apenas quando há necessidade de repor as

células que morrem naturalmente ou em conseqüência de acidentes. Entretanto,

observa-se que podem ocorrer alterações que danificam o sistema de controle da

divisão celular, levando a célula a crescer e se multiplicar sem necessidade. Caso

essa tendência de multiplicação incontrolada seja transmitida às células-filhas,

surgirá um clone de células com propensão a se expandir indefinidamente dando

origem a um tumor maligno (SNUSTAD; SIMMONS, 2008).

Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de100 doenças que têm em

comum o crescimento desordenado (maligno) de células que invadem os tecidos

e órgãos, podendo espalhar-se (metástase) para outras regiões do corpo.

Dividindo-se rapidamente, estas células tendem a ser muito agressivas e

incontroláveis, determinando a formação de tumores (acúmulo de células

cancerosas) ou neoplasias malignas. Tumores malignos podem disseminar-se

para outros locais no corpo, formando tumores secundários, sendo denominado

metástase (estado alterado). Por outro lado quando estas células não invadem os

tecidos vizinhos o tumor é benigno, significa simplesmente uma massa localizada

de células que se multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu tecido

Carvalho, P. R. C.

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original. Hoje o termo tumor é utilizado quase exclusivamente para massas

neoplásicas (KUMAR; COTRAN, 2000; BRASILEIRO FILHO, 2004)

As neoplasias são originadas de apenas uma ou de algumas células

normais que sofrem transformações. O processo de crescimento anormal dos

tumores é o reflexo de complexas anormalidades fisiológicas resultantes da

expressão de genes virais mutantes e/ou de expressão desregulada de genes

normais (COUSSENS; WERB, 2002)

O câncer é uma doença de natureza crônica que possui repercussão de

ordem econômica e social de grande monta. Poucas doenças demonstram ser

tão dependentes de uma etiologia multifatorial como o câncer. No seu diagnóstico

e tratamento são exigidos uma equipe multiprofissional altamente especializada,

de formação e manutenção onerosa, e o emprego de uma tecnologia sofisticada e

dispendiosa para a sua cura (BRASIL, 2003)

A maioria dos casos de câncer (80%) está relacionada à influência do meio

ambiente, no qual encontramos um grande número de fatores de risco. Entende-

se por ambiente o meio em geral (água, terra e ar), o ambiente ocupacional

(indústrias químicas e afins), o ambiente de consumo (alimentos, medicamentos),

o ambiente social e cultural (estilo e hábitos de vida). As mudanças provocadas

no meio ambiente pelo próprio homem, os "hábitos" e o "estilo de vida" adotados

pelas pessoas, podem determinar diferentes tipos de câncer. São raros os casos

de cânceres que se devem exclusivamente a fatores hereditários, familiares e

étnicos, apesar de o fator genético exercer um importante papel na oncogênese.

Um exemplo são os indivíduos portadores de retinoblastoma que, em 10% dos

casos, apresentam história familiar deste tumor. Alguns tipos de câncer de mama,

estômago e intestino parecem ter um forte componente familiar, embora não se

Carvalho, P. R. C.

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possa afastar a hipótese de exposição dos membros da família a uma causa

comum. Determinados grupos étnicos parecem estar protegidos de certos tipos

de câncer: a leucemia linfocítica é rara em orientais, e o sarcoma de Ewing é

muito raro em negros (INCA, 2007).

O câncer ainda é um grande problema de saúde pública em paises

desenvolvidos e em desenvolvimento, sendo responsável por mais de seis

milhões de óbitos a cada ano, representando cerca de 12% de todas as causas

de morte no mundo. Embora as maiores taxas de incidência de câncer sejam

encontradas em países desenvolvidos, dos dez milhões de casos novos anuais

de câncer, cinco milhões e meio são diagnosticados nos países em

desenvolvimento (INCA, 2003).

Pode parecer paradoxal, mas uma das causas de grande incidência do

câncer é o aumento da expectativa de vida do homem, que ao longo de sua

existência, as células humanas são expostas a agentes mutagênicos e sofrem

erros de duplicação, resultando em alterações sutis e progressivas na seqüência

de DNA. Quanto maior o número de divisões da célula, maiores as chances de

ocorrência de alterações no seu DNA. Eventualmente, uma dessas mutações no

DNA (mutações somáticas) pode alterar a função de um gene crítico, fornecendo

uma vantagem no crescimento e na multiplicação da célula na qual ocorreu a

mutação, levando a uma expansão do clone derivado dessa célula. Essa

multiplicação aumentada pode acelerar a taxa de mutações que ocorrem em

diversas regiões do genoma, levando, em última instância, ao surgimento de

clones celulares capazes de invadir, proliferar e colonizar diversas regiões do

corpo formando metásteses (HAHN; WEINBERG, 2002).

Carvalho, P. R. C.

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Quatro funções tendem a ser desreguladas em uma neoplasia: primeiro, os

controles normais de proliferação celular são ineficazes; segundo, o programa de

diferenciação pode estar comprometido, ou seja, as células tumorais podem estar

bloqueadas em um determinado estágio de diferenciação ou podem estar

diferenciadas em um tipo celular inapropriado ou anormal; terceiro, a organização

cromossômica e genética pode estar desestabilizada tal o número de variantes

celulares que surgem com freqüência elevada (algumas variantes podem

aumentar a mobilidade ou a produção de enzimas que permitem a invasão e a

metástase); e o quarto, o programa de morte celular (apoptose) pode estar

desregulado (PONDER, 2001).

As células alteradas passam então a se comportarem de forma anormal,

com constante multiplicação celular exigindo uma alta carga metabólica para se

manterem. Seguindo este acúmulo numeroso de células, estas sofrem mudanças

e disseminam para os tecidos vizinhos, caracterizando um processo metastático

(DE ALMEIDA et al., 2005).

Acredita-se que as causas do câncer seriam uma mistura de componentes

ambientais e alterações genéticas. Os incríveis avanços na biologia molecular e

genética esclarecem os elementos básicos do câncer. A compreensão sobre

esses eventos será de suma importância no controle do câncer e que devem

levar a terapias melhores, e possivelmente à prevenção ou cura da doença

(PAWELEC, 2004).

Existem hoje quatro tratamentos classicamente adotados contra o câncer

que são a quimioterapia, a radioterapia, a terapia genética (realizada através de

genes supressores de tumor, onde estes são inseridos num vírus que os carrega

para dentro dos núcleos das células cancerosas, onde irão produzir proteínas que

Carvalho, P. R. C.

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regulam a proliferação) e a cirurgia (remoção do tecido e seus arredores) que

apresentam inúmeras desvantagens, como a desfiguração do paciente, com

prejuízos à sua auto-estima, inúmeros efeitos colaterais (quimioterapia e

radioterapia), além de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz. Em virtude

disso, tratamentos alternativos estão sendo constantemente propostos na área de

oncologia, dentre os quais se inclui a terapia com o uso de imunoduladores, com

o objetivo de fortalecer o sistema de defesa natural do organismo, livrando o

hospedeiro do câncer (WASSER, 2002; SNUSTAD; SIMMONS, 2008).

Nas ultimas décadas têm-se observado relevantes mudanças na relação

médico e paciente, visto que este solicita ao seu médico que sejam prescritos

tratamentos alternativos para a cura do seu mal. Por outro lado, se o paciente não

for atendido em sua solicitação, ele próprio ou com ajuda de familiares, amigos ou

vizinhos, buscam outras terapêuticas, como é o caso da fitoterapia. Estima-se que

mais de 60% de todos os pacientes usam métodos alternativos de tratamento no

curso de sua doença (INCA, 2006).

3.2. INFLAMAÇÃO

Segundo Natathan, 2002 e Hardman et al., 2003, a inflamação é uma

resposta normal do organismo a lesões teciduais, sendo este um processo

complexo e formado por uma rede intrincada de diferentes mediadores que, uma

vez desencadeada pelo agente agressor (que podem ser infecciosos, alérgicos,

traumáticos ou auto-imune) a resposta inflamatória será sempre repetitiva e

composta por cinco etapas principais como ativação enzimática, liberação de

mediadores, extravasamento de fluido com formação de edema, migração celular

e lesões teciduais, seguidas de reparação tecidual.

Carvalho, P. R. C.

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A exacerbação da inflamação é fundamentalmente uma resposta protetora

cujo objetivo final é livrar o organismo da causa inicial da lesão celular e das

conseqüências dessa lesão (COLLINS, 2000). Consistindo na primeira linha de

defesa do organismo, localizar a região afetada, eliminar o agente agressor e

remover os tecidos lesionados, preparando a região acometida para a reparação.

Sem a inflamação, as infecções se desenvolveriam descontroladamente, as

feridas nunca cicatrizariam e o processo destrutivo nos órgãos atacados seria

permanente. Entretanto, em algumas situações e doenças, a resposta inflamatória

torna-se exagerada, persistindo sem qualquer benefício aparente (SILVA;

CARVALHO, 2004; SIQUEIRA; DANTAS, 2000).

Este mecanismo já é bem esclarecido, pois as alergias e doenças nos

quais os indivíduos desenvolvem respostas imunológicas desreguladas contra

antígenos ambientais encontrados freqüentemente, e as doenças auto-imunes,

nas quais as respostas imunológicas se desenvolvem contra auto-antígenos

normalmente tolerados, são desordens nas quais a inflamação é causa

fundamental da lesão tecidual. Estudos demonstram o papel importante

desempenhado pela inflamação em uma variedade de doenças humanas que não

são doenças primariamente do sistema imunológico. Elas incluem câncer,

aterosclerose, doença cardíaca isquêmica e algumas doenças

neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer. Além disso, a inflamação

prolongada e a fibrose que a acompanha são responsáveis pela maior parte das

alterações patológicas vistas em muitas doenças infecciosas crônicas,

metabólicas e outras. Já que essas são as principais desordens que afligem a

humanidade, não é de surpreender que a resposta inflamatória, normalmente

Carvalho, P. R. C.

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protetora, seja chamada de “assassino silencioso” (KUMAR, ABBAS; FAUSTO,

2005).

A inflamação inclui atividades conjuntas e freqüentemente opostas de

vários tipos de células e dezenas de mediadores protéicos e lipídicos (KUMAR,

ABBAS; FAUSTO, 2005). O processo inflamatório apresenta, inicialmente,

mudanças no fluxo sanguíneo local e acumulação de várias células inflamatórias

(neutrófilos, células dendríticas, monócitos, mastócitos e linfócitos), sendo

denominada inflamação aguda ou reação inflamatória aguda. Seus sinais já foram

descritos há aproximadamente 2000 anos, como rubor (vermelhidão), dor, calor

(hipertermia) e tumor (edema). O rubor e a hipertermia da inflamação aguda são

resultados da dilatação dos vasos e aumento do fluxo sangüíneo na região

inflamada, o edema é provocado pelo acúmulo de exsudato e a dor resulta de

uma combinação de fatores incluindo a pressão nas terminações pelo edema e de

um efeito de determinados fatores químicos liberados durantes a resposta

inflamatória. A perda da função, total ou parcial, na área inflamada resulta em

edema e dor marcantes (HARDMAN et al., 2003).

Esta reação inflamatória consiste em dois componentes: uma reação inata,

do sistema imune que engloba os eventos que ocorrem localmente no interior dos

tecidos; e uma resposta imune adquirida e especifica, tornando a resposta de

defesa a um microorganismo invasor mais eficaz (TLASKALOVA et al., 2005).

Os eventos que ocorrem localmente no interior dos tecidos podem ser

divididos em vasculares e celulares. Os eventos vasculares compreendem a

vasodilatação, com conseqüente aumento do fluxo sanguíneo local, o aumento da

permeabilidade vascular e a exsudação plasmática. Tais eventos são importantes

na medida em que promovem um aumento local da concentração de mediadores

Carvalho, P. R. C.

