PEDRO VICENTE MICHELOTTO JÚNIOR

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANAacute

PEDRO VICENTE MICHELOTTO JUacuteNIOR

EFEITOS DO DESAFIO AMBIENTAL E DO EXERCIacuteCIO NA FUNCIONALIDADE

DOS MACROacuteFAGOS DO LAVADO BRONCOALVEOLAR DE CAVALOS PURO

SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA

CURITIBA

2010





Tese apresentada ao Curso de Poacutes-

Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular

aacuterea de concentraccedilatildeo Fisiologia Setor de

Ciecircncias Bioloacutegicas Universidade Federal do

Paranaacute como requisito parcial agrave obtenccedilatildeo do

tiacutetulo de Doutor em Fisiologia

Orientadora Profa Dra Anita Nishiyama

CURITIBA

2010

A mente que se abre a uma nova ideacuteia

jamais voltaraacute ao seu tamanho

original

Albert Einstein

Obrigado Senhor por na dificuldade

carregar-me no colo pela Sua

presenccedila constante mesmo nos

momentos mais tranquumlilos e por

conceder-me mais esta benccedilatildeo

DEDICATOacuteRIA

Este trabalho eacute dedicado agrave minha esposa Ana

Luacutecia e aos meus filhos Joatildeo Pedro e

Bernardo com todo o meu amor

Aos cavalos por me ensinarem tanto

AGRADECIMENTOS

A Deus por permitir-me concluir mais esta etapa em minha vida

A minha esposa Ana Luacutecia e meus filhos Joatildeo Pedro e Bernardo que estiveram ao

meu lado desde o iniacutecio desta jornada souberam me dar tranquumlilidade e muito amor aleacutem de levarem pizza no laboratoacuterio nos dias de experimento

Aos meus pais Pedro Maria Luis e Zelma pelos exemplos que vocecircs satildeo e por todo o amor e apoio em todos os momentos

Aos meus irmatildeos Marcus e Andreacute cunhados Cristine Dani e Luiz Gustavo sobrinhas Mariana e Juacutelia pela amizade e torcida

A minha orientadora Profa Dra Anita Nishiyama sobretudo pela amizade e incentivo sendo orientadora nos momentos certos sempre com muita competecircncia

Aos meus colegas meacutedicos veterinaacuterios e amigos Alessandro Mercadante Daniel Mendes Campos Fernando Perche e Luis Henrique Costa pelo apoio prestado na execuccedilatildeo deste trabalho permitindo a avaliaccedilatildeo de potros sob sua

responsabilidade

Aos estabelecimentos que me apoiaram e suas equipes de funcionaacuterios sempre

prestativos Haras Belmont Haras Cifra Haras Santa Rita da Serra Haras dos Girassoacuteis Haras Palmerini Haras Santareacuten

Aos treinadores que me apoiaram permitindo a avaliaccedilatildeo dos potros sob sua responsabilidade extensivo agraves suas respectivas equipes de funcionaacuterios Fernando Azevecircdo Beto Feltran Gladston Santos J Ceacutesar A A Farias Marcus Lanza

Agrave incansaacutevel equipe de colheitas de lavado broncoalveolar que em momento algum deixou de madrugar nos 22 experimentos conduzidos Lorena Andrade da Cruz

Renata Schaefer Liacutevia Medalha Arauacutejo Amine do Vale Meira Fabiana Tieme da Silva Mariana Muumlller da Silva Aline Bonfaacute Richard

A maravilhosa equipe da qual tive a felicidade de conhecer e trabalhar Luis Alexandre Muehlmann MS Fernanda Ceccon Grando MS Ana Luacutecia Zanatta Carolina Farias Gabriela Rubbo Eloyse Bieberbach Ana Claacuteudia e Victor Vocecircs

me deram a amizade e o prazer de trabalhar com vocecircs me ensinaram muito e valorizaram o verdadeiro sentido de equipe com simplicidade determinaccedilatildeo e muita competecircncia

Aos amigos do Laboratoacuterio de Metabolismo Celular da UFPR companheiros de poacutes-graduaccedilatildeo de duacutevidas de buscas pelas respostas de risadas e de conquistas

muito obrigado pela amizade ajuda e muita paciecircncia Fabiacuteola Eacuteverson Ricardo Carine Loli Sandro Gleisson Marcelo Jaison Isabela Diogo Paulo Dalton Gina Daniele Pequito

Ao Prof Dr Luiz Claacuteudio Fernandes pela inestimaacutevel oportunidade de poder

trabalhar no seu laboratoacuterio disponibilizando material necessaacuterio e seu tempo quando o solicitei

A minha amiga e soacutecia meacutedica veterinaacuteria MS Cassiana Maria Garcez Ramos

Aos meus amigos da Direccedilatildeo do Curso de Medicina Veterinaacuteria da PUCPR Profa

Dra Claacuteudia Turra Pimpatildeo e Prof Rodrigo Taacutevora Mira por todo o apoio incentivo e amizade incondicionais

Aos amigos professores da PUCPR Rita M Rocha Denise Kozemjakin Antonia Maria Marconi Farias pelo apoio

Ao Decano do Centro de Ciecircncias Agraacuterias e Ambientais da PUCPR Prof Dr Sylvio Peacutellico Neto pelo apoio e incentivo

Ao Professor Metry Bacila por tantos exemplos demonstrados e por nunca haver se omitido em ajudar e entusiasmar

As bibliotecaacuterias da UFPR pela ajuda e tambeacutem da PUCPR Lucieli e Teresinha e equipe

A amiga Monica Echeverria pela amizade e apoio no inglecircs nesta e em muitas outras oportunidades Thank you

Ao Laboratoacuterio Fort Dodge pelo apoio me fornecendo os sedativos e pela dedicaccedilatildeo dos competentes profissionais Alessandra Carol e Leonardo que sempre estiveram dispostos a ajudar

Ao amigo Nilton Reis companheiro de trabalho na Unidade Hospitalar para Equinos da PUCPR pelo apoio

Aos amigos do Regimento de Poliacutecia Montada Coronel Dulciacutedio pela amizade e apoio durante esta etapa Coronel Heraldo Reacutegis Boacuterio da Silva Major Lorival da

Cunha Sobrinho Major Maacutercio Luis Fonseca Capitatildeo Adilar Marcelo de Lima e agrave equipe do Centro Veterinaacuterio da PMPR Sargento Faacutetima Sd Manasseacutes e demais amigos

SUMAacuteRIO

LISTA DE ABREVIATURAS IX

LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES XI

LISTA DE TABELAS XV

RESUMO XVI

ABSTRACT XVII

1 INTRODUCcedilAtildeO 18

11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 18

12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA) 18

13 PAF E VIAS AEacuteREAS 23

14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS 27

15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO 29

16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE) 34

2 OBJETIVOS 40

21 OBJETIVOS GERAIS 40

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS 41

31 REAGENTES E SEDATIVOS 41

32 ANIMAIS 41

33 ASPECTOS EacuteTICOS43

34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA 43

35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS 43

36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) 45

37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA46

38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957) 47

39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS 48

310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE CA++

EM PMNS INDUZIDO POR PAF

(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE ET AL 2001) 48

311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)51

312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR E MARLETTA 1985) 51

313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA

(NOUROOZ-ZADEH ET AL 1994)52

314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984) 53

315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA ET AL 1998) 54

316 PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR

(DYRYNDA ET AL 1998) 54

317 PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO

ALVEOLAR (PICK E MIZEL 1981) 55

318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN E GORDON 1987) 56

319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 57

4 RESULTADOS 59

41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO 59

411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica59

412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas 60

413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT) 61

414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA) 62

415 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem Diferencial de Ceacutelulas do LBA 62

416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF 63

417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF 65

418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA 67

419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA 68

4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA 69

4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA 70

4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA 71

4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar 72

4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar 73

4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar 74

42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO 75

421 Contagem do Nuacutemero Total de Ceacutelulas Nucleadas (NTCN) e Contagem

Diferencial de Ceacutelulas do LBA 75






427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-) 80


5 DISCUSSAtildeO 83

6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS 96

7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 97

LISTA DE ABREVIATURAS

ACVIM American College of Veterinary Internal Medicine

AT Aspirado traqueal

CN Grupo Condiccedilotildees Naturais

DA Grupo Desafio Ambiental

DIVA Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas

DIVAI Doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores

DPOC Doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica

EX Grupo Exerciacutecio

HAIE Hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio

HPIE Hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio

HRPO Horse radish peroxidase

IFN-γ Interferon gama

IL-1 Interleucina-1

IL-4 Interleucina-4

IL-8 Interleucina-8

IL-9 Interleucina-9

IL-17 Interleucina-17

LBA Lavado broncoalveolar

L-NAME N-nitro-L-arginina metil ester

LTB4 Leucotrieno B4

LTE8 Leucotrieno E8

MLCP Myosin light chain phophatase

NO Oacutexido niacutetrico

NOS Oacutexido niacutetrico sintase

NTCN Nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas

ORVA Obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas

PAF Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria

PAF-AH Fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria acetilhidrolase

PAF-R Receptor de fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria

PBS Soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada

PMA Phorbol myristate acetate

PMN Polimorfonuclear

PRS Phenol red solution

PSI Puro sangue inglecircs

RNS Espeacutecie reativa do nitrogecircnio

ROS Espeacutecie reativa do oxigecircnio

SOD Superoacutexido dismutase

Th2 Linfoacutecitos T helper 2

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES

FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE 20

FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO SN-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL 24

FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM

RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS 25

FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E

SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE 30

FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA

ASMA 31

FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS 32

FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO

A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35

FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR

(BAC) 36

FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO

DERSKEN et al (2009) 38

QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA

FARINGE 44

QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS

ARITENOacuteIDES DE I A IV 44

FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME

ENDOSCOacutePICO 45

FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO

DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO

REGISTRADA A 510 nm 50

FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA

ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 57

FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA

AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 63

FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS

DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF

BN52021 64

FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR

NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO

ANTAGONISTA DE PAF BN52021 64

FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO

ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF

BN52021 65

FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO

ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 66

FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR

PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF

BN52021 66

FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS

CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++

EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 67

FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO

EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA

ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSADA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm 68

FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A

PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 69

FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO

SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA 70

FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX

(n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA 71

FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) 72

FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) 73

FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) 74


MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) 75

FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) HPIE NEG (n=5) e EX NORMAL (n=4) 76

FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE

POS (n=13) HPIE NEG (n=12) E EX NORMAL (n=8) 77

FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) HPIE NEG (n=10) E EX NORMAL (n=7) 79

FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS

CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) HPIE NEG (n=8) E EX NORMAL (n=5) 80

FIGURA 32 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE AcircNION SUPEROacuteXIDO (O2

-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS

POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) HPIE NEG (n=5) E EX NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2

- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE

POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 81

FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE

PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) HPIE NEG (n=6) E EX

NORMAL (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2

ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e EX NORMAL e) 82

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS

TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE

INGLEcircS DE CORRIDA 59

TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGIANOS

OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS

DE I A IV 60

TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS

CARTILAGENS ARITENOacuteIDES 60

TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA

ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO

SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE

AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 61

TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS

CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN

(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61

TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS

DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN

(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63

TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM

PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO

LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX E DOS

SUBGRUPOS HPIE POS HPIE NEG E EX NORMAL 76

RESUMO

A doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas (DIVA) e a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) satildeo comuns em cavalos de corrida resultando em interrupccedilatildeo no treinamento A hipoacutetese do presente estudo foi de que o ambiente e o exerciacutecio

causam estresse oxidativo produccedilatildeo do fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF) e inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas de potros PSI de corrida e que haacute uma relaccedilatildeo entre a DIVA e a HPIE Estudou-se potros PSI em ambiente natural (NC n=45) estabulados

por 30 dias (DA n=40) e treinados (EX n=34) Apoacutes os potros do grupo EX foram divididos em trecircs subgrupos HPIE pos (presenccedila de hemossideroacutefagos no lavado broncoalveolar - LBA) HPIE neg (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA) e EX

normal (ausecircncia de hemossideroacutefagos no LBA e menos de 5 de neutroacutefilos e menos de 1 de eosinoacutefilos no LBA) Avaliou-se perfil citoloacutegico e paracircmetros do LBA relacionados a estresse oxidativo bioatividade de PAF atividade da catalase e

funccedilatildeo de macroacutefago alveolar (MA) Os percentuais de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no LBA do grupo EX foram maiores (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 e 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectivamente) que os limites superiores para cavalos normais

(5 para neutroacutefilos e 1 para eosinoacutefilos) juntamente com um maior nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 ceacutelulasmicroL de LBA P=0017) evidenciaram a ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo pulmonar A bioatividade de PAF e a

concentraccedilatildeo de proteiacutenas no LBA foram maiores no grupo EX (relaccedilatildeo 340380 nm 0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg de proteiacutenasmL de LBA Plt0001) A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos no LBA foi maior

no grupo DA (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg de proteiacutenas Plt0001) e a atividade da catalase foi maior no grupo EX (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg de proteiacutenas P=0002) A fagocitose de MA (P=0006) bem como a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido (Plt0001) e peroacutexido de hidrogecircnio (P=0006) foram

significativamente menores no grupo EX Vinte e trecircs (622) potros do grupo EX foram HPIE pos e o LBA desse subgrupo apresentou concentraccedilatildeo de proteiacutenas (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) bioatividade de

PAF (relaccedilatildeo 340380 nm 0180 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 P=0042) e concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) significativamente maiores que o subgrupo HPIE neg A concentraccedilatildeo de nitritos

(008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) e a atividade de MA foi menor em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg O ambiente e o exerciacutecio modificaram o fluido broncoalveolar confirmando a hipoacutetese do presente estudo

Houve aumento da resposta de MA induzida pelo ambiente enquanto o exerciacutecio fiacutesico resultou em HPIE inflamaccedilatildeo pulmonar e diminuiccedilatildeo na resposta imune inata relacionada aos macroacutefagos alveolares nos potros PSI jovens durante o treinamento

para corrida e o PAF esteve presente nesse processo Sugere-se a conduccedilatildeo de novas investigaccedilotildees para elucidar os mecanismos inflamatoacuterios da HPIE bem como o papel do PAF neste processo como um potencial alvo terapecircutico

Palavras-chave cavalo fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria hemorragia pulmonar inflamaccedilatildeo pulmonar fluido broncoalveolar

ABSTRACT

Inflammatory airway disease (IAD) and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH) are common in racehorses during training being important ailments interrupting training of thoroughbred racehorses The present study hypothesis was

that stabling and exercise cause oxidative stress release of platelet-activating factor (PAF) and inflammation in airways of Thoroughbred colts and that there is an association between IAD and EIPH The subjects were colts in breeding farms (NC

n=45) stabled for 30 days (EC n=40) and race trained (EX n=34) Colts of the EX group were subdivided into three subgroups EIPH pos (presence of hemosiderophages in BALF) EIPH neg (absence of hemosiderophages in BALF)

and Normal EX (absence of hemosiderophages and less than 5 neutrophils and 1 eosinophils in BALF) Cytological profile and parameters of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) related to oxidative stress bioactivity of the pro-inflammatory

mediator PAF catalase activity and alveolar macrophage (AM) activity were studied Percentages of neutrophils and eosinophils in the BALF of the EX group were higher (54 plusmn11 vs 09 plusmn02 Plt0001 and 15 plusmn07 vs 12 plusmn01 Plt005 respectively)

than the upper limits for normal horses (5 of neutrophils and 1 of eosinophils) that associated with a significantly higher total nucleated cell count (456 plusmn28 vs 343 plusmn 24 cellsmicroL of BALF P=0017) displayed pulmonary inflammation PAF

bioactivity and the total protein concentration in the BALF were higher in the EX group (0068 plusmn 002 vs 0006 plusmn 0002 340380nm ratio P=0017 036 plusmn 006 vs 014 plusmn 003 mg of proteinsmL of BALF Plt0001) Concentration of BALF hydroperoxides

was higher in the EC group (1047 plusmn 241 vs 352 plusmn 84 nmolesmg of proteins Plt0001) and catalase activity was higher in the EX group (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol H2O2minmg of proteins P=0002) AM phagocytosis (P=0006) as well as production of superoxide anion (Plt0001) and hydrogen peroxide (P=0006) were

significantly lower in EX group Twenty three (622) colts of the EX group were EIPH pos and the BALF of this subgroup presented a significantly higher protein concentration (039 plusmn 008 vs 019 plusmn 004 mg of proteinsmL of BALF P=0031) PAF

bioactivity (018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 340380 nm ratio P=0042) and lipid hydroperoxide concentration (367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg of proteins P=0009) as well as lower nitrite concentration (008 plusmn 003 vs 012 plusmn 007

absorbance 550 nm P=0049) and AM activity than EIPH neg subgroup Environment and exercise modified the bronchoalveolar fluid confirming the hypothesis of the present study Environment increased AM response as exercise resulted in EIPH

pulmonary inflammation and decreased innate immune response of alveolar macrophages in young Thoroughbred horses during race training and PAF participated in this event Further studies should be conducted to better understand

the inflammatory mechanisms of EIPH and the role of PAF in this process as a potential therapeutic target

Keywords horse platelet-activating factor pulmonary hemorrhage pulmonary

inflammation bronchoalveolar fluid

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS

As doenccedilas respiratoacuterias satildeo comuns nos cavalos e as condiccedilotildees a que

estatildeo sujeitos fazem com que a inflamaccedilatildeo seja uma manifestaccedilatildeo frequumlente dessas

afecccedilotildees O epiteacutelio das vias aeacutereas superiores e dos pulmotildees estatildeo expostos a

patoacutegenos invasores e fatores ambientais Portanto o conhecimento dos

mecanismos da resposta inflamatoacuteria nas vias aeacutereas se faz importante a fim de se

estabelecer estrateacutegias para reduzir o impacto e os danos causados (THACKER

2006)

A inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apresenta um agravante o papel dos pulmotildees

na troca gasosa Assim as quatro principais consequumlecircncias de um processo

inflamatoacuterio desencadeado nas vias aeacutereas incluem vasodilataccedilatildeo e a reduccedilatildeo no

fluxo sanguiacuteneo resultando em capilares ingurgitados o aumento da permeabilidade

capilar permitindo a passagem de fluiacutedo e ceacutelulas para os tecidos o influxo e

acuacutemulo de fagoacutecitos e ceacutelulas ativadas no local e a bronconstricccedilatildeo (LUNN et al

2007)

O estudo das doenccedilas respiratoacuterias em cavalos eacute relevante particularmente

nos cavalos jovens de corrida onde a taxa de inflamaccedilatildeo detectada nas vias aeacutereas

eacute significativa (CHRISTLEY e RUSH 2007)

12 DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS (DIVA)

Os termos ldquodoenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereasrdquo (DIVA) e ldquodoenccedila

inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferioresrdquo (DIVAI) tecircm sido usados para descrever uma

siacutendrome inflamatoacuteria do trato respiratoacuterio de cavalos de corrida (CHRISTLEY e

RUSH 2007)

Tem-se relatado que a DIVA ocorre em 11 a 50 dos cavalos de corrida em

treinamento chegando a afetar ateacute 80 dos cavalos de corrida de dois anos de

idade (CHRISTLEY e RUSH 2007) MALIKIDES (2003) estudou a prevalecircncia da

DIVA em cavalos de corrida na Austraacutelia evidenciando que 41 deles apresentaram

inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas apoacutes duas semanas de iniciarem treinamento

19

A DIVA eacute considerada a segunda afecccedilatildeo mais comum a interromper o

treinamento para corridas (WILSHER et al 2006) podendo resultar em prejuiacutezos a

troca gasosa e diminuiccedilatildeo da capacidade atleacutetica (COUEumlTIL e DENICOLA 1999

SAacuteNCHEZ et al 2005)

Cavalos com DIVA ou com hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio

(HPIE) apresentaram uma maior hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE)

(CHRISTLEY et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)

(FIGURA 1)

FIGURA 1 ndash VALORES DE PAO2 (MEacuteDIA plusmnSD) DURANTE QUATRO ETAPAS DE UM TESTE PADRAtildeO EM ESTEIRA DE ALTA VELOCIDADE EIPH HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO IAD DOENCcedilA INFLAMATOacuteRIA DAS VIAS AEacuteREAS UAO OBSTRUCcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS SUPERIORES FONTE SAacuteNCHEZ et al (2005)

Cavalos trotadores de corrida diagnosticados com DIVA tiveram a mecacircnica

pulmonar (volume corrente frequumlecircncia respiratoacuteria ventilaccedilatildeo pulmonar duraccedilatildeo da

inspiraccedilatildeo e da expiraccedilatildeo complacecircncia dinacircmica) alterada apresentaram um

significativo aumento da carga ventilatoacuteria e da energia requerida para a respiraccedilatildeo

sofrendo restriccedilotildees em seu rendimento atleacutetico (PIRRONE et al 2007)

Contudo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas dos cavalos atletas natildeo eacute entendida

por completo especialmente pela falta de consistecircncia e precisatildeo na definiccedilatildeo

dessa siacutendrome (CHRISTLEY e RUSH 2007)

Recentemente um painel de discussatildeo promovido pelo American College of

Veterinary Internal Medicine (ACVIM) definiu que a DIVA pode ocorrer em cavalos

de qualquer idade e eacute caracterizada pelo seguinte fenoacutetipo (COUEumlTIL et al 2007)

20

- Baixo rendimento desportivo intoleracircncia ao exerciacutecio

- Tosse com ou sem quantidade excessiva de muco traqueal

- Inflamaccedilatildeo natildeo seacuteptica detectada pela avaliaccedilatildeo citoloacutegica do fluido do LBA

ou disfunccedilatildeo pulmonar baseada em evidecircncia de obstruccedilatildeo de vias aeacutereas

inferiores hiperresponsividade das vias aeacutereas ou prejuiacutezo a troca gasosa durante o

repouso ou exerciacutecio

Este painel formado por experts e pesquisadores da aacuterea propocircs tambeacutem

alguns fatores de exclusatildeo para a DIVA

- Evidecircncia de sinais sistecircmicos de infecccedilatildeo (febre alteraccedilotildees hematoloacutegicas

compatiacuteveis com infecccedilatildeo)

- Aumento do esforccedilo respiratoacuterio durante o repouso

A etiopatogenia da DIVA eacute pouco definida Acredita-se que uma variedade de

fatores de risco estejam envolvidos variando nas diferentes populaccedilotildees de cavalos

baseado na alimentaccedilatildeo manejo praacuteticas preventivas distribuiccedilatildeo de agentes

infecciosos e influecircncias geneacuteticas (COUEumlTIL et al 2007)

Alguns autores encontraram uma reduccedilatildeo da incidecircncia desta afecccedilatildeo em

cavalos mais velhos (BURRELL et al 1996 CHAPMAN et al 2000 CHRISTLEY et

al 2001 WOOD et al 2005) sendo que a idade natildeo provocou diferenccedila no estudo

de McKANE et al (1993)

O ambiente da cocheira representa um risco adicional para a DIVA nos

cavalos (BURRELL et al 1996 HOLCOMBE et al2001 CLEMENTS e PIRIE

2007 BERNDT et al 2008) bem como para a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas das

pessoas envolvidas no trabalho com os cavalos (ELFMAN et al 2009)

HOLCOMBE et al (2001) associaram o manejo de estabulaccedilatildeo com a

ocorrecircncia de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas inferiores Estudaram 14 potros aacuterabes

que foram transferidos da pastagem para cocheiras com cama de palha Apoacutes 90

dias de estabulados houve um aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no

lavado broncoalveolar (LBA) Cavalos estabulados em cama de palha tambeacutem

apresentaram maior chance de apresentar DIVA em outros estudos (BURRELL et

al 1996 WOODS et al 1993)

No entanto em cavalos de montaria no estado norte-americano de Michigan

foi a permanecircncia em piquetes durante o inverno que esteve associado com

aumento do acuacutemulo de muco traqueal com maior nuacutemero de neutroacutefilos Neste

21

estudo a alimentaccedilatildeo com feno tambeacutem representou risco para a ocorrecircncia de

inflamaccedilatildeo (ROBINSON et al 2006)

Contudo o ambiente de cocheiras em modelos convencionais de manejo aos

quais os cavalos em treinamento estatildeo submetidos reconhecidamente apresenta

riscos para as vias aeacutereas Nestes haacute aumento nas concentraccedilotildees de partiacuteculas

inalaacuteveis contendo partiacuteculas orgacircnicas e inorgacircnicas incluindo endotoxinas β-D-

glucan partiacuteculas ultra finas (lt100 nm de diacircmetro) microorganismos esporos de

fungos material vegetal poeira inorgacircnica e gases toacutexicos (COUEumlTIL et al 2007)

Recentemente no estudo de BERNDT et al (2008) se demonstrou que o ambiente

de cocheira apresenta uma concentraccedilatildeo de endotoxinas 8 vezes maior que nos

piquetes

Aleacutem disso haacute muito jaacute foi descrita a presenccedila de actinomicetos termofiacutelicos

como a Micropolyspora faeni nos fenos fornecidos aos cavalos capazes de serem

inalados atingindo as vias aeacutereas inferiores (McPHERSON e THOMSON 1983)

