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Reacção em Cadeia do Polimerase - PCR

Objectivos

Teve-se como objectivo extrair o DNA total (genómico e mitocondrial) a partir

de carne de vaca.

Pretendeu-se também amplificar e analisar fragmentos de DNA a partir de duas

amostras desconhecidas (A e B) de DNA genómico ou mitocondrial, usando como

técnica experimental a reacção em cadeia do polimerase (PCR) e procedeu-se à

identificação da composição das duas amostras.

Resumo

Extraiu-se e purificou-se o DNA total (genómico e mitocondrial) de uma

amostra de carne de vaca através de centrifugações sucessivas e precipitações

diferenciais. O DNA extraído foi, posteriormente, analisado espectrofotometricamente,

de modo a quantificá-lo e determinar o seu grau de pureza.

Através da técnica de PCR, amplificaram-se as amostras de DNA extraído da

carne de vaca e uma outra amostra de DNA extraído de batata, recorrendo ao Taq

DNA polimerase, aos primers específicos (de vaca e de batata) e aos

desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPs).

Para análise dos resultados experimentais procedeu-se a uma electroforese

em gel de agarose, na qual se analisaram, com os diferentes primers, as amostras

desconhecidas (A e B), com o marcador de massa molecular e respectivos controlos

positivo e negativo.

Concluiu-se que a amostra A correspondia ao DNA extraído de batata e a

amostra B ao DNA extraído da carne de vaca. Os resultados experimentais relativos

ao tamanho dos fragmentos e à distância de migração corresponderam aos resultados

esperados.

Salvado, Alexandra (40267); Lamy, Ana (40279); Sousa, Andreia (40261);

Paiva, Telmo (40243)

Licenciatura em Bioquímica

Bioquímica Experimental II, Turma nº 2, Grupo nº 1, DQB/FCUL

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1. Apresentação e Discussão de Resultados

1.1. Determinação in silico o tamanhos dos fragmentos esperados após

amplificação com os primers fornecidos

De forma a identificar qual das amostras pertencia ao DNA extraído de batata

e qual pertencia ao DNA extraído de vaca, determinaram-se os tamanhos dos

fragmentos esperados após amplificação com os primers específicos de carne de vaca

e de batata.

Deste modo, comparou-se a sequência dos primers com a sequência do

gene que se pretendia hidrolisar. Recorrendo-se à ferramenta Primer-Blast do NCBI,

introduziu-se a sequência do gene de batata (DQ185064) e a sequência do gene de

vaca (V00654), as respectivas espécies, Solanum tuberosum e Bos taurus,

respectivamente e os respectivos primers. Obteve-se que o fragmento do gene de

batata amplificado iniciava-se com o nucleótido da posição 420 até ao nucleótido da

posição 785, tendo uma sequência com 366 nucleótidos. O fragmento do gene de

vaca amplificado iniciava-se no nucleótido da posição 14210 até ao nucleótido da

posição 15960, tendo uma sequência com 1751 nucleótidos – Anexo A.

Como os fragmentos lineares de DNA migram a velocidades inversamente

proporcionais ao logaritmo de base 10 das suas massas moleculares, migra mais o

fragmento com menor número de nucleótidos. Assim, esperava-se que a amostra com

DNA extraído de batata migrasse mais em relação à amostra com DNA extraído de

vaca.

1.2. Quantificação e determinação do grau de pureza do DNA extraído

Após a extracção do DNA realizaram-se medições espectrofotométricas, de

modo a determinar a concentração de ácidos nucleicos em solução, quadro 1.2.1.