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de origem plasmática, entre eles os componentes do sistema complemento, da

coagulação, do sistema fibrinolítico e das cininas. Concomitantemente, são

desencadeados os eventos celulares, onde há saída de leucócitos circulantes da

luz do vaso e a migração destas células para o sítio inflamatório. Esse fenômeno

segue algumas fases como captura, rolamento dos leucócitos pelo endotélio,

adesão firme e transmigração (WAHL et al; 1996; SILVA et al; 2007). Todas estas

etapas do processo de migração leucocitária são dependentes da expressão,

pelos leucócitos e pelas células endoteliais, de moléculas de adesão e de

mediadores quimiotáticos (WEBER, 2003).

A mobilização adequada dos leucócitos circulantes para o sítio inflamado é

fundamental para a defesa do organismo, já que estas células podem desenvolver

suas ações fagocíticas e destruição de agentes patogênicos, levando à resolução

do processo. Os leucócitos circulantes migram seletivamente e em número

significativo para o tecido inflamado no decorrer do processo. Em uma resposta

inflamatória aguda, e logo nos estágios iniciais, há acúmulo predominante de

neutrófilos, enquanto que as células mononucleares são observadas mais

tardiamente durante a fase aguda, bem como nos processos crônicos. A migração

de eosinófilos também pode ocorrer em processos inflamatórios, estando

principalmente associada a processos alérgicos e infecções parasitárias. Algumas

das células já estão presentes no tecido afetado tais como: células endoteliais,

células mesoteliais, mastócitos, eosinófilos, macrófagos e alguns linfócitos

(BROCHE; TELLADO, 2001).

Posteriormente, patógenos, debris celulares e células inflamatórias

precisam ser removidas e a integridade e funcionamento normal do tecido

restaurado. Quando esse delicado balanço entre inflamação e restauração

Carvalho, P. R. C.

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tecidual é quebrado, ocorrerá o desenvolvimento de doenças inflamatórias

crônicas e auto-imunes, tais como doenças inflamatórias intestinais, artrite ou

asma (SZÉLES; TOROSIK; NAGY, 2007).

O processo inflamatório pode iniciar-se a partir de traumas no tecido,

presença de complexos imunes, produtos derivados de bactérias, vírus ou

parasitos (CUNHA et al., 2004), e depende de mediadores celulares liberados por

células como neutrófilos, monócitos, macrófagos, eosinófilos, mastócitos e

mediadores químicos. Os mediadores químicos têm diferentes origens no

organismo e exercem funções diversas na cascata inflamatória, podendo ser

provenientes de células (histamina, serotonina, enzimas lisossomiais,

prostaglandinas, leucotrienos, fatores ativadores de plaquetas, citocinas e óxido

nítrico) e/ou mediadores provenientes do plasma (o complemento, as cininas

bradicininas e os fatores de coagulação e fibrinólise). Os primeiros mediadores

químicos a se manifestarem no processo inflamatório são histamina e serotonina.

(CUZZOCREA, 2005; WANG; ALJAROUDI; NEWBY, 2005; SARKAR; FISHER,

2006).

Dentre os mediadores inflamatórios, a histamina e a serotonina destacam-

se por realizar a desgranulação de mastócitos, responsáveis pela vasodilatação e

aumento da permeabilidade vascular (GONZALEZ-REY et al, 2007).

A bradicina se destaca entre os mediadores químicos envolvidos no

processo inflamatório, promovendo vasodilatação, extravasamento plasmático e

aderência de neutrófilos (CALIXTO et al., 2004). Além destes, mediadores

peptídicos, como as neurocininas e o peptídio relacionado ao gene da calcitonina

(CGRP) também exercem um importante papel no processo inflamatório

(OKAJIMAS; HARADA, 2006).

Carvalho, P. R. C.

. . .


Os efeitos dos mediadores do tipo prostaglandinas (PGs) e leucotrienos

(LTs) resultam em incrementos de quimiotaxias e fagocitoses dos leucócitos

polimorfonucleares (PMNs), e conseqüentemente a eliminação dos agentes

agressores. A ativação de macrófagos permite o estabelecimento de uma

resposta imune específica mediante a cooperação com os subgrupos de linfócitos

T auxiliares (Th). O meio ambiente pode condicionar uma resposta do tipo Th1 ou

Th2 de acordo com as características do agente agressor (SÁNCHEZ-RAMÍREZ

e TALAMÁS-ROHANA, 2002).

Assim, verifica-se que a inflamação manifesta-se clinicamente como um

fenômeno estereotipado e independente da natureza do agente agressor,

mediado por vários fatores, podendo ocorrer somente pequenas variações em

determinadas situações, dependentes do tecido ou órgão afetado, e da

coexistência de estados patológicos, que alterariam a capacidade do organismo

de mobilizar as fontes de defesa (SILVA, 2004).

A terapia antiinflamatória atual baseia-se na necessidade de controlar os

sinais cardinais da inflamação. A maioria dos antiinflamatórios estudados são

bloqueadores das vias principais de mediadores pró-inflamatórios que estão

envolvidos na iniciação de uma resposta inflamatória aguda. Assim, a maioria dos

antiinflamatórios bloqueia vias bioquímicas e/ou sinalizadores de mecanismos

pró-inflamatórios (SERHAN et al., 2003).

Dentre os medicamentos mais comuns estão os antiinflamatórios não-esteroidais

(AINEs) sendo a classe de medicamentos mais amplamente utilizada entre todos

os agentes terapêuticos. Com freqüência, são prescritos para queixas músculo-

esqueléticas e são freqüentemente tomados sem prescrição para dores menores,

uma vez que estes medicamentos possuem três tipos principais de efeitos: efeitos

Carvalho, P. R. C.

. . .


antiinflamatórios, efeito analgésico, e efeito antipirético (RANG, DALE; RITTER,

2001a.b).

3.3. DOR

A dor é conceituada como uma experiência sensorial e emocional

desagradável, tendo como causa um dano tecidual real ou potencial. A percepção

da dor envolve dois componentes, nocicepção que é o estímulo doloroso

propriamente dito, e a reação emocional à dor. A dor alerta o indivíduo sobre a

ocorrência de alguma forma de lesão orgânica instalada ou em vias de se instalar,

esta não envolve apenas a transdução da informação gerada pelo estímulo

nocivo, mas também o processamento cognitivo e emocional pelo cérebro

(CUNHA et al; 2004).

A percepção dolorosa a um determinado estímulo tem como ação biológica

alertar o organismo sobre o perigo no ambiente, incluindo a resposta

comportamental de proteger o organismo contra a possível lesão (DEVOR, 2006).

Em condições normais, a informação sensorial é captada por estruturas do

sistema nervoso periférico (SNP) e transmitida ao sistema nervoso central (SNC).

Nestas estruturas, neurotransmissores diferentes realizam a função bioquímica de

transmitir a dor (DAUDT et al., 1998).

A dor de acordo com a sua duração pode ser aguda ou crônica, onde a dor

crônica pode perpetuar por meses ou anos, e se caracteriza em relação à

persistência e alterações adaptativas, o que muitas vezes dificulta o tratamento; a

dor aguda está associada com uma lesão tecidual recente, ativação de

nociceptores e pode desaparecer até mesmo antes da cura do dano tecidual

(BESSON, 1999; PARK; VASKO, 2005).

Carvalho, P. R. C.

. . .


A origem da dor ainda é bastante variada, incluindo trauma, desordens

metabólicas e vasculares, infecções virais ou bacterianas, entre outros fatores. A

dor neuropática causa o dano neural, o qual é seguido de alterações que também

são comuns a diversos tipos de dor (DEVOR, 2006). No sistema nervoso

periférico, as principais conseqüências da lesão de nervos são alterações na

excitabilidade e no fenótipo das fibras aferentes primárias, sendo estes

fenômenos agentes contribuintes para as alterações que ocorrem no sistema

nervoso central, que incluem excitabilidade aumentada, inibição diminuída e

reestruturação organizacional das células (WOOLF, 2004).

Uma propriedade essencial dos tecidos animais consiste na capacidade de

responder defensivamente a estímulos lesivos. Essa propriedade é discernível de

algum modo, na maioria das espécies e manifesta-se de maneira cada vez mais

complexa, à medida que aumenta a especialização biológica (YAGIELA; NEIDE;

DOWD, 2000; CUZZOCREA, 2005).

A dor tem seu início nas áreas periféricas como a pele e órgãos internos,

isto é, fora do cérebro e da medula espinhal. Sendo assim, neste contexto, dar

uma topada ou encostar a mão em uma chapa quente são eventos que ativam os

neurônios que reagem como estímulos danosos, como temperaturas ou pressão

mecânica extrema e substâncias produzidas pelo organismo em respostas a uma

lesão ou inflamação (BASBAUM; JULIUS, 2006).

A sensação dolorosa é comumente acompanhada de alterações sensoriais

e de substâncias algiogênicas que são liberadas dos mastócitos e leucócitos, bem

como vasos sanguíneos e células traumatizadas, sendo responsável pela

hiperalgesia termomecânica (sensibilidade aumentada para um estímulo

doloroso), pela vasodilatação observada em lesões traumáticas, inflamatórias e

Carvalho, P. R. C.

. . .


isquêmicas e alodinia (dor provocada por um estimulo previamente não nocivo)

(CUNHA, 2004).

O fenômeno sensitivo doloroso é a transformação dos estímulos

ambientais em potenciais de ação que das fibras periféricas e são transferidos

para o Sistema Nervoso Central. Os receptores nociceptivos são representados

pelas terminações nervosas livres presentes nas fibras mielínicas A-δ e

amelínicas C (ANDRADE-FILHO, 2001).

Os nociceptores possuem duas extremidades, onde uma detecta

sensações e projeta-se para as regiões periféricas inervando pequenas porções

de tecido e a segunda extremidade estende-se até o interior do corno medular

espinhal dorsal. O corpo celular dos nociceptores fica entre esses dois

segmentos, quando o agente nocivo é detectado pela extremidade periférica na

pele ou algum outro órgão, um impulso elétrico é disparado e propagado por toda

a fibra nervosa até atingir uma região da medula espinhal (BASBAUN; JULIUS,

2006).

Os nociceptores que constituem os receptores farmacológicos dos axônios

de células nervosas desencadeiam a condução elétrica, levando a informação

dolorosa de sua origem periférica à medula espinhal por via específica. No

cérebro, a informação é identificada e se transforma em sensação de dor. Entre

os receptores periféricos e o cérebro, existem duas vias mediadoras dos

estímulos dolorosos: a neoespinotalâmica e a paleoespinotalâmica (LÜLLMANN

et al., 2001).

A via neoespinotalâmica (Trato espinotalâmico lateral) é a principal via que

medeia a sensibilidade dolorosa e térmica, envolvendo uma cadeia de três

neurônios. Através desta via, sensações térmicas são trazidas dos membros e do

Carvalho, P. R. C.

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tronco do lado oposto, sendo que esta via informa a sensação de dor rápida e

bem localizada (somatotopia) (ROCHA, 2005); e a via paleoespinotalâmica (Trato

espinotalâmico retículo), ao contrário da via neoespinotalâmico, não tem

organização somatotópica. Assim, ela é responsável por um tipo de dor pouco

localizada, a dor profunda do tipo crônico, correspondendo a chamada dor em

queimação, ao contrário da via neoespinotalâmica, que veicula dores localizadas

do tipo dor em pontada (LÜLLMANN et al., 2000).

Neurônios sensoriais lesionados, ou fibras próximas a eles, podem

desenvolver alterações na sua excitabilidade, suficientes para gerar potenciais de

ação ectópica, podendo estes resultar na desmielinização e ou no aumento da

expressão de canais de sódio e diminuição da expressão de canais de potássio

(LIU; MICHAELIS; DEVOR, 2000).