Assim a praacutetica de encharcar o feno antes da administraccedilatildeo para diminuir a

quantidade de poeira disponiacutevel resultou em benefiacutecio agraves vias aeacutereas dos cavalos

(CLEMENTS e PIRIE 2007)

Por outro lado a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA ainda

natildeo estaacute bem esclarecida Cavalos com sinais cliacutenicos de inflamaccedilatildeo das vias

aeacutereas apresentaram maior frequecircncia de isolados bacterianos nos estudos de

CHRISTLEY et al (2001) e WOOD et al (2005) apesar de o painel do ACVIM

entender que a participaccedilatildeo das bacteacuterias na etiopatogenia da DIVA precisa ser

melhor estudada (COUEumlTIL et al 2007)

O exerciacutecio tambeacutem tem sido associado agrave inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas

inferiores dos cavalos atletas (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999

SAacuteNCHEZ et al 2005) A prevalecircncia da DIVA eacute maior em cavalos em treinamento

que em cavalos do mesmo grupo mas sem treinamento talvez pela inalaccedilatildeo de

maiores quantidades de partiacuteculas pela exposiccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores ao ar

frio ou pela ocorrecircncia da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (DAVIS et

al 2006 CHRISTLEY e RUSH 2007)

O diagnoacutestico da DIVA inclui a histoacuteria e o exame fiacutesico detalhados para a

identificaccedilatildeo de potenciais fatores etioloacutegicos A tosse durante o exerciacutecio ou

durante a alimentaccedilatildeo constitui a queixa mais comum (CHRISTLEY e RUSH 2007)

esteve associada agrave presenccedila de quantidades aumentadas de secreccedilatildeo traqueal bem

22

como a um maior percentual de neutroacutefilos tanto na secreccedilatildeo traqueal (CHRISTLEY

et al 2001) como no LBA (BENEDICE et al 2008) mas sua ausecircncia natildeo descarta

o diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)

A presenccedila de descarga nasal mucopurulenta eacute achado comum em cavalos

de corrida de dois anos de idade sendo menos comum em cavalos mais velhos

Sua relaccedilatildeo com a DIVA todavia natildeo eacute sabida (COUEumlTIL et al 2007)

A auscultaccedilatildeo toraacutecica durante o repouso raramente evidencia alteraccedilotildees em

cavalos atletas com inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores (MAZAN e HOFFMAN

2003 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007) sendo necessaacuteria a

utilizaccedilatildeo de uma sacola para o cavalo respirar no seu interior ampliando o esforccedilo

respiratoacuterio (bdquorebreathing bagrsquo) podendo tornar audiacuteveis alguns sons anormais em

certos casos (MAZAN e HOFFMAN 2003 COUEumlTIL et al 2007)

MAZAN e HOFFMAN (2003) relataram que os testes de funccedilatildeo pulmonar

como o pneumotacoacutegrafo e o teste de broncoprovocaccedilatildeo com histamina podem

auxiliar tornando o diagnoacutestico da DIVA definitivo Contudo o diagnoacutestico precoce

da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas inferiores deve enfatizar a avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA

e natildeo os testes de funccedilatildeo pulmonar (COUEumlTIL et al 2007)

A avaliaccedilatildeo citoloacutegica do AT tambeacutem tem contribuido ao diagnoacutestico dos

processos inflamatoacuterios das vias aeacutereas contudo natildeo eacute considerado suficiente para

o diagnoacutestico da DIVA Isto se deve a falta de concordacircncia entre os achados

citoloacutegicos do AT e do LBA e da falta de estudos associando os achados no AT e o

rendimento atleacutetico (HODGSON e HODGSON 2003 HUGHES et al 2003

COUEumlTIL et al 2007) Ainda um cuidado a ser levado em conta quando da

realizaccedilatildeo de AT eacute o tempo da colheita jaacute que a realizaccedilatildeo de exerciacutecio

esteneuante pode aumentar o percentual de neutroacutefilos na amostra obtida

(MALIKIDES et al 2007)

O LBA por sua vez eacute o meacutetodo para a obtenccedilatildeo de amostras de ceacutelulas

presentes nas vias aeacutereas mais distais e espaccedilo alveolar (HOFFMAN 1999

FERNANDES et al 2000 LESSA et al 2005) considerado como uma bioacutepsia

liacutequida (MAZAN e HOFFMAN 2003) sendo a teacutecnica de avaliaccedilatildeo citoloacutegica

preferida para o diangoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007)

Um aumento no percentual de ceacutelulas inflamatoacuterias no fluido do LBA eacute um dos

principais criteacuterios diagnoacutesticos para a DIVA Usualmente ocorre uma predominacircncia

de neutroacutefilos mas tambeacutem pode ocorrer aumento nos nuacutemeros percentuais de

23

eosinoacutefilos linfoacutecitos e mastoacutecitos normalmente associados com diminuiccedilatildeo no

rendimento desportivo e hiperresponsividade das vias aeacutereas (McKANE et al 1993

HARE e VIEL 1998 CHRISTLEY e RUSH 2007 COUEumlTIL et al 2007)

O perfil citoloacutegico de LBA mais comumente encontrado em cavalos com DIVA

eacute caracterizado por aumento no nuacutemero total de ceacutelulas nucleadas (NTCN) com

discreta neutrofilia (gt5) linfocitose e monocitose Tambeacutem pode ser encontrado

um aumento do nuacutemero percentual de eosinoacutefilos (gt01) e mastoacutecitos (gt2)

(HOFFMAN 1999 COUEumlTIL et al 2007)

O painel de estudo da DIVA promovido pelo ACVIM apontou direccedilotildees para as

pesquisas nesta aacuterea e dentre elas o estudo das citocinas e mediadores

inflamatoacuterios envolvidos no processo (COUEumlTIL et al 2007)

Sabe-se que ocorre um incremento da imunidade inata nas vias aeacutereas dos

cavalos estabulados com o envolvimento de IL-6 (RIIHIMAumlKI et al 2008a) Em

cavalos trotadores de corrida em treinamento ocorre uma eosinofilia transitoacuteria no

fluido broncoalveolar e um aumento da expressatildeo de IL-4 e IL-5 contudo natildeo foi

encontrada correlaccedilatildeo entre estes eventos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)

Dentre os mediadores quiacutemicos participantes do processo inflamatoacuter io nas

vias aeacutereas o PAF (platelet-activating factor) estaacute especialmente implicado na asma

sepse e injuacuteria pulmonar aguda (THACKER 2006) presente tambeacutem na

fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas em cavalos mais velhos

(FAIRBAIRN et al 1996) Contudo a participaccedilatildeo do PAF no processo inflamatoacuterio

nas vias aeacutereas de cavalos atletas ainda natildeo eacute conhecida

13 PAF E VIAS AEacuteREAS

O fator de ativaccedilatildeo plaquetaacuteria (PAF 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocoline)

eacute um potente mediador proacute inflamatoacuterio envolvido na angiogecircnese aterosclerose

anafilaxia cicatrizaccedilatildeo inflamaccedilatildeo apoptose e endotoxemia (MARATHE et al

2001 STAFFORINI et al 2003 OWEN et al 2005) O PAF eacute produzido por

eosinoacutefilos macroacutefagos alveolares neutroacutefilos plaquetas e ceacutelulas endoteliais

(BAKER et al 2002 STAFFORINI et al 2003 GAUDREAULT et al 2005 SUMITA

et al 2005) a partir de uma subclasse especiacutefica de fosfatidilcolina que conteacutem um

eacuteter ao inveacutes de um eacutester ligado a posiccedilatildeo sn-1 do esqueleto de glicerol (FIGURA

24

2) A fosfatidilcolina eacute o mais abundante fosfolipiacutedio presente nas membranas

bioloacutegicas (MARATHE et al 2001 OWEN et al 2005)

FIGURA 2 ndash ESTRUTURA DA FOSFATIDILCOLINA FOSFOLIPIacuteDIO PRECURSOR DO PAF CONTENDO UM EacuteTER LIGADO A POSICcedilAtildeO sn-1 DO ESQUELETO DE GLICEROL FONTE MARATHE et al (2001)

O PAF tambeacutem estaacute envolvido numa variedade de funccedilotildees pulmonares como

por exemplo no tocircnus vascular e das vias aeacutereas na frequumlecircncia de movimentaccedilatildeo

dos ciacutelios e na permeabilidade endotelial causando um aumento da secreccedilatildeo de

fluido traqueal broncoconstricccedilatildeo edema e hiperresponsividade das vias aeacutereas

resultando em prejuiacutezos a troca gasosa (CLAVIJO et al 2001 GABRIJELCIC et al

2003 ISHII et al 2004 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008)

Os efeitos do PAF sobre a circulaccedilatildeo pulmonar foram descritos por diversos

autores CHEN et al (1992) demonstraram um aumento das pressotildees arterial e

microvascular pulmonares e edema apoacutes a injeccedilatildeo de PAF SHIBAMOTO et al

(1993) estudaram os efeitos do PAF na circulaccedilatildeo venosa em pulmatildeo de catildeo onde

o PAF causou venoconstricccedilatildeo e aumento da pressatildeo capilar sem aumento da

permeabilidade vascular OHAR et al (1994) tambeacutem demonstraram

venoconstricccedilatildeo em estudo com pulmatildeo de coelhos mas demostraram que a

reduccedilatildeo da complacecircncia e aumento da resistecircncia vascular deveu-se a alteraccedilatildeo

estrutural vascular por perda de colaacutegeno intersticial induzida por PAF

Contudo o papel do PAF como causador de aumento da permeabilidade

vascular e edema pulmonar estaacute bem estudado devido a sua participaccedilatildeo na

fisiopatologia da anafilaxia da endotoxemia e da asma (EVANS et al 1987

25

CLAVIJO et al 2001 GOumlGGEL e UHLIG 2005 SHIBAMOTO et al 2008

MUEHLMANN et al 2009)

Em estudo preacutevio o extravasamento microvascular ocorrido apoacutes a infusatildeo de

PAF natildeo foi acompanhado de aumento da pressatildeo arterial pulmonar assim os

autores concluiacuteram que o edema pulmonar mediado por PAF resulta de aumento da

permeabilidade microvascular pulmonar (CLAVIJO et al 2001)

De fato demonstrou-se que o aumento da permeabilidade capilar induzida

por PAF ocorre pela formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular devido a

desorganizaccedilatildeo das proteiacutenas juncionais VE-caderina e ocludina (ZHANG et al

2003 JIANG et al 2008) mediada por receptores especiacuteficos (EVANS et al 1987)

e atraveacutes da ativaccedilatildeo da via do insositol trisphosphato e influxo de caacutelcio (GOumlGGEL

e UHLIG 2005) (FIGURA 3)

PLC phopholipase C IP3 inositol 145-trisphosphato IP3R receptor de IP3

MLCK myosin light chain kinase ML-7 5-iodonaphthalene-1sulphonyl-

homopiperazine L108 edelfosina Inibiccedilatildeo ativaccedilatildeo

FIGURA 3 ndash RESUMO DAS VIAS DE SINALIZACcedilAtildeO INTRACELULAR EM RESPOSTA AO PAF NO PULMAtildeO DE RATOS NO LADO ESQUERDO OBSERVA-SE O EFEITO DO PAF EM CEacuteLULAS ENDOTELIAIS NO LADO DIREITO OBSERVA-SE OS EFEITOS DO PAF EM CEacuteLULAS DA MUSCULATURA LISA VASCULAR E DAS VIAS AEacuteREAS A QUAL Eacute ALTAMENTE MEDIADA POR TROMBOXANO NESTE A VIA PRINCIPAL Eacute ATRAVEacuteS DA ATIVACcedilAtildeO DE RHO E PROTEIacuteNAS KINASES ASSOCIADAS Agrave RHO QUE ATENUAM A ATIVIDADE DA MLCP (MYOSIN LIGHT CHAIN PHOPHATASE) COM CONSEQUumlENTE AUMENTO DA FOSFORILACcedilAtildeO DA CADEIA LEVE DA MIOSINA E PORTANTO A CONTRACcedilAtildeO FONTE GOumlGGEL e UHLIG (2005)

26

Adicionalmente os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser

dependentes em parte da liberaccedilatildeo de oacutexido niacutetrico (NO) (BELLAN et al 1992) O

aumento da produccedilatildeo de NO induzida por PAF via ativaccedilatildeo de receptor de PAF foi

demonstrado em ceacutelulas do endoteacutelio vascular humano considerado como um efeito

cardioprotetor (KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Contudo particularmente

na microcirculaccedilatildeo o NO contra-ataca muitos dos efeitos bioloacutegicos do PAF inibindo

a vasoconstricccedilatildeo arteriolar e o aumento da permeabilidade vascular aleacutem de inibir

a adesatildeo de plaquetas e de leucoacutecitos ao endoteacutelio (BRKOVIC e SIROIS 2007

KIKUCHI et al 2008 LEARY et al 2008) Mas os mecanismos pelos quais o NO

modula a permeabilidade microvascular ainda natildeo satildeo bem entendidos podendo ser

confusos e dependentes do estado das ceacutelulas endoteliais (RAMIREZ et al 2006)

A inibiccedilatildeo da NO sintase (NOS) em ceacutelulas endoteliais atenuou o aumento da

permeabilidade microvascular induzida por PAF no estudo de ZHU et al (2004) Por

outro lado estudando a participaccedilatildeo de NO e PAF em lesotildees de intestino delgado

de ratos KWASNIEWSKI et al (2008) evidenciaram que a inibiccedilatildeo da produccedilatildeo de

NO endoacutegeno aumentou bastante as lesotildees hemorraacutegicas e a taxa de mortalidade

demonstrando o papel proacute inflamatoacuterio do PAF e o efeito protetor do NO na

microcirculaccedilatildeo Tal relaccedilatildeo tambeacutem foi descrita por BRKOVIC e SIROIS (2007)

estudando o papel do PAF e do NO nos efeitos proacute inflamatoacuterios resultantes da

participaccedilatildeo de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e concluindo que eacute

o PAF que diretamente aumenta a permeabilidade vascular sendo o NO um cofator

A atuaccedilatildeo do PAF como mediador inflamatoacuterio eacute bastante importante na

asma onde aleacutem de provocar aumento da permeabilidade vascular tambeacutem induz

uma neutropenia transitoacuteria seguida de neutrofilia resultando no recrutamento de

neutroacutefilos para o pulmatildeo evidenciado atraveacutes de estudo citoloacutegico do lavado

broncoalveolar (LEE et al 2002 GABRIJELCIC et al 2003)

No estudo de AU et al (2001) a ativaccedilatildeo de neutroacutefilos resultou em ativaccedilatildeo

dos receptores de PAF aumento da fagocitose de neutroacutefilos e subsequumlente

liberaccedilatildeo de interleucina-8 (IL-8) causando mais quimiotaxia de neutroacutefilos

Adicionalmente demonstrou-se que haacute envolvimento de receptor 1 de leucotrieno B4

(LTB4) nas atividades de neutroacutefilos humanos mediadas por PAF (GAUDREAULT et

al 2005)

Em indiviacuteduos asmaacuteticos e com doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC)

o influxo de neutroacutefilos mediado por PAF nas vias aeacutereas foi modulado pelo aumento

27

de LTB4 provavelmente pelo estiacutemulo de PAF para a liberaccedilatildeo de LTB4 dos

macroacutefagos alveolares (SHINDO et al 1998 GABRIJELCIC et al 2003 FINNEY-

HAYWARD et al 2009)

Nas vias aeacutereas dos cavalos se demonstrou a participaccedilatildeo do PAF na

fisiopatologia da obstruccedilatildeo recorrente das vias aeacutereas (ORVA) levando a um

aumento do recrutamento de neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo resultando em

prejuiacutezos agrave funccedilatildeo pulmonar (FAIRBAIRN et al 1996)

O PAF tendo como uma de suas origens o macroacutefago alveolar eacute capaz de

modificar o comportamento de neutroacutefilos sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da

adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a

ORVA (MARR et al 2002)

A participaccedilatildeo do PAF na asma humana e em outras espeacutecies foi evidenciada

pela sua capacidade em reproduzir mecanismos fisiopatoloacutegicos tais como a

broncoconstricccedilatildeo hiperresponsividade das vias aeacutereas aumento da

permeabilidade na microcirculaccedilatildeo pulmonar e aumento na secreccedilatildeo de muco (LOU

et al 1998 ISHII et al 2004 MUEHLMANN et al 2009)

14 MUCO E INFLAMACcedilAtildeO DAS VIAS AEacuteREAS

Os desafios indutores de alteraccedilotildees na funcionalidade dos macroacutefagos

alveolares resultando em quimiotaxia de neutroacutefilos para as vias aeacutereas levam a um

quadro inflamatoacuterio pulmonar acompanhado de hipersecreccedilatildeo de muco Por sua vez

o muco presente nas vias aeacutereas possui uma seacuterie de funccedilotildees essenciais que

coletivamente levam a proteccedilatildeo das vias aeacutereas Juntamente com as ceacutelulas

epiteliais forma o sistema mucociliar que associado agrave tosse eacute essencial para

manter as vias aeacutereas desobstruiacutedas (ADLER 2005)

Por outro lado a produccedilatildeo excessiva de muco representa um fator importante

de morbidade e mortalidade nas doenccedilas das vias aeacutereas (THORNTON e

SHEEHAN 2004) Assim a resposta imunoloacutegica do epiteacutelio das vias aeacutereas frente

a infecccedilotildees virais e bacterianas e endotoxinas inaladas eacute caracterizada pela

liberaccedilatildeo de citocinas e pela produccedilatildeo de mucinas para prover proteccedilatildeo adicional

(HODGSON et al 2003 GERBER et al 2004 LORA et al 2005) Entretanto nos

quadros inflamatoacuterios os danos teciduais substanciais podem levar a produccedilatildeo

28

excessiva de muco e comprometimento da funccedilatildeo respiratoacuteria (LORA et al 2005

ROBINSON 2005)

O muco eacute uma mistura de aacutegua (~95) eletroacutelitos (~1) lipiacutedios (~1)

proteiacutenas (2-3) enzimas proteiacutenas seacutericas e mucinas (GERBER 2001) As

mucinas glicoproteiacutenas oligomeacutericas representam um constituinte importante do

muco sendo o gene responsaacutevel pela produccedilatildeo de mucinas o MUC5 (THORNTON

e SHEEHAN 2004)

Nas vias aeacutereas a produccedilatildeo de mucinas ocorre predominantemente pelas

ceacutelulas caliciformes do epiteacutelio e em menor parte nas glacircndulas da submucosa

(GERBER et al 2004 THORNTON e SHEEHAN 2004) A produccedilatildeo de

quantidades excessivas de muco pode representar a causa direta de obstruccedilatildeo

bronquial podendo amplificar o efeito de estreitamento luminal da broncoconstricccedilatildeo

e estar associada ao comprometimento da funccedilatildeo pulmonar tosse e capacidade

reduzida para a corrida em atletas humanos (HALLSTRAND et al 2007) e em

cavalos de corrida (CHRISTLEY et al 2001 HOLCOMBE et al 2006)

Assim a quantidade de muco secretado apresenta uma correlaccedilatildeo estreita

com a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas (GERBER et al 2004 ROBINSON et al 2003

HOLCOMBE et al 2006 ROBINSON 2005) De fato haacute uma evidente associaccedilatildeo

entre a hipersecreccedilatildeo de muco e presenccedila de quantidades aumentadas de

neutroacutefilos nas secreccedilotildees respiratoacuterias em seres humanos e em cavalos

(HODGSON et al 2003 ROBINSON et al 2003 ADLER 2005) Contagens de

neutroacutefilos no LBA menores que 30 ceacutelulasμL correspondem a pequenas

quantidades de muco nas vias aeacutereas e os acuacutemulos de secreccedilatildeo aumentam

quando as quantidades de neutroacutefilos estatildeo entre 30 e 100 ceacutelulasμL Entre 100 e

1000 ceacutelulasμL ocorre obstruccedilatildeo mensuraacutevel das vias aeacutereas Possivelmente esse

mecanismo pode estar relacionado com a secreccedilatildeo de proteiacutenas pelos neutroacutefilos

(ROBINSON et al 2003) De fato jaacute foi demonstrado que o neutroacutefilo secreta

elastase a qual estaacute associada com um aumento nas secreccedilotildees relacionadas com a

expressatildeo do gene MUC5 (SHAO e NADEL 2005) e metaplasia de ceacutelulas

caliciformes (VOYNOW et al 2004)

A expressatildeo anormal de neutroacutefilos e de moleacuteculas de adesatildeo em indiviacuteduos

com asma e doenccedila pulmonar obstrutiva crocircnica (DPOC) foi demonstrada por

GABRIJELCIC et al (2003) Aleacutem do aumento no nuacutemero de neutroacutefilos tambeacutem

foram observados diferentes padrotildees de ativaccedilatildeo e niacuteveis aumentados de elastase

29

neutrofiacutelica e IL-8 Estes uacuteltimos bem como a expressatildeo do gene MUC5 estatildeo

associados a um aumento no estresse oxidativo pulmonar (DROST et al 2005

SHAO e NADEL 2005)

A associaccedilatildeo entre a severidade da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas e o estresse

oxidativo em cavalos com ORVA foi relatada por KIRSCHVINK et al (2008) os

quais relacionaram a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas ao aumento da glutationa oxidada

do aacutecido uacuterico e de isoprostano (8-iso-PGF2α) no LBA

15 ESTRESSE OXIDATIVO INFLAMACcedilAtildeO NAS VIAS AEacuteREAS E EXERCIacuteCIO

Estresse oxidativo eacute o termo utilizado para descrever os danos causados

quando as espeacutecies reativas do oxigecircnio (ROS) superam a capacidade de defesa

antioxidante do indiviacuteduo (WOOD et al 2003)

Entretanto tanto as ROS como as espeacutecies reativas do nitrogecircnio (RNS)

ocorrendo em concentraccedilotildees pequenas a moderadas apresentam importante papel

na fisiologia celular incluindo a defesa contra invasores e atuando em diversas vias

de sinalizaccedilatildeo celular e na induccedilatildeo da resposta mitogecircnica O estresse oxidativo

propriamente dito ocorre quando o sistema redox sofre desequiliacutebrio pela produccedilatildeo

aumentada de ROS eou RNS ou produccedilatildeo reduzida de antioxidantes (VALKO et al

2007)

Os pulmotildees encontram-se sujeitos ao estresse oxidativo pois estatildeo

diretamente expostos a quantidades muito elevadas de oxigecircnio o que torna

imperativo que este oacutergatildeo possua um arsenal para a defesa contra possiacuteveis

ataques oxidativos Portanto os pulmotildees satildeo providos de um desenvolvido sistema

de defesa endoacutegeno constituiacutedo de agentes chamados antioxidantes Os

antioxidantes ajudam os pulmotildees a se livrarem dos efeitos de uma variedade de

oxidantes provenientes do oxigecircnio (ROS) como o acircnion superoacutexido radical

hidroxila peroacutexido de hidrogecircnio e do nitrogecircnio (RNS) como o oacutexido niacutetrico (NO)

peroxinitrito e nitritos endoacutegenos e do ambiente Os principais sistemas

antioxidantes natildeo enzimaacuteticos dos pulmotildees satildeo a glutationa a vitamina C a

vitamina E o beta-caroteno e o aacutecido uacuterico enquanto os antioxidantes enzimaacuteticos

satildeo as superoacutexido dismutases a catalase e as peroxidases (RAHMAN et al 2006)

(FIGURA 4)

30

FIGURA 4 ndash GERACcedilAtildeO DE ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO (ROS) E SISTEMAS DE DEFESA ANTIOXIDANTE O2- AcircNION SUPEROacuteXIDO NO OacuteXIDO NIacuteTRICO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO ONOO- PEROXINITRITO FE2+ IacuteON FERROSO GPX GLUTATIONA PEROXIDASE FONTE RAHMAN et al (2006)

O estresse oxidativo pode resultar em muitos prejuiacutezos agraves funccedilotildees das vias

aeacutereas incluindo a contraccedilatildeo da musculatura lisa das vias aeacutereas a induccedilatildeo de

hiperresponsividade das vias aeacutereas a hipersecreccedilatildeo de muco danos ao epiteacutelio

respiratoacuterio e aumento da permeabilidade capilar (WOOD et al 2003)

A fisiopatologia da asma e da DPOC caracteriza-se por inflamaccedilatildeo crocircnica

localizada e estresse oxidativo O estresse oxidativo ocorre pelo aumento de

agentes oxidantes que satildeo inalados bem como por grandes quantidades de ROS

liberadas das ceacutelulas inflamatoacuterias Niacuteveis aumentados de ROS aumentam a

resposta inflamatoacuteria diretamente ou via formaccedilatildeo de produtos da peroxidaccedilatildeo

lipiacutedica levando a um aumento na severidade da doenccedila (KIRKHAM e RAHMAN

2006)

A peroxidaccedilatildeo dos lipiacutedios da membrana celular leva a geraccedilatildeo de

isoprostanos (FIGURA 5) um composto bioativo semelhante agraves prostaglandinas Os

isoprostanos satildeo produzidos independentemente das enzimas ciclooxigenases via

peroxidaccedilatildeo do aacutecido aracdocircnico catalizada por ROS apresentando potente efeito