Quadro 1.2.1. Resultados da extracção de DNA

Grupos Abs260 nm Abs280 nm Abs325 nm Grau de pureza

[DNA]extraído/ ng μL-1

mDNA extraído/

ng

1 0,070 0,042 0,000 1,69 3,50 1750

2 0,117 0,074 0,000 1,58 5,80 2900

3 0,420 0,447 0,000 0,94 21,00 10500

4 0,082 0,054 0,000 1,53 4,10 2050

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Sabendo que 1 OD corresponde a, aproximadamente, 50 μg/mL de DNA de

cadeia dupla, utilizou-se a concentração de DNA extraído, indicada directamente pelo

espectrofotómetro, para calcular a massa de DNA extraído. Considerou-se o volume

de solução 500 μL, dado que no final do processo de extracção se dissolveu o DNA

neste volume de tampão TE. Exemplifica-se para o grupo 1, tendo-se procedido de

modo semelhante para os restantes:

Relativamente à determinação do grau de pureza das amostras de DNA

extraído, este é calculado através da razão

. Considera-se que uma amostra

pura apresenta um grau de pureza entre 1,8 e 2,0.

Como o DNA extraído pelos grupos apresentava um grau de pureza inferior a

1,8, pode considerar-se que as amostras se encontravam contaminadas com

proteínas e fenol.

Os valores de absorvência a 325 nm foram, aproximadamente, zero, podendo-

se concluir que não existiam partículas em suspensão na cuvette e que esta não

apresentava sujidade.

1.3. Cálculo do tamanho dos fragmentos amplificados experimentalmente

(in vitro) por PCR para cada reacção com diferentes pares de primers,

usando o marcador de massa molecular

~

Legenda:

VA – primers de vaca; amostra A VB – primers de vaca; amostra B VC – primers de vaca (controlo negativo) BA – primers de batata; amostra A BB – primers de batata; amostra B BC – primers de batata (controlo negativo) CV – controlo positivo (DNA da vaca) CB – controlo positivo (DNA da batata)

M – marcador de massa molecular

Figura 1.3.1. Electroforama obtido

VA VB VC

VB

BA

VB

BB

VB

BC

VB

VA VB VC

VB

BA

VB

BB

VB

BC

VB

Grupo 1 Grupo 2

VA VB VC

VB

BA

VB

BB

VB

BC

VB

VA VB VA BA

VB

BB

VB

BC

VB

CV CB

Grupo 4 Grupo 3

M

VB

M

VB

CV CB

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Pela figura 1.3.1, na qual se observa apenas as bandas correspondentes aos

fragmentos de DNA extraído de carne de vaca e de batata amplificados pela técnica

de PCR, verifica-se que não se formaram produtos inespecíficos. As bandas que

migraram mais correspondem aos fragmentos que surgiram da dimerização dos

primers.

Esperava-se que no controlo negativo não fosse visível qualquer banda, pois

estes tubos continham os mesmos componentes que os restantes, excepto as

amostras A e B de DNA, que foram substituídas por água. Desta forma, como não

continham as cadeias molde de DNA, não se esperava que ocorresse amplificação

através de PCR.

As bandas que se observam nos poços em que ambos os controlos negativos

foram colocados (VC e BC) correspondem à dimerização dos primers, com excepção

do grupo 1. Para este grupo, no poço correspondente ao controlo negativo contendo

os primers de batata (BC) observa-se uma banda mais intensa do que para os

restantes grupos e com menor massa. Se este resultado correspondesse ao controlo

negativo, deveria verificar-se a presença desta banda em todos os poços. Por outro

lado, não se esperava o aparecimento de alguma banda neste poço. Desta forma,

pode-se inferir que poderá ter ocorrido uma troca de tubos e o contéudo do tubo

contendo os primers de batata e a amostra B foram colocados neste poço.

Após a revelação do electroforama verificou-se que o marcador não formou

bandas características, não podendo ser utilizado para calcular o comprimento dos

fragmentos amplificados figura 1.3.2.

Figura 1.3.2. A figura da esquerda corresponde ao poço do marcador (poço 6) na parte superior do gel de

electroforese. A figura do meio corresponde ao poço do marcador (poço 6) na parte inferior do gel de electroforese. Marcador NZY DNA Ladder IV, com as respectivas bandas de referência (lado direito, não está à escala das figuras experimentais).