3.4. Plantas Medicinais como Fonte de Novos Fármacos.

A fitoterapia é uma terapia milenar que se caracteriza pelo tratamento com

o uso de plantas medicinais e suas diferentes formas farmacêuticas, sem a

utilização de princípios ativos isolados. Pode-se afirmar que 2000 anos antes do

aparecimento dos primeiros médicos gregos, já existia uma medicina egípcia

organizada, onde o tratamento de várias enfermidades era feito

predominantemente com plantas medicinais. Os recursos terapêuticos disponíveis

até o século XIX eram exclusivamente oriundos de plantas medicinais e extratos

vegetais. No século XX, surgiu a tendência de se isolar os princípios ativos

(PUPO; GALLO, 2007).

Ao longo dos séculos, produtos de origem vegetal constituíram as bases

para tratamento de diferentes doenças. Desde a Declaração de Alma-Ata, em

Carvalho, P. R. C.

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1978, a Organização Mundial de saúde (OMS) tem expressado a sua posição a

respeito da necessidade de valorizar a utilização de plantas medicinais no âmbito

sanitário, tendo em conta que 80% da população mundial utilizam essas plantas

ou preparações destas no que se refere à atenção primaria à saúde (BRASIL,

2006a.b).

Embora o uso de plantas na cura de enfermidades seja um dos meios mais

antigos de tratamento, o conhecimento sobre as plantas medicinais representa,

muitas vezes, apenas informações de seu uso popular por comunidades e grupos

étnicos. Sob este aspecto, é importante ressaltar que o sucesso das

investigações na área de princípios ativos naturais depende, principalmente, do

grau de interação entre a Botânica, a Química, a Fitoquímica e a Farmacologia

pré-clinica e clínica (GARCIA-GONZÁLES, 2000), para a identificação de uma

nova estrutura química, que possa representar um novo candidato a fármaco,

elegendo-se o melhor alvo-farmacológico para a aplicação terapêutica (MACIEL;

PINTO; VEIGA-JÚNIOR, 2002).

Esta interação apresenta-se dividida em etapas onde, na botânica está

envolvida a seleção e identificação do material a ser avaliado. A etapa fitoquímica

compreende o isolamento, elucidação estrutural e a identificação dos constituintes

mais importantes da planta. Este conhecimento, quando associado ao

monitoramento da atividade biológica, permite a análise e a caracterização da

fração ou substância dotada de atividade terapêutica e/ou tóxica. A etapa

farmacológica pré-clinica engloba estudos farmacodinâmicos, farmacocinéticos e

toxicológicos do extrato total da planta a ser estudado, realizados in vivo e/ou in

vitro. Um dos passos iniciais destes estudos é a investigação dos efeitos

farmacológicos da substância isolada de uma planta em modelos experimentais

Carvalho, P. R. C.

. . .


relevantes e relacionada às ações farmacológicas sugeridas pela análise popular

(ELIZABETSKY; SOUZA, 2004).

A fitoterapia tem apresentado um importante papel na terapia anticâncer e

os mecanismos de interação entre fitocompostos e células neoplásicas vem

sendo extensivamente estudado (MUKHERJEE, 2001). Vários laboratórios se

encontram envolvidos na tarefa de buscar novos agentes terapêuticos

antineoplásicos a partir de fontes naturais (BARACAT, FERNANDES, SILVA,

2000).

A natureza, ao longo dos anos, tem fornecido muitos produtos efetivos

contra o câncer que até hoje são amplamente utilizados na clínica, a exemplo

disto pode-se citar a grande ação dos extratos de plantas de gênero Taxus de

onde se obteve a substância conhecida como Taxol (paclitaxel) e Docetaxel. Além

destes compostos, a Vincristina e Vinblastina extraídos de Cataranthus roseus

são efetivos contra tumores no fígado, rins, cérebro, mama e próstata

(MUKHERJEE; CHATTERJEE, 2001; CECHINEL; YUNES, 2001).

A literatura mostra que além das efetivas drogas contra o câncer, os

produtos naturais são considerados agentes quimiopreventivos, especialmente os

flavonóides (LAPA et al., 2004).

Apesar do grande desenvolvimento da síntese orgânica e dos processos

biotecnológicos, cerca de 25% dos medicamentos prescritos nos países

industrializados são originados de plantas, oriundos de nada mais de que 90

espécies. No entanto, durante os últimos 20 anos, os fármacos de origem natural

que aparecem no mercado são quase que na totalidade, oriundos de pesquisas

científicas de países como China, Coréia e Japão, sendo que a contribuição dos

outros países é bem menor (CALIXTO; OTUKI; SANTOS, 2003).

Carvalho, P. R. C.

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O mercado mundial atual de fitofármacos e fitoterápicos são de ordem de 9

a 11 bilhões de dólares por ano, sendo que mais de 13.000 plantas são

mundialmente usadas como fármacos ou fonte de fármacos (FOGLIO et al, 2006).

Outras estimativas revelam que o mercado mundial de produtos farmacêuticos

movimenta 320 bilhões de dólares por ano, dos quais 20 bilhões são originados

de substâncias ativas derivadas de plantas (ROBBERS; SPEEDIE; TYLER,

1997), sendo importante salientar que cerca de 49% das drogas ou análogos

semi-sinteticos ou ainda compostos sintéticos, desenvolvidas entre 1981 a 2001

foram obtidos a partir de produtos naturais (VIEGAS; BOLZANI, 2006)

No Brasil, o crescimento do mercado de fitoterápicos é de 15% ao ano,

enquanto o crescimento anual do mercado de medicamentos sintéticos gira em

torno de 3 a 4% (ABIFISA, 2006). O panorama brasileiro mostra que 84% de

todos os fármacos são importados e que 78% da produção brasileira ocorrem por

multinacionais, revelando assim a necessidade de buscar alternativas para

superar a dependência externa, principalmente quando confrontamos com altos

preços praticados no Brasil em comparação àqueles praticados nos países

desenvolvidos (BERMUDEZ, 2002). É nesse contexto, que as plantas medicinais

adquirem importância como agentes terapêuticos e, por isso, sua segurança e

eficácia devem ser analisadas para que os mesmos sejam registrados no

Ministério da Saúde para posterior comercialização.

No Brasil, recentemente, foi criado o Decreto nº 5.813 de 22 de junho de

2006, que aprova a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, com o

objetivo de garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de

plantas medicinais e fitoterápicos, através principalmente da promoção do uso

sustentável da biodiversidade, do desenvolvimento da cadeia produtiva e do

Carvalho, P. R. C.

. . .


fortalecimento da indústria farmacêutica nacional, estimulando a produção de

fitoterápicos em escala industrial e incrementando suas exportações o que pode

ajudar a superar a dependência externa (BRASIL, 2006b).

O levantamento acurado do uso popular de uma planta pode servir de base

para a busca sistemática de novos fármacos. Entretanto, o uso popular e

tradicional de plantas não é suficiente para validar eticamente o seu uso como

medicamentos eficazes e seguros (LAPA et al., 2004), sendo necessária à

abordagem etnofarmacológica como estratégia para investigação de plantas

medicinais, que consiste em combinar informações adquiridas junto a

comunidades que façam uso da flora local com estudos químico-farmacológicos

realizados em laboratórios especializados (BAIS et al., 2006).

A descoberta de novos compostos é motivada pela busca de substâncias

mais ativas e menos tóxicas, que possam ser utilizadas no tratamento de diversas

patologias, ou em substituição àquelas já existentes. Dentro da perspectiva de se

estudar plantas medicinais, o Brasil se encontra em posição privilegiada, pois é o

país com a maior diversidade vegetal do mundo, contando com mais de 55.000

espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 (GUERRA;

NODARI, 2003).

As plantas medicinais contêm propriedades diversas de acordo com os

seus princípios ativos, estes princípios não são estáveis e não se distribuem de

maneira homogênea na planta. Estas substâncias podem se concentrar nas

raízes, rizomas, talos, caules, folhas, sementes ou flores. Seu teor também varia

de acordo com a época do ano, solo e clima onde a planta se desenvolve. Quanto

à concentração das substâncias, também ocorrem diferenças com plantas que

convivem lado a lado (DA CUNHA, 2003).

Carvalho, P. R. C.

. . .


3. 5. Família Malvacea: Características da Família Malvacea

A família Malvacea foi classificada por Cronquist (1981) e pertence à ordem

Malvales, sendo constituída por 243 gêneros e 4225 espécies.

No Brasil estima-se que esta se apresenta com cerca de 40 gêneros e 400

espécies (STEVENS, 2003). É constituída por plantas de hábitos variados, como

ervas subarbustos, arbustos e árvores, podendo ocorrer isoladas ou em

populações maiores, em áreas úmidas, alagadas e semi-áridas (BARACHO,

1998).

Ocorrem por quase todas as partes do mundo sendo mais abundantes nas

regiões tropicais, principalmente na América do Sul (HEYWOOD, 1993).

Figura 01.

Carvalho, P. R. C.

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Figura 01 Distribuição de espécies de Malvácea no Mundo. (Região

mais escura)

Os representantes da família Malvácea possuem ramos cilíndricos, às vezes

aplanados, eretos, prostrados ou decumbentes, raramente aculeados, tricomas

simples ou estrelados.

Suas folhas são pecioladas, alternas, inteiras ou lobadas, raramente glabras,

às vezes com nectários na face dorsal; estipuladas. Suas inflorescências são

solitárias, fasciculadas nas axilas das folhas ou em racemos, panículas e algumas

vezes em espigas, com cimas escorpióides, raramente em umbelas.

São plantas que possuem flores e em geral são grandes e vistosas,

actinomorfas, cíclicas, hermafroditas, muitas vezes triclamídeas pelo

desenvolvimento de um cálice externo, com pétalas geralmente soldadas na

base, podendo estar presente ou ausente; os cálices são gamossépalos, 5

sépalas; 5 pétalas ungüiculadas, adnatas a base do tubo estaminal; possui cinco

numerosos estames monadelfos, com os filetes apresentando partes livres

Carvalho, P. R. C.

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diversamente distribuídas ao longo do tubo, com anteras reniformes,

biesporangiadas, monotecas, rimosas; o ovário supero, 3-muitos lóculos, 1-muitos

óvulos; estiletes livres entre si ou parcialmente concrescidos e depois liberando-

se em tantos ramos quantos forem os carpelos ou em dobro do número deles;

estigmas capitados ou decorrentes. O androceu possui estames muito

numerosos, sempre com filetes parcialmente soldados, que formam um longo

tubo (andróforo, coluna) envolvendo o gineceu. As anteras apresentam-se sempre

com uma só teca. O pólen é espinhoso. O ovário é trilocular e cada loja possui

dois óvulos. Seus frutos são baciformes, capsulares ou, ainda, esquizocárpicos

com frutículos apendiculados, podendo ser transportados tanto pelo pêlo dos

animais como pelo homem (BOVINI; CARVALHO-OKANO; VIEIRA, 2001).

Figura 02.

Carvalho, P. R. C.

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Figura 02 – Caracteres morfológicos mais evidentes em espécies de Malváceas (1-flor; 2-petala mostrando sua soldadura na base; 3-estames soldados formando um único tubo (androforo); 4-antera mostrando uma única teca; 5-grao de polen; 6-ovario, podendo ser penta ou plurilocular, 6a; 7-fruto; 7a-fruto aberto). Fonte: Joly, 1976.

Stevens, 2003, apresenta os gêneros mais numerosos que compõem esta

família: os Hisbiscus (300), Sida (200), Pavonia (150), Abutilon (100), Nototriche

(100), Cristaria (75) e Gossypium (40).

Carvalho, P. R. C.

. . .