31

constritor na musculatura lisa respiratoacuteria hiperresponsividade e exsudaccedilatildeo de

plasma nas vias aeacutereas (WOOD et al 2003)

FIGURA 5 ndash MECANISMOS LEVANDO A PEROXIDACcedilAtildeO LIPIacuteDICA NA ASMA IL INTERLEUCINA TH2 CEacuteLULAS T-HELPER TIPO 2 ROS ESPEacuteCIES REATIVAS DO OXIGEcircNIO O2

- AcircNION SUPEROacuteXIDO H2O2 PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO OH RADICAL HIDROXILA NO2 DIOacuteXIDO DE NITROGEcircNIO NADPH NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO REDUZIDA NADP NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDIO FOSFATO SOD SUPEROacuteXIDO DISMUTASE EPO PEROXIDASE EOSINOFIacuteLICA MPO MIELOPEROXIDASE NF FATOR DE TRANSCRICcedilAtildeO NUCLEAR FONTE WOOD et al (2003)

O oacutexido niacutetrico (NO) sintetizado enzimaticamente pela oxidaccedilatildeo do

aminoaacutecido L-arginina para L-citrulina apresenta diversas funccedilotildees fisioloacutegicas nas

vias aeacutereas como o relaxamento da musculatura lisa a regulaccedilatildeo da responsividade

e da permeabilidade das vias aeacutereas e na defesa contra invasores Contudo em

altas concentraccedilotildees o NO apresenta diversos efeitos proacute inflamatoacuterios participando

da infiltraccedilatildeo de ceacutelulas inflamatoacuterias e apresentando efeitos citotoacutexicos sobre

32

diversas ceacutelulas tal como a ceacutelula do epiteacutelio respiratoacuterio especialmente por

interagir com o acircnion superoacutexido formando o peroxinitrito (REDINGTON 2006)

As ceacutelulas inflamatoacuterias recrutadas agraves vias aeacutereas do indiviacuteduo asmaacutetico

apresentam excepcional capacidade de produccedilatildeo de oxidantes Eosinoacutefilos

neutroacutefilos e macroacutefagos bem como ceacutelulas do epiteacutelio respiratoacuterio podem gerar

oxidantes Inicialmente ocorre a formaccedilatildeo de acircnion superoacutexido no complexo

dependente de NADPH oxidase na membrana celular no sistema xantina oxidase

citosoacutelico e na cadeia respiratoacuteria mitocondrial (FIGURA 6) (CARAMORI e PAPI

2004) A seguir a interaccedilatildeo do acircnion superoacutexido com outros oxidantes e o ataque

oxidativo ao tecido pulmonar leva agrave peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e danos ao tecido pulmonar

(MILLS e HIGGINS 1997 KIRKHAM e RAHMAN 2006)

FIGURA 6 ndash PRINCIPAIS FONTES DE OXIDANTES NAS CEacuteLULAS FONTE CARAMORI E PAPI (2004)

O estudo do estresse oxidativo na asma se utiliza de modelos que podem

envolver os murinos (MUEHLMANN et al 2009) ou mesmo os cavalos jaacute que estes

naturalmente desenvolvem a ORVA doenccedila respiratoacuteria com diversas similaridades

com a asma humana (DEATON 2006)

33

Nos cavalos com ORVA os marcadores de estresse oxidativo estatildeo

aumentados e diretamente relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e infiltrado

inflamatoacuterio neutrofiacutelico (KIRSCHVINK et al 2008) ao aumento da produccedilatildeo de

acircnion superoacutexido por neutroacutefilos sanguiacuteneos apoacutes a exposiccedilatildeo agrave poeira orgacircnica

ambiental (MARR et al 1997) e ao aumento da secreccedilatildeo de muco apresentando

tambeacutem concentraccedilotildees reduzidas de aacutecido ascoacuterbico no fluido do epiteacutelio respiratoacuterio

(DEATON 2006)

O exerciacutecio fiacutesico por sua vez tambeacutem pode causar estresse oxidativo nas

vias aeacutereas em atletas humanos e em cavalos pela geraccedilatildeo de ROS e RNS (MILLS

e HIGGINS 1997 ART e LEKEUX 2005 KIRSCHVINK et al 2008)

Os cavalos de corrida apresentam a habilidade de aumentar o consumo de

oxigecircnio em 60 vezes durante o esforccedilo maacuteximo o que representa um fator de risco

ao estresse oxidativo nesses animais (ART e LEKEUX 2005)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica eacute o marcador de dano oxidativo poacutes exerciacutecio mais

estudado (DEATON e MARLIN 2003) Em atletas humanos houve aumento da

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes a realizaccedilatildeo de ultramaratona (MASTALOUDIS et al

2004) mas o treinamento produziu efeitos beneacuteficos e reduccedilatildeo dos marcadores de

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes um periacuteodo de treinamento (MIYAZAKI et al 2001

BALOG et al 2006) Em cavalos o exerciacutecio submaacuteximo induziu um aumento nos

hidroperoacutexidos lipiacutedicos plasmaacuteticos dentro de 5 minutos apoacutes o teacutermino (DEATON e

MARLIN 2003)

As ROS e seus produtos como os peroacutexidos lipiacutedicos podem diretamente

danificar o tecido pulmonar e causar um incremento da pressatildeo vascular pulmonar

pela liberaccedilatildeo aumentada de mediadores inflamatoacuterios vasoconstrictores (pex

PAF) interferindo na atividade do NO como vasodilatador podendo assim contribuir

na patogecircnese da hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio (HPIE) nos cavalos

atletas (MILLS e HIGGINS 1997)

34

16 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCIacuteCIO (HPIE)

A HPIE eacute caracterizada por hipertensatildeo pulmonar edema nas regiotildees de

troca gasosa ruptura dos capilares pulmonares e a presenccedila de sangue nas vias

aeacutereas (ERICKSON e POOLE 2007) sendo extremamente comum em cavalos de

corrida (PEREZ-MORENO et al 2009)

Tem-se relatado que a HPIE ocorre essencialmente em todos os cavalos

PSI de corrida em treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007) mas

tambeacutem constitui um problema em outras raccedilas de cavalos que realizam exerciacutecio

intenso como os trotadores e os quarto de milha e em cavalos realizando exerciacutecio

de menor intensidade como os cavalos de salto e traccedilatildeo (LAPOINTE et al 1994

ERICKSON e POOLE 2007 VICINO 2007)

O comprometimento ao rendimento desportivo causado pela HPIE natildeo havia

sido comprovado ateacute o estudo de HINCHCLIFF et al (2005a) quando demonstraram

que cavalos de corrida com HPIE grau 1 apresentaram 4 vezes mais possibilidades

de vencer em relaccedilatildeo a graduaccedilotildees mais elevadas de hemorragia

Cavalos PSI de corrida estatildeo sob maior risco de apresentar HPIE porque

apresentam pressatildeo capilar pulmonar mais elevada que cavalos de outras raccedilas e

atividades durante o esforccedilo maacuteximo (HACKETT et al 2003)

Adicionalmente a criaccedilatildeo seletiva de cavalos de corrida visando que sejam

cada vez mais capazes de atingir altas velocidades associado a consumo bastante

alto de oxigecircnio resultou em deacutebito cardiacuteaco substancial (WEST e MATHIEU-

COSTELLO 1994) e barreira alveacuteolo-capilar (BAC) bastante fina (WEST e

MATHIEU-COSTELLO 1999) A espessura meacutedia em micrometros do interstiacutecio da

BAC eacute 0175 plusmn 0010 em coelhos 0318 plusmn 0081 em catildees e 0390 plusmn 002 em

cavalos evidenciando que proporcionalmente a BAC dos cavalos eacute mais fina que a

de outras espeacutecies (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1999) Portanto haacute um dilema

envolvendo a evoluccedilatildeo da BAC dos cavalos Por um lado a necessidade de ser

extremamente fina para uma troca gasosa eficiente enquanto de outro a

necessidade de ser resistente o suficiente para suportar o estresse extremamente

alto na parede dos capilares pulmonares quando a pressatildeo capilar se eleva durante

o exerciacutecio (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)

A pressatildeo hidrostaacutetica maacutexima nos capilares pulmonares humanos durante o

exerciacutecio supera 30 mmHg Nos cavalos PSI de corrida a pressatildeo capilar ultrapassa

35

100 mmHg aproximando-se da forccedila necessaacuteria para ocorrer a ruptura do colaacutegeno

que suporta a parede capilar na BAC (WEST e MATHIEU-COSTELLO 1995)

Quando o estresse na parede capilar se eleva demasiadamente ocorrem

alteraccedilotildees ultra-estruturais na BAC uma condiccedilatildeo conhecida como falecircncia por

estresse descrita em atletas de elite humanos e em cavalos (WEST 2000)

BIRKS et al (1997) demonstraram a falecircncia por estresse e consequumlente

ruptura dos capilares pulmonares em cavalos exercitando a altas velocidades

havendo maior risco de ocorrecircncia da HPIE quando encontraram-se sob importante

aumento da pressatildeo arterial pulmonar (FIGURA 7)

FIGURA 7 ndash ELETROMICROGRAFIAS DA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) DE PULMOtildeES DE CAVALOS FIXADOS POR PERFUSAtildeO A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) A ULTRAESTRUTURA CAPILAR NORMAL B RUPTURA DO ENDOTEacuteLIO CAPILAR (SETAS) COM ERITROacuteCITOS ADJACENTES (ASTERISCO) NOTA-SE TAMBEacuteM ERITROacuteCITOS NO ESPACcedilO ALVEOLAR (PONTAS DE SETAS) C ERITROacuteCITO NO INTERSTIacuteCIO (ASTERISCO) D RUPTURA DO EPITEacuteLIO ALVEOLAR (SETAS) A ALVEacuteOLO C CAPILAR BAR 2 microm FONTE BIRKS et al (1997)

36

Portanto a falecircncia por estresse dos capilares pulmonares eacute a teoria aceita

para a ocorrecircncia da HPIE sendo causada pela elevada pressatildeo transmural nos

capilares pulmonares resultado do aumento da pressatildeo arterial pulmonar somada agrave

pressatildeo pleural inspiratoacuteria negativa (WEST 2000) (FIGURA 8)

FIGURA 8 ndash TREcircS FORCcedilAS AGEM NA BARREIRA ALVEacuteOLO-CAPILAR (BAC) TTMP TENSAtildeO CIRCUNFERENCIAL OU EM ARCO CAUSADA PELA PRESSAtildeO TRANSMURAL CAPILAR TEL Eacute A TENSAtildeO LONGITUDINAL NOS COMPONENTES DA PAREDE ALVEOLAR ASSOCIADA COM A INFLACcedilAtildeO PULMONAR PARTE DESTA Eacute TRASMITIDA Agrave BAC TST Eacute A TENSAtildeO DE SUPERFIacuteCIE DA CAMADA SUPERFICIAL ALVEOLAR ESTA APARENTEMENTE EXERCE UMA FORCcedilA DE ACcedilAtildeO INTERNA PARA SUPORTAR O CAPILAR QUANDO ESTE INTUMESCE PARA DENTRO DO ESPACcedilO ALVEOLAR A ALTAS PRESSOtildeES TRANSMURAL CAPILARES PALV PRESSAtildeO ALVEOLAR PCAP PRESSAtildeO CAPILAR FONTE WEST (2000)

Diversos estudos estiveram envolvidos em avaliar a participaccedilatildeo do NO no

aumento da pressatildeo arterial pulmonar no cavalo durante o exerciacutecio e na

fisiopatologia da HPIE Inicialmente evidenciou-se que cavalos realizando exerciacutecio

intenso apresentam hipoxemia arterial induzida pelo exerciacutecio (HAIE) (CHRISTLEY

et al 1997 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 DEMPSEY e WAGNER 1999

SAacuteNCHEZ et al 2005) o que resulta na inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO abolindo o

relaxamento vascular dependente do endoteacutelio (MILLS e HIGGINS 1997)

Portanto acreditou-se que a reduccedilatildeo da produccedilatildeo do NO durante o exerciacutecio

intenso poderia contribuir para a alta incidecircncia de HPIE nos cavalos de corrida

Contudo a administraccedilatildeo do antagonista da oacutexido niacutetrico sintase (NOS) N-nitro-L-

arginina metil ester (L-NAME) mostrou que o NO endoacutegeno resulta numa maior

37

extraccedilatildeo de O2 no repouso e no exerciacutecio submaacuteximo mas natildeo causou alteraccedilatildeo no

exerciacutecio intenso (MANOHAR e GOETZ 1998 MANOHAR et al 2006) A

administraccedilatildeo de L-NAME por KINDIG et al (2000) resultou em agravamento da

HPIE nos cinco animais estudados contudo natildeo observou-se aumento da pressatildeo

arterial pulmonar

MANOHAR e GOETZ (1999) avaliaram os efeitos da infusatildeo intravenosa de

nitroglicerina em cavalos realizando exerciacutecio e natildeo observaram alteraccedilotildees sobre a

incidecircncia ou severidade da HPIE

Adicionalmente KINDIG et al (2001) estudaram os efeitos do exerciacutecio na

pressatildeo arterial pulmonar e na HPIE em cavalos inalando NO Comparados aos

controles o grupo que inalou o NO apresentou uma pequena mas consistente

reduccedilatildeo na pressatildeo arterial pulmonar maacutexima mas com um significativo aumento da

HPIE nesses animais avaliado pelo aumento na contagem do nuacutemero de eritroacutecitos

no LBA Os autores entenderam que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete em

parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das

pressotildees arteriais pulmonares extremamente altas desencadeadas durante o

exerciacutecio maacuteximo em cavalos PSI Assim o tratamento com NO exoacutegeno natildeo soacute natildeo

ajudou como agravou a HPIE

Portanto em face aos achados relacionados agrave participaccedilatildeo do NO e da NOS

no cavalo em exerciacutecio maacuteximo e na HPIE satildeo necessaacuterias outras investigaccedilotildees a

respeito dos efeitos da inibiccedilatildeo da NOS e da produccedilatildeo do NO na circulaccedilatildeo

pulmonar e na HPIE (KINDIG et al 2000)

Apesar da maior atenccedilatildeo aos efeitos da HPIE e da pressatildeo arterial pulmonar

em cavalos realizando exerciacutecios intensos a HPIE tambeacutem passou a ser

demonstrada em cavalos envolvidos em atividades de menor intensidade sugerindo

que outros mecanismos podem estar envolvidos na fisiopatologia (EPP et al 2006)

VICINO (2007) demonstrou a ocorrecircncia de HPIE em cavalos de salto sendo

que cavalos que participaram de provas na altura entre 130 m ndash 150 m

apresentaram maior incidecircncia que aqueles que saltaram provas entre 100 m ndash 120

m

Neste contexto a associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar jaacute foi

demonstrada anteriormente (McKANE et al 1993 SAacuteNCHEZ et al 2005) Em

concordacircncia o estudo epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) evidenciou

38

uma significativa associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos puro

sangue inglecircs (PSI) jovens durante treinamento para corrida

O processo de hemorragia pulmonar pode culminar em irritaccedilatildeo e inflamaccedilatildeo

das vias aeacutereas o que exacerbaria a doenccedila inflamatoacuteria das vias aeacutereas inferiores

(ERICKSON e POOLE 2007) WEST e MATHIEU-COSTELLO (1999) sugerem que

alteraccedilotildees na BAC ativariam vias proacute inflamatoacuterias nas vias aeacutereas com a

participaccedilatildeo de LTB4 Possivelmente a membrana basal alveolar exposta apoacutes a

ruptura ativaria macroacutefagos alveolares sendo que estes satildeo ricos em LTB4

DERKSEN et al (2009) sugeriram uma hipoacutetese para a ocorrecircncia da HPIE

(FIGURA 9) onde a ocorrecircncia das altas pressotildees vasculares pulmonares levaria a

alteraccedilotildees venulares culminando na ruptura capilar sangramento inflamaccedilatildeo e

hemossiderose agravando o quadro da HPIE

FIGURA 9 ndash HIPOacuteTESE PARA A PATOGEcircNESE DA HPIE SEGUNDO DERSKEN et al (2009)

Contudo mediadores bem como os mecanismos inflamatoacuterios que estatildeo

envolvidos na fisiopatologia da HPIE ainda precisam ser esclarecidos

O diagnoacutestico da HPIE pode ser feito pela evidecircncia de sangue na traqueacuteia

visiacutevel atraveacutes de exame endoscoacutepico (HINCHCLIFF et al 2005b ERICKSON e

POOLE 2007) pela contagem de eritroacutecitos no LBA (MEYER et al 1998) ou pela

39

presenccedila de hemossideroacutefagos (macroacutefagos contendo hemossiderina ou eritroacutecitos)

no AT (EPPINGER 1990 MICHELOTTO JUacuteNIOR et al 2007) eou no LBA

(DOUCET e VIEL 2002 SAacuteNCHEZ et al 2005 BIAVA et al 2006) realizado uma

hora apoacutes o exerciacutecio A presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA eacute considerada a

forma mais sensiacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993)

Em resumo a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas acompanhada de

hiperresponsividade e hipersecreccedilatildeo de muco denominada doenccedila inflamatoacuteria das

vias aeacutereas (DIVA) bem como a hemorragia pulmonar induzida pelo exerciacutecio

(HPIE) satildeo causas de enormes perdas econocircmicas e de queda de rendimento

desportivo interrupccedilatildeo nos treinamentos e de encerramento de campanha em

cavalos de corrida Apesar disso a maioria dos estudos sobre as doenccedilas

inflamatoacuterias das vias aeacutereas dos cavalos satildeo direcionados para a ORVA e a

fisiopatologia da DIVA ainda estaacute pouco esclarecida bem como os mecanismos

inflamatoacuterios da HPIE ainda precisam ser mais bem estudados

Tendo-se em vista estes aspectos a hipoacutetese levantada no presente estudo

foi de que o desafio ambiental e o exerciacutecio fiacutesico estejam acompanhados de

estresse oxidativo alterando o quadro inflamatoacuterio possivelmente por alterar a

produccedilatildeo de PAF no pulmatildeo com consequumlente alteraccedilatildeo da funcionalidade celular

e que a hemorragia pulmonar pode exercer influecircncia sobre essa situaccedilatildeo As

ceacutelulas estudadas foram os macroacutefagos alveolares os quais podem apresentar um

papel central na regulaccedilatildeo deste processo

2 OBJETIVOS

21 OBJETIVOS GERAIS

Verificar alteraccedilotildees em paracircmetros cliacutenicos e inflamatoacuterios pulmonares em

cavalos puro sangue inglecircs (PSI) de corrida jovem submetidos ao desafio ambiental

e ao treinamento fiacutesico

22 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Avaliar os seguintes paracircmetros cliacutenicos e laboratoriais

- Avaliaccedilatildeo cliacutenica

- Avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas

- Avaliaccedilatildeo citoloacutegica das vias aeacutereas atraveacutes das teacutecnicas de aspirado

traqueal (AT) e de lavado broncoalveolar (LBA)

- Avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF bem como a concentraccedilatildeo de proteiacutenas

e a produccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos e nitritos no LBA

- Avaliaccedilatildeo da capacidade de produccedilatildeo de espeacutecies reativas de oxigecircnio

(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por macroacutefagos alveolares

bem como a capacidade fagocitaacuteria e de adesatildeo


(acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) por neutroacutefilos do sangue

perifeacuterico bem como a capacidade fagocitaacuteria

3 MATERIAIS E MEacuteTODOS

31 REAGENTES E SEDATIVOS

O BN52021 (Gingkolide B) foi obtido da Biomol (Plymouth Meeting PA USA)

Fura-2 AM (cat num F-0888) PAF (β-Acetyl-γ-O-hexadecyl-L-α-

phosphatidylcholine P-4904) foram obtidos da Sigma (St Louis MO USA) A

coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacuteticoreg) foi obtida da Laborclin (Pinhais PR Brasil) e

a acepromazina da Univet (Satildeo Paulo SP Brasil) A xylazina e o butorphanol foram

obtidos do laboratoacuterio Fort Dodge (Satildeo Paulo SP Brasil) Todos os demais

reagentes foram comprados da Sigma (St Louis MO USA)

32 ANIMAIS

Foram utilizados equinos machos adultos jovens (potros) da raccedila puro sangue

inglecircs (PSI) de cinco diferentes criatoacuterios (haras) da regiatildeo metropolitana de Curitiba

estado do Paranaacute (Haras Cifra e Haras dos Girassoacuteis em Piraquara Haras

Palmerini e Haras Belmont em Satildeo Joseacute dos Pinhais e Haras Santa Rita da Serra

em Tijucas do Sul e potros de quatro diferentes cocheiras no Jockey Club do

Paranaacute (Av Viacutector Ferreira do Amaral 2291 Tarumatilde Curitiba PR)

Inicialmente os potros foram divididos em trecircs grupos O primeiro grupo foi

denominado grupo condiccedilotildees naturais (CN n=45) compreendendo os potros dos

haras vivendo soltos em piquetes dia e noite alimentando-se de gramiacuteneas e

leguminosas da pastagem mais complemento peletizado fornecido no campo A

meacutedia de idade dos animais deste grupo foi de 145 plusmn 04 meses O segundo grupo

foi denominado grupo desafio ambiental (DA n=45) constituiacutedo por potros

estabulados por 30 dias com o propoacutesito de preparaacute-los para o iniacutecio de treinamento

Estes animais eram mantidos em grupos de 15 a 20 potros sendo que permaneciam

em baias individuais com dimensotildees de 35m x 35m x 35m em meacutedia em cama de

serragem e alimentados duas vezes ao dia com aveia mais raccedilatildeo peletizada e feno

de gramiacutenea e de alfafa A meacutedia de idade dos potros do grupo DA foi de 217 plusmn 29

meses O terceiro grupo foi denominado de grupo exerciacutecio (EX n=34) onde foram

incluiacutedos potros ineacuteditos (satildeo considerados ineacuteditos animais que ainda natildeo correram

42

em hipoacutedromos oficiais) mas que estavam em treinamento para corrida haacute

aproximadamente cinco meses e mantidos nas mesmas condiccedilotildees de estabulaccedilatildeo e

alimentaccedilatildeo que os potros do grupo DA Estes animais foram acompanhados

durante o periacuteodo de treinamento sendo que a avaliaccedilatildeo cliacutenica endoscoacutepica e a

colheita de LBA ocorreu 24 horas apoacutes seu primeiro exerciacutecio intenso (15 ms ndash 16

ms) em 800m ndash 1000m de distacircncia na pista de areia do Jockey Club do Paranaacute A

meacutedia de idade dos potros do grupo EX foi de 270 plusmn 03 meses

A obtenccedilatildeo de dados para o presente trabalho de pesquisa ocorreu durante

uma sequumlecircncia de experimentos independentes durante um periacuteodo de 18 meses

Durante este periacuteodo grupos de potros foram acompanhados ateacute se encontrarem

nas condiccedilotildees estabelecidas para cada grupo quando entatildeo foram avaliados As

amostras do grupo CN foram obtidas de oito diferentes experimentos sendo dois

durante o veratildeo dois durante o inverno trecircs durante a primavera e um no outono

As amostras do grupo DA foram provenientes de seis experimentos sendo dois

durante o veratildeo dois no inverno e dois no outono e para o grupo EX os resultados

advieram de amostras obtidas durante o veratildeo em cinco ocasiotildees e durante a

primavera em quatro totalizando nove experimentos independentes para este grupo

Os resultados apresentados para cada uma das anaacutelises provecircm de pelo menos

trecircs experimentos independentes

Todos os animais estudados eram pertencentes a estabelecimentos com

programa de desverminaccedilatildeo bimensal bem como foram todos vacinados

regularmente contra Influenza Equina e Herpes Viacuterus Equino tipos 1 e 4 A

alimentaccedilatildeo utilizada nos estabelecimentos que cederam os potros para o estudo

era similar bem como a anaacutelise da alimentaccedilatildeo utilizada para os potros dos trecircs

grupos natildeo diferiu no que se refere a constituintes essenciais que poderiam

influenciar nas avaliaccedilotildees realizadas no presente trabalho Os criteacuterios de inclusatildeo

para os potros dos trecircs grupos foram os estabelecidos e jaacute descritos previamente

nas caracteriacutesticas de cada grupo e a exclusatildeo do estudo ocorreu quando da

histoacuteria de doenccedila recente ou diferenccedilas em manejo

As comparaccedilotildees intergrupos foram feitas entre os grupos CN e DA (diferenccedila

ambiental) e entre os grupos DA e EX (diferenccedila no regime de exerciacutecio)

Na segunda etapa do trabalho dedicada ao estudo da hemorragia pulmonar

induzida pelo exerciacutecio (HPIE) avaliou-se somente os potros do grupo EX agora

com n=37 Este grupo foi dividido em subgrupos sendo o subgrupo HPIE pos (n=23

43

constituiacutedo por potros com qualquer percentual de hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo

citoloacutegica do LBA) e subgrupo HPIE neg (n=14 constituiacutedo por potros sem

hemossideroacutefagos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica do LBA) Nesta etapa as comparaccedilotildees

realizadas foram entre os subgrupos HPIE pos e HPIE neg

33 ASPECTOS EacuteTICOS

Este trabalho de pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em

Experimentaccedilatildeo Animal (CEEA) do setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR sob o

nuacutemero de registro 168 e pelo Comitecirc de Eacutetica no Uso de Animais (CEUA) da

