Pectinases

Enzimas PECTINASES

Patrícia Poletto

Substâncias pécticas

Protopectina - insolúvel Ácido péctico - sem grupos esterificados Ácido pectínico - 0 a 75% de grupos esterificados Pectina - mínimo de 75% de grupos esterificados

Representação da estrutura da parede celular de plantas .

Sharma et al. (2012). Rev. Environm. Sci. Biotechnol. 12: 45–60. Jayani et al. (2005). Process Biochem. 40:2931–2944. Pedrolli et al. (2009). Open Biotechnol. J. 3: 9-18.

INTRODUÇÃO

Enzimas Pectinolíticas

•Pectina Liase •Exo - poligalacturonase •Endo - poligalacturonase

Despolimerizantes

• Pectina esterase Desmetoxilante

INTRODUÇÃO

Mecanismo de ação das principais enzimas encontradas nas preparações pectinolíticas. Fonte:http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/ inajam/pdf/jam01.pdf

Enzimas Pectinolíticas INTRODUÇÃO

Sucos de frutas

Maceração

Despectinização

Aumento na extração, liberação de aromas e antioxidantes

Clarificação, redução de viscosidade e aumento na estabilidade

Grassin, C.; Fauquembergue, P. (1996). Progress in Biotechnology, 14:453-462. Sandri et al. (2011). LWT – Food Science and Technology, 44: 2217-2222.

Nur ‘Aliaa et al. (2011). Journal of Food Process Engineering, 34: 1523-1534.

INTRODUÇÃO

Aplicação das pectinases no processamento de sucos de frutas

Despectinização de suco de maçã: hidrólise da pectina gera agregação de partículas Fonte: http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/inajam/pdf/jam01.pdf .

Pinelo et al. (2010). Food and Bioproducts Processing, 88:259-265. Kashyap et al. (2001). Bioresource Technology, 77:215-227.

INTRODUÇÃO

Viscosidade

Turbidez Clarificação

INTRODUÇÃO

Brasil

Aplicação das pectinases no processamento de sucos de frutas

Ibravin Produção de suco

de uva - 2013

33 milhões de litros

Dosagem - 3 g de enzima por 100 kg

de fruta

1 tonelada de enzimas

Microrganismos produtores de pectinases

Anvisa: Aspergillus awamori , Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Penicillium simplicissium, Rhizopus oryzae, Trichoderma reesei.

RESOLUÇÃO ANVISA Nº 26, DE 26 DE MAIO DE 2009

FDA – GRAS (generally recognized as safe)

INTRODUÇÃO

Enzima Microrganismo Empresa produtora

Pectinex Ultra SP-L Aspergillus aculeatus Novozymes

Pectinex Ultra Clear Aspergillus aculeatus

Aspergillus niger Novozymes

Pectinex Ultra Color Aspergillus aculeatus


Pectinex Ultra Mesh Aspergillus aculeatus


Novozym 33095 Aspergillus aculeatus


Rohapect 10L Aspergillus niger Rŏhm Enzyme

Rapidase Vino super L Aspergillus niger DSM

Rapidase Adex-D Aspergillus sp DSM

Cultivo

Submerso

Novozymes. (2013). Enzymes at work. http://www.novozymes.com/en/about-us/brochures/Documents/Enzymes_at_work.pdf

Cultivo em estado sólido (CES) Cultivo submerso (CSm)

Meio apresenta ate 80% de umidade; as hifas são

expostas ao ar podendo ser ressecadas

Meio é geralmente solubilizado em água; as hifas se

mantêm hidratadas

Baixo risco de contaminação devido à baixa

atividade de água O risco de contaminação é maior

Espessura do meio dentro do reator é pequena

(baixo volume de ocupação) Geralmente o volume útil do reator é ocupado

Substrato sólido fornece nutrientes Os nutrientes estão dissolvidos no meio líquido

O2 é livremente disponível na superfície da partícula A disponibilidade de O2 pode ser controlada

razoavelmente bem

Ocorrem gradientes de temperatura, pH e umidade

ao longo do cultivo (difícil controle)

Os parâmetros pH e temperatura são geralmente

controlados ao longo do cultivo

Movimento das partículas do substrato sólido pode

causar impacto e danos severos ao microrganismo

Agitação dos biorreatores, geralmente proporciona

ambiente de baixo cisalhamento

Problemas causados por inibição são baixos Inibição por substrato e produto são mais frequentes

INTRODUÇÃO

Prabhakar et al. (2005). Malaysian J. Microbiol. 12: 10-16.

Hölker & Lenz (2005). Curr. Opin. Microbiol. 8: 301-306.