3.6. Aspectos quimiotaxonômicos, etnobotânicos e etnofarmacológicos da

família Malvaceae

Quanto aos aspectos etnobotânicos, etnofarmacológicos e

quimiotaxonomia, a família Malvácea mostrou-se bastante diversificada, podendo-

se destacar algumas classes de produtos naturais como: esteróides, terpenos,

ácidos fenólicos (SHARMA; AHMAD, 1989; AHMED; KAZMI; MALIK, 1990;

AHMED; KAZMI; MALIK, 1991;), alcalóides (GUNATILAKA et al., 1980), bem

como flavonóides (ELLIGER, 1984; BILLETER; MEIER; STICHER, 1991; SILVA

et al., 2005A) e cumarinas (SILVA et al., 2006; COSTA, 2007), onde inúmeras

substâncias isoladas pertencentes às suas respectivas classes, apresentando

significativa atividade farmacológica segundo várias literaturas.

A família Malváceae possui representantes de considerável valor econômico,

sendo utilizada na ornamentação em todo o mundo, como por exemplo, espécies

dos gêneros Althea (A. officinalis, A. rosea), Hibiscus (H. rosa-sinensis, H.

schizopetalus, H. tiliaceus, H. sabdariffa), Malvaviscus e Abutilon (A. molle, A.

megapotamicum, A. striatum, A. darwinii, A. bedfordianum) (SCHULTZ, 1968),

além de espécies dos gêneros Gossypium (algodão) e Urena (juta) que são

utilizadas na indústria têxtil (BOVINI; CARVALHO; VIEIRA, 2001).

As espécies do gênero Sida, um dos maiores representantes da família

Malváceae, são consideradas “daninhas” e/ou “invasoras” e reconhecê-las é

importante para evitar infestação em culturas e conseqüentemente prejuízos à

economia agrícola (FERREIRA; MACEDO; LACA-BUENDIA, 1984).

Carvalho, P. R. C.

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Brandão et al.; 1985; alertam para o possível interesse econômico da flora

invasora, inclusive de espécies de Sida. Segundo estes autores, essa flora pode

ser utilizada como alimento, medicinal, ornamental ou, ainda, como forrageira.

A Sida rhombifolia L., conhecida como “guanxuma”, “malva”, “relógio”,

“vassoura-do-campo”, “vassoura-relógio”, “mata-pasto” ou “vassourinha”, é

amplamente empregada na medicina caseira, como emoliente, tônica,

estomáquica, febrífuga, calmante, anti-hemorroidal, anti-diarréico e para aliviar

dores ocasionadas por picadas de insetos. Na Índia, a infusão de suas raízes é

utilizada no tratamento do reumatísmo. Sida carpinifolia (L.f.) K. Schum e

Sidastrum micranthum (A. St.-Hill.) Frixell possuem características e propriedades

semelhantes (LORENZI; MATOS, 2002).

Sida rhomboidea Roxb, é uma erva encontrada em pântanos da Índia cujas

raízes e folhas são usadas como tônico, para cura de febres, doenças do coração

e todos os tipos de inflamação. Estudos farmacológicos desta planta indicaram

sua atividade antinociceptiva e antiinflamatória (VENKATESH et al., 1999).

Sida cordifolia L., conhecida como “malva branca” ou “malva branca

sedosa”, é usada para o tratamento de estomatites, asma, congestão nasal,

inflamação da mucosa oral e blenorréia. Os efeitos antiinflamatórios e analgésicos

foram investigados para o extrato aquoso desta planta, mostrando-se bastante

significativos, comprovando assim sua utilização popular (FRANZOTTI et al.,

2000; FRANCO et al., 2005).

Sida spinosa L. é usada no tratamento da asma, em outros distúrbios do

peito e como tônico. As folhas têm sido usadas para tratamento de algumas

Carvalho, P. R. C.

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doenças de pele e como tratamento oral para veneno de cobra. As raízes e folhas

são usadas no tratamento da diarréia e disenteria (DARWISH; REINECKE, 2003).

Sida acuta é usada tradicionalmente por curandeiros para neutralizar o

efeito do veneno da serpente Bothrops atrox, encontrada na América Latina.

Estudos de laboratório in vitro com os extratos desta planta avaliaram este efeito e

os resultados mostraram a capacidade desta espécie em inibir de forma moderada

o efeito hemorrágico provocado pelo veneno de Bothrops, comprovando o seu uso

popular (OTERO et al., 2000). Esta espécie é também usada no tratamento da

malária e outras doenças febris (BANZOUZI et al., 2004).

Várias espécies de Malvaceae possuem uso na medicina popular. Como

exemplos, podemos citar: Malva sylvestris L., conhecida como “malva”, “malva-

alta”, “malva-de-botica”, “malva-grande”, é utilizada desde a antiguidade,

principalmente na Europa, no tratamento de tosses e doenças inflamatórias de

membranas e mucosas. Na Idade Média, Plínio e Dioskorides, já indicavam o seu

sumo para evitar indisposições, tratar queimaduras e picadas de insetos

(BILLETER et al., 1991; LORENZI; MATOS, 2002). Na medicina tradicional

egípcia, a Malva sylvestris L. era utilizada para o tratamento de hemorróidas

(NAWWAR; BUDDRUS, 1981).

Hibiscus sabdariffa L., conhecida como “vinagreira”, “rosela”, “caruru-azedo”,

“caruru-da-guiné”, “azeda-da-guiné”, “quiabo-azedo”, ou “groselheira”, é

amplamente empregada na medicina caseira em quase todo o Brasil. O chá de

suas folhas e raízes é considerado emoliente, estomáquico, anti-escorbútico,

diurético e febrífugo (LORENZI; MATOS, 2002).

Carvalho, P. R. C.

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Hibiscus esculentus, conhecida como quiabo, é usada há muitos anos no

tratamento de desordens gástricas, tais como, dores no estômago e úlceras

pépticas (YESILADA; GURBUZ, 2002). Existem grandes evidências para tal

utilização a partir de estudo farmacológico recente, que avaliou o efeito

gastroprotetor de extratos de Hibiscus esculentus contra lesões induzidas por

etanol, o que foi confirmado através de análise histopatológica (GURBUZ et al.,

2003).

Hibiscus abelmoschus, planta comum em regiões tropicais é muito usada na

medicina popular e na perfumaria. Sua análise por cromatografia gasosa e

cromatografia liquida de alta eficiência mostrou a presença de isômeros de ácidos

graxos de 20 carbonos (NEE; KARTT; POLLARD, 1986).

Gossypium herbaceum, espécie mais citada da família Malvácea é um tipo de

algodoeiro que é o mais cultivado desde os tempos do Império Romano e com

evidências de ter-se originado na Índia devido a suas inúmeras utilidades. Seus

pêlos compridos e sedosos constituem algodão, utilizados na indústria têxtil, suas

sementes contêm 15-30% de um óleo empregado na indústria e na alimentação,

podendo substituir o óleo de oliveira. A torta remanescente das sementes é

empregada para a forragem e adubo, suas raízes e suas cascas são usadas para

fins medicinais (SCHULTZ, 1968).

As folhas do Gossypium hirsutum L., conhecida como “algodoeiro”,

“algodão”, “algodão-herbáceo”, “algodão-mocó”, “algodão-anual”, são utilizadas

pela medicina caseira no Brasil, na forma de chá, para o tratamento de disenteria

e hemorragia uterina. Suas folhas machucadas são empregadas localmente como

cicatrizantes e o chá da raiz é utilizado nos casos de falta de memória,

Carvalho, P. R. C.

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amenorréia, distúrbios da menopausa e impotência sexual. As flores e frutos ainda

verdes são utilizados friccionando-os localmente, em casos de micoses como

frieiras, panos brancos e pretos, além de impingens. O óleo extraído das suas

sementes é empregado como purgativo e vermífugo para áscaris (ascaricida) e,

localmente, como emoliente e no combate de piolhos. O gossipol, principal

constituinte do algodoeiro, é usado na China como anticoncepcional masculino,

por sua propriedade de inibir a espermatogênese (LORENZI; MATOS, 2002).

Outras espécies ainda são cultivadas como a G. barbadense, G. peruvianum, G.

arboreum e alguns híbridos (SCHULTZ, 1968).

Pavonia zeylanica é usada como vermífugo e purgativo por nativos do

Zâmbia (TIWARI; MINOCHA, 1980).

Abutilon indicum possui uso terapêutico como febrífugo, anti-helmíntico,

anti-emético, antiinflamatório, em alterações urinárias e uterinas, hemorróidas e

dores na região lombar (GAIND; CHOPRA, 1976).

No campo alimentício destacam-se as seguintes espécies: Hibiscus

esculentus (quiabo), por seus frutos comestíveis, apreciados como verdura

(SCHULTZ, 1968); Hibiscus sabdariffa (groselha), pelo aproveitamento de suas

brácteas e sépalas empregadas na preparação de geléias, e de suas folhas para

preparar o famoso arroz-de-cuchá, prato típico da cozinha maranhense. Em

algumas regiões, suas raízes são utilizadas para o preparo de aperitivo.

Destacam-se ainda o Gossypium hirsutum e Gossypium herbaceum, por seus

óleos extraídos das sementes que possuem largo uso em culinária (LORENZI;

MATOS, 2002), e a espécie Hibiscus abelmoschus é utilizada na indústria de

Carvalho, P. R. C.

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perfume, onde suas sementes são valorizadas por seu aroma (NEE; CARTT;

POLLARD, 1986).

3.7. Considerações botânicas sobre o gênero Herissantia:

Em 1788 Medicus, propôs e validou Herissantia como um novo gênero,

cujo nome é uma homenagem a Louis Antoine Prospere Herissant, físico,

naturalista e poeta do século XVIII (WAGNER; HERBST; SOHMER, 1999). O

novo gênero foi proposto com base na morfologia dos frutos, com uma descrição

do fruto de Sida crispa, diferenciando-o dos frutos de Abutilon. Entretanto, o autor

não associou o epíteto crispa a Herissantia. As combinações para o gênero foram

realizadas por Brizicky (1968), 180 anos depois, que efetuou três combinações

para Herissantia (H. crispa, H. nemoralis e H. tiubae). Posteriormente, Fryxell

(1973, 1979) descreveu uma nova espécie no México (Herissantia dressleri) e

efetuou uma nova combinação (Herissantia trichoda), baseado em Abutilon

trichodon Rich.

Herissantia é um gênero neotropical, distingue-se do Abutilon, com o qual

possui grande afinidade, pelo hábito subarbustivo e arbustivo, difuso e

escandente, fruto pendular e inflado, com mericarpos reniformes e escariosos

(BRIZICKY, 1968; FRYXELL, 1973). É constituído por seis ou mais espécies

restritas a América tropical (FRYXELL, 1997). A maioria das espécies ocorre no

México, Antilhas e América do Sul.

O gênero Herissantia caracteriza-se pelos frutos inflados, pendentes e

pelos carpídios com as paredes laterais frágeis.

Carvalho, P. R. C.

. . .


3. 8. Herissantia crispa L. (Brizicky)

A Herissantia crispa L. (Brizicky), é de ampla distribuição, dicotiledônea,

anuais ou perenes, subarbustos eretos ou decumbentes, ramos cilíndricos,

pubescentes a velutinos, folhas com laminas ovadas, estípulas filiformes, às

vezes caducas, flores solitárias, axilares pediceladas, epicálice ausente, cálise

cupuliforme, 5-laciniado, 5 pétalas brancas com mácula escura na base, estames

vários partes livres no ápice do tubo estaminal; ovário com tantos lóculos quanto o

número de estigmas, 1-3 óvulos por lóculo; estigmas capitados, frutos

esquizocárpicos, inflados, pendentes; carpídios com faces laterais frágeis,

deiscentes.e sementes 1-3, glabras ou pilosas, é uma erva que é nativa da

Califórnia, ocorrendo desde os Estados Unidos até a Argentina (FRYXELL, 1997).

Figura 03.

Figura 03: Herissantia crispa L. (Brizicky).

Carvalho, P. R. C.

. . .