Deste modo, os docentes forneceram um marcador e um controlo positivo com

produto específico de vaca e de batata, figura 1.3.3.

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Figura 1.3.3. A figura da esquerda corresponde ao gel fornecido pelos docentes. Legenda: M – marcador

de DNA Generuler 1 kb[1]

. 1. Produto específico de vaca. 2. Produto específico de batata. A figura da direita corresponde ao marcador com as respectivas bandas de referências.

Para se poder fazer comparações, sobrepôs-se no electroforama o marcador e

os controlos positivos, figura 1.3.4.

Figura 1.3.4. Electroforama com o marcador e controlos positivos (CV – 1 e CB – 2) fornecido pelos

docentes.

Para o cálculo do tamanho dos fragmentos amplificados experimentalmente (in

vitro) por PCR, procedeu-se inicialmente à medição da distância, em mm, desde o

bordo frontal do poço a cada uma das bandas constituintes do marcador, Anexo B.

Registaram-se esses valores no quadro 1.3.2.

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Quadro 1.3.2. Distâncias de migração das bandas do marcador

dmigração/ mm

SM/ bp log10 SM/ bp G1 G2 G3 G4

10000(1) 4,0000(1) 7(1) 7(1) 7(1) 8(1)

8000(1) 3,9031(1) 8(1) 8(1) 8(1) 9(1)

6000(1) 3,7782(1) 9(1) 9(1) 9(1) 10(1)

5000(1) 3,6990(1) 10(1) 10(1) 10(1) 11(1)

4000 3,6021 11 11 11 12

3500 3,5441 12 12 12 13

3000 3,4771 14 14 14 15

2500 3,3979 15 15 15 16

2000 3,3010 17 17 17 19

1500 3,1761 20 20 20 22

1000 3,0000 25 25 25 27

750 2,8751 28 28 28 31

500 2,6990 31 31 31 35

250 2,3979 36 36 36 40 Observação: SM - tamanho das bandas do marcador.

(1) Valores desprezados para a construção das curvas de calibração.

Com os valores do logaritmo de base 10 do tamanho das bandas do marcador

e com as distâncias de migração, em mm, para cada ensaio, um por cada grupo,

construíram-se duas curvas de calibração, figura 1.3.5, pois os valores das distâncias

dos grupos 1, 2 e 3 foram iguais. Desprezaram-se alguns dos valores na construção

das curvas de calibração para se obterem rectas de calibração melhor ajustadas.

Figura 1.3.5. 1 - Curva de calibração para os ensaios dos grupos 1, 2 e 3 (à esquerda). 2 - Curva de calibração para o ensaio do grupo 4 (à direita).

As curvas de calibração são do tipo , onde , corresponde ao

logaritmo decimal do tamanho das bandas do marcador (bp), , ao declive, à

distância de migração (mm) e corresponde à ordenada na origem.

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Para a medição das distâncias de migração utilizou-se o electroforama

fornecido pelos docentes para medir as distâncias do marcador e dos controlos

positivos de vaca e de batata, quadro 1.3.3. Experimentalmente, o controlo positivo de

vaca migrou como esperado. No entanto, optou-se por medir pelo electroforama

fornecido para se diminuir os erros associados à sobreposição dos electroforamas

diferentes.

Quadro 1.3.3. Distância de migração dos fragmentos amplificados em cada poço

dmigração/ mm

Poços G1 G2 G3 G4

VA — — — —

VB 19 — — 23

VC — — — —(2)

BA —(3) 34 — —

BB — — 36 —

BC 34 — — —

CV 19 18 19 22

CB 34 34 36 38 Observação:

(2) Neste grupo corresponde a VA.