INTRODUÇÃO

Biorreatores utilizados em cultivo em estado sólido

Mitchell et al. (2006). Solid-state fermentation bioreactors. Fundamentals of design and operation. Springer-Verlag Berlin

INTRODUÇÃO

pH

Umidade

Temperatura

Aeração

Espessura do meio

Agitação

Produção de enzimas pectinolíticas por CES – Efeito dos parâmetros operacionais

INTRODUÇÃO

pH

Umidade

Temperatura

Aeração

Espessura do meio

Agitação

Não sofre controle durante o cultivo Ajuste-se o valor no início do cultivo

Berovič & OstroveršniK (1997). J. Biotechnol. 53: 47-53.


INTRODUÇÃO

pH

Umidade

Temperatura

Aeração

Espessura do meio

Agitação

T aumenta até 20oC acima da T de incubação Gradientes de temperatura de 3 a 5oC

Diminuição do crescimento e formação de produto Desnaturação do produto

Limita a espessura do meio

Thomas et al. (2013). Biochem. Eng. J. 81: 146-161. Meien et al. (2004). Chem. Eng. Sci. 59: 4493-4504.

Chen et al. (2005). Biochem. Eng. J. 23: 117-122.


INTRODUÇÃO

pH

Umidade

Temperatura

Aeração

Espessura do meio

Agitação

Limita o crescimento e o metabolismo Altos níveis reduzem a porosidade do meio

Pandey, A. (2003). Biochem. Eng. J. 13: 81-84.

Demir & Tari, (2014). Ind. Crops Prod. 54: 302-309.


INTRODUÇÃO

pH

Umidade

Temperatura

Aeração

Espessura do meio

Agitação

Fornecer O2 para o metabolismo Remover CO2, calor e vapor de água

Otimização do fluxo de ar empregado

Rodríguez-Fernández et al. (2011). Bioresour. Technol. 102: 10657-10662. Kalogeris, et al. (2003). Bioresour. Technol. 86: 207-213.


INTRODUÇÃO

pH

Umidade

Temperatura

Aeração

Espessura do meio

Agitação

Fator limitante em grandes escalas devido ao acúmulo de calor

Thomas et al. (2013). Biochem. Eng. J. 81: 146-161. Mitchell et al. (2006). Solid-state fermentation bioreactors.

Fundamentals of design and operation. Springer-Verlag Berlin Heidelberg.


INTRODUÇÃO

pH

Umidade

Temperatura

Aeração

Espessura do meio

Agitação

Contínua ou intermitente Agitações intensas podem causar danos ao micélio

Rodríguez-Jasso et al. (2013). Food Bioproduc. Process. 91: 587-594. Gasiorek (2008). Chem. Pap. 62: 141-146.

Demir & Tari (2014). Ind. Crops Prod. 54: 302-309.


Recuperação, concentração e purificação de enzimas

Fluxograma das etapas do processo de recuperação das enzimas (downstream processing) (Adaptado de Lima et al., (2001). Biotecnologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos).

INTRODUÇÃO

Métodos de concentração de enzimas

Liofilização Sais presentes na solução inicial são concentrados. Enzima na forma de

pó é muito mais estável.

Membranas de separação

Processo rápido e apresenta altos níveis de recuperação.

Evaporação 30-40°C, alto consumo energético.

Precipitação Precipitação por solvente ou por sais.

Pequena escala.

INTRODUÇÃO

Pessoa Jr, A. Kilikian, B.V. (2005). Purificação de produtos biotecnológicos. Manole. São Paulo.

Separação por membranas em biotecnologia

Caraterísticas dos processos de microfiltração e ultrafiltração.

Vantagens: - Não requer altas temperaturas; - sem adição de produtos químicos; Desvantagem: - necessidade de pré-tratamento.

Processos Força Motriz Tamanho de poro

Aplicações

Microfiltração Pressão (0,1 – 2 bar) 0,1–10 µm Remoção de microrganismos, clarificação

Ultrafiltração Pressão (1 - 7 bar) 1–100 nm Concentração de macromoléculas

Mulder, M. (1996). Basic Principles of Membrane Technology. 2.ed. Kluwer Academic Publishers, USA. Habert, A.C. e t al (2006) Processos de Separação com Membranas. Rio de Janeiro: E-papers.

INTRODUÇÃO

Formulação das preparações enzimáticas

Extrato enzimático concentrado Aditivos

INTRODUÇÃO

Influência do glicerol na estrutura e na estabilidade das enzimas: hidratação preferencial em torno da superfície da enzima promove compactação e aumenta a estabilidade da estrutura.

Kumar & Venkatesu, (2012) Chem. Rev. 112: 4283-4307.

Evitar crescimento microbiano e conservar a atividade ao longo do período de estocagem

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