Pontifiacutecia Universidade Catoacutelica do Paranaacute sob o nuacutemero de registro 129 e estaacute de

acordo com o Guiding Principles in the Care and Use of Animals

34 AVALIACcedilAtildeO CLIacuteNICA

Preacutevio agrave colheita de material procedeu-se a avaliaccedilatildeo cliacutenica de cada potro

iniciada pela histoacuteria incluindo possiacuteveis ocorrecircncias meacutedicas relevantes agrave sauacutede do

sistema respiratoacuterio manejo alimentaccedilatildeo desverminaccedilatildeo e vacinaccedilatildeo Na histoacuteria

incluiu-se tambeacutem a informaccedilatildeo sobre a ocorrecircncia de tosse espontacircnea quando em

piquetes na baia no momento da alimentaccedilatildeo ou durante o treinamento O exame

fiacutesico incluiu a observaccedilatildeo da presenccedila de secreccedilatildeo nasal estiacutemulo da tosse

palpaccedilatildeo de linfonodos submandibulares e retrofaringeanos auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e

auscultaccedilatildeo traqueal e pulmonar (McGORUM e DIXON 2007)

35 AVALIACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DAS VIAS AEacuteREAS

A avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas foi realizada previamente a

realizaccedilatildeo do LBA com o animal tranquumlilizado atraveacutes da administraccedilatildeo de

acepromazina (acepran 1 Univet) (003 mgkg IM) e apoacutes 30 minutos seguindo-

se a administraccedilatildeo de xilazina (sedazine Fort Dodge) (03-05 mgkg IV) mais

butorfanol (torbugesic Fort Dodge) (005 mgkg IV) (HOFFMAN 1999 HEWSON e

VIEL 2002) Utilizou-se um fibroscoacutepio flexiacutevel Pentax de 170 cm de comprimento e

128 mm de diacircmetro para a avaliaccedilatildeo das vias aeacutereas superiores e inferiores ateacute a

bifurcaccedilatildeo da traqueacuteia

44

A presenccedila de foliacuteculos linfoacuteides na faringe foi graduada segundo RAKER e

BOWLES (1978) adotando-se a graduaccedilatildeo de I a IV (QUADRO 1) e graus III e IV

foram considerados como faringite

A movimentaccedilatildeo das cartilagens aritenoacuteides foi graduada de I a IV segundo

RACKESTRAW et al (1991) (QUADRO 2) e graus III e IV foram considerados como

anormais

GRADUACcedilAtildeO SIGNIFICADO

Grau I Faringe com poucos foliacuteculos claros na parede dorsal

Grau II Presenccedila de numerosos pequenos foliacuteculos juntamente a

hiperemia cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe

Grau III Presenccedila de grandes grupos de foliacuteculos hiperecircmicos

cobrindo a superfiacutecie dorsal e lateral da faringe

Grau IV Presenccedila de foliacuteculos grandes edematosos e hiperecircmicos

por toda a mucosa faringeana

QUADRO 1 ndash GRADUACcedilAtildeO DA PRESENCcedilA DE FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES NA FARINGE FONTE RAKER E BOWLES (1978)


Grau I Movimentaccedilatildeo sincrocircnica e abduccedilatildeo completa das

cartilagens aritenoacuteides

Grau II Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores

fraqueza na abduccedilatildeo) da cartilagem aritenoacuteide esquerda

durante qualquer fase da respiraccedilatildeo com abduccedilatildeo

completa da cartilagem aritenoacuteide esquerda (em relaccedilatildeo

agrave direita) conseguida com a degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal

Grau III Movimentaccedilatildeo assincrocircnica (hesitaccedilatildeo tremores


durante qualquer fase da respiraccedilatildeo e a abduccedilatildeo


agrave direita) natildeo eacute conseguida na degluticcedilatildeo nem na

oclusatildeo nasal

Grau IV

(Hemiplegia

Laringeana)

Cartilagem aritenoacuteide esquerda posicionada

medialmente na glote e natildeo apresenta movimento

quando da degluticcedilatildeo ou oclusatildeo nasal

QUADRO 2 ndash GRADUACcedilAtildeO DA MOVIMENTACcedilAtildeO DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE I A IV FONTE RACKESTRAW et al (1991)

45

Especial interesse foi dado agrave presenccedila de muco no lume traqueal e sua

quantificaccedilatildeo atraveacutes de graduaccedilatildeo de 0 a 5 conforme GERBER et al (2004)

(FIGURA 10)

FIGURA 10 ndash GRADUACcedilAtildeO DE 0 a 5 PARA A QUANTIDADE DE MUCO TRAQUEAL OBSERVADA DURANTE O EXAME ENDOSCOacutePICO FONTE GERBER et al 2004

Quando da observaccedilatildeo de muco traqueal este foi aspirado atraveacutes de tubo

de silicone introduzido pelo canal de trabalho do endoscoacutepio sendo imediatamente

transferido para uma lacircmina de microscopia e deixado para secar ao ar As lacircminas

foram coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico Laborclin Pinhais PR

Brasil) e 500 ceacutelulas foram contadas em aumento de 1000X (HODGSON e

HODGSON 2003)

Foi considerado achado citoloacutegico normal para o aspirado traqueal (AT)

contendo lt10 de linfoacutecitos lt1 de eosinoacutefilos e lt20 de neutroacutefilos (ROBINSON

2003 HODGSON e HODGSON 2007)

36 COLHEITA E PROCESSAMENTO DO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA)

Para a realizaccedilatildeo do LBA foi utilizado um cateter flexiacutevel de silicone

especiacutefico para a obtenccedilatildeo de LBA de equinos marca Cook (V-PBAL-300 Cook Vet

Products Hamburg Alemanha) de 300 cm de comprimento e 8 mm de diacircmetro

Este foi introduzido agraves cegas via nasotraqueal preferencialmente do lado direito ateacute

se alojar em um brocircnquio quando o cuff na extremidade distal era inflado com 5-10

mL de ar Utilizou-se 300 mL de soluccedilatildeo salina fosfatada tamponada (PBS) esteacuteril e

com heparina soacutedica (5 UImL de PBS) preacute-aquecidos a 37oC (HOFFMAN 1999

PICKLES et al 2002abc MORI et al 2003 RIIHIMAumlKI et al 2008b) O PBS era

infundido em aliacutequotas de 120 mL (HEWSON e VIEL 2002) aspirando-se

46

gentilmente apoacutes cada aliacutequota e dispensando-se o LBA recolhido em frascos

plaacutesticos esteacutereis mantidos em isopor com gelo Este procedimento foi repetido ateacute

que o volume de 300 mL era totalmente empregado O material recolhido foi mantido

refrigerado em isopor com gelo ateacute a chegada ao Laboratoacuterio de Metabolismo

Celular no Departamento de Fisiologia do Setor de Ciecircncias Bioloacutegicas da UFPR

para o processamento em menos de 3 horas apoacutes a colheita (PICKLES et al 2002c

VIEL e HEWSON 2003)

No laboratoacuterio o LBA era centrifugado a 340g (1300 rpm) por seis minutos a

40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA) e o pellet obtido foi

ressuspendido em 2 mL de PBS para a contagem do nuacutemero total de ceacutelulas

nucleadas (NTCN)

37 AVALIACcedilAtildeO CITOLOacuteGICA DO LBA

A contagem do NTCN foi realizada usando-se a cacircmara de Neubauer Uma

aliacutequota da suspensatildeo de ceacutelulas foi diluiacuteda 110 em PBS em um frasco de

centrifugaccedilatildeo de 15 mL de fundo cocircnico (Eppendorf) Desta uma aliacutequota de 50 microL

foi misturada a 50 microL do corante vital Azul de Tripan para a contagem das ceacutelulas

vivas A partir do nuacutemero de ceacutelulas vivas por mililitro da suspensatildeo de ceacutelulas a

concentraccedilatildeo da suspensatildeo de ceacutelulas foi ajustada para 5 x 106 ceacutelulasmL para as

avaliaccedilotildees da atividade de macroacutefago alveolar (fagocitose produccedilatildeo de acircnion

superoacutexido produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio e adesatildeo ndash ver toacutepicos 315 316

317 e 318)

Para a avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA lacircminas para microscopia

foram preparadas a partir de 10 μL da suspensatildeo de ceacutelulas distribuiacutedos de forma

circular sobre a lacircmina secadas ao ar e coradas com coloraccedilatildeo de Romanowski

(Panoacutetico Laborclin Pinhais PR Brasil) (HEWSON e VIEL 2002) e 500 ceacutelulas

foram contadas em aumento de 1000X

Foi considerado achado citoloacutegico normal para o LBA contendo em meacutedia

60 de macroacutefagos 35 de linfoacutecitos lt5 de neutroacutefilos lt2 de mastoacutecitos lt1

de eosinoacutefilos (ROBINSON 2003 MAZAN e HOFFMAN 2003 RICHARD et al

2009)

47

38 EXTRACcedilAtildeO LIPIacuteDICA TOTAL DAS CEacuteLULAS DO LBA (FOLCH ET AL 1957)

Uma porccedilatildeo correspondente a 90 mg de pellet de ceacutelulas do LBA foi

ressuspendido em um solvente extrator (metanolclorofoacutermio12 volvol) na

quantidade de 18 mL e sonicado (6 ciclos de 4 segundos) Os tubos foram

deixados em gelo por 20 minutos

Na etapa seguinte mais metanol foi adicionado (324 microL o caacutelculo eacute a

quantidade de sovente extrator x 0180 resultando na quantidade de metanol em

mililitros) para reduzir a densidade do liacutequido e possibilitar assim a decantaccedilatildeo do

material particulado insoluacutevel no meio Apoacutes o material foi centrifugado a 5000g por

10 minutos a 40C (Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)

O sobrenadante foi transferido para tubos de vidro e clorofoacutermio foi

adicionado (648 microL ou seja o dobro da quantidade de metanol utilizada

anteriormente)

Na sequumlecircncia o extrato foi lavado uma vez com 19 mL de aacutegua ultra pura O

sistema bifaacutesico formado foi submetido a uma intensa agitaccedilatildeo ateacute natildeo serem mais

distinguiacuteveis as duas fases (forma-se momentaneamente uma emulsatildeo) Nesta

etapa substacircncias com maior afinidade agrave aacutegua do que ao solvente orgacircnico satildeo

solubilizadas no meio aquoso e portanto se separam dos lipiacutedios

Apoacutes a reconstituiccedilatildeo espontacircnea do sistema bifaacutesico o sobrenadante

(aquoso) foi removido com o auxiacutelio de uma micropipeta cuidando-se para natildeo

retirar o que se encontrava abaixo

Em seguida foi adicionado o FSP (CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM NaCl 497

mM clorofoacutermio 30 metanol 490 aacutegua ultra pura 480) lentamente (para

evitar a formaccedilatildeo de emulsatildeo) e de maneira que as paredes do tubo fossem lavadas

com esta soluccedilatildeo Apoacutes a remoccedilatildeo do sobrenadante este procedimento foi repetido

mais duas vezes

A mistura de clorofoacutermio e metanol na qual estavam dissolvidos os lipiacutedios

foi evaporada em banho-maria a 370C sob corrente de nitrogecircnio O extrato lipiacutedico

seco foi armazenado a -800C em atmosfera de nitrogecircnio Para a determinaccedilatildeo da

bioatividade de PAF (toacutepico 310) esses extratos foram solubilizados em 100 microL de

DMSO sob agitaccedilatildeo intensa

48

39 ISOLAMENTO DAS CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS

O sangue de cavalo foi colhido em bolsas de transfusatildeo (CPDA-1 JP

Induacutestria Farmacecircutica SA Satildeo Paulo Brasil) atraveacutes de punccedilatildeo venosa jugular

O sangue foi diluiacutedo 11 (vv) em PBS e 40 mL do sangue diluiacutedo foram

adicionados a tubos para centriacutefuga esteacutereis (tubos Falcon de 50 mL) sobre 8 mL de

Ficoll Paque Plus e centrifugado (400g por 40 minutos a 40C) para o isolamento das

ceacutelulas PMN por gradiente

Apoacutes a centrifugaccedilatildeo a camada superior composta por plasma soluccedilatildeo de

Ficoll e ceacutelulas mononucleares foi descartada A camada inferior composta

principalmente por PMNs e eritroacutecitos foi dividida em duas aliacutequotas iguais as quais

foram separadas em dois tubos para centriacutefuga A cada aliacutequota foi adicionada

soluccedilatildeo hemoliacutetica (NH4Cl 077 tris[hydroxymethyl]aminomethane 021 pH 74

soluccedilatildeo aquosa) para completar 50 mL e incubadas por 20 minutos a 370C em

estufa

A seguir a suspensatildeo celular livre dos eritroacutecitos foi centrifugada (400g 6

min 4oC) O sobrenadante foi descartado e o pellet de ceacutelulas (basicamente PMNs)

foi ressuspendido em 5 mL de PBS contendo glucose 5 mM A densidade de ceacutelulas

foi determinada em cacircmara de Neubauer e ajustada para 10 x 107 ceacutelulas

viaacuteveismL

A viabilidade celular foi determinada atraveacutes do corante vital Azul de Tripan e

resultou aproximadamente 95 A percentagem de neutroacutefilos na suspensatildeo de

PMNs foi superior a 90 determinada pela coloraccedilatildeo de Romanowski (Panoacutetico

Laborclin Pinhais PR Brasil)

310 MENSURACcedilAtildeO DO INFLUXO DE Ca++ EM PMNS INDUZIDO POR PAF

(BIOATIVIDADE DE PAF) (MARATHE et al 2001)

Agrave suspensatildeo de PMNs (toacutepico 39) na densidade de 10 x 107 ceacutelulas

viaacuteveismL foi adicionado FURA-2 AM (Sigma soluccedilatildeo estoque 1 nM em DMSO)

para concentraccedilatildeo final de 1 microM A suspensatildeo foi incubada em ambiente escuro a

37oC por 45 minutos

Nesta etapa os PMNs incorporaram o FURA-2 AM um indicador fluorescente

de caacutelcio Quando o FURA-2 AM estaacute ligado ao Ca++ haacute reduccedilatildeo da eficiecircncia de

49

excitaccedilatildeo a 380 nm e aumento da eficiecircncia de excitaccedilatildeo a 340 nm observados no

comprimento de onda de emissatildeo de 510 nm Com isso eacute possiacutevel quantificar a

concentraccedilatildeo de Ca++ intracelular nas ceacutelulas carregadas com FURA-2 AM atraveacutes

da relaccedilatildeo da intensidade de emissatildeo a 510 nm entre os comprimentos de onda de

excitaccedilatildeo de 340 nm e de 380 nm (relaccedilatildeo 340380 nm)

Apoacutes a incubaccedilatildeo as ceacutelulas foram lavadas duas vezes com soluccedilatildeo de

Ringer (NaCl 1425 mM KCl 40 mM CaCl2 18 mM MgCl2 18 mM 50 mM 4-(2-

hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid glicose 50 mM pH 74 soluccedilatildeo

aquosa) para a remoccedilatildeo do FURA-2 AM que natildeo foi incorporado agraves ceacutelulas

As ceacutelulas entatildeo foram ressuspendidas em soluccedilatildeo de Ringer para uma

concentraccedilatildeo final de 225 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL Esta foi a preparaccedilatildeo utilizada

na leitura de fluorescecircncia

A suspensatildeo de ceacutelulas foi mantida em gelo ateacute a sua utilizaccedilatildeo Aliacutequotas de

2 mL eram previamente incubadas em banho-maria por 4 minutos a 37oC no escuro

(tubo envolto em papel alumiacutenio) previamente a serem transferidas para uma cubeta

para a leitura da fluorescecircncia em espectrofluoriacutemetro acoplado a um

microcomputador (RF5301PC Shimadzu Kyoto Japatildeo) controlado pelo software

Super Ion Probe (Shimadzu Kyoto Japatildeo) Durante esta incubaccedilatildeo as ceacutelulas que

seriam utilizadas como controle negativo para PAF foram tratadas com antagonista

de receptor de PAF BN52021 (Biomol soluccedilatildeo 10 mM em DMSO)

Foi utilizada excitaccedilatildeo dual com comprimentos de onda 340 nm e 380 nm

(janela de leitura de 2 segundos) com emissatildeo registrada a 510 nm A temperatura

foi mantida em 37oC pelo sistema termostatisado do aparelho A leitura da

fluorescecircncia consistiu primeiramente da obtenccedilatildeo de uma linha de base nos

primeiros 50 segundos Apoacutes esta leitura inicial foram adicionados 10 microL do extrato

lipiacutedico (toacutepico 38) agrave suspensatildeo de ceacutelulas seguindo-se a agitaccedilatildeo (por 3

segundos) com uma barra magneacutetica presente dentro da cubeta A leitura foi feita

entatildeo por mais 100 segundos

Para cada amostra foram realizados os procedimentos descritos na presenccedila

e na ausecircncia de BN52021 A resposta maacutexima obtida pelo tratamento da

suspensatildeo de PMNs com extrato lipiacutedico na presenccedila de BN52021 foi subtraiacuteda da

resposta maacutexima obtida na ausecircncia deste antagonista O resultado desta subtraccedilatildeo

foi utilizado como indicador semiquantitativo da bioatividade de PAF no extrato

lipiacutedico e os resultados foram expressos como relaccedilatildeo 340380 nm

50

Antes de analisar as amostras de extrato lipiacutedico para a bioatividade de PAF

a cada experimento a suspensatildeo de PMNs tratada com FURA-2 AM foi testada com

PAF (1-0-palmitil-2-acetil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina soluccedilatildeo estoque de 3 mM em

DMSO da Sigma) nas concentraccedilotildees de 1 10 e 100 nM e com 100 nM na presenccedila

de 150 microM de BN52021 (concentraccedilatildeo suficiente para antagonizar 102 nM de PAF)

A resposta dos PMNs de equinos aos padrotildees de PAF eacute mostrada na FIGURA 11

sendo representativa dos dados obtidos em todos os experimentos

FIGURA 11 ndash REGISTRO DA FLUORESCEcircNCIA CAUSADA PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS POLIMORFONUCLEARES (PMN) DE EQUINOS (225 x 106 CEacuteLULAS PMNmL SUSPENSAtildeO) MENSURADA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm COM EMISSAtildeO REGISTRADA A 510 nm () SUSPENSAtildeO DE PMN () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 1 nM (diams) SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 10 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + PAF 100 nM () SUSPENSAtildeO DE PMN + BN52021 150 microM + PAF 100 nM A EMISSAtildeO BASAL DAS CEacuteLULAS PMN FOI REGISTRADA POR 50 SEGUNDOS PREVIAMENTE Agrave ADICcedilAtildeO DE PAF

Os PMNs do sangue de equinos foram utilizados no presente estudo como

uma ferramenta para a avaliaccedilatildeo da bioatividade de PAF (pelo influxo de Ca++ nos

PMNs induzido por PAF) Para a determinaccedilatildeo da viabilidade desta ferramenta

estudou-se a resposta dos PMNs do sangue de equino a diferentes concentraccedilotildees

de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na ausecircncia do antagonista de

PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose de neutroacutefilos e a produccedilatildeo de acircnion

superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio por neutroacutefilos pelas teacutecnicas descritas

51

abaixo (ver toacutepicos 315 ndash fagocitose de macroacutefago alveolar 316 ndash produccedilatildeo de

acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar e 317 ndash produccedilatildeo de peroacutexido de

hidrogecircnio por macroacutefago alveolar) sendo que para cada ensaio foram realizadas

quatro repeticcedilotildees Igualmente estudou-se a resposta do macroacutefago alveolar a

diferentes concentraccedilotildees de PAF (01nM 1nM 10nM e 100nM) na presenccedila e na

ausecircncia do antagonista de PAF BN52021 avaliando-se a fagocitose e a produccedilatildeo

de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio tambeacutem realizando-se quatro

repeticcedilotildees para cada anaacutelise

311 CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA (BRADFORD 1976)

Em microplaca de 96 poccedilos 250microL de reagente de Bradford (100mg de

Coomassie Blue 50 mL de etanol 95 + 100 mL de aacutecido fosfoacuterico 85 completar

com aacutegua ultra pura para 1000 mL) foi adicionado a 10 microL de LBA sem ceacutelulas

(sobrenadante obtido apoacutes a primeira centrifugaccedilatildeo do LBA durante seu

processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA) Nesta etapa o

corante Comassie eacute complexado por proteiacutenas presentes na amostra o que muda a

sua cor

Apoacutes 5 minutos em temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada a

595 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-Rad

Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) A concentraccedilatildeo de proteiacutenas foi determinada

interpolando-se os valores de absorbacircncia numa curva padratildeo resultante de

concentraccedilotildees conhecidas de albumina seacuterica bovina (Sigma) Os resultados foram

expressos como miligramas de proteiacutenas por mililitro de LBA

312 CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS DO LBA (STUEHR e MARLETTA 1985)

A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA foi utilizada como indicador da produccedilatildeo de

oacutexido niacutetrico na regiatildeo broncoalveolar

Em micro placa de 96 poccedilos adicionou-se 100 microL de reagente de Griess

(mistura de cloreto de naftiletilenodiamina a 005 e por sulfanilamida a 05 em

meio aacutecido proporcionado por H3PO4 a 25) a 100 microL de LBA sem ceacutelulas


processamento (ver toacutepico 36 - Colheita e Processamento do LBA)

52

A sulfanilamida (um derivado de anilina) reage com o aacutecido nitroso e apoacutes

rearranjos intramoleculares forma o iacuteon diazocircnio Apoacutes o iacuteon diazocircnio reage com a

naftiletilenodiamina (um derivado de naftilamina) para formar pigmento roacuteseo

Depois de 5 minutos na temperatura ambiente a absorbacircncia foi mensurada

a 550 nm utilizando-se um espectrofotocircmetro para micro placas (Benchmark Bio-

Rad Laboratoacuterios do Brasil Rio de Janeiro) Os resultados foram expressos como

absorbacircncia a 550 nm

313 CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO

LBA (NOUROOZ-ZADEH et al 1994)

Utilizou-se uma aliacutequota de suspensatildeo de ceacutelulas de LBA na densidade de

15 x 106 ceacutelulasmL de LBA Esta foi ultrasonicada (6 ciclos de 4 segundos) em 1mL

de metanol sendo centrifugada em seguida a 5000g por 5 minutos a 40C

(Centrifuge 5810 R Eppendorf Bloomington IN EUA)

Uma aliacutequota de 50 microL de sobrenadante foi armazenada para posterior

mensuraccedilatildeo da concentraccedilatildeo total de proteiacutenas

Para cada amostra aliacutequotas de 90 microL foram depositadas em seis frascos

para centriacutefuga (de 15 mL Eppendorf) foi agitada no voacutertex e incubada por 30

minutos a temperatura ambiente A trecircs desses tubos foram adicionados 10 microL de

soluccedilatildeo metanoacutelica de trifenilfosfina (TPP Sigma) 10 mM para ocorrer a reduccedilatildeo

seletiva de hidroperoacutexidos (os grupamentos hidroperoacutexido especificamente os

presentes em lipiacutedios satildeo convertidos a grupamentos hidroxila pela trifenilfosfina)

As amostras contidas nos trecircs tubos restantes receberam apenas 10 microL de metanol

Todos os tubos foram agitados vigorosamente e entatildeo incubados em temperatura

ambiente por 30 minutos

Apoacutes adicionou-se a todos os tubos 900 microL de reagente de FOX2 Este

reagente deve ser preparado no momento do uso consistindo de xilenol laranja 100

microM hidroxitolueno butilado (BHT) 400 mM aacutecido sulfuacuterico 25 mM e sulfato ferroso

de amocircnio 250 microM em metanol 90 (vv em aacutegua) Apoacutes agitaccedilatildeo o meio

reacional foi incubado por mais 30 minutos a temperatura ambiente

Nesta etapa os caacutetions ferrosos (Fe2+) do reativo de FOX2 satildeo oxidados por

hidroperoacutexidos presentes na amostra (tanto pelos hidroperoacutexidos lipiacutedicos quanto

por outros tipos de hidroperoacutexidos presentes na amostra) Como todos os

53

hidroperoacutexidos lipiacutedicos das amostras tratadas com TPP foram reduzidos a

produccedilatildeo de Fe3+ seraacute menor nestas do que nas amostras natildeo tratadas com TPP

O Fe3+ formado eacute entatildeo quelado pelo xilenol laranja o que faz a cor deste

indicador passar de laranja a azul-puacuterpura (passa a absorver luz em 560 nm)

Passado o tempo de incubaccedilatildeo a absorbacircncia foi mensurada a 560 nm

utilizando-se um espectrofotocircmetro (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil

Satildeo Paulo)