3.9. Sidastrum paniculatum L. (Fryxell)

A Sidastrum paniculatum é conhecida popularmente como malva-roxa ou

malvavisco, é um arbusto perene, heliófilo e higrófilo, ocorrendo desde altitudes

ao nível do mar até altitudes em torno de 3 metros (BARACHO, 1998).

No Brasil, a região Nordeste é a que apresenta o maior número de

representantes do gênero Sidastrum, sendo provavelmente o centro de

diversidade do gênero no país. A análise fitoquímica de Sidastrum paniculatum

permitiu o isolamento de dois esteróides e dois flavonóides, descritos pela

primeira vez nesta espécie, os quais foram o canferol- 3-O-ß-D-(6’’-E-p-cumaroil)

glicosídeo pode ser considerado como um marcador quimiotaxômico por ter sido

encontrado em outras espécies de Malvaceae (COSTA, 2006; CAVALCANTE,

2006).

Carvalho, P. R. C.

. . .


O quadro 1 apresenta algumas atividades farmacológicas relacionadas com os

representantes da família Malvaceae.

ESPÉCIES

ATIVIDADE

FARMACOLÓGICA

REFERÊNCIAS

Abutilon aritum (Wall. Ex LinK) Sweet,

Carcinogênico

DEWICK, 2002.

Antioxidante

MIR-BABAEV ; SEREDA, 1987

Abutilon indicum (L.) Don.

Antiinflamatório;

Hepatoprotetor

KURMA; MISHRA, 1997.

Antifúngica, Antiúlcera

MA; SCHAFFER, 1953

Gastroprotetora

LING ; JONES, 1995

Hipoglicêmica

NAVARRETE et al., 2007 MCANUFF et al., 2005

Bakeridesia pickelii Moteiro

Anticancerígena (Inibidor do cancer de prostata e

de mama)

AWAD et al., 2005

Carvalho, P. R. C.

. . .


Anti-ofídica (contra veneno de cobra

Bothrops)

DIMAS et al., 2000

Antioxidante

GALOTTA ; BOAVENTURA,

2005

Antibacteriana

TRIANTS et al., 2005

Anti-HIV

MATSUDA et al., 2002

MAHMOOD et al., 1996

Bakeridesia pickelii Moteiro

Antiinflamatório

MOUNNISSAMY et al., 2002.

Gossypium arboreum L.

Antileucêmico, Antioxidante.

ROSENBLOOM, 2006.

Carcinogênico

NAKATANI et al., 1986

Gossypium stuntianum J. H. Willis

Carcinogênico.

DEWICK, 2002

Carvalho, P. R. C.

. . .


Antifúngico

MASSON et al., 2006

Larvicida contra A. aegypti

FURTADO et al., 2005

Antiinflamatório

SARTORI et al., 2003

Gossypium hirsutum L.

Ascaricida,

Anticoncepcional

masculino

LORENZI; MATOS, 2002

Anticonvulsivante , Anti-

bacteriana

SOUSA et al., 2006.

Larvicida contra A.

aegypti

FURTADO et al., 2005.

Hibiscus esculentus L.

Úlceras pépticas

YESILADA; GURBUZ, 2002.

Antioxidante,

Bloqueadora UV

CHICARO et al., 2004

Herissantia tiubae (K. Schum.) Brizicky

Espasmolítico

CAZAROLLI, 2004

Carvalho, P. R. C.

. . .


Antioxidante Hipotensora

PASTENE et al., 2001

Antiinflamatório,

GOHARA; ELMAZAR, 1998

Antinociceptiva

TOKER et al., 2004

Vasorelaxante

SILVA, 2005A, B

Anticancerígena

WANG et al., 2004

Herissantia tiubae (K. Schum.) Brizicky

Antidiabética

CAZAROLLI, 2004

Antiinflamatório AnticancerÍgena

PEREIRA et al., 2006

Anti-hepatotóxica

AWAD et al., 2005

Sida acuta Burm. F.

Hipocolesterolêmico e

sedativo

AGRICULTURAL RESEARCH

SERVICES, 2007

Carvalho, P. R. C.

. . .


Antiinflamatório

AQUINO et al., 1998

Sida veronicaefolia

Lam.

Hipocolesterolêmico

MOGHADASIAM; FROHLICHH,

1999

Analgésico, antiartrítico

MADAUS, 1976

Antibacteriano; antiinflamatório;

antioxidante; antipirético;

HUANG, 1993

Antisséptico

JU et al., 2007

Anticancerígeno

BASILE, 1999

Antibacteriano

KIM et al., 2000

Antialérgico

KIMATA, et al, 2000

Sida galheirensis Ulbr

Antioxidante Antiinflamatório

UEDA, et al., 2002

Sida cordifolia L.

Antioxidante

PIETTA, 2000

Carvalho, P. R. C.

. . .


Antioxidante

LEE, et al., 2000

Sida hermaphrodita ( L.) Rusby

Antifúngico

MING, et al., 2005

Antibacteriano

SAWER, 2005

Antidiabético

BIERER et al., 1998

Sida acuta Burm. F.

Antiasmático

CHATTERJEE, 2003

Sida spinosa L.

Antibacteriano, antiinflamatório e

analgésico Antiasmático

CHATTERJEE, 2003

Sida cordifolia L.

Antiasmático

CHATTERJEE, 2003

Carvalho, P. R. C.

. . .


REFERÊNCIAS

4. REFERÊNCIAS

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Carvalho, P. R. C.

. . .


ARTIGO 1JOURNAL OF PHARMACY & PHARMACEUTICAL SCIENCES –SUBMETIDO

Carvalho, P. R. C.

. . .


In vitro and in vivo antitumor effects of the flavonol glycosides isolated of Herissantia crispa L.

(Brizicky)

Paulo R. C. Carvalho1, Jaciana S. Aguiar

1, Danielly A. Costa

2, Wemerson N. Matias

2, Yanna

Carolina F. Teles2, Maria de Fátima V. Souza

2, Paloma L. Medeiros

3, Eliete C. Silva

3, Teresinha

Gonçalves-Silva11, Silene C. Nascimento

1.

1

Department of Antibiotics, Federal University of Pernambuco

50670-901, Recife-PE, Brazil, 2Pharmaceutical Technology Laboratory, Federal University of Paraiba, University Campus, 970,

João Pessoa-PB, Brazil

3

Department of Histology and Embryology, Federal University of Pernambuco

50670-901, Recife-PE, Brazil,

ABSTRACT - PURPOSE. This paper describes the cytotoxic and antitumoral activities of the

kaempferol 3-O-(6”-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside (tiliroside), kaempferol 3,7-di-O-α-L-

rhamnoside (dhiramnoside) and of the mixture a mixture of sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside

and stigmasteryl-3-O-β-D-glucopyranoside (GM) isolated of the Herissantia crispa. METHODS.

The aerial parts of Herissantia crispa was macerated in ethanol. The ethanol solution was

concentrated under vacuum, dissolved in EtOH:H2O (7:3) and partitioned with n-hexane,

chloroform, ethyl acetate and n-butanol, which after concentration under vacuum supplied to the

respective phases. The chloroform phase after this chromatographic process, 2.0g of the amorphous

substance were isolated and identified as being a mixture of sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside

and stigmasteryl-3-O-β-D-glucopyranoside (GM). The ethyl acetate phase (10g) supplied 1,5g of

dhiramnoside and 1,2g of tiliroside. Their citotoxicity and anticancer activity were evaluated in

vitro and in vivo. RESULTS. The compounds have not presented cytotoxic activity against NCI-

H292, HEp-2 and KB cells. In the evaluation of the antitumor activity in vivo, dhiramnoside did not

present significant inhibitory activity of the growth of sarcoma 180 in doses tested (50 and

100mg/kg) when compared with the control group. However, tiliroside-treated animals showed a

high inhibition rate in the tumors growth, with a percentage of inhibition of the growth of sarcoma

180 of 52.7 and 60.5 in doses of 50 and 100mg kg-1 of weight, respectively. The mixture of

glycosides (GM) also inhibits significantly the growth of sarcoma 180. The tiliroside inhibit

significantly the growth of the carcinoma of Ehrlich at a dose of 100 mg kg-1. The histophatological

analysis showed that the kidneys of tiliroside-treated animals were only slightly affected, but the

livers had not presented alterations. CONCLUSIONS. In conclusion, among compounds tested,

tiliroside exhibited promising antitumor effects without an expressive toxicity. This activity seemed

to be related to its antioxidant properties and not to the reduction of tumor proliferation rate.

1 Corresponding author: Teresinha Gonçalves-Silva. Universidade Federal de Pernambuco.

Departamento de Antibióticos. R. Prof. Moraes Rego, 1235- Cidade Universitária. Recife-

Pernambuco. Brasil. Phone: +55 31 81 2126 8347; Fax: +55 31 81 2126 8346. E-mail address:

[email protected]

Carvalho, P. R. C.

. . .


INTRODUCTION Natural products are an important source of drugs leads. The study of natural products has

contributed enormously for the development of drugs with important therapeutic applications

currently used in modern medicine, from which, approximately 25% are derived directly or

indirectly from superior plants (1). New developments based on natural products include several

substances of importance, such as forscolin, which presents a promising effect against hypertension

(2), and many anticancer agents, including vindesine, etoposide, vincristine and topotecan (3).

Herissantia is a neotropical genus constituted by five or more species restricted to tropical

America. The majority of the species occurs in Mexico, Antilles and South America. Only

Herissantia crispa is of ample distribution, occurring from the United States until Argentina (4). In

the genus Herissantia, the species Herissantia tiubae has had previous phytochemistry and

pharmacological studies done and the Herissantia crispa has been described few pharmacological

studies (5).

Flavonoids have been identified as either simple or complexes glycosides in plants, and a human

has been estimated to consume approximately 1g flavonoids/day (6). Flavonoids have been

reported to exert multiple biological effects due to their antioxidant and free radical-scavenging

abilities, although results from different studies have demonstrated that flavonoids can act as pro-

oxidant at very high doses. Furthermore, most investigations have reported antibacterial,

antifungal, antiviral, anti-inflammatory, anti-allergic activity and protective roles in heart diseases,

cancer and different pathologies (7).

Tiliroside isolated from Geranium mexicanum, Cuphea pinetorum, Helianthemum glomeratum, and

Rubus coriifolius demonstrated in vivo anti-protozoal activities (8). Tiliroside, the principal

flavonol glycoside isolated from the flowers of Tilia argentea (linden) strongly inhibited serum

GPT and GOT elevations at doses of 25–100 mg/kg (p.o.) in d-GalN/LPS-treated mice, showing

hepatoprotetor effect (9).

The aim of this study was to investigate, in experimental models, in vivo and in vitro of the

tiliroside, dhiramnoside and mixture of sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside and stigmasteryl-3-O-

β-D-glucopyranoside (GM) isolated from Herissantia crispa. In order to evaluate the cytotoxic

activity against NCI-H292, HEp-2 and KB tumor cells and the antitumor activity in vivo using the

tumor cell of Sarcoma 180 and Carcinoma of Ehrlich.

METHODS

Plant Material

The total plant, Herissantia crispa, was collected in the Pedra da Boca, in the region of Araruna -

PB, in September of 2004 and identified by the Profª Drª Maria de Fátima Agra, of the Nucleus of

Research in Natural Products /LTF/UFPB, being Vouchers were prepared and stored at Herbarium

Prof. Lauro Pires Xavier (CCEN/UFPB) under numeration 6237.