Com estes resultados, pode-se concluir que a amostra B corresponde ao DNA

extraído da carne de vaca. Pelo quadro 1.3.3, verifica-se que as distâncias de

migração da banda dos poços VB, que continham primers de vaca e a amostra B, para

os grupos 1 e 4, foram, aproximadamente, iguais às distâncias de migração das

bandas dos controlos positivos CV, que continham DNA extraído da carne de vaca.

Este resultado permite afirmar que nos tubos correspondentes a estes poços, o Taq

polimerase amplificou os fragmentos de DNA extraído de carne de vaca utilizando os

primers de vaca.

A amostra A corresponde ao DNA extraído de batata. Pelo quadro 3, verifica-se

que as distâncias de migração da banda dos poços VA, que continham primers de

batata e a amostra A, para os grupos 1, 2 e 3, foram, aproximadamente, iguais às

distâncias de migração das bandas dos controlos positivos CB, que continham DNA

extraído de batata. Por este resultado pode-se concluir que os tubos que continham o

conteúdo dos poços BC e BA foram trocados, como sugerido. Neste caso, o Taq

polimerase amplificou os fragmentos de DNA extraído de batata utilizando os primers

específicos.

A partir destes valores e das curvas de calibração respectivas, calcularam-se

os tamanhos dos fragmentos amplificados (SF). Exemplificam-se os cálculos para o

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ensaio do grupo 1. A equação da recta de calibração é (Eq.

1.3.1), onde e .

(Eq. 1.3.2)

Exemplifica-se para o poço 2 do ensaio do grupo 1, dmigração = 19 mm

Para os restantes ensaios procedeu-se de forma semelhante obtendo-se os

resultados do quadro 1.4.1.

1.4. Verificação se os tamanhos dos fragmentos obtidos estão de acordo

com o esperado pela análise in silico realizada anteriormente

Quadro 1.4.1. Tamanho dos fragmentos amplificados das amostras por PCR

Grupos Poços dmigração/ mm SF/ bp

1 VB 19 1711

BC 34 352

2 BA 34 352

3 BB 36 285

4 VB 23 1402

Comparando-se os resultados do quadro 1.4.1 e com a análise in silico

realizada anteriormente, pode-se concluir que os resultados experimentais

corresponderam aos resultados esperados. Verifica-se que os fragmentos

amplificados das amostras de DNA extraído da carne de vaca migraram menos que os

de batata.

Verificou-se que os fragmentos do poço BB (grupo 3) migraram mais, em

relação aos fragmentos dos poços BC e BA (grupos 1 e 2, respectivamente).

Os fragmentos dos poços BC e BA tiveram a mesma distância de migração,

obtendo-se o mesmo valor de tamanho dos fragmentos.

Podem ter ocorrido erros associados à medição e por se ter sobreposto a

imagem do electroforama com o marcador e com a dos marcadores positivos do gel

fornecido pelos docentes no electroforama experimental.

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2. Conclusão

Pelos resultados experimentais, pode-se concluir que a amostra B continha a

sequência amplificada do gene da vaca e a amostra A continha a sequência

amplificada do gene da batata.

Verificou-se que a distância de migração das amostras era inversamente

proporcional ao tamanho dos fragmentos, como esperado.

Apesar dos erros experimentais, estes resultados estão em concordância com

os resultados esperados.

Para se diminuírem os erros associados a este trabalho, poderia ter-se

realizado outra electroforese com as mesmas amostras e outro marcador.

3. Referências

[1] www.fermentas.com/en/products/all/dna-electrophoresis/generuler-dna-

ladders/sm0313-generuler-1kb, consultado a 15 de Maio de 2012;

Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and

StruhlK. Eds. 1995. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons,

Inc.,Chichester, NY, Brisbane, Toronto, Singapore, pp 2.5.1-2.5.9;

Nelson, D., Cox, M. (2008), Lehninger, Principles of Biochemistry, Fifth Edition,

W. H. Freeman and Company, New York;

Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning. A

Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New

York, pp 6.3-6.20;

Protocolo fornecido pelos docentes 2011/2012.