Subtraiu-se entatildeo o valor da absorbacircncia das amostras tratadas com TPP

(sem hidroperoacutexidos lipiacutedicos) do valor da absorbacircncia das amostras sem TPP O

valor obtido nessa subtraccedilatildeo (referente apenas agrave quantidade de ferro oxidado por

hidroperoacutexidos lipiacutedicos) foi utilizado na foacutermula da curva padratildeo de peroacutexido de

hidrogecircnio obtida com soluccedilotildees padratildeo de diferentes concentraccedilotildees (1000 500

250 125 62 31 e 16 microM) submetidas aos mesmos procedimentos descritos

acima para a dosagem de hidroperoacutexidos (com exceccedilatildeo ao tratamento com TPP) O

resultado obtido foi referente agrave concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos

Dividiu-se o valor da concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos pela

concentraccedilatildeo de proteiacutenas totais do extrato metanoacutelico Os resultados foram

expressos como nmolesmg de proteiacutenas

314 ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA (AEBI 1984)

Utilizou-se 300 microL de uma suspensatildeo de ceacutelulas de LBA em PBS na

densidade de 5 x 106 ceacutelulasmL que foram centrifugados (10600g por 20min a

4oC) para remoccedilatildeo de partiacuteculas

Apoacutes foi colocada em banho com gelo Uma aliacutequota de 10 microL desse extrato

de ceacutelulas foi adicionada a 990 microL de meio reativo (soluccedilatildeo aquosa de H2O2 20 mM

tris[hidroximetil] aminometano 005M e EDTA 025 mM pH 74)

Imediatamente utilizando-se um espectrofotocircmetro acoplado a um

microcomputador (Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech do Brasil Satildeo Paulo)

monitorou-se a absorbacircncia a 220 nm por 90 segundos a 370C com intervalos de 2

segundos entre leituras consecutivas

A degradaccedilatildeo do peroacutexido de hidrogecircnio pela catalase causa uma diminuiccedilatildeo

gradual na absorbacircncia do meio reativo a 220 nm a qual indica a atividade da

catalase no extrato de ceacutelulas Os valores de atividade da catalase foram corrigidos

54

pela concentraccedilatildeo de proteiacutenas do extrato de ceacutelulas (realizado conforme descrito

no toacutepico 311) e foram expressos como micromoles de H2O2minmg proteiacutenas

315 FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (DYRYNDA et al 1998)

Em micro placas de 96 poccedilos adicionou-se em triplicatas aliacutequotas de

100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulas viaacuteveismL (= 5 x 105

ceacutelulaspoccedilo) e os macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A

suspensatildeo de ceacutelulas na densidade descrita foi obtida durante o processamento do

LBA (ver toacutepico 37)

Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS e foram adicionados

20microL de zymosan corado com vermelho neutro (67 mgmL) mais 100 microL de PBS

sendo deixados a temperatura ambiente por 30 minutos

Em seguida depois de descartado o sobrenadante as ceacutelulas foram fixadas

com soluccedilatildeo de Baker (4 formaldeiacutedo 2 cloreto de soacutedio 1 acetato de caacutelcio

soluccedilatildeo aquosa) por 30 minutos

Apoacutes os poccedilos foram lavados com PBS para que o zymosan corado com

vermelho neutro natildeo fagocitado por macroacutefagos alveolares fosse retirado

Em seguida o corante vermelho neutro foi solubilizado em cada poccedilo com

200microL de soluccedilatildeo aacutecido-aacutelcool (aacutecido aceacutetico 1 etanol 50 soluccedilatildeo aquosa) e

deixado por 30 minutos

Apoacutes este periacuteodo a absorbacircncia foi mensurada a 550 nm Os resultados

foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 -

Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)


(DYRYNDA et al 1998)

Estimou-se a produccedilatildeo de acircnions pela da formaccedilatildeo de formazan produto da

reduccedilatildeo do NBT (nitroblue tetrazolium) pelo acircnion superoacutexido Avaliou-se a produccedilatildeo

de acircnion superoacutexido por macroacutefago alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA

(phorbol myristate acetate) O PMA estimula o complexo NADPH oxidase na

membrana dos fagoacutecitos a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio

55

mimetizando o resultado da fagocitose de um microorganismo (DEKKER et al

2000)


100microL de uma suspensatildeo contendo 5 x 106 ceacutelulasmL (= 5 x 105 ceacutelulaspoccedilo) e os

macroacutefagos foram deixados para aderir por 1 hora a 370C A suspensatildeo de ceacutelulas

na densidade descrita foi obtida durante o processamento do LBA (ver toacutepico 37)

Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para a retirada das

ceacutelulas natildeo aderentes Em seguida adicionou-se a cada poccedilo 100 microL de PBS com

NBT 02 ou com NBT 02 mais PMA 11microM sempre em triplicatas para cada

potro

Apoacutes a incubaccedilatildeo por 1 hora a 370C e em ambiente escuro (a placa deve

estar envolta em papel alumiacutenio) a placa foi centrifugada (800g por 5 minutos a

40C) Em seguida o sobrenadante foi descartado e 100 microL de PBS foram

adicionados a cada poccedilo e a placa foi novamente centrifugada

Apoacutes o sobrenadante foi descartado e as ceacutelulas foram fixadas com metanol

por 10 minutos Em seguida a placa passou por nova centrifugaccedilatildeo o sobrenadante

foi descartado e a placa foi deixada secar ao ar em estufa

Em seguida a placa foi lavada duas vezes com metanol 50 e o formazan

(produto da reaccedilatildeo entre o NBT e o acircnion superoacutexido) foi solubilizado atraveacutes da

incubaccedilatildeo por 30 minutos com 120 microL soluccedilatildeo aquosa de hidroacutexido de potaacutessio 2M

e 140 microL de dimetilsulfoacutexido por poccedilo

A absorbacircncia foi lida a 595 nm e os resultados foram corrigidos pela adesatildeo

de macroacutefago alveolar de cada potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago

Alveolar)


ALVEOLAR (PICK e MIZEL 1981)

Mensurou-se a produccedilatildeo de peroacutexido de hidrogecircnio (H2O2) por macroacutefago

alveolar natildeo estimulado e estimulado por PMA atraveacutes da oxidaccedilatildeo do vermelho

fenol pela peroxidase onde esta enzima utiliza nesta reaccedilatildeo o H2O2 O composto

oxidado absorve luz em pH baacutesico com maacutexima intensidade em 550 nm

56





Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS observando-se a retirada

de grumos presentes nos poccedilos Em seguida 100 microL de soluccedilatildeo de vermelho fenol

(PRS phenol red solution 140 mM NaCl 10 mM fosfato de potaacutessio 55 mM

dextrose 056 mM vermelho fenol 19 UmL de HRPO horse radish peroxidase pH

70 soluccedilatildeo aquosa) ou soluccedilatildeo de vermelho fenol + PMA 110nM foram adicionados

a cada poccedilo em triplicatas e deixados incubar por 1 hora a 370C no escuro

Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo adicionou-se 10 microL de NaOH 1N para

interromper a reaccedilatildeo alcalinizar o meio e permitir a absorbacircncia da soluccedilatildeo que foi

lida a 595 nm apoacutes 30 minutos

Os resultados foram corrigidos pela adesatildeo de macroacutefago alveolar de cada

potro (ver toacutepico 318 - Adesatildeo de Macroacutefago Alveolar)

318 ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR (ROSEN e GORDON 1987)





Apoacutes os poccedilos foram lavados duas vezes com PBS para se selecionar as

ceacutelulas aderentes que a seguir foram fixadas com metanol 50 por 10 minutos

Apoacutes este periacuteodo o sobrenadante foi descartado e 100 microL de corante de

Giemsa a 02 foram adicionados a cada poccedilo e deixados por 40 minutos em

temperatura ambiente

Os poccedilos foram novamente lavados com PBS por duas vezes observando-se

a retirada de grumos nos poccedilos e 200 microL de metanol 50 foram adicionados

Apoacutes 30 minutos a absorbacircncia da suspensatildeo foi lida a 550 nm

A adesatildeo resultou menor no grupo DA (n=17) em comparaccedilatildeo ao grupo CN

(n=36) (P=0010) sendo que o grupo EX (n=26) apresentou adesatildeo maior que o

grupo DA (P=0001) (FIGURA 12) indicando diferenccedilas na capacidade de adesatildeo

em placa acriacutelica possivelmente devido a diferenccedilas no estado funcional das ceacutelulas

57

de cada grupo Por esta razatildeo utilizou-se o ensaio de adesatildeo de macroacutefago

alveolar realizado concomitantemente aos ensaios de funccedilatildeo de macroacutefago

(fagocitose e produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio) a cada

experimento realizado durante o estudo A correccedilatildeo dos valores obtidos de

macroacutefago em funccedilatildeo da adesatildeo foi feito atraveacutes da divisatildeo da meacutedia final obtida

para o ensaio de funccedilatildeo de macroacutefago dividido pela meacutedia obtida no ensaio de

adesatildeo para cada potro avaliado e a cada experimento realizado

FIGURA 12 ndash ADESAtildeO DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR EM MICRO PLACA ACRIacuteLICA DE 96 POCcedilOS UTILIZANDO CORANTE DE GIEMSA A 02 (ROSEN e GORDON 1987) aP=0010 vs CN e bP=0001 vs DA

319 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

A normalidade na distribuiccedilatildeo dos dados foi avaliada pelo teste de D‟Agostino

e Pearson Valores considerados outliers pelo teste de Grubb foram excluiacutedos das

anaacutelises Para os dados que apresentaram distribuiccedilatildeo normal dos valores

(distribuiccedilatildeo Gaussiana) (contagem percentual de linfoacutecitos concentraccedilatildeo total de

proteiacutenas do LBA bioatividade de PAF catalase hidroperoacutexidos nitritos fagocitose

de macroacutefago alveolar produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e de peroacutexido de hidrogecircnio

por macroacutefago alveolar) foi utilizado o teste t natildeo pareado Os dados com

distribuiccedilatildeo natildeo Gaussiana dos valores (contagens percentuais de neutroacutefilos de

58

eosinoacutefilos e de macroacutefagos multinucleados contagem do NTCN do LBA e adesatildeo

de macroacutefago alveolar) foram analisados pelo teste de Mann-Whitney A

comparaccedilatildeo entre os resultados obtidos de funccedilatildeo de macroacutefago alveolar

estimulado e natildeo estimulado por PMA foi feita por teste t de Student natildeo pareado

Os achados cliacutenicos e endoscoacutepicos foram analisados por meio de teste de Mann-

Whitney A correlaccedilatildeo entre o percentual de um mesmo tipo celular no aspirado

traqueal e no lavado broncoalveolar foi analisada atraveacutes do teste de Spearman

Todas as anaacutelises estatiacutesticas foram realizadas utilizando-se o programa GraphPad

Prism versatildeo 500 para Windows (GraphPad Software San Diego CA EUA) e os

valores apresentados como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia (SEM) Valores de

Plt005 foram considerados como significativos

4 RESULTADOS

41 PRIMEIRA ETAPA DO ESTUDO

411 Avaliaccedilatildeo Cliacutenica

Nenhum dos potros dos grupos CN e DA apresentou tosse segundo o

histoacuterico obtido Contudo oito potros (235) do grupo EX apresentaram tosse

espontacircnea na cocheira ou durante o treinamento o que resultou em diferenccedila

significativa em relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0002) (TABELA 1)

A presenccedila de corrimento nasal seroso (coriza) observada nos trecircs grupos

estudados estaacute demonstrada na TABELA 1 Natildeo houve diferenccedila significativa entre

os grupos apesar de o percentual de potros com coriza no grupo DA ter reduzido

em relaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)

Os linfonodos submandibulares eou retrofaringeanos estiveram aumentados

em 382 222 e 382 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente

natildeo havendo diferenccedila entre os grupos (TABELA 1)

A auscultaccedilatildeo cardiacuteaca e traqueal resultou normal em todos os potros

avaliados dos trecircs grupos estudados Contudo sons pulmonares crepitantes foram

audiacuteveis em 28 156 e 115 dos potros avaliados nos grupos CN DA e EX

respectivamente havendo um aumento do percentual de crepitaccedilatildeo pulmonar nos

potros do grupo DA em ralaccedilatildeo ao grupo CN (P=0068) (TABELA 1)

TABELA 1 ndash PRINCIPAIS INDICADORES DE EXAME CLIacuteNICO PARA OS TREcircS GRUPOS AVALIADOS DE POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DE CORRIDA

Grupos Tosse

Espontacircnea

Corrimento

Nasal

Linfonodos

Auscultaccedilatildeo

Pulmonar

CN 034

(0)

1534

(441)

1334

(382)

136

(28)

DA 045

(0)

1145

(244)

1045

(222)

745

(156)

EX 834

(235)a

1534

(441)

1334

(382)

326

(115)

aP=0002 vs DA

60

412 Avaliaccedilatildeo Endoscoacutepica das Vias Aeacutereas

No iniacutecio da avaliaccedilatildeo endoscoacutepica das vias aeacutereas primeiramente

considerando os foliacuteculos linfoacuteides faringeanos ou hiperplasia folicular linfoacuteide (HFL)

a distribuiccedilatildeo das diferentes graduaccedilotildees pode ser vista na TABELA 2

TABELA 2 ndash DISTRIBUICcedilAtildeO DOS FOLIacuteCULOS LINFOacuteIDES FARINGEANOS OBSERVADOS POR EXAME ENDOSCOacutePICOS E GRADUADOS DE I A IV SEGUNDO RAKER E BOLES (1978)

Grupos HFL I HFL II HFL III HFL IV

CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)

DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)

EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)

Considerando as graduaccedilotildees de HFL III e IV como faringite esta

anormalidade foi observada em 546 286 e 539 dos potros dos grupos CN

DA e EX respectivamente Houve uma significativa reduccedilatildeo no percentual meacutedio de

observaccedilotildees de faringite para o grupo DA em comparaccedilatildeo ao grupo CN (P=0024)

enquanto no grupo EX o percentual de faringites foi significativamente maior em

relaccedilatildeo ao grupo DA (P=0039)

Com relaccedilatildeo ao aspecto morfoloacutegico da epiglote um potro do grupo DA e um

potro do grupo EX evidenciaram epiglote com aspecto fraacutegil sendo que os demais

potros foram normais

Com relaccedilatildeo agrave avaliaccedilatildeo funcional da laringe todos os potros foram normais

apresentando graduaccedilotildees I ou II (TABELA 3)

TABELA 3 ndash OBSERVACcedilAtildeO ENDOSCOacutePICA DOS MOVIMENTOS DAS CARTILAGENS ARITENOacuteIDES DE ACORDO COM RAKESTRAW et al (1991)

Grupos NLP I NLP II NLP III NLP IV

CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)

DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)

EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)

61

A quantidade de secreccedilatildeo observada no lume traqueal estaacute demonstrada na

TABELA 4

TABELA 4 ndash QUANTIDADE DE SECRECcedilAtildeO TRAQUEAL OBSERVADA ATRAVEacuteS DE EXAME ENDOSCOacutePICO NOS POTROS PURO SANGUE INGLEcircS DOS GRUPOS CN DA E EX DURANTE AVALIACcedilAtildeO EM REPOUSO E GRADUADA DE 0 a 5 SEGUNDO GERBER et al (2004)

Grupos 0 1 2 3 4 5

CN 233

(61)

933

(273)

933

(273)

1133

(332)

233

(61)

033

(0)

DA 742

(167)

1242

(286)

1242

(286)

742

(167)

342

(70)

142

(24)

EX 327

(111)

727

(259)

727

(259)

627

(223)

427

(148)

027

(0)

Quantidade de secreccedilatildeo traqueal acima de grau 2 considerada passiacutevel de

prejuiacutezo agrave troca gasosa e ao rendimento desportivo foi observada em 666 547

e 630 dos potros dos grupos CN DA e EX respectivamente

413 Citologia do Aspirado Traqueal (AT)

Os achados de anaacutelise citoloacutegica diferencial para os principais tipos celulares

do AT para os trecircs grupos de potros estudados estatildeo demonstrados na TABELA 5

TABELA 5 ndash CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO ASPIRADO TRAQUEAL (AT) DOS GRUPOS CN (n=20) DA (n=19) E EX (n=15) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM

Grupos Mac Lin Neut Eos Mast Calic Multi Epit Sid

CN 429plusmn63 75

plusmn19

76

plusmn29

12

plusmn07

002

plusmn02

05

plusmn02

02

plusmn01

201

plusmn56

0

DA 591

plusmn41

141

plusmn24

85

plusmn23

11

plusmn05

0 01

plusmn01

11

plusmn02a

161

plusmn48

0

EX 593

plusmn42

134

plusmn23

171

plusmn49

09

plusmn03

0 05

plusmn03

08

plusmn03

71

plusmn32

09

plusmn04

Mac macroacutefago alveolar Lin linfoacutecitos Neut neutroacutefilos Eos eosinoacutefilos Mast mastoacutecitos Calic ceacutelulas caliciformes Multi macroacutefagos multinucleados Epit ceacutelulas epiteliais Sid hemossideroacutefagos aPlt0001 vs CN

62

414 Colheita do Lavado Broncoalveolar (LBA)

As quantidades de LBA recuperado estiveram entre 54 e 59 do volume

infundido para os grupos CN (n=16) DA (n=23) e EX (n=16)


Diferencial de Ceacutelulas do LBA

A contagem do NTCN e a contagem diferencial de ceacutelulas do LBA estatildeo

demonstradas na TABELA 6

TABELA 6 ndash CONTAGEM DO NTCN E CONTAGEM PERCENTUAL DOS DIFERENTES TIPOS CELULARES DO LBA DOS GRUPOS CN (n=45) DA (n=40) E EX (n=34) VALORES ESTAtildeO EXPRESSOS COMO PERCENTAGEM MEacuteDIA plusmn SEM

CTCN

(ceacutelulasmicroL

de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Macroacutef

Multi

Hemosid

CN 395

plusmn 38

673

plusmn 17

294

plusmn 15

23

plusmn 04

05

plusmn 03

005

plusmn 004

04

plusmn 01

0

DA 343

plusmn 24

698

plusmn 14

281

plusmn 13

09

plusmn 02

12

plusmn 01

002

plusmn 002

11

plusmn 01d

0

EX 456

plusmn 28a

676

plusmn 18

229

plusmn 15

54

plusmn 11b

15

plusmn 07c

02

plusmn 01

13

plusmn 02

22

plusmn 06

CTCN = contagem total de ceacutelulas nucleadas Macroacutef = macroacutefagos Linfoacutec = linfoacutecitos Neutroacutef = neutroacutefilos Eosino = eosinoacutefilos Masto = mastoacutecitos Macroacutef Multi = macroacutefagos multinucleados Hemosid = hemossideroacutefagos aPlt001 vs DA bPlt0001 vs DA cPlt005 vs DA dPlt0001 vs CN

Hemossideroacutefagos foram observados somente no LBA dos potros do grupo

EX mais especificamente em 23 (622) deles representando 22 do total de

ceacutelulas A quantidade observada de hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 da

contagem citoloacutegica diferencial do LBA

A correlaccedilatildeo entre as contagens percentuais de um mesmo tipo celular no AT

e no LBA foi analisada para os potros do grupo CN (n=11) DA (n=18) e EX (n=12)

que tiveram material colhido para as duas teacutecnicas citoloacutegicas natildeo tendo sido

63

encontrada correlaccedilatildeo entre ambas as teacutecnicas de avaliaccedilatildeo citoloacutegica para

nenhuma das ceacutelulas

416 Resposta de Neutroacutefilos do Sangue de Equino Frente ao PAF

A resposta dos neutroacutefilos do sangue de equino frente ao PMA e frente ao

PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na ausecircncia e na presenccedila

do antagonista de PAF BN52021 estaacute demonstrado nas FIGURAS 13 a 15

FIGURA 13 ndash FAGOCITOSE DE NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF aP=0028 vs controle bPlt0001 vs sem BN52021 cP=0028 vs PMA

64

FIGURA 14 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0007) 10nM (aP=0003) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA e PAF 1 e 10nM

FIGURA 15 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR NEUTROacuteFILOS DO SANGUE DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF EM TODAS AS CONCENTRACcedilOtildeES (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PAF 01nM dPlt0001 vs PMA ePlt0001 vs PAF 1nM e fPlt0001 vs PAF 1nM e 10nM

65

417 Resposta de Macroacutefago Alveolar de Equino Frente ao PAF

Tambeacutem se estudou a resposta dos macroacutefagos alveolares de equino frente

ao PMA e frente ao PAF nas concentraccedilotildees 01 nM 1 nM 10 nM e 100 nM na

ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 demonstrado nas

FIGURAs 16 a 18

FIGURA 16 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A FAGOCITOSE INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0003) 10nM (aPlt0001) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0010 vs PMA dPlt0001 vs PAF 01nM e PAF 1nM

66

FIGURA 17 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 1nM (aP=0037) e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA e PAF 01nM dPlt0001 vs PAF 1nM

FIGURA 18 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DE EQUINO ESTIMULADO POR PMA (400 nM) E CONCENTRACcedilOtildeES DE PAF 01nM 1nM 10nM e 100nM NA PRESENCcedilA E NA AUSEcircNCIA DO ANTAGONISTA DE PAF (BN52021) BN52021 INIBIU A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO INDUZIDA POR PAF NAS CONCENTRACcedilOtildeES 01nM e 100nM (aPlt0001) bPlt0001 vs controle cPlt0001 vs PMA dPlt001 vs PAF 1nM e 10nM

67

418 Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedico das Ceacutelulas do LBA

A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos

foi mensurada pelo influxo de Ca++ em ceacutelulas PMN de equinos (FIGURA 19)

Registrou-se uma baixa relaccedilatildeo 340380 nm para os grupos CN (0005 plusmn 0002

relaccedilatildeo 340380 nm) e DA (0006 plusmn 0002 relaccedilatildeo 340380 nm) representando um

baixo niacutevel de bioatividade de PAF no LBA dos potros avaliados nestes grupos

Contudo a bioatividade de PAF do grupo EX (0068 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm) foi

significativamente maior em comparaccedilatildeo ao grupo DA (P=0017) Um graacutefico

representativo da bioatividade de PAF em uma das amostras do grupo EX na

ausecircncia e na presenccedila do antagonista de PAF BN52021 pode ser visto na FIGURA

20

CN DA EX000

002

004

006

008

010 a

Re

laccedil

atildeo

34

03

80

nm

Bioatividade de PAF no Extrato Lipiacutedicodas Ceacutelulas do LBA

FIGURA 19 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=10) E EX (n=10) MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380 nm OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE AO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0017 vs DA

68

0 50 100

150

200

0

1

2

3

4

Tempo (segundos)

Bioatividade de PAFR

ela

ccedilatildeo

3403

80n

m

FIGURA 20 ndash GRAacuteFICO DEMONSTRANDO A BIOATIVIDADE DE PAF NO EXTRATO LIPIacuteDICO DAS CEacuteLULAS DO LBA DE UM POTRO DO GRUPO EX NA AUSEcircNCIA () E NA PRESENCcedilA DO ANTAGONISTA DE PAF BN52021 () MENSURADA ESPECTROFLUOROMETRICAMENTE PELO INFLUXO DE Ca++ EM CEacuteLULAS PMN DE EQUINOS E EXPRESSA COMO RELACcedilAtildeO 340380nm A AMOSTRA Eacute ADICIONADA Agrave SUSPENSAtildeO DE CEacuteLULAS PMN APOacuteS 50 SEGUNDOS DE LEITURA BASAL (SETA)

419 Concentraccedilatildeo Total de Proteiacutenas no LBA

A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi maior no grupo DA em relaccedilatildeo

ao grupo CN (014 plusmn 003 vs 003 plusmn 001 mg de proteiacutenasmL de LBA) (P=0001) O

grupo EX apresentou concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA (036 plusmn 006 mg de

proteiacutenasmL de LBA) significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001)

(FIGURA 21)

69

FIGURA 21 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=25) DA (n=26) E EX (n=31) MENSURADA A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0001 vs CN bPlt0001 vs DA

4110 Concentraccedilatildeo de Nitritos no LBA

A concentraccedilatildeo de nitritos foi maior no LBA do grupo DA (019 plusmn 001

absorbacircncia 550 nm) em relaccedilatildeo ao grupo CN (014 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm)

(P=0011) O grupo EX apresentou uma reduccedilatildeo significativa na concentraccedilatildeo de

nitritos no LBA (008 plusmn 001 absorbacircncia 550 nm) significativamente menor em

comparaccedilatildeo ao grupo DA (Plt0001) (FIGURA 22)

70

FIGURA 22 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA PARA OS GRUPOS CN (n=22) DA (n=23) e EX (n=16) MENSURADO A PARTIR DO SOBRENADANTE LIVRE DE CEacuteLULAS OBTIDO APOacuteS A PRIMEIRA CENTRIFUGACcedilAtildeO DURANTE O PROCESSAMENTO DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS QUATRO EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0011 vs CN bPlt0001 vs DA

4111 Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos nas Ceacutelulas do LBA

A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA foi

significativamente maior no grupo DA em relaccedilatildeo ao grupo CN (1047 plusmn 241 vs 66

plusmn 35 nmolesmg de proteiacutenas) (Plt0001) No grupo EX a concentraccedilatildeo de

hidroperoacutexidos nas ceacutelulas do LBA apresentou reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo

DA (352 plusmn 84 vs 1047 plusmn 241 nmolesmg de proteiacutenas) (P=0007) (FIGURA 23)

71

Concentraccedilatildeo de Hidroperoacutexidos Lipiacutedicos no LBA

CN DA EX0

50

100

150a

b

nm

ole

s

mg

de

pro

teiacuten

as

FIGURA 23 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=11) e EX (n=11) MENSURADO NO EXTRATO METANOacuteLICO DAS CEacuteLULAS DO LBA OS RESULTADOS SAtildeO APRESENTADOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNA DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aPlt0001 vs CN bP=0007 vs DA

4112 Atividade da Catalase nas Ceacutelulas do LBA

No grupo EX a atividade da catalase nas ceacutelulas do LBA foi

significativamente maior em relaccedilatildeo ao grupo DA (024 plusmn 005 vs 006 plusmn 001 μmol

H2O2minmg de proteiacutenas) (P=0002) natildeo havendo diferenccedila entre os grupos CN e

DA (FIGURA 24)

72

FIGURA 24 ndash ATIVIDADE DA CATALASE NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS GRUPOS CN (n=10) DA (n=7) e EX (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO microMOL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOMINUTOMILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS DO LBA E SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO aP=0002 vs DA

4113 Fagocitose de Macroacutefago Alveolar

A fagocitose de macroacutefago alveolar foi significativamente maior no grupo DA

em comparaccedilatildeo ao grupo CN (223 plusmn 043 vs 072 plusmn 018 absorbacircncia 550

nmadesatildeo) (P=0002) Observou-se uma diminuiccedilatildeo na fagocitose no grupo EX em

relaccedilatildeo ao grupo DA (104 plusmn 027 vs 223 plusmn 043 absorbacircncia 550 nmadesatildeo)

(P=0006) (FIGURA 25)

73

FIGURA 25 ndash FAGOCITOSE DE MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=14) DA (n=13) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A FAGOCITOSE PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (FAGOCITOSEADESAtildeO) aP=0002 vs CN e bP=0006 vs DA

4114 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar

A utilizaccedilatildeo de PMA aumentou significativamente a produccedilatildeo de acircnion

superoacutexido pelos macroacutefagos alveolares dos grupos DA (219 plusmn 053 vs 392 plusmn 062

absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0049) e EX (060 plusmn 011 vs 090 plusmn 014

absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0031) A produccedilatildeo basal de acircnion superoacutexido foi


plusmn 007 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) enquanto o exerciacutecio resultou numa

reduccedilatildeo em comparaccedilatildeo ao grupo DA (060 plusmn 011 vs 219 plusmn 053 absorbacircncia 595

nmadesatildeo) (P=0001) A produccedilatildeo de acircnion superoacutexido estimulada por PMA foi



74

diminuiccedilatildeo na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido em comparaccedilatildeo ao grupo DA (090 plusmn

014 vs 392 plusmn 062 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) (FIGURA 26)

FIGURA 26 ndash PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=11) DA (n=9) e EX (n=14) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE PELO MENOS TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE AcircNION SUPEROacuteXIDOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0049 vs DA bP=0031 vs EX cPlt0001 vs CN dP=0001 vs DA ePlt0001 vs CNe fPlt0001 vs DAe

4115 Produccedilatildeo de Peroacutexido de Hidrogecircnio (H2O2) por Macroacutefago Alveolar

O PMA aumentou a produccedilatildeo de H2O2 pelos macroacutefagos alveolares nos

grupos CN (041 plusmn 008 vs 099 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0004) DA

(035 plusmn 005 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (P=0002) e EX (010 plusmn

001 vs 034 plusmn 008 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) A produccedilatildeo basal de

H2O2 para o grupo EX foi significativamente menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (010 plusmn

001 vs 035 plusmn 005 absorbacircncia 595 nmadesatildeo) (Plt0001) Aleacutem disso a produccedilatildeo

75

de H2O2 estimulada por PMA diminuiu no grupo EX tendo sido significativamente

menor em relaccedilatildeo ao grupo DA (034 plusmn 008 vs 096 plusmn 017 absorbacircncia

595nmadesatildeo) (P=0006) (FIGURA 27)

FIGURA 27 ndash PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR NOS GRUPOS CN (n=19) DA (n=14) e EX (n=15) OS RESULTADOS SAtildeO PROVENIENTES DE TREcircS EXPERIMENTOS INDEPENDENTES PARA CADA GRUPO EM CADA EXPERIMENTO UM ENSAIO DE ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS FOI CONDUZIDO PARALELAMENTE E AS MEacuteDIAS OBTIDAS PARA A PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO PARA CADA POTRO FORAM CORRIGIDAS PELA MEacuteDIA DA ADESAtildeO DE MACROacuteFAGOS DO MESMO POTRO (PRODUCcedilAtildeO DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIOADESAtildeO) A PRODUCcedilAtildeO BASAL (CN DA E EX) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO ESTIMULADA POR PMA (CNe DAe e EXe) ESTAtildeO DEMONSTRADAS NA FIGURA aP=0004 vs CN bP=0002 vs DA cPlt0001 vs EX dPlt0001 vs DA eP=0006 vs DAe

42 SEGUNDA ETAPA DO ESTUDO



Hemossideroacutefagos foram observados no LBA de 23 potros (622) sendo

que estes foram considerados no subgrupo HPIE pos A quantidade observada de

76

hemossideroacutefagos variou entre 04 e 152 A ausecircncia de hemossideroacutefagos foi

evidenciada em 14 potros (378) sendo que estes foram considerados para o

subgrupo HPIE neg

Dentre os potros avaliados 15 (405) deles (10 potros do subgrupo HPIE

pos e 5 potros do subgrupo HPIE neg) apresentaram mais de 5 de neutroacutefilos eou

mais de 1 de eosinoacutefilos na contagem diferencial de ceacutelulas indicando um perfil

citoloacutegico de LBA compatiacutevel com inflamaccedilatildeo pulmonar

Os valores do NTCN bem como da contagem diferencial de ceacutelulas para o

grupo EX e para os subgrupos estaacute demonstrado na TABELA 7

TABELA 7 ndash CONTAGEM TOTAL DE CEacuteLULAS NUCLEADAS E CONTAGEM PERCENTUAL DOS PRINCIPAIS TIPOS CELULARES NO LAVADO BRONCOALVEOLAR (LBA) DO GRUPO EX (n=37) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=23) E HPIE NEG (n=14)

CTCN (ceacutelulasmicroL

de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Siderof

Grupo EX

456 plusmn 28

676 plusmn 18

229 plusmn 15

47 plusmn 10

13 plusmn 06

02 plusmn 01

22 plusmn 35

HPIE pos

571

plusmn 78a

645

plusmn 22b

240 plusmn 20

56 plusmn 12

09 plusmn 07

02 plusmn 02

34 plusmn 37

HPIE neg

348 plusmn 38

725 plusmn 30

207 plusmn 25

35 plusmn 18

19 plusmn 11

03 plusmn 01

00

CTCN contagem total de ceacutelulas nucleadas Macrof macoacutefagos Linfoc linfoacutecitos Neutrof

neutroacutefilos Eosinof eosinoacutefilos Mastoc mastoacutecitos Siderof hemossideroacutefagos aP=0005

vs HPIE neg bP=0020 vs HPIE neg


A bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA foi

significativamente maior no subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg

(018 plusmn 005 vs 0043 plusmn 002 relaccedilatildeo 340380 nm P=0042) (FIGURA 28)

77

FIGURA 28 ndash BIOATIVIDADE DE PAF NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=11) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=6) e HPIE NEG (n=5) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO RELACcedilAtildeO 340380nm aP=0042 vs HPIE neg


A concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA foi significativamente maior no

subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (039 plusmn 008 vs 019 plusmn

004 mg de proteiacutenasmL de LBA P=0031) (FIGURA 29)

78

FIGURA 29 ndash CONCENTRACcedilAtildeO TOTAL DE PROTEIacuteNAS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=28) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=13) E HPIE NEG (n=12) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS POR MILILITRO DE LBA aP=0031 vs HPIE neg


A concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos resultou

significativamente reduzida em comparaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (008 plusmn 003 vs

012 plusmn 007 absorbacircncia 550 nm P=0049) (FIGURA 30)

79

FIGURA 30 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE NITRITOS NO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=22) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=12) E HPIE NEG (n=10) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 550 nm aP=0049 vs HPIE neg


A concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA dos potros do

subgrupo HPIE pos resultou significativamente maior que no subgrupo HPIE neg

(367 plusmn 93 vs 62 plusmn 20 nmoles mg de proteiacutenas P=0009) (FIGURA 31)

80

FIGURA 31 ndash CONCENTRACcedilAtildeO DE HIDROPEROacuteXIDOS LIPIacuteDICOS NAS CEacuteLULAS DO LBA DOS POTROS DO GRUPO EX (n=17) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=9) E HPIE NEG (n=8) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO NANOMOLES POR MILIGRAMA DE PROTEIacuteNAS aP=0009 vs HPIE neg


Natildeo houve diferenccedila na fagocitose de macroacutefago alveolar entre os grupos

estudados

427 Produccedilatildeo de Acircnion Superoacutexido por Macroacutefago Alveolar (O2-)

A produccedilatildeo basal de O2- por macroacutefagos alveolares resultou similar entre os

grupos estudados A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA aumentou

significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0047) mas natildeo no subgrupo HPIE pos

(FIGURA 32)

A produccedilatildeo de O2- estimulada por PMA foi significativamente menor no


015 absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0042) (FIGURA 32)

81


-) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=14) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=10) E HPIE NEG (n=5) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE O2

- ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0047 vs HPIE neg bP=0042 vs HPIE neg e


A produccedilatildeo basal de H2O2 por macroacutefago alveolar foi similar entre os grupos

avaliados no presente estudo A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA aumentou

significativamente no subgrupo HPIE neg (P=0002) mas natildeo no subgrupo HPIE

neg (FIGURA 33)

A produccedilatildeo de H2O2 estimulada por PMA resultou significativamente menor no

subgrupo HPIE pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (025 plusmn 003 vs 067 plusmn 014

absorbacircncia 595 nm adesatildeo P=0001)

82

FIGURA 33 ndash ESTAtildeO DEMONSTRADOS A PRODUCcedilAtildeO BASAL DE PEROacuteXIDO DE HIDROGEcircNIO (H2O2) POR MACROacuteFAGO ALVEOLAR DOS POTROS DO GRUPO EX (n=15) E DOS SUBGRUPOS HPIE POS (n=11) E HPIE NEG (n=6) BEM COMO A PRODUCcedilAtildeO DE H2O2 ESTIMULADA POR PMA (EX e HPIE POS e HPIE NEG e) OS RESULTADOS SAtildeO EXPRESSOS COMO ABSORBAcircNCIA 595 nmadesatildeo aP=0002 vs HPIE neg bP=001 vs HPIE neg e

5 DISCUSSAtildeO

O estudo da inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas de cavalos de corrida adultos jovens

em trecircs diferentes situaccedilotildees em seu ambiente natural foi possiacutevel devido agrave

utilizaccedilatildeo de um grande nuacutemero de animais Assim permitiu-se detectar diferenccedilas

entre os grupos mesmo havendo variaccedilotildees ambientais tais como estaccedilotildees do ano

condiccedilotildees climaacuteticas e diferenccedilas sutis em manejo Como os potros dos trecircs grupos

encontravam-se na mesma faixa etaacuteria de risco para as doenccedilas respiratoacuterias virais

e os experimentos foram realizados durante um mesmo periacuteodo as diferenccedilas entre

os grupos CN e DA foram consideradas como sendo devido ao ambiente e as

diferenccedilas entre os grupos DA e EX foram consideradas como sendo devido ao

treinamento

O grupo CN evidenciou um percentual de observaccedilotildees de faringite na

avaliaccedilatildeo endoscoacutepica (TABELA 2) maior que os 37 relatado por HOBO et al

(1995) em cavalos PSI de corrida de dois anos de idade Os potros deste grupo

foram mantidos integralmente em piquetes e nesta situaccedilatildeo a hiperplasia dos

foliacuteculos linfoacuteides da faringe em cavalos jovens pode ser uma resposta normal a

inalaccedilatildeo de antiacutegenos ambientais ou agentes infecciosos (HOLCOMBE e

DUCHARME 2007)

De fato as vias aeacutereas dos potros desse grupo deram mostra de estarem

sendo desafiadas pelo nuacutemero percentual de corrimento nasal linfonodos

aumentados e quantidades elevadas de secreccedilatildeo traqueal iguais aos demais

grupos (TABELAS 1 e 4) Possivelmente isso tambeacutem se deva a fatores climaacuteticos

pois no estudo de ROBINSON et al (2006) com cavalos de montaria de vaacuterias

idades aqueles que permaneceram fora dos estaacutebulos durante o inverno

apresentaram quantidades elevadas de muco traqueal No entanto diferentemente

do nosso estudo os cavalos avaliados por ROBINSON et al (2006) tiveram nuacutemero

percentual de neutroacutefilos aumentado na secreccedilatildeo traqueal enquanto os potros do

grupo CN resultaram em avaliaccedilatildeo citoloacutegica tanto de AT (TABELA 5) como de LBA

(TABELA 6) normais (ROBINSON 2003 HODGSON e HODGSON 2007)

evidenciando vias aeacutereas especialmente as vias aeacutereas inferiores saudaacuteveis

Com relaccedilatildeo ao desafio ambiental no presente estudo adotou-se um sistema

convencional de estabulaccedilatildeo pois estudos anteriores em modelos semelhantes ao

84

nosso jaacute demonstraram a presenccedila de altas concentraccedilotildees de endotoxinas

(BERNDT et al 2008) bem como de poeira e de aeroalergenos (WOODS et al

1993)

Contudo o desafio ambiental de 30 dias utilizado em nosso estudo resultou

em quadro comparaacutevel ao do grupo CN isento de processo inflamatoacuterio das vias

aeacutereas Possivelmente um periacuteodo maior de desafio pudesse causar um processo

inflamatoacuterio tal como foi demonstrado previamente por HOLCOMBE et al (2001)

onde potros da raccedila puro sangue aacuterabe que sofreram desafio ambiental de 90 dias

apresentaram aumento no nuacutemero percentual de neutroacutefilos no LBA Contudo no

estudo citado o material utilizado para a cama dos potros foi a palha que tambeacutem

representou um maior risco de desenvolvimento de inflamaccedilatildeo nas vias aeacutereas dos

cavalos em outros estudos quando comparada a serragem utilizada na cama dos

potros do grupo DA (BURRELL et al 1996 VANDEPUT et al 1998 GERBER et

al 2000 KLEIBER et al 2005 DEWACHI et al 2006)

Entretanto ateacute o momento os efeitos dos fatores ambientais das cocheiras

nas vias aeacutereas foram relatados em sua maioria em cavalos apresentando ORVA e

natildeo em indiviacuteduos jovens e saudaacuteveis como os potros avaliados em nosso estudo

Nos animais com ORVA um curto periacuteodo de exposiccedilatildeo ambiental (6 a 48 horas)

em baia e recebendo alimentaccedilatildeo composta principalmente por feno causou

aumento da expressatildeo de algumas citocinas (pex IL-4 e IL-5) em alguns estudos

mas nenhuma alteraccedilatildeo em outros (GERBER et al 2000 AINSWORTH et al 2003

CORDEAU et al 2004 KLEIBER et al 2005) sendo que um longo tempo de

exposiccedilatildeo ambiental (variando de cinco semanas a trecircs meses) causou aumento da

expressatildeo de IFN-γ e IL-8 (AINSWORTH et al 2003) IL-9 (DEWACHI et al 2006)

IL-17 (DEBRUE et al 2005) e o desenvolvimento dos sinais cliacutenicos da ORVA

acompanhados de alteraccedilotildees na funccedilatildeo pulmonar (VANDEPUT et al 1998)

Contudo nos potros do grupo DA se evidenciou no AT (TABELA 5) e no LBA

(TABELA 6) um aumento significativo do nuacutemero percentual de macroacutefagos

multinucleados em comparaccedilatildeo ao grupo CN bem como nuacutemero percentual de

eosinoacutefilos acima do valor considerado limite para cavalos normais (ROBINSON

2003) sugerindo que houve uma resposta por parte do sistema de defesa nas vias

aeacutereas dos potros deste grupo

Os macroacutefagos multinucleados ou ceacutelulas gigantes multinucleadas satildeo

formados a partir da fusatildeo de dois ou mais macroacutefagos na resposta imune pulmonar

85

(ANDERSON et al 1999) representando especificamente uma resposta imune do

tipo Th2 com a participaccedilatildeo da IL-4 (HELMING e GORDON 2007) Em pessoas os

macroacutefagos multinucleados satildeo considerados como um achado indicativo de

reaccedilotildees inflamatoacuterias crocircnicas nas vias aeacutereas como a tuberculose por exemplo

(LEMAIRE et al 2006 HELMING e GORDON 2007) Em equinos satildeo escassos os

estudos envolvendo a citologia respiratoacuteria que descrevam o nuacutemero percentual

normal deste tipo celular De qualquer forma eacute relatado que pode ser observado em

pequeno nuacutemero em cavalos sem evidecircncias de doenccedila pulmonar sendo que uma

quantidade aumentada jaacute foi descrita associada agrave inflamaccedilatildeo crocircnica (DECONTO

1983 HODGSON e HODGSON 2007) Estas informaccedilotildees parecem natildeo corroborar

com o aumento no nuacutemero percentual de macroacutefagos multinucleados no grupo DA

em se tratando de potros jovens considerados saudaacuteveis o que demonstra a

necessidade de mais estudos para se entender o papel do macroacutefago multinucleado

no pulmatildeo saudaacutevel e na inflamaccedilatildeo pulmonar dos cavalos

Entretanto o nuacutemero percentual de eosinoacutefilos acima do limite normal no

LBA dos potros do grupo DA pode ser considerado como uma resposta ao

ambiente assim como eacute considerado em humanos (DENGUEZLI-BOUZGARROU et

al 2007) e jaacute relatado em cavalos (COUEumlTIL et al 2007)

O periacuteodo de treinamento por sua vez induziu inflamaccedilatildeo pulmonar nos

potros do grupo EX O nuacutemero significativamente aumentado de potros com tosse

(TABELA 1) constituiu a evidecircncia cliacutenica sugerindo inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas nos

potros desse grupo Cavalos saudaacuteveis raramente tossem (ROBINSON 2007)

sendo a tosse um sinal cliacutenico comprovadamente associado agrave inflamaccedilatildeo das vias

aeacutereas (BURRELL et al 1996 McGROUM e DIXON 2007) CHRISTLEY et al

(2001) correlacionaram a tosse com a presenccedila de faringite sendo que tal

associaccedilatildeo tambeacutem foi observada no grupo EX (TABELAS 1 e 2) Adicionalmente

BEDENICE et al (2008) estudaram a relaccedilatildeo entre a tosse e a inflamaccedilatildeo pulmonar

e descreveram que os cavalos avaliados por apresentarem tosse tiveram contagens

percentuais de neutroacutefilos no LBA maiores que 5

No presente estudo um aumento no NTCN e nas contagens percentuais de

neutroacutefilos e eosinoacutefilos do LBA (TABELA 6) confirmaram a presenccedila de inflamaccedilatildeo

pulmonar no grupo EX (McKANE et al 1993 COUEumlTIL e DENICOLA 1999

COUEumlTIL et al 2007) A neutrofilia no LBA de cavalos de corrida jaacute foi

correlacionada a um baixo rendimento desportivo e constitui sinal chave para o

86

diagnoacutestico da DIVA (COUEumlTIL et al 2007) A eosinofilia no LBA de cavalos de

corrida por sua vez pode ser um achado transitoacuterio (VIEL e HEWSON 2003)

apesar de tambeacutem ter sido associada a um baixo rendimento desportivo aleacutem de

hiperresponsividade das vias aeacutereas em cavalos de corrida jovens (HARE e VIEL

1998) Portanto tais evidecircncias podem ser consideradas como um risco ao futuro

potencial atleacutetico dos potros do grupo EX

No presente estudo natildeo houve correlaccedilatildeo entre os achados citoloacutegicos de AT

e LBA para nenhum dos trecircs grupos estudados e esta falta de correlaccedilatildeo entre AT

e LBA jaacute foi relatada anteriormente Portanto entende-se que os epiteacutelios traqueal e

broncoalveolar respondem diferentemente aos agentes agressores sendo que a

avaliaccedilatildeo de cavalos com tosse ou diminuiccedilatildeo de rendimento desportivo deve ser

realizada por ambas as teacutecnicas associadas (MALIKIDES et al 2003 CHRISTLEY

RUSH 2007 HODGSON e HODGSON 2007)

A ligaccedilatildeo entre o exerciacutecio e a inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas provavelmente

envolve diversos mediadores proacute-inflamatoacuterios que uma vez identificados poderatildeo

ser alvo para abordagens terapecircuticas com o objetivo de minimizar os efeitos

deleteacuterios da inflamaccedilatildeo pulmonar em cavalos PSI de corrida jovens Neste

contexto um dos mais potentes e versaacuteteis mediadores proacute inflamatoacuterios envolvidos

na inflamaccedilatildeo das vias aeacutereas eacute o PAF (UHLIG et al 2005)

PAF eacute quimiotaacutetico para bem como produzido por eosinoacutefilos macroacutefagos e

neutroacutefilos em resposta a estresse fiacutesico ou quiacutemico apresentando muitos dos

criteacuterios essenciais de um mediador proacute inflamatoacuterio (OWEN et al 2005)

De fato estudos realizados in vitro demonstraram que o PAF pode induzir a

migraccedilatildeo de neutroacutefilos e monoacutecitos do cavalo (DAWSON et al 1988) Aleacutem disso

demonstrou-se a quimiotaxia de eosinoacutefilos e neutroacutefilos no trato respiratoacuterio de

murinos e humanos induzida por PAF (LEE et al 2002 ISHII et al 2004) Em

cavalos com ORVA a administraccedilatildeo intravenosa de PAF promoveu uma reduccedilatildeo de

leucoacutecitos no sangue perifeacuterico e apoacutes alguns minutos houve um aumento de

neutroacutefilos e eosinoacutefilos no pulmatildeo seguido de uma deterioraccedilatildeo cliacutenica e da funccedilatildeo

respiratoacuteria (FAIRBAIRN et al 1996) Portanto apoiado nestes estudos e nos

resultados de aumento do NTCN e de neutrofilia e eosinofilia no LBA do grupo EX

(TABELA 6) eacute razoaacutevel assumir que o PAF possa contribuir para a induccedilatildeo da

inflamaccedilatildeo pulmonar observada nos potros PSI jovens em treinamento avaliados no

presente estudo

87

A inflamaccedilatildeo pulmonar tambeacutem estaacute associada a um aumento nas

concentraccedilotildees de proteiacutenas no LBA principalmente devido ao extravasamento de

plasma (TSANGARIS et al 2003) que pode ser resultado da accedilatildeo de vaacuterios

mediadores proacute inflamatoacuterios tal como o PAF

Um aumento da permeabilidade microvascular induzida pelo PAF resultando

em extravasamento de plasma e edema foi demonstrado previamente no estudo de

CLAVIJO et al (2001) Aleacutem disso WEST et al (1997) demonstraram o acuacutemulo de

um fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar de cavalos exercitados a velocidades

entre 13 ms e 16 ms No presente estudo o significativo aumento da concentraccedilatildeo

de proteiacutenas no LBA dos potros do grupo EX em comparaccedilatildeo ao grupo DA (FIGURA

21) confirma que a permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) estava

aumentada nos potros do grupo EX e o PAF pode estar envolvido neste mecanismo

Diferentemente o significativo aumento de proteiacutenas no LBA do grupo DA em

comparaccedilatildeo ao grupo CN deve envolver outros mecanismos inflamatoacuterios pois natildeo

houve biotavidade de PAF significativa no LBA destes dois grupos (FIGURA 19)

Contudo os efeitos do PAF na permeabilidade vascular podem ser

dependentes em parte da disponibilidade de oacutexido niacutetrico (NO) (KIKUCHI et al

2008) Houve uma produccedilatildeo limitada de NO nas vias aeacutereas dos potros do grupo

EX esperada em cavalos realizando exerciacutecio moderado ou proacuteximo do maacuteximo

(MILLS e HIGGINS 1997) Isto pode ser explicado pela hipoxemia arterial induzida

pelo exerciacutecio (HAIE) descrita em atletas humanos (HOPKINS 2005) e em cavalos

exercitando a altas intensidades (MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999

DEMPSEY e WAGNER 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005) A produccedilatildeo de NO requer

normoxia (GRIMMINGER et al 1995) sendo que a anoxia abole o relaxamento

vascular dependente do endoteacutelio e a hipoxemia degrada o NO (De MEY e

VANHOUTTE 1980) Adicionalmente ocorre uma inibiccedilatildeo do NO pela hemoglobina

sendo que esta inibiccedilatildeo eacute inversamente proporcional a saturaccedilatildeo de oxigecircnio

(IWAMOTO e MORIN 1993)