Isolation of the chemical constituents The aerial parts of Herissantia crispa were dried at 40ºC during three days and ground in a

mechanical mill. 5000g of the dust was macerated in ethanol for three days, the process being

repeated until the complete extration of the chemical constituents was achieved. The ethanol

solution was concentrated under vacuum, dissolved in EtOH:H2O (7:3) and partitioned with n-

hexane, chloroform, ethyl acetate and n-butanol, which after concentration under vacuum supplied

to the respective phases and the hydro alcoholic phase. The chloroform phase (6.0g) was

chromatographed in silica gel, eluted in n-hexane, chloroform and methanol, in an increasing

sequence of polarity. After this chromatographic process, 2.0g of the amorphous substance were

isolated, identified as being a mixture of sitosterol 3-O-D-glucopyranoside and stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside. The ethyl acetate phase (10g) after chromatography in column of sephadex

eluted with methanol supplied 1,5g of the kaempferol 3,7-di-O-α-L-ramnoside (dhiramnoside) and

Carvalho, P. R. C.

. . .


1,2g of kaempferol 3-O-β-D- (6” - E-p-cumaroil) glucopyranoside (tiliroside). The structures of the

substances were characterized through spectroscopic methods IV, 1D and 2D NMR and 13C (5).

Animals For the tests, were used swiss albino female mice (25–30 g), obtained from the Animal House of

Department of Antibiotics of the Federal University of Pernambuco, Brazil. The animals were

housed in cages with free access to food and water. All animals were kept under 12h light/dark

cycle (lights on at 6:00 am.). The animals were treated according to the ethical principles of animal

experimentation of COBEA (Brazilian College of Animal Experiments) Brazil and the norms of

the National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. The Animal

Studies Committee of the Federal University of Pernambuco approved the experimental protocols

(number 116/07). Sarcoma 180 and carcinoma of Ehrlich cells are maintained in the peritoneal

cavities of the swiss mice in the Laboratory of Experimental Pharmacology and Cancerology of the

Federal University of Pernambuco.

Cells The cytotoxicity of kaempferol 3,7-di-O-α-L-raminosideo (dhiramnoside), kaempferol 3-O-(6”-O-

E-p-cumaroil)-β-D-glucopyranoside (tiliroside) and mixture of sitosteryl-3-O-β-D-glucopyranoside

and stigmasteryl-3-O-β-D-glucopyranoside (GM) were tested against NCI-H292(carcinoma of

human lungs), HEp-2 (carcinoma epidermoid of human larynx) and KB (carcinoma of the mouth)

all obtained from the Bank of Cells, Rio de Janeiro, Brazil. The cells were grown in DMEM –

Minimum Essencial Medium Eagle modified Dulbecco’s- medium supplemented with 10% fetal

bovine serum, 2 mM glutamine, 100 µg/ml streptomycin, 100 Uml−1 penicillin at 37°C with a 5%

CO2 atmosphere.

Antitumor Activity of kaempferol 3,7-di-O-α-L-ramnoside (dhiramnoside), kaempferol 3-O-

(6”-O-E-p-cumaroil)-β-D-glucopyranoside (tiliroside) and mixture of sitosteryl-3-O-ββββ-D-

glucopyranoside and stigmasteryl-3-O-ββββ-D-glucopyranoside (GM).

Cell Proliferation Assays

The tumor cell growth was quantified by the ability of living cells to reduce the yellow dye 3-(4,5-

dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) to a purple formazan product

(10). A cellular suspension (105 cells/mL) was prepared and distributed in 96-well (225µL/well)

and incubated by 24h at 37°C. After that, tiliroside, dhiramnoside and GM were added. At the end

of incubation (72 h), the plates were centrifuged and the medium was then replaced by fresh

medium (200 µl) containing 25 µl of MTT. Three hours later, the MTT formazan product was

dissolved in 100 µl DMSO, and the absorbance was measured using a multiplate reader (10,11).

The drugs effects were quantified as the percentage of control absorbance of reduced dye at 595

nm. The tested concentrations were 10.0, 5.0, 2.5 and 1.25 µg/mL and the experiments were done

in triplicate.

Assay of Antitumor Activity and Histopathology Study Ten-day-old sarcoma 180 ascites tumor cells and carcinoma of Ehrlich tumor cells (5 × 10

6 cell 200

µl−1) were implanted subcutaneously into the right axillary region of the experimental mice. One

day after inoculation, tiliroside, dhiramnoside and GM (50 and 100 mg kg−1) or doxorubicin (2.0

mg kg−1) was dissolved in saline solution containing 5% tween 80 and administered

intraperitoneally for 7 days. The negative control was injected with vehicle. On day 8, the mice

were killed and the tumors were excised, weighed and fixed in 10% formaldehyde. The inhibition

ratio (%) was calculated by the following formula: inhibition ratio (%) = [(A − B)/A] × 100, where

A is the average tumor weight of the negative control, and B is the tumor weight of the treated

group (12).

Carvalho, P. R. C.

. . .


Histopathology Observations For histology, tissue samples (tumors, livers and kidneys) were fixed in 10% buffered formalin and

paraffin-embedded. Sections of 5 µm were stained with hematoxylin and eosin. The histopathology

analysis was performed using a video-microscope system MOTIC (BA200) with digital camera

MOTICAM (1000 1.3M, Pixel–USB 2.0).

RESULTS

Citotoxy activity

The in vitro activity of tiliroside, dhiramnoside and GM against three human tumor cell lines were

determined. However, all compounds assayed did not show cytotoxicity at the tested concentrations

(Table 1).

Table 1. In vitro Cytotoxicity of the dhiramnoside, tiliroside the mixture of sitosteryl-3-O-ββββ-D-

glucopyranoside and stigmasteryl-3-O-ββββ-D-glucopyranoside (GM) isolated of the Herissantia

crispa on tumor cell lines.

Cells line

CI50 (µg/mL) Compounds

KB NCI-H292 HEp-2

Dhiraminoside >10 >10 >10

GM >10 >10 >10

Tiriloside >10 >10 >10

Antitumoral activity

The effects of dhiramnoside, tiliroside and GM in mice transplanted with the tumor sarcoma 180

are shown in figure 1. On day 8, the average tumor weight in the sarcoma 180 was 1.35± 0.13g in

control mice and 0.64 ± 0.08 g in mice treated with tiliroside at the dose 50 mg kg-1day

-1 and

0.53±0.07g in mice treated with 100 mg kg-1day

-1. The inhibitions were significant for tiliroside in

both doses in relation to the control group (P < 0.05). The mixture of glycosides presented the

average tumor weight in the sarcoma 180 was 0.74±0.05g and 0.34±0.06g at the dose 50 and 100

mg kg-1day

-1, respectively. For dhiramnoside, the average tumor weight was 1.2±0.14 and 1.2±0.13

at the dose 50 and 100 mg kg-1day

-1, respectively (Figure 1A). The control drug doxorubicin

presented average tumor weight 0.61±0.17 in mice transplanted with sarcoma 180 tumor. As

tiliroside was isolated with good yields and presented a promising activity in sarcoma 180, we

selected it so as to continue the studies with the carcinoma of Ehrlich. The average tumor weight in

the carcinoma of Ehrlich was 1.75±0.13g in control mice and 1.49±0.09 g in mice treated with

tiliroside at the dose 50 mg kg-1day

-1 and

0.51±0.07g in mice treated with 100 mg kg

-1day

-1. The

doxorubicin in the dose of 2.0 mg kg-1day

-1 reduced tumor weight by 45,2% (0.74±0.2g), within the

same period (Figure 1).

Carvalho, P. R. C.

. . .


Sarcoma 180

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Control

Dhiramnoside 50mg/kg

Dhiramnoside 100mg/kg

Tiliroside 50 mg/kg

Tiliroside 100 mg/kg

GM 50 mg/kg

GM 100 mg/kg

Doxorubicin 2mg/kg

Tum

or weight (g)

Control Dhiramnoside 50mg/kgDhiramnoside 100mg/kgTiliroside 50 mg/kgTiliroside 100 mg/kgGM 50 mg/kgGM 100 mg/kgDoxorubicin 2mg/kg

A

*

*

* *

*

Carcinoma of Ehrlich

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Control Tiliroside50mg/kg

Tiliroside100mg/kg

Doxorubicin2mg/kg

Tumor weight (g)

Control

Tiliroside 50mg/kg

Tiliroside 100mg/kg

Doxorubicin 2mg/kg

B

* *

Figure 1. Effect of tiliroside, dhiramnoside and the mixture mixture of sitosteryl-3-O-ββββ-D-

glucopyranoside and stigmasteryl-3-O-ββββ-D-glucopyranoside (GM) in mice transplanted with

sarcoma 180 tumor (A) and carcinoma of Ehrlich (B). Data are presented as mean±SEM of

eight animals. * (P< 0.05) compared with control by ANOVA one-way followed by

Bonferroni.

Histopathology Observations

In the present study it was observed clearly that the animals treated with the tiliroside (100mg Kg-

1) had presented perivascular lymphocyte infiltration around the centrolobular vein and cells of

inflammatory infiltrate spreaded in some areas of the hepatic parenchyma (figure 1D); moreover, it

can also be observed changed in the glomerular morphology such as glomerular swelling

decreasing the urinary space (Figure 2 E), when compared with the respective controls (Figure 2B).

The structural characteristics of sarcoma 180 had disclosed in both tumors, (treated and

control groups), cells with ovoid formats, organized in a mantle with little stroma. In the tumors

treated with the tiliroside (100mg/kg), the histophatologic findings had been, in part, similar to

Carvalho, P. R. C.

. . .


m

m

m

g

*

*

* *

*

g

L

L

DDDD

L

AAAA

BBBB

V

V

EEEE

FFFF CCCC

those finding in the tumors not treated (controls), at which time we also observed adipose

subcutaneous tissue in the treated tumors (Figure 1F) and skeletal striated muscle in the tumors not

treated (Figure 2C).

Figure 2 - Photomicrography of organs (liver and kidneys) and tumor (Sarcoma 180) of mice

swiss. Animals control: A) Liver with centrolobular vein (v) around preserved hepatocytes

and capillaries sinusoides preserved. B) Kidney with glomerelus renals (*) and spaces

(arrows) without any alterations, C) Sarcoma 180 with muscular infiltration (m). Tiliroside-

treated animals: D) To notice areas of perivascular lymphocytic infiltration (L) and spread in

hepatic parenchyma, preserved hepatocytes and capillaries sinusoides. E) Renals glomerelus

(*) with reduction of the urinários spaces (arrows), F) Sarcoma 180 with greasy infiltration

(g). H.E.: 100X.

Carvalho, P. R. C.

. . .


Statistical Analysis Data are presented as mean ± SE. The differences between the experimental groups were compared

by analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni (P < 0.05) using the Origin 8.0 program.

N= 6 animals.

DISCUSSION The species of the Malvaceae family present several pharmacological properties. However, in the

genus Herissantia, only the species Herissantia tiubae has had previous phytochemistry and

pharmacological studies done and the Herissantia crispa has been described few phamacological

studies (5).

Tiliroside, dhiramnoside and GM did not show any significant in vitro cytotoxic effect at the

experimental exposure levels, but tiliroside and GM showed a promising in vivo antitumor effect.

In the preclinical anticancer drug-screening program used in this study, only the lead compounds

that presented IC50 values below 1 µgml−1 were considered as promising (13). All compounds

tested showed IC50 values greater than 10 µgml−1 for all tumor cell lines tested, suggesting that the

in vivo anticancer properties were not related to direct antiproliferative effects. Some compounds

isolated of Hisbiscos taiwanensis of the Malvaceae family had also not presented cytotoxic activity

in lines of human cells H.549 (carcinoma of lung) and NC5-7 (breast carcinoma) until the dose of

20 µg/mL (14). In previous studies, the tiliroside was tested in the tumor cell lines CCRF-CEM,

H33AJ-JA13, HUT-78, H9, NAMALWA, JIYOYE, CCRF-SB, K562, U937, and was active only

in CCRF-CEM and NAMALWA (15).

In the in vivo assays dhiramnoside did not inhibit the growth of sarcoma 180 in dose of 50 mg/kg

and 100mg/kg of weight. However, a significant reduction in the weight of the tumors was

observed for the tiliroside and GM dose of 100mg/kg. The percentage of inhibition of the tumoral

growth for the tiliroside in sarcoma 180 was of 52.7 and 60.5 in the doses of 50 and 100mg/kg of

weight, respectively. The mixture of glycosides also significantly inhibited the growth of sarcoma

180. Nevertheless, the effect of tiliroside and mixture of glycosides seems to be dose-dependent.

As tiliroside was isolated with good yields and presented a promising activity in sarcoma 180

tumor, we selected it so as to continue the studies with the carcinoma of Ehrlich. The tiliroside did

not inhibit the growth of the carcinoma of Ehrlich in the dose of 50 mg/kg, however in the dose of

100mg/kg of weight presented a 70.8% inhibition. This compound also presented results very

promising in the inhibition of the tumoral growth, whose the response it seems to be dose-

dependent. We do not find in literature previous studies of the tiliroside with animals tumors, as

well as this work it is the first description of the antitumor studies with tiliroside isolated from

Herissantia crispa.

Histology alterations observed in the organs analysed (liver and kidneys) under a biologically

active compound, such as tiliroside, identified from the phytochemical analysis of the Herissantia

crispa extract, alerted us as to the hepatic involvement as evidenced by the perivascular

lymphocytic infiltration and spread throughout the parenchyma, as well as the renal involvement

through the changed in the glomerular morphology such as glomerular swelling decreasing the

urinary space. Findings in literature suggest that the area of glomerular filtering could be

responsible for a deficiency in the ability to excrete sodium and water, important factors in the

genesis of primary arterial hypertension (16, 17). Antitumor studies in vivo of the compound

tiliroside and dhiramnoside could not be found in literature, seeing that the hystopathological

results presented represent, however, the first description of the structural constitution of organs

(liver and kidneys) and tumor (sarcoma 180) under a tiliroside activity.

Flavonoids have been identified as either simple or complex glycosides in plants. These poly

phenolic compounds and their sugar derivatives display a remarkable spectrum of biological

activities including antitumor (9). Furthermore, a flavonoid derivative flavopiridol has been found

Carvalho, P. R. C.

. . .


to inhibit cyclin-dependent kinases, induce apoptosis, suppress inflammation, and modulate the

immune response (18). Moreover, flavonoids are potent scavengers of reactive oxygen species and

thus prevent per oxidation of lipids (19). These compounds often exhibit a strong antioxidant

activity, notably due to the presence of hydroxyl groups and aromatic heterocyclic rings that

provide these molecules with hydrophilic and particular stability. Recent studies have also

indicated that flavonoids act as cellular modulators by interaction with enzymes, receptors, and

transcription factors of intracellular signalling cascades: understanding the role of flavonoids as

antioxidants and modulators of cell signalling could explain their potential as anticancer agents and

neurodegeneration inhibitors (20, 21).

In conclusion, among compounds tested, tiliroside exhibited anti tumor effects on experimental

tumors without an expressive toxicity. This activity seemed to be related to its anti-inflammatory

and antioxidant properties and not to the reduction of tumor proliferation rate. Moreover, further

studies are in progress to determine its mechanism of action.

Acknowledgments: This research was supported by CNPq. In addition, a part of this investigation

was supported by UFPE/PROPESQ in the form of fellowship awards. We thank Maria do Desterro

Rodrigues for technical assistance.

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Carvalho, P. R. C.

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ARTIGO 2 REVISTA QUIMICA NOVA

Carvalho, P. R. C.

. . .


STEROIDAL AND PHENOLIC COMPOUNDS FROM Sidastrum Paniculatum

(L.) Fryxell AND EVALUATION OF CITOTOXICITY AND ANTI-

INFLAMMATORY ACTIVITIES

José Marcílio Sobral Cavalcante; Tiago Bezerra de Sá de Souza Nogueira; Anna

Cláudia de Andrade Tomaz; Paulo Roberto Cavalcanti Carvalho; Silene Carneiro

do Nascimento; Teresinha Gonçalves-Silva; Maria de Fátima Vanderlei de

Souza*

Laboratório de Tecnologia Farmacêutica “Prof. Delby Fernandes de Medeiros”,

Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, Caixa Postal

5009, 58051-970, João Pessoa, PB, Brasil.

Laboratório de Bioensaios para Pesquisa de Fármacos, Departamento de

Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco 50670-901, Recife, PE, Brasil.

*e-mail: [email protected]

Carvalho, P. R. C.

. . .


STEROIDAL AND PHENOLIC COMPOUNDS FROM Sidastrum Paniculatum

(L.) Fryxell AND EVALUATION OF CITOTOXICITY AND ANTI-

INFLAMMATORY ACTIVITIES

Sidastrum paniculatum (L.) Fryxell belongs to the family Malvaceae and is

popularly known as “malva roxa” or “malvavisco”. The phytochemical study of the

hexane, CHCl3 and EtOAc phases from the crude extract of S. paniculatum led to

the isolation of six compounds: a β-sitosterol and stigmasterol mixture, m-

methoxy-p-hydroxy-benzoic acid, m-methoxy-p-hydroxy-benzaldehyde, N-trans-

feruloyltyramine and kaempferol-3-O-β-D-(6’’-E-p-coumaroyl) glucoside. The

structural identification of these compounds was made on the basis of

spectroscopic methods such as IR, NMR 1H and 13C with the add of two-

dimensional techniques (HOMOCOSY, HETCOR, HMQC, HMBC and NOESY),

besides comparison with literature data.

Keywords: Sidastrum paniculatum, Malvaceae, chemical compounds.

Carvalho, P. R. C.

. . .


INTRODUCTION

The species Sidastrum paniculatum (L.) Fryxell is a bush that belongs to the

family Malvaceae and is popularly known as “malva-roxa” or “malvavisco”. In

Brazil, the northeast region is probably the diversity core of the genus Sidastrum

since a great number of species can be found there.1

Previous phytochemical studies on species from Malvaceae have reported

the presence of steroids,2,3,4,5 phenols,3,4,6 flavonoids,3,4,5,7,8 triterpenes,2,6 essential

oils,9 alkaloids,10 sesquiterpenelactones,11 fatty acids,12,13,14,15 and pheophorbide.3

Aiming at contributing to the chemotaxonomic study of the family

Malvaceae and considering the absence of data in literature concerning the

chemical constitution of the genus Sidastrum, the species Sidastrum paniculatum

was submitted to a phytochemical study to isolate and identify its chemical

constituents, through usual chromatographic and spectroscopic methods, besides

comparison with literature data.

EXPERIMENTAL

General procedures

NMR spectra (HOMOCOSY, HETCOR, HMQC, HMBC and NOESY) were

measured in CDCl3, CD3OD and recorded on a Mercury Varian instrument

operating at 200 MHz and 50 MHz for 1H and 13C, respectively. The solvent signal

was used as internal standard. IR spectra were measured on a Perkin-Elmer, FT-

IR-1750 spectrometer in KBr pellets. Chromatography columns were carried out

on silica gel (Merck) and Sephadex LH-20 (Merck). TLC were performed on silica

gel PF254 plates and the spots were visualized under UV light (254 and 366 nm)

and by exposure to the iodine vapor.

Carvalho, P. R. C.

. . .


Plant material

The whole plant of S. paniculatum was collected in Pedra da Boca, in the

city of Araruna, State of Paraíba, on February 2004. The botanical identification

was made by Dr. Maria de Fátima Agra from the Botany section of Núcleo de

Pesquisa de Produtos Naturais of Laboratório de Tecnologia Farmacêutica (LTF)

and a voucher specimen was deposited at the Herbarium Prof. Lauro Pires Xavier

(JPB), Universidade Federal da Paraíba, under the code 6051.

Extraction and isolation

The plant material (10 kg) was subjected to dehydration in an oven in a

temperature of 40ºC for 72 hours; after that, it was grownded in a mechanical mill,

yielding 5.7 kg of a powder which was submitted to maceration with ethanol for

three consecutive days. This process was repeated until the maximum extraction

of the chemical constituents. The obtained ethanol extractive solution was

concentrated in a rotatory evaporator, yielding 500 g of crude ethanol extract

(CEE). The latter was suspended in ethanol:H2O (9:1) and successively partitioned

with hexane, CHCl3, EtOAc and n-butanol. 6.0 g of the hexane extract were

subjected to column chromatography packed with silica gel and eluted with

hexane, CHCl3, EtOAc and methanol. 69 fractions of 20 mL each were collected

and analysed and combined through analytical thin-layer chromatography (TLC).

The sub-fraction 37/42 (1.36 g) was rechromatographed on silica gel column

eluted with hexane, CHCl3 and methanol providing 15 sub-fractions which were

analysed and joined through analytical TLC. The sub-fraction 11/15 showed itself

as crystals, yielding 0.093 g of substance 1. The CHCl3 extract provided a

precipitate and a supernatant. 6.0 g of the latter were submitted to

Carvalho, P. R. C.

. . .


chromatography on a column packed with silica gel and eluted with hexane,

EtOAc and methanol, giving 239 fractions that were analysed and joined through

analytical TLC. 0.81 g of the sub-fraction 5/15 was rechromatographed on silica

gel column utilizing the above eluents, yielding 177 sub-fractions which were

combined and analysed through analytical TLC. The sub-fraction 26/57 (0.05 g)

showed itself as an amorphous solid, defined as substance 2. The sub-fraction

26/102, on the other hand, was rechromatographed following the previous

methodology, providing 96 sub-fractions of which the sub-fraction 43/56 was

recrystallized in chloroform and drops of methanol, yielding 0.025 g of the

substance 3. 0.15 g of the precipitate was submitted to preparative TLC, utilizing a

mixture of hexane:ethyl acetate (1:1) as eluent, resulting on the isolation and

purification of 0.021 g of substance 4. 3.0 g of the ethyl acetate extract were

subjected to chromatography column packed with Sephadex LH-20 and eluted

with methanol, providing 23 sub-fractions that were analysed and combined

through analytical TLC. The sub-fraction 12/16 (0.087 g) was rechromatographed

according to the above methodology, yielding 14 sub-fractions which were

analysed and combined through analytical TLC. The sub-fraction 5/8 (0.032 g)

was defined as substance 5.

Cells

The cytotoxicity of β-sitosterol and stigmasterol mixture was tested against

NCI-H292 (carcinoma of human lungs), HEp-2 (carcinoma epidermoid of human

larynx) and KB (carcinoma of the mouth) all obtained from the Bank of Cells, Rio

de Janeiro, Brazil. The cells were grown in DMEM – Minimum Essencial Medium

Eagle modified Dulbecco’s- medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 2

Carvalho, P. R. C.

. . .


mM glutamine, 100 µg/ml streptomycin, 100 Uml−1 penicillin at 37°C with a 5%

CO2 atmosphere.

Animals

For the tests, were used swiss albino female mice (25–30 g), obtained from

the Animal House of Department of Antibiotics of the Federal University of

Pernambuco, Brazil. The animals were housed in cages with free access to food

and water. All animals were kept under 12h light/dark cycle (lights on at 6:00 am.).

The animals were treated according to the ethical principles of animal

experimentation of COBEA (Brazilian College of Animal Experiments) Brazil and

the norms of the National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory

Animals. The Animal Studies Committee of the Federal University of Pernambuco

approved the experimental protocols (number 116/07). Sarcoma 180 and

carcinoma of Ehrlich cells are maintained in the peritoneal cavities of the swiss

mice in the Laboratory of Experimental Pharmacology and Cancerology of the

Federal University of Pernambuco.

Cell Proliferation Assays

The tumor cell growth was quantified by the ability of living cells to reduce

the yellow dye 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide

(MTT) to a purple formazan product (10). A cellular suspension (105 cells/mL) was

prepared and distributed in 96-well (225µL/well) and incubated by 24h at 37°C.

After that, the β sitosterol and stigmasterol mixture was added. At the end of

incubation (72 h), the plate was centrifuged and the medium was then replaced by

fresh medium (200 µl) containing 25 µl of MTT. Three hours later, the MTT

Carvalho, P. R. C.