A inibiccedilatildeo da siacutentese de NO resultou no aumento da permeabilidade vascular

no estudo de KIKUCHI et al (2008) concordando com os nossos achados

referentes agrave bioatividade de PAF aumentada associada ao aumento da

concentraccedilatildeo total de proteiacutenas e agrave diminuiccedilatildeo da concentraccedilatildeo de nitritos no LBA

do grupo EX

88

De fato no estudo de BRKOVIC e SIROIS (2007) o PAF e natildeo o NO foi

considerado o mediador proacute inflamatoacuterio e causador do aumento da permeabilidade

vascular enquanto o NO foi considerado como um co-fator para as atividades

inflamatoacuterias do PAF Na relaccedilatildeo entre PAF e NO na microcirculaccedilatildeo parece que

NO apresenta um efeito protetor atenuando as atividades inflamatoacuterias de PAF

tendo inclusive reduzido a formaccedilatildeo de PAF em vecircnulas mesenteacutericas em ratos

(NEVIN e BROADLEY 2002)

Contudo o NO tambeacutem tem papel preponderante na defesa das vias aeacutereas

(NEVIN e BROADLEY 2002 XU et al 2006) e o aumento na concentraccedilatildeo de

nitritos no LBA do grupo DA pode ser considerado uma resposta aos poluentes

ambientais existentes nas cocheira dos cavalos (WOODS et al 1993 BERNDT et

al 2008) Aleacutem disso o NO reage com o acircnion superoacutexido (O -2) para formar

peroxinitrito (ONOO-) um forte oxidante capaz de provocar lesatildeo no tecido pulmonar

resultando em peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (XU et al 2006)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi investigada no presente estudo atraveacutes da

concentraccedilatildeo de hidroperoacutexidos lipiacutedicos nas ceacutelulas do LBA que resultou

aumentada no grupo DA em comparaccedilatildeo com o grupo CN (FIGURA 23) A

peroxidaccedilatildeo lipiacutedica foi associada ao acuacutemulo de neutroacutefilos e produccedilatildeo de ROS por

esses nas vias aeacutereas de crianccedilas (BUSS et al 2000) e de pessoas com DPOC

(SANTUS et al 2005) Natildeo houve aumento de neutroacutefilos no LBA dos potros do

grupo DA mas os macroacutefagos alveolares dos potros deste grupo apresentaram

maior produccedilatildeo de ROS (FIGURAS 26 e 27) Isso pode ter contribuiacutedo para o

aumento da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA neste grupo como resultado da

modificaccedilatildeo da funcionalidade dos macroacutefagos alveolares induzida por fatores

ambientais como descrito em estudos em humanos (LUNDBORG et al 2007) e em

cavalos (RIIHIMAumlKI et al 2008b)

Por outro lado o treinamento resultou em reduccedilatildeo da concentraccedilatildeo de

hidroperoacutexidos lipiacutedicos no LBA em comparaccedilatildeo com o grupo DA No estudo de

MASTALOUDIS et al (2004) corredores de ultramaratona apresentaram aumento

da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica avaliada por marcadores do sangue destes atletas

Contudo outros relataram a reduccedilatildeo dos marcadores de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica apoacutes

exerciacutecio intenso em corredores e esquiadores (URSO e CLARKSON 2003) em

indiviacuteduos treinados (BALOG et al 2006) em pessoas apoacutes 6 meses de

89

treinamento e tambeacutem apoacutes um programa de treinamento de 3 semanas (ALDRED

2007) e em pacientes com DPOC apoacutes programa de exerciacutecios (PINHO et al 2007)

Provavelmente essa diminuiccedilatildeo na peroxidaccedilatildeo lipiacutedica no LBA dos potros do

grupo EX deveu-se a mecanismos protetores pois o treinamento influencia de forma

positiva a capacidade antioxidante do organismo em atletas humanos (URSO e

CLARKSON 2003 PARK et al 2005 BALOG et al 2006 ALDRED 2007 PINHO

et al 2007) e em cavalos (KIRSCHVINK et al 2008)

URSO e CLARKSON (2003) relataram um aumento significativo da atividade

da catalase uma enzima antioxidante nos eritroacutecitos de atletas humanos apoacutes um

exerciacutecio de corrida de longa distacircncia corroborando com os nossos achados de

aumento significativo da atividade da catalase no LBA dos potros do grupo EX em

comparaccedilatildeo com o grupo DA (FIGURA 24)

No presente estudo a atividade de macroacutefago alveolar foi investigada devido

ao papel inerente desta ceacutelula na defesa pulmonar O aumento na atividade dos

macroacutefagos alveolares no grupo DA foi discutida acima e provavelmente deveu-se agrave

presenccedila de aeroalergenos e endotoxinas presentes nas cocheiras dos cavalos

(RIIHIMAumlKI et al 2008b)

Por outro lado o treinamento reduziu tanto a fagocitose de macroacutefago

alveolar (FIGURA 25) como a capacidade de produccedilatildeo de ROS (acircnion superoacutexido e

peroacutexido de hidrogecircnio) (FIGURAS 26 e 27)

O macroacutefago alveolar eacute a ceacutelula efetora do sistema imune predominante nos

espaccedilos alveolares e nas vias aeacutereas condutoras responsaacutevel por ativar as

respostas inflamatoacuterias de forma suficiente a eliminar agentes agressores (PETERS-

GOLDEN 2004) Os macroacutefagos alveolares satildeo essenciais agrave sobrevivecircncia

devendo estar em harmonia com o sistema nervoso e endoacutecrino para responder a

estiacutemulos fisioloacutegicos bem como patoloacutegicos (GORDON 2007) sem exagerar na

resposta a fim de natildeo comprometer a troca gasosa (PETERS-GOLDEN 2004)

Apesar de KIZAKI et al (2008) terem demonstrado que o macroacutefago pode

sofrer uma adaptaccedilatildeo ao exerciacutecio melhorando sua funcionalidade os potros PSI

jovens em treinamento para corrida do grupo EX apresentaram supressatildeo da

imunidade especificamente a relacionada agrave resposta imune inata dos macroacutefagos

alveolares corroborando com estudos anteriores (HUSTON et al 1987 RAIDAL et

al 2000 RAIDAL et al 2001) que avaliaram o LBA de cavalos apoacutes exerciacutecio

90

realizado em esteira de alta velocidade e obtiveram resultados semelhantes aos

nossos

Outro aspecto ainda natildeo relatado em equinos mas demonstrado em

pessoas eacute que a melhora na atividade antioxidante induzida pelo exerciacutecio pode

resultar em diminuiccedilatildeo da atividade da NADPH oxidase na membrana dos

macroacutefagos consequumlentemente reduzindo a produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e

peroacutexido de hidrogecircnio por essas ceacutelulas (PARK et al 2005) como observado no

grupo EX

Portanto a influencia do exerciacutecio sobre a funcionalidade das ceacutelulas do

sistema imunoloacutegico como a observada nos macroacutefagos alveolares do grupo EX no

presente estudo explicaria a maior suscetibilidade apresentada por potros de corrida

sob treinamento intenso a infecccedilotildees respiratoacuterias (HINES et al 1996) Em

humanos o exerciacutecio intenso reduziu a capacidade de apresentaccedilatildeo de antiacutegeno

(CEDDIA e WOODS 1999) bem como a resistecircncia antiviral (DAVIS et al 1997) por

macroacutefagos O PMA (phorbol myristate acetate) utilizado nas avaliaccedilotildees da

atividade de macroacutefago alveolar (ver toacutepicos 4114 e 4115) teve como funccedilatildeo

estimular a NADPH oxidase a produzir acircnion superoacutexido e peroacutexido de hidrogecircnio

(DEKKER et al 2000 NAKAJIMA et al 2000) mimetizando o estiacutemulo provocado

por agentes infecciosos (JI 2008) Isto de fato ocorreu no grupo EX jaacute que os

macroacutefagos estimulados apresentaram aumento significativo na atividade

comparando-se aos macroacutefagos natildeo estimulados (FIGURAS 26 e 27) entretanto a

atividade ainda foi significativamente menor que no grupo DA evidenciando a

reduccedilatildeo na atividade de macroacutefagos induzida pelo exerciacutecio

Os efeitos do PMA sobre os macroacutefagos alveolares e sobre os PMNs do

sangue de equino podem ser apreciados no experimento de validaccedilatildeo da teacutecnica

de estudo da bioatividade de PAF (FIGURAS 13 a 18) A teacutecnica utilizada para o

estudo da bioatividade de PAF no extrato lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos potros

empregando-se PMNs de equinos como ferramenta para se avaliar o influxo de Ca++

induzido por PAF foi ineacutedita em estudos em cavalos Anteriormente a mesma

avaliaccedilatildeo foi realizada utilizando-se PMNs de humanos (GRYNKIEWICZ et al 1985

MARATHE et al 2001) Anteriormente os PMNs de equinos foram empregados

com ecircxito no estudo da bioatividade de PAF em extrato lipiacutedico obtido a partir de

amostras de pulmatildeo de ratos no estudo da asma (MUEHLMANN et al 2009)

91

Portanto a validaccedilatildeo desta teacutecnica se fez necessaacuteria e importante para o

reconhecimento dos resultados obtidos para a bioatividade de PAF no extrato

lipiacutedico das ceacutelulas do LBA dos trecircs grupos investigados No presente estudo o PAF

ativou os PMNs do sangue do cavalo assim como os macroacutefagos alveolares de

forma concentraccedilatildeo dependente Portanto o PAF tendo como uma de suas origens

o macroacutefago alveolar eacute capaz de modificar o comportamento de neutroacutefilos

sanguumliacuteneos induzindo a um aumento da adesatildeo (BRAZIL 2001) e na ativaccedilatildeo dos

neutroacutefilos em cavalos suscetiacuteveis a ORVA (MARR et al 2002)

As influecircncias exercidas pelo PAF na circulaccedilatildeo pulmonar permeabilidade

capilar pulmonar e na agregaccedilatildeo plaquetaacuteria estimulou o estudo da HPIE nos potros

avaliados no grupo EX Para tal o hemossideroacutefago no LBA foi escolhido como o

marcador da HPIE porque a colheita do LBA 24 horas apoacutes o exerciacutecio resultou que

a observaccedilatildeo endoscoacutepica de sangue na traqueacuteia bem como a contagem do

nuacutemero de eritroacutecitos no LBA natildeo fossem teacutecnicas diagnoacutesticas indicadas nesse

momento

A observaccedilatildeo do hemossideroacutefago no LBA mesmo se constituindo numa

forma confiaacutevel de diagnoacutestico da HPIE (McKANE et al 1993) poderia natildeo servir

aos nossos propoacutesitos de identificar diferenccedilas em marcadores inflamatoacuterios e de

estresse oxidativo bem como na funcionalidade de macroacutefagos alveolares dentro

de um mesmo grupo ateacute entatildeo considerado homogecircneo Contudo o

hemossideroacutefago presente no LBA foi confirmado no presente estudo natildeo soacute como

um marcador confiaacutevel da HPIE como tambeacutem foi capaz de diferenciar subgrupos

significativamente distintos dentro do grupo EX

Interessantemente observou-se um percentual de HPIE (determinado pela

presenccedila de hemossideroacutefagos no LBA) maior que o de inflamaccedilatildeo pulmonar (gt5

de neutroacutefilos eou gt1 de eosinoacutefilos na avaliaccedilatildeo citoloacutegica diferencial do LBA)

Isso nos leva a pensar que a HPIE precede a inflamaccedilatildeo no pulmatildeo dos cavalos de

corrida tal como foi sugerido por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) mas que

requer outras investigaccedilotildees para excluir que o contraacuterio estivesse acontecendo isto

eacute um processo inflamatoacuterio em periacuteodo anterior do treinamento que pudesse ter

deixado alguma fragilidade pulmonar Possivelmente o estudo de potros PSI de

corrida tatildeo jovens e em iniacutecio de treinamento permitiu tal discussatildeo visto que se

considera que a HPIE acometa praticamente a totalidade dos cavalos PSI em

treinamento (WEST et al 1993 HINCHCLIFF 2007)

92

A associaccedilatildeo entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo jaacute foi demonstrada anteriormente

(McKANE et al 1993) e foi considerada como sendo significativa no estudo

epidemioloacutegico de NEWTON e WOOD (2002) apesar dos mecanismos pelos quais

esta associaccedilatildeo ocorre ainda serem apresentados de forma hipoteacutetica como no

recente estudo de DERKSEN et al (2009)

No estudo de COUEumlTIL e DENICOLA (1999) cavalos de corrida com HPIE

apresentaram na avaliaccedilatildeo do LBA um aumento no NTCN associado agrave neutrofilia

De fato isto ocorreu no subgrupo HPIE pos e esses achados de citologia

demonstram que a HPIE esteve associada agrave inflamaccedilatildeo pulmonar nos potros do

subgrupo HPIE pos

Outro achado comum entre a HPIE e a inflamaccedilatildeo pulmonar eacute o aumento da

concentraccedilatildeo total de proteiacutenas no LBA como observado no subgrupo HPIE pos em

comparaccedilatildeo com o grupo HPIE neg (FIGURA 29) evidenciando um aumento na

permeabilidade da barreira alveacuteolo-capilar (BAC) no subgrupo HPIE pos

O acuacutemulo de fluiacutedo rico em proteiacutenas no espaccedilo alveolar associado agrave

inflamaccedilatildeo pulmonar como demonstrado por TSANGARIS et al (2003) foi discutido

acima Contudo cavalos com HPIE exercitados a altas velocidades tambeacutem

apresentaram aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas no espaccedilo alveolar (WEST e

MATTHIEU-COSTELLO 1999)

Possivelmente o aumento da concentraccedilatildeo de proteiacutenas associado agrave HPIE

possa ser devido ao aumento da pressatildeo transmural nos capilares pulmonares

resultando em falecircncia por estresse dos capilares como demonstrado por BIRKS et

al (1997) em cavalos exercitados nas mesmas velocidades que os potros avaliados

no presente estudo

Adicionalmente parece que a HPIE deflagrou um mecanismo inflamatoacuterio

causador de extravasamento de plasma no espaccedilo alveolar nos potros do subgrupo

HPIE pos e a bioatividade de PAF significativamente aumentada no subgrupo HPIE

pos em relaccedilatildeo ao subgrupo HPIE neg (FIGURA 28) indica a participaccedilatildeo desse

mediador proacute inflamatoacuterio nesse evento

O extravasamento de plasma na microcirculaccedilatildeo pulmonar e a formaccedilatildeo de

edema pulmonar induzidos por PAF foram demonstrados anteriormente e jaacute

discutidos acima (EVANS et al 1987 CLAVIJO et al 2001) No caso da HPIE

provavelmente o PAF induza a formaccedilatildeo de fendas no endoteacutelio microvascular

atraveacutes da desorganizaccedilatildeo de proteiacutenas juncionais (JIANG et al 2008) Estes dados

93

concordam com a proposta de WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) de que a

altas pressotildees em capilares pulmonares ocorra a formaccedilatildeo de fendas nas junccedilotildees

entre as ceacutelulas endoteliais Desta forma as evidecircncias indicam que associado ao

evento mecacircnico na etiopatogenia da HPIE um evento inflamatoacuterio tambeacutem estaacute

presente o que representa um fator de risco para o agravamento do quadro

Adicionalmente os eventos inflamatoacuterios presentes na HPIE se constituem em

potencial aacuterea para investigaccedilotildees terapecircuticas visto que ainda natildeo se tem um

tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar em cavalos atletas Recentemente

evidecircncias de que a suplementaccedilatildeo de cavalos atletas com aacutecidos graxos ocircmega-3

melhora a fluidez da membrana dos eritroacutecitos (PORTIER et al 2006) sugeriu que a

influecircncia beneacutefica na resposta inflamatoacuteria pulmonar pode reduzir os iacutendices HPIE

(ERICKSON et al 2007)

Portanto eacute razoaacutevel assumir um papel para o PAF na fisiopatologia da HPIE

pelas suas propriedades angiogecircnicas aleacutem de seus efeitos proacute inflamatoacuterios

(APONTE et al 2008) concordando com a hipoacutetese da patogecircnese da HPIE

proposta por DERKSEN et al (2009) (FIGURA 9) onde a ruptura dos capilares

pulmonares resultaria em inflamaccedilatildeo sangramento e hemosiderose e

consequumlentemente a ocorrecircncia de angiogecircnese na circulaccedilatildeo bronquial e fibrose

agravando o quadro da HPIE

Adicionalmente ZHANG et al (2003) demonstraram que o aumento da

permeabilidade capilar induzido por PAF envolve a participaccedilatildeo de estresse

oxidativo visto que a enzima antioxidante superoacutexido dismutase (SOD) atenuou os

efeitos do PAF sobre o endoteacutelio De fato o grupo HPIE pos apresentou a

concentraccedilatildeo de peroacutexidos lipiacutedicos significativamente aumentada em comparaccedilatildeo

ao subgrupo HPIE neg sendo uma evidecircncia de estresse oxidativo no LBA dos

potros deste grupo possivelmente exacerbada pela alta quantidade de ferro da

hemossiderina presente no espaccedilo alveolar (DERSEN et al 2009)

A peroxidaccedilatildeo lipiacutedica induz alteraccedilotildees patoloacutegicas no tecido pulmonar

destruindo pneumoacutecitos e ceacutelulas endoteliais do epiteacutelio levando a um aumento da

permeabilidade microvascular inibe a siacutentese e a liberaccedilatildeo de surfactante e interfere

negativamente na atividade do NO O conjunto dessas accedilotildees dos peroacutexidos lipiacutedicos

no pulmatildeo resulta em dano da estrutura pulmonar e leva agrave hipertensatildeo

representando um fator adicional contribuindo para a patogenia da HPIE (MILLS e

HIGGINS 1997)

94

Os macroacutefagos alveolares como ceacutelulas orquestradoras da resposta imune

pulmonar (PETERS-GOLDEN 2004) devem possuir um importante papel na

patogenia da HPIE visto que a obtenccedilatildeo de subgrupos significativamente distintos

a partir do grupo EX no presente estudo se deu pela presenccedila ou ausecircncia de

hemossideroacutefagos THACKER (2006) descreveu que os macroacutefagos ativados

secretam interleucina-1 (IL-1) que atrai e ativa a proliferaccedilatildeo de fibroblastos e a

siacutentese de colaacutegeno para reparar o tecido danificado Em estudo histopatoloacutegico do

pulmatildeo de cavalos com HPIE as aacutereas de ocorrecircncia de hemorragia caracterizaram-

se por hemossiderose e fibrose (DERKSEN et al 2009)

Adicionalmente WEST e MATTHIEU-COSTELLO (1999) sugeriram o

envolvimento de leucotrieno B4 (LTB4) no mecanismo inflamatoacuterio envolvido na

HPIE apesar deste mecanismo ainda requerer comprovaccedilatildeo Neste evento a

ruptura do epiteacutelio alveolar com a exposiccedilatildeo da membrana ativaria os macroacutefagos

alveolares os quais satildeo ricos em LTB4

O LTB4 por sua vez tambeacutem conecta o PAF agrave HPIE HOPKINS et al (1997)

estudaram a HPIE em humanos avaliando o LBA de seis ciclistas de elite apoacutes 4 km

de esforccedilo maacuteximo Comparados aos controles os ciclistas que realizaram o esforccedilo

apresentaram altas concentraccedilotildees de eritroacutecitos proteiacutenas e LTB4 no LBA No

estudo citado exceto pelo aumento da LTB4 natildeo houve diferenccedila no nuacutemero

percentual de neutroacutefilos e nem nos niacuteveis de IL-8 e TNF-α entre os grupos

suportando a hipoacutetese do estresse mecacircnico alterando a BAC na HPIE segundo a

conclusatildeo dos autores Contudo a associaccedilatildeo entre LTB4 e PAF foi demonstrada

anteriormente onde o receptor de LTB4 esteve envolvido com a quimiotaxia

pulmonar e degranulaccedilatildeo de neutroacutefilos induzida por PAF (GAUDREAULT et al

2005) Todavia ateacute o momento este tipo de associaccedilatildeo natildeo foi demonstrada em

cavalos apesar de ter-se relatada a neutrofilia nas vias aeacutereas de cavalos com

ORVA mediada por LTB4 (LINDBERG et al 2004) Portanto reunindo as

informaccedilotildees acima pode-se assumir a hipoacutetese de que a neutrofilia no LBA e o

aumento da permeabilidade da BAC nos potros do subgrupo HPIE pos tenha sido

induzida por PAF e mediada por receptor de LTB4

Adicionalmente reforccedila-se a evidecircncia da importacircncia dos macroacutefagos

alveolares na HPIE e por sua vez como a hemorragia pulmonar pode influenciar a

funcionalidade dos macroacutefagos Na primeira etapa do presente estudo descrevemos

a reduccedilatildeo na fagocitose e na produccedilatildeo de acircnion superoacutexido e peroacutexido de

95

hidrogecircnio pelos macroacutefagos alveolares do grupo EX (FIGURAS 25 a 27) Contudo

evidenciamos que a HPIE agravou ainda mais esta situaccedilatildeo (FIGURAS 32 e 33)

pois a resposta de macroacutefago alveolar esteve significativamente reduzida no

subgrupo HPIE pos em comparaccedilatildeo com o subgrupo HPIE neg

A reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no subgrupo HPIE pos pode ser

explicada novamente pela HAIE com consequumlente inibiccedilatildeo da produccedilatildeo do NO

(MILLS et al 1996 COUEumlTIL e DENICOLA 1999 SAacuteNCHEZ et al 2005)

favorecendo o aumento da permeabilidade capilar (KIKUCHI et al 2008)

provavelmente agravado pela ocorrecircncia de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica neste grupo (MILLS

e HIGGINS 1997)

Os mecanismos pelos quais o NO modula a permeabilidade microvascular

natildeo satildeo bem conhecidos Em cavalos de PSI de corrida a inibiccedilatildeo da NOS pela

administraccedilatildeo de L-NAME agravou a HPIE enquanto natildeo alterou a pressatildeo arterial

pulmonar (KINDIG et al 2000) e a inalaccedilatildeo de NO durante o exerciacutecio reduziu

ligeiramente a pressatildeo arterial pulmonar enquanto tambeacutem causou agravamento da

HPIE (KINDIG et al 2001) Parece que a pressatildeo arterial pulmonar elevada reflete

em parte uma vasoconstricccedilatildeo arteriolar que serve para proteger o leito capilar das



ajudou mas agravou a HPIE

Adicionalmente corroborando com o aumento da bioatividade de PAF e

reduccedilatildeo na concentraccedilatildeo de nitritos no LBA do subgrupo HPIE pos o estudo de

KWASNIEWSKI et al (2008) com um modelo de lesatildeo e hemorragia em intestino

delgado demonstrou que o preacute tratamento com antagonista de PAF reduziu as

lesotildees enquanto a inibiccedilatildeo do NO endoacutegeno aumentou consideravelmente as

lesotildees hemorraacutegicas e a mortalidade Portanto o estudo citado demonstrou a

existecircncia da relaccedilatildeo entre PAF e NO na hemorragia ocorrida na microcirculaccedilatildeo

assim como reafirma o papel protetor do NO para os efeitos proacute inflamatoacuterios do

PAF (NEVIN e BROADLEY 2002 BRKOVIC e SIROIS 2007)

6 CONCLUSOtildeES E CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS

A hipoacutetese do presente estudo foi confirmada pois tanto o desafio ambiental

como o exerciacutecio causaram alteraccedilotildees no fluido broncoalveolar e modificaram a

funccedilatildeo de macroacutefago alveolar Potros PSI de corrida jovem em treinamento para

corrida apresentaram depressatildeo da resposta imune inata mais especificamente do

macroacutefago alveolar induzida pelo exerciacutecio e agravada pela ocorrecircncia da HPIE

PAF influencia os neutroacutefilos do sangue bem como os macroacutefagos alveolares

de equinos e no presente estudo esteve presente na inflamaccedilatildeo pulmonar induzida

pelo exerciacutecio nos potros PSI durante o treinamento para corrida

Os achados relacionados agrave inflamaccedilatildeo pulmonar e ao aumento da

bioatividade de PAF no fluido broncoalveolar dos potros exercitados estiveram

relacionados agrave HPIE e agrave presenccedila dos hemossideroacutefagos no LBA o que resultou

numa resposta de macroacutefago alveolar ainda mais reduzida

Desta forma assume-se que os resultados obtidos para o grupo EX podem

ser extrapolados para as populaccedilotildees similares de cavalos PSI jovens em

treinamento para a corrida

Finalmente sugere-se a conduccedilatildeo de novos estudos para o entendimento

dos mecanismos inflamatoacuterios envolvidos na HPIE bem como o papel do PAF neste

processo

7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

ADLER KB Regulation of mucus secretion in the airway epithelium Proceedings

of the Third World Equine Airways Symposium Cornell University Ithaca 20-22 July p 31-32 2005

AEBI H Catalase in vitro Methods of Enzymology v 105 p 121-126 1984

AINSWORTH DM GRUumlNIG G MATYCHAK MB YOUNG J WAGNER B ERB HN ANTCZAK DF Recurrent airway obstruction (RAO) in horses is characterized by IFN-γ and IL-8 production in bronchoalveolar lavage cells