. . .


formazan product was dissolved in 100 µl DMSO, and the absorbance was

measured using a multiplate reader27,28. The drugs effects were quantified as the

percentage of control absorbance of reduced dye at 595 nm. The tested

concentrations were 10.0, 5.0, 2.5 and 1.25 µg/mL and the experiments were done

in triplicate.

Statistical analysis

The experiments were analyzed according to the mean ± standard deviation

of the average (DPM) the percentage of inhibition of cell growth using the program

GraphPad Prism.

Anti-inflammatory activity

Air pouches were produced on the dorsal cervical region of mice (25-30 g)

by subcutaneous injection of 2.5 mL on day 0, followed by a second injection of

2,5 ml of sterile air 3 days later. Only day 6, carrageenan solution 1ml of a 1%

(w/v) was injected into the cavity. The compound and indometacin were

administered orally 1h before injection of carrageenan. After 6h, mice were

sacrificed, pouches were washed with 3 mL of saline solution containing 3 mM

EDTA, and number of migrated neutrophils determined, following staining with

Turk’s solution (0,01% crystal violet in 3% acetic cid) and counting performed

using a Neubauer haemocytometer17.

Carvalho, P. R. C.

. . .


RESULTS AND DISCUSSION

The structural assignments of compounds 1-3 and 5 were made based on

the spectral analysis and are in good agreement with those reported in the

literature. Thus, their structures were identified as the mixture of the steroids β-

sitosterol and stigmasterol (1),16 m-methoxy-p-hydroxy-benzoic acid (2),4,17 m-

methoxy-p-hydroxy-benzaldehyde (3)18 and kaempferol 3-O-β-D-(6’’-E-p-

coumaroil) glucopyranoside (5) (tiliroside).3,4,7 All of them are being reported here

for the first time in the genus Sidastrum. Compound 5 (tiliroside) was previously

isolated from Malvaceae species, for example Sida galheirensis,3 Bakeridesia

pickelli,4 Herissantia crispa.5 and Herissantia tiubae.7

The IR spectrum of compound 4 showed a large absorption band at 3300-

3350 cm-1 (N-H bending) and at 1658 cm-1 (C=O bending) suggesting an amide

function. The aromatic skeleton was evidenced by the absorptions between 1600

and 1450 cm-1.19 The 1H NMR spectra showed a pair of doublets at δ 6.68 and δ

6.96 (2H, J = 8.40 Hz), characterizing A,A′, B,B′-type aromatic hydrogens.20 It

showed yet a doublet at δ 6.74 (1H, J = 8.80 Hz) together with a large doublet at δ

6.93 (1H) and a large singlet at δ 6.90 (1H), characterizing ABX-type aromatic

hydrogens.

Those IR and 1H NMR data together with a pair of doublets at δ 6.16 and δ

7.37 (H-8, 7, J = 15.80 Hz) referring to trans olefinic hydrogens 7 and a pair of

triplets at δ 2.67 and δ 3.43 (H-7’, 8’), suggested the presence of the coumaroyl

and tyramine units, respectively. A methoxyl group in one of the aromatic nuclei

was inferred by the signal at δ 3.79.

The 13C NMR spectral data strengthened the information provided by the IR

and 1H NMR spectra, emphasizing the presence of the amide function due to the

Carvalho, P. R. C.

. . .


signal at δ 167.04 (α,β-unsaturated carbonyl) thus reinforcing the coumaroyl unit

because of the α,β-unsaturated carbons (C-8 and C-7) at δ 117.47 and δ 140.89,

respectively, as well as the tyramine unit whose methylene carbons were shown to

be at δ 34.41 (C-7’) and δ 40.89 (C-8’). The absorptions at δ 115.17 and δ 129.53

(2C, C-3’/5’ and C-2’/6’) corroborated the A,A′, B,B′ system, while a methoxyl

group was suggested by the signal at δ 55.56. Non-hydrogenated carbons bound

to oxygen groups were inferred by the signals at δ 147.20, δ 147.60 and δ 155.12.

The homonuclear correlation spectrum COSY showed coupling between δ

2.67 (H-7’) and δ 3.43 (H-8’) of the tyramine portion, and between at δ 6.16 (H-8)

and δ 7.37 (H-7) of the coumaroyl one.

The heteronuclear correlation spectrum HMBC confirmed the suggestion of

the α,β-unsaturated amide strengthening the presence of the coumaroyl and

tyramine units since it showed, respectively, two- and three-bond correlations

(2,3JCH) between C-1’ with H-7’ and H-8’, respectively, and 2JCH and

3JCH

correlations between the carbonyl carbon and H-8 and H-7, respectively (Figure

1).

Figure 1: Correlations observed at the HMBC spectrum of 4

CH

CH2

CH2NHCH1

234

5

67

8

2'

3'

4'

5'6'

7'8'

O

R1

R2

R3

J2J2

J3 J3

Carvalho, P. R. C.

. . .


N H

O H

H O H

O C H 3

O

The homonuclear correlation spectrum NOESY revealed the space coupling

between the methoxyl hydrogens with H-2, thus determining the meta position for

the methoxyl group in the coumaroyil portion of the molecule (Figure 2).

The other assignments of carbons and hydrogens were determined based

on all spectral data (Table 1) and on comparison with the literature ones,3,4,7

permitting to unambiguously identify substance 4 as being the N-trans-

feruloyltyramine (Figure 3), substance already isolated from other vegetal species

21,22,23,24 with studies demonstrating its action against weeds and improvement of

seed germination,25,26 being described for the first time in the family Malvaceae.

Figure 3: Substance 4 (N-trans-feruloyltyramine)

Figure 2: Coupling observed at the NOESY spectrum of 4

NH1

23

4

5

6 7

81'

2'

3'

4'

5'

6'7'

8'

O OH

HO

OCH3

9

Carvalho, P. R. C.

. . .


Table 1: 1H and 13C NMR data (δ, CDCl3, 200 and 50MHz) of compound 4

1H x 13C-HETCOR

1H x 13C-

HMBC

1H x 1H-

COSY

1H x 1H-

NOESY

C δC δH J2 J3

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1’

2’/6’

3’/5’

4’

7’

8’

OCH3

126.82

109.70

147.69

147.20

114.91

121.89

140.89

117.47

167.04

129.68

129.53

115.17

155.17

34.41

40.89

55.56

-

6.90(bs)

-

-

6.74(d, J=8.40Hz)

6.93(bd)

7.37(d, J=15.80Hz)

6.16(d, J=15.80Hz)

-

-

6.96(d, J=8.40Hz)

6.68(d, J=8.40Hz)

-

2.67(t, J=6.9Hz)

3.43(t J=6.9Hz)

3.79(s)

-

C-3

-

-

-

-

-

C-9

-

-

C-1’

C-2’/6’,C-4’

-

C-1’, C-8’

C-7’

-

-

C-6, C-7

-

-

C-1

-

C-9

C-1

-

-

C-4’

-

-

C-2’/6’

C-1’

-

-

-

-

-

-

-

H-8

H-7

-

-

-

-

-

H-8’

H-7’

-

-

OCH3, H-8

-

-

-

H-7

H-6

H-2

-

-

-

-

-

-

-

H-2

Carvalho, P. R. C.

. . .


Citotoxy activity

The in vitro activity of mixture β-sitosterol and stigmasterol against three

human tumor cell lines were determined however, the mixture assayed did not

show cytotoxicity at the tested concentrations (table 2).

Table 2. CITOTOXY ACTIVITY OF THE MIXTURE OF Β-SITOSTEROL AND

STIGMASTEROL

Cells lines

CI50 (µg/mL) Product

KB NCI-H292 HEp-2

Mixture of Β-sitosterol

and stigmasterol >10 >10 >10

The mixture of stigmasterol-sitosterolβ isolated from the kind of Sidastrum

paniculatum showed no activity cytotoxic in tumor cell lines of human KB, NCI-

H293 and Hep-2. According to the protocol of the National Cancer Institute (NCI-

USA), for all products from plants are considered active the IC50 should be less

than or equal to 30µg/mL.

The compound tested showed IC50 values greater than 10 µgml−1 for all

tumor cell lines tested. These values figure show that the product has low toxicity

tested cell, which is desirable in the case of anti-inflammatory drugs. It would also

appear that in some compounds isolated from the family Malvaceae Hisbiscos

taiwanensis also showed no activity cytotoxic in strains of human cells H.549

(carcinoma of the lung) and NC5-7 (breast cancer) to the dose of 20µg/mL28.

Carvalho, P. R. C.

. . .


The mixture of β-sitosterol of and stigmasterol showed significant

antiinflammatory activity when compared to the control group, inhibiting cell

migration induced by carrageenan by 30, 56,8 and 81,2% at doses of 10, 30 and

90 mg / kg of weight, respectively (Table 3).

The leukocytes polymorphonuclear of number that migrated to the

peritoneal cavity in the group control was 4,53 ± 0,8 and standard dexamethasone

was 0,90 ± 0,3 x 106 cells per well (p <0,05 for all doses).

TABLE 3. ATIVIDADE ANTIINFLAMATÓRIA

Product Doses PMN cells ± SD

(x106)/cavity

Inhibition (%)a

90 0,85±0,3 81,2

30 1,96±0,3 56,8

Mixture of ββββ-sitosterol

and stigmasterol

10 3,17±0,6 30,0

Dexametasona 3 0,90±0,3 80,2

Controle - 4,53± 0,8 -

PMNL = polymorphonuclear leucocytes;. PMNL count is expressed as total cell number by volume of exudate. Activity (%) was calculated considering the control group cells counting as 100%. aValues represent average ± standard desviation.

Carvalho, P. R. C.

. . .


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Carvalho, P. R. C.

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CONCLUSÃO

Carvalho, P. R. C.

. . .


7- CONCLUSÃO

Estudo Citotóxico

• Os glicosideos β-sitosterol+estigmasterol glicosilados, diraminosídeo e

tirilosídeo não apresentaram atividade citotóxica frente às linhagens

celulares KB, NCI-H292 e HEp-2.

Atividade Antitumoral

• O glicosideo tirilosídeo apresentou uma inibição significativa frente ao

sarcoma 180 e no carcinoma de Ehrlich, sugerindo, que a atividade seja

dose-dependente, sendo ainda confirmada com a administração de outras

doses;

• O diraminosídeo não inibiu o crescimento do Sarcoma 180;

• A mistura β-sitosterol+estigmasterol também apresentou uma inibição

significativa frente ao sarcoma 180, sugerindo que a atividade seja dose-

dependente.

Carvalho, P. R. C.

. . .


Histopatologia de tumores e órgãos.

• No estudo histológico dos órgãos analisados (fígado e rins) foi verificado

um comprometimento hepático pela evidenciação de infiltração linfocitária

perivascular e espalhada no parênquima, apresentando um

comprometimento renal pela acentuada redução da área de filtração

glomerular;

• No sarcoma 180 foi verificado em ambos os grupos (controle e tratado)

células com formatos ovóides, tecido adiposo subcutâneo e nos tumores

tratados com o tilirosídeo músculo estriado esquelético.

Atividade antiinflamatória

• Os glicosideos tirilosídeo, β-sitosterol+estigmasterol glicosilados e o

diraminosídeo apresentaram uma boa inibição na atividade antiinflamatória

quando comparados a Indometacina;

• Este estudo revelou que os produtos são uma alternativa promissora a ser

explorada para a ação antiinflamatória.

Carvalho, P. R. C.

. . .


Atividade analgésica

• Os glicosideos tirilosídeo, β-sitosterol+estigmasterol glicosilados e o

diraminosídeo apresentaram uma boa inibição na atividade analgésica;

• Este estudo revelou que os produtos são também uma alternativa

promissora a ser explorada para a ação analgésica.

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