Veterinary Immunology and Immunopathology v 96 n 1-2 p 83-91 2003

ALDRED S Oxidative and nitrative changes seen in lipoproteins following exercise

Atherosclerosis v 192 p 1-8 2007

ANDERSON S SHIRES VL WILSON RA MOUNTFORD AP Formation of

multinucleated giant cells in the mouse lung is promoted in the absence of interleukin-12 American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology v 20 p 371-378 1999

APONTE M JIANG W LAKKIS M LI MJ EDWARDS D ALBITAR L VITONIS A MOK SC CRAMER DW YE B Activation of platelet-activating

factor receptor and pleiotropic effects on tyrosine phospho-EGFRSrcFAKpaxillin in ovarian cancer Cancer Research v 68 n 14 p 5839-5848 2008

ART T LEKEUX P Exercised-induced physiological adjustments to stressful conditions in sports horses Livestock Production Science n92 p 101-111 2005

AU B TEIXEIRA MM COLLINS PD WILLIAMS TJ Blockade of PAF receptors controls interleukin-8 production by regulating the activation of neutrophil CD11CD18 European Journal of Pharmacology v 425 p 65-71 2001

BAKER PRS OWEN JS NIXON AB THOMAS LN WOOTEN R DANIEL LW O‟FLAHERTY JT WYKLE RL Regulation of platelet-activating factor

synthesis in human neutrophils by MAP kinases Biochimica et Biophysica Acta v 1592 p 175-184 2002

BALOG T SOBOCANEC S SVERKO V KROLO I ROCIC B MAROTTI M MAROTTI T The influence of season on oxidant-antioxidant status in trained and sedentary subjects Life Sciences v 78 p 1441-1447 2006

BEDENICE D MAZAN MR HOFFMAN AM Association between cough and cytology of bronchoalveolar lavage fluid and pulmonary function in horses diagnosed

with inflammatory airway disease Journal of Veterinary Internal Medicine v 22 p 1022-1028 2008

98

BELLAN JA MINKES RK HOOD JS McMAHON TJ HIGUERA TR

NOSSAMAN BD McNAMARA DB KADOWITZ PJ Analysis of pulmonary and systemic vascular responses to platelet-activating factor in the cat The American Journal of Physilogy v 263 n 1-2 p H234-H243 1992

BERNDT A DERKSEN FJ ROBINSON NE Endotoxin concentrations within the breathing zone of horses are higher in stables than on pasture The Veterinary Journal Oct 17 2008 [Epub ahead of print]

BIAVA JS GONCcedilALVES RC DORNBUSCH PT MICHELOTTO JUacuteNIOR PV

BIONDO AW CASSOU F ZANOTTO GM TELLES JEQ Avaliaccedilatildeo cliacutenica e citoloacutegica do trato respiratoacuterio de cavalos da raccedila quarto de milha apoacutes o exerciacutecio Archives of Veterinary Science v 11 n 1 p 60-65 2006

BIRKS EK MATHIEU-COSTELLO O FU Z TYLER WS WEST JB Very high pressures are required to cause stress failure of pulmonary capillaries in

Thoroughbred racehorses Journal of Applied Physiology v 82 p 1584-1592 1997

BRADFORD MM A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities utilizing the principles of protein dye binding Analytical Biochemistry v 142 p 79-83 1976

BRAZIL TJ The role of neutrophils in equine heaves In VIEL L ROBINSON NE DUCHARME NG McGORUM BC (Eds) Proceedings of the 2nd World

Equine Airways Symposium Scotland Edinburg 2001 Disponiacutevel em httpwwwivisorgproceedingsweas2001Gerberpdf Acesso em 09jun2009

BRKOVIC A SIROIS MG Vascular permeability induced by VEGF family

members in vivo role of endogenous PAF and NO synthesis Journal of Cellular Biochemistry v 100 n 3 p 727-737 2007

BURRELL MH WOOD JL WHITWELL KE CHANTER N MACKINTOSH ME MUMFORD JA Respiratory disease in thoroughbred horses in training the relationship between disease and viruses bacteria and environment Veterinary

Record v 139 n 13 p 308-313 1996

BUSS IH DARLOW BA WINTERBOURN CC Elevated protein carbonyls and

lipid peroxidation products correlating with myeloperoxidase in tracheal aspirates from premature infants Pediatric Research v 47 n 5 p 640-645 2000

CARAMORI G PAPI A Oxidants and asthma Thorax v59 n2 p170-173 2004

CEDDIA MA WOODS JA Exercise suppresses macrophage antigen

presentation Journal of Applied Physiology v 87 n 6 p 2253-2258 1999

CHAPMAN PS GREEN C MAIN JP TAYLOR PM CUNNINGHAM FM

COOK AJ MARR CM Retrospective study of the relationships between age inflammation and the isolation of bacteria from the lower respiratory tract of thoroughbred horses Veterinary Record v 146 n 4 p 91-95 2000

99

CHEN CR VOELKEL NF CHANG SW Pulmonary vascular reactivity effect of

PAF and PAF antagonists Journal of Applied Physiology v 73 p 1762-1769 1992

CHRISTLEY RM HODGSON DR EVANS DL ROSE RJ Effects of training on the development of exercise induced arterial hypoxemia in horses American Journal of Veterinary Research v 58 n 6 p 653-657 1997

CHRISTLEY RM HODGSON DR ROSE RJ HODGSON JL WOOD JL REID SW Coughing in thoroughbred racehorses risk factors and tracheal

endoscopic and cytological findings Veterinary Record v 148 n 4 p 99-104 2001

CHRISTLEY R RUSH BR Inflammatory airway disease In MCGORUM BC DIXON PM ROBINSON NE SCHUMACHER J Equine Respiratory Medicine and Surgery Philadelphia Saunders Elsevier 2007 p 591-599

CLAVIJO LC CARTER MB MATHESON PJ WILSON MA WEAD WB GARRISON RN PAF increases vascular permeability without increasing pulmonary

arterial pressure in the rat Journal of Applied Physiology v 90 n1 p261-268 2001

CLEMENTS JM PIRIE RS Respirable dust concentrations in equine stables Part 2 the benefits of soaking hay and optimizing the environment in a neighbouring stable Research in Veterinary Science v 83 p 263-268 2007

CORDEAU ME JOUBERT P DEWACHI O HAMID Q LAVOIE JP IL-4 IL-5 and IFN-γ mRNA expression in pulmonary lymphocytes in equine heaves

Veterinary Immunology and Immunopathology v 97 p 87-96 2004

COUEumlTIL LL DENICOLA DB Blood gas plasma lactate and bronchoalveolar

lavage cytology analyses in racehorses with respiratory disease Equine Veterinary Journal Suppl v 30 p77-82 1999

COUEumlTIL LL HOFFMAN AM HODGSON J BUECHNER-MAXWELL V VIEL

L WOOD JLN LAVOIE JP Inflammatory airway disease of horses Journal of Veterinary Internal Medicine v 21 p 356-361 2007

DAVIS JM KOHUT ML COLBERT LH JACKSON DA GHAFFAR A MAYER EP Exercise alveolar macrophage function and susceptibility to respiratory infection Journal of Applied Physiology v 83 n 5 p 1461-1466

1997

DAVIS MS ROYER CM McKENZIE EC WILLIAMSON KK PAYTON M

MARLIN D Cold air-induced late-phase bronchoconstriccion in horses Equine Veterinary Journal Suppl v 36 p 535-539 2006

DAWSON J LEES P E SEDGWICK AD Platelet activating factor as a mediator of equine cell locomotion Veterinary Research Communications v 12 n 2-3 p 101-107 1988

100

De MEY JG VANHOUTTE PM Interaction between Na+K+ exchanges and the

direct inhibitory effect of acetylcholine on canine femoral arteries Circulation Research v 46 n 6 p 826-836 1980

DEATON CM MARLIN DJ Exercise-associated oxidative stress Clinical Techniques in Equine Practice v 2 n3 p278-291 2003

DEATON CM The role of oxidative stress in an equine model of human asthma Redox Report v 11 n2 p 46-52 2006

DEBRUE M HAMILTON E JOUBERT P LAJOIE-KADOCH S LAVOIE JP Chronic exacerbation of equine heaves is associated with an increased expression of interleukin-17 mRNA in bronchoalveolar lavage cells Veterinary Immunology and

Immunopathology v 105 p 25-31 2005

DECONTO I Zytologische und bakteriologische untersunchungen des

tracheobronchialsekretes bei chronisch lungenkranken pferden Tese (Doutorado em Medicina Veterinaacuteria) Hannover (Faculdade de Medicina Veterinaacuteria Universidade de Hannover) 1983

DEKKER LV LEITGES M ALTSCHULER G MISTRY N McDERMOTT A ROES J SEGAL AW Protein kinase C-β contributes to NADPH oxidase activation

in neutrophils Biochemical Journal v 347 p 285-289 2000

DEMPSEY JA WAGNER PD Exercise-induced arterial hypoxemia Journal of

Applied Physiology v 87 p 1997-2006 1999

DENGUEZLI-BOUZGARROU M SAAD HB CHIEKH IB TABKA Z ZBIDI A

Role of lung inflammatory mediators as a cause of training-induced lung function changes in runners Science amp Sports v 22 p 35-42 2007

DERKSEN FJ WILLIAMS KJ PANNIRSELVAM RR FEIJTER-RUPP H STEEL CM ROBINSON NE Regional distribution of collagen and haemosiderin in the lungs of horses with exercise-induced pulmonary haemorrhage Equine Veterinary Journal v 41 n6 p 586-591 2009

DEWACHI O JOUBERT P HAMID Q LAVOIE JP Expression of interleukin (IL)-5 and IL-9 receptors on neutrophils of horses with heaves Veterinary

Immunology and Immunopathology v109 p 31-36 2006

DOUCET MY VIEL L Clinical radiographic endoscopic bronchoalveolar lavage

and lung biopsy findings in horses with exercise-induced pulmonary hemorrhage Canadian Veterinary Journal v 43 p 195-202 2002

DROST EM SKWARSKI KM SAULEDA J SOLER N ROCA J AGUSTI A MACNEE W Oxidative stress and airway inflammation in severe exacerbations of COPD Thorax v60 n 4 p293-300 2005

DYRYNDA EA PIPE RK BURT GR RATCLIFFE NA Modulations of the immune defences of mussels (Mytilus edulis) from contaminated sites in the UK

Aquatic Toxicology v 42 p169-185 1998

101

ELFMAN L RIIHIMAumlKI M PRINGLE J WALINDER R Influence of horse stable

environment on human airways Journal of Occupational Medicine and Toxicology v 4 n 10 p 1-7 2009

EPP TS McDONOUGH P PADILLA DJ GENTILE JM EDWARDS KL ERICKSON HH POOLE DC Exercise-induced pulmonary haemorrhage during submaximal exercise Equine Veterinary Journal Suppl v 36 p 502-507 2006

EPPINGER M Hemorragia pulmonar de esforccedilo e o desempenho de equinos PSI (Equus caballus) em corridas de galope no Jockey Club do Paranaacute 1990

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) ndash Universidade Federal do Paranaacute Curitiba

ERICKSON HH EPP TS POOLE DC Review of alternative therapies for EIPH

Proceedings of the Congress of the American Association of Equine Practitioners Ithaca International Veterinary Information Service 2007 Doc P81121207 Disponiacutevel em lt

httpwwwivisorgproceedingsaaep2007ericksonchapterasp gt Acesso em 23Set2009

ERICKSON HH POOLE DC Exercise-induced pulmonary hemorrhage current concepts In LEKEUX P Equine Respiratory Disease Ithaca EUA International Veterinary Information Service 2007 Doc B03200102 Disponiacutevel em lt

httpwwwivisorgspecial_booksLekeuxericksonchapteraspLA=1gt Acesso em 06set2009

EVANS TW CHUNG KF ROGERS DF BARNES PJ Effect of platelet-activating factor on airway vascular permeability possible mechanisms Journal of Applied Physiology v 63 n 2 p 479-484 1987

FAIRBAIRN SM MARR KA LEES P CUNNINGHAM FM Effects of platelet activating factor on the distribution of radiolablled leukocytes and platelets in normal

horses and asymptomatic horses with chronic obstructive pulmonary disease Research in Veterinary Science v 61 p107-113 1996

FERNADES WR MORI E SANCHES A Cytological evaluation of Rosenfeld-

stained tracheobronchial washes and bronchoalveolar lavages in healthy horses Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia vol 52 n 6 p 604-609 2000

FINNEY-HAYWARD TK BAHRA P LI S POLL CT NICHOLSON AG RUSSELL REK FORD PA WESTWICK J FENWICK PS BARNES PJ

DONNELLY LE Leukotriene B4 release by human lung macrophages via receptor not voltage operated Ca2+ channels European Respiratory Journal v 33 n 5 p 1105-1112 2009

FOLCH J LEES M SLOANE STANLEY GH A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues Journal of Biological Chemistry

v 226 n 1 p 497-509 1957

102

GABRIJELCIC J ACUNtildeA A PROFITA M PATERNOgrave A CHUNG KF

VIGNOLA AM RODRIacuteGUEZ-ROISIN R Neutrophil airway influx by platelet-activating factor in asthma role of adhesion molecules and LTB4 expression The European Respiratory Journal v 22 n 2 p 290-297 2003

GAUDREAULT E STANKOVA J ROLA-PLESZCZYNSKI M Involvement of Leukotriene B4 receptor 1 signaling in platelet-activating factor-mediated neutrophil

degranulation and chemotaxis Prostaglandins amp Other Lipid Mediators v 75 n 1-4 p 25-34 2005

GERBER V KING M SCHNEIDER DA ROBINSON NE Tracheobronchial mucus viscoelasticity during environmental challenge in horses with recurrent airway obstruction Equine Veterinary Journal v 32 n 5 p 411-417 2000

GERBER V Mucus in equine lower airway disease In VIEL L ROBINSON NE DUCHARME NG McGORUM BC (Eds) Proceedings of the 2nd World Equine

Airways Symposium Scotland Edinburg 2001 Disponiacutevel em httpwwwivisorgproceedingsweas2001Gerberpdf Acesso em 09jun2009

GERBER V STRAUB R MARTI E HAUPTMAN J HERHOLZ C KING M

IMHOF A TAHON L ROBINSON NE Endoscopic scoring of mucus quantity and quality observer and horse variance and relationship to inflammation mucus

viscoelasticity and volume Equine Veterinary Journal v 36 n 7 p 576-582 2004

GOumlGGEL R UHLIG S The inositol trisphosphate pathway mediates platelet-activating-factor-induced pulmonary oedema The European Respiratory Journal v 25 n 5 p 849-857 2005

GORDON S The macrophage past present and future European Journal of Immunology v 37 p 9-17 2007

GRIMMINGER F SPRIESTERSBACH R WEISSMANN N WALMRATH D SEEGER W Nitric oxide generation and hypoxic vasoconstriction in buffer-perfused rabbit lungs Journal of Applied Physiology v 78 n 4 p 1509-1515 1995

GRYNKIEWICZ G POENIE M TSIEN RY A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties The Journal of Biological

Chemistry v 260 n6 p 3440-3450 1985

HACKETT RP DUCHARME NG GLEED RD MITCHELL L SODERHOLM

LV ERICKSON BK ERB HN Do Thoroughbred and Standardbred horses have similar increases in pulmonary vascular pressures during exertion The Canadian Journal of Veterinary Research v 67 p 291-296 2003

HALLSTRAND TS DEBLEY JS FARIN FM HENDERSON WR Role of MUC5AC in the pathogenesis of exercise-induced bronchoconstriction Journal of

Allergy and Clinical Immunology v 119 n 5 p 1092-1098 2007

HARE JE VIEL L Pulmonary eosinophilia associated with increased airway

responsiveness in young racing horses Journal of Veterinary Internal Medicine v 12 n 3 p 163-170 1998

103

HELMING L GORDON S Macrophage fusion induced by IL-4 alternative activation

is a multistage process involving multiple target molecules European Journal of Immunology v 37 n 1 p 33-42 2007

HEWSON J VIEL L Sampling microbiology and cytology of the respiratory tract In LEKEUX P Equine Respiratory Diseases Ithaca International Veterinary Information Service 2002 Doc 03080602 Disponiacutevel em lt

httpwwwivisorgspecial_booksLekeuxvielchapter_frmaspLA=1gt Acesso 06Set2009

HINCHCLIFF KW JACKSON MA MORLEY PS BROWN JA DREDGE AE O‟CALLAGHAN PA McCAFFREY JP SLOCOMBE RE CLARKE AE Association between exercise-induced pulmonary hemorrhage and performance in

Thoroughbred racehorses Journal of the American Veterinary Medical Association v 227 n 5 p 768-774 2005a

HINCHCLIFF KW JACKSON MA BROWN JA DREDGE AE O‟CALLAGHAN PA McCAFFREY JP MORLEY PS SLOCOMBE RE CLARKE AE Tracheobronchoscopic assessment of exercise-induced pulmonary

hemorrhage in horses American Journal of Veterinary Research v 66 n 4 p 596-598 2005b

HINCHCLIFF KW Exercise-induced pulmonary hemorrhage In McGORUM BC DIXON PM ROBINSON NE SCHUMACHER J Equine Respiratory Medicine and Surgery Philadelphia Saunders Elsevier 2007 p 617-629

HINES MT SCHOTT II HC BAYLY WM LEROUX AJ Exercise and immunity a review with emphasis on the horse Journal of Veterinary Internal

Medicine v 10 p 280-289 1996

HOBO S MATSUDA Y YOSHIDA K Prevalence of upper respiratory tract

disorders detected with a flexible videoendoscope in thoroughbred racehorses Journal of Veterinary Medical Science v 57 n 3 p 409-413 1995

HODGSON DR CHRISTLEY RM WOOD JLN REID SWJ HODGSON

JL Relationship between coughing and airway inflammation in young racehorses In HOFFMAN A ROBINSON NE WADE JF Proceedings of a Workshop on Inflammatory Airway Disease Defining the Syndrome Havemeyer Foundation

Monograph Series No 9 Newmarket UK R amp W Publications p16-18 2003

HODGSON JL HODGSON DR Tracheal aspirates indications technique and

interpretation In ROBINSON NE Current Therapy in Equine Medicine 5ed St Louis Saunders 2003 p 401-407

HODGSON JL HODGSON DR Collection and analysis of respiratory tract samples In McGORUM BC DIXON PM ROBINSON NE SCHUMACHER J Equine Respiratory Medicine and Surgery Philadelphia Saunders Elsevier 2007

p 119-150

HOFFMAN AM Bronchoalveolar lavage technique and cytological diagnosis of

small airway inflammatory disease Equine Veterinary Education v 11 n 6 p 330-336 1999

104

HOLCOMBE SJ JACKSON C GERBER V JEFCOAT A BERNEY C

EBERHARDT S ROBINSON NE Stabling is associated with airway inflammation in young Arabian horses Equine Veterinary Journal v 33 n 3 p 244-249 2001

HOLCOMBE SJ ROBINSON NE DERKSEN FJ BERTOLD B GENOVESE R MILLER R de FEITER-RUPP H CARR EA EBERHART SW BORUTA D KANEENE JB Effect of tracheal mucus and tracheal cytology on racing

performance in Thoroughbred racehorses Equine Veterinary Journal v 38 n4 p 300-304 2006

HOLCOMBE SJ DUCHARME NG Disorders of the nasopharynx and soft palate In McGORUM BC DIXON PM ROBINSON NE SCHUMACHER J Equine Respiratory Medicine and Surgery Philadelphia Saunders Elsevier 2007 p 437-

457

HOPKINS SR The lung at maximal exercise insights from comparative physiology

Clinics in Chest Medicine v 26 n 3 p 459-468 2005

HOPKINS SR SCHOENE RB HENDERSON WR SPRAGG RG MARTIN

TR WEST JB Intense exercise impairs the integrity of the pulmonary blood-gas barrier in elite athletes American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine v 155 n 3 p 1090-1094 1997

HUGHES KJ MALIKIDES N HODGSON DR HODGSON JL Comparison of tracheal aspirates and bronchoalveolar lavage in racehorses 1 Evaluation of

cytological stains and the percentage of mast cells and eosinophils Australian Veterinary Journal v 81 n 11 p 681-684 2003

HUSTON L BAYLY W LIGGITT H Alveolar macrophage function in Thoroughbreds after strenuous exercise In GILLESPIE JR ROBINSON NE (eds) Equine Exercise Physiology 2 Davis CA ICEEP 1987 p 243-253

ISHII S NAGASE T SHINDOU H TAKIZAWA H OUCHI Y SHIMIZU T Platelet-activating factor receptor develops airway hyperresponsiveness independently of airway inflammation in a murine asthma model The Journal of

Immunology v 172 n 11 p 7095-7102 2004

IWAMOTO J MORIN FC 3rd Nitric oxide inhibition varies with hemoglobin

saturation Journal of Applied Physiology v 75 n 5 p 2332-2336 1993

JI LL Modulation of skeletal muscle antioxidant defense by exercise role of redox

signaling Free Radical Biology amp Medicine v 44 p 142-152 2008

JIANG Y WEN K ZHOU X SCHWEGLER-BERRY D CASTRANOVA V HE

P Three-dimensional localization and quantification of PAF-induced gap formation in intact venular microvessels American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology v 295 n2 p H898-H906 2008

KIKUCHI M SHIRASAKI H HIMI T Platelet-activating factor (PAF) increases NO production in human endothelial cells-real-time monitoring by DAR-4M AM

Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids v 78 n 4-5 p 305-309 2008

105

KINDIG CA ERICKSON HH POOLE DC Dissociation of exercise-induced

pulmonary hemorrhage and pulmonary artery pressure via nitric oxide synthase inhibition Journal of Equine Veterinary Science v 20 n 11 p 715-721 2000

KINDIG CA MCDONOUGH P FINLEY G BEHNKE BJ RICHARDSON TE ERICKSON HH POOLE DC NO inhalation reduces pulmonary arterial pressure but not hemorrhage in maximal exercising horses Journal of Applied Physiology

v 91 n6 p 2674-2678 2001

KIRKHAM P RAHMAN I Oxiadtive stress in asthma and COPD antioxidants as a

therapeutic strategy Pharmacology amp Therapeutics v 111 n 2 p 476-494 2006

KIRSCHVINK N MOFFARTS B LEKEUX P The oxidantantioxidant equilibrium

in horses The Veterinary Journal v 177 p 178-191 2008

KIZAKI T TAKEMASA T SAKURAI T IZAWA T HANAWA T KAMIYA S

HAGA S IMAIZUMI K OHNO H Adaptation of macrophages to exercise training improves innate immunity Biochemical and Biophysical Research Communications v 372 p 152-156 2008

KLEIBER C McGORUM BC HOROHOV DW PIRIE RS ZURBRIGGEN A STRAUB R Cytokine profiles of peripheral blood and airway CD4 and CD8 T

lymphocytes in horse with recurrent airway obstruction Veterinary Immunology and Immunopathology v 104 p 91-97 2005

KWASNIEWSKI FH LANDGRAF RG JANCAR S Small bowel injury associated to allergy is triggered by platelet-activating factor mast cells neutrophils and protected by nitric oxide International Immunopharmacology v 8 p 371-378

2008

LAPOINTE JM VRINS A McCARVILL E A survey of exercise-induced

pulmonary haemorrhage in Quebec standardbred racehorses Equine Veterinary Journal v 26 n 6 p 482-485 1994

LEARY PJ RAJASEKARAN S MORRISON RR TUOMANEN EI CHIN TK

HOFMANN PA A cardioprotective role for platelet-activating factor through NOS-dependent S-nitrosylation American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology v294 n 6 p H2775-H2784 2008

LEE YM HYBERTSON BM CHO YG REPINE JE Platelet-activating factor induces lung inflammation and leak in rats hydrogen peroxide production along

neutrophil-lung endothelial cell interfaces The Journal of Laboratory and Clinical Medicine v 140 n5 p 312-319 2002

LEMAIRE I FALZONI S LEDUC N ZHANG B PELLEGATTI P ADINOLFI E CHIOZZI P DI VIRGILIO F Involvement of the purinergic P2X7 receptor in the formation of multinucleated giant cells Journal of Immunology v 177 n 10 p

7257-7265 2006

106

LESSA DAB MORI E VIANA EB SANTOS OJ MOREIRA JFE

FERNANDES WR Lavado broncoalveolar em equinos revisatildeo de literatura parte 1 teacutecnicas de colheita Arquivo em Ciecircncias Veterinaacuterias e Zoologia UNIPAR v 8 n 2 p 213-217 2005

LINDBERG A ROBINSON NE NAumlSMAN-GLASER B JENSEN-WAERN M LINDGREN JA Assessment of leukotriene B4 production in leukocytes from horses

with recurrent airway obstruction American Journal of Veterinary Research v 65 n 3 p 289-295 2004

LORA JM ZHANG DM LIAO SM BURWELL T KING AM BARKER PA SINGH L KEAVENEY M MORGENSTERN J GUTIEacuteRREZ-RAMOS JC COYLE AJ FRASER CC Tumor necrosis factor-α triggers mucus production in

airway epithelium through an IκB kinase β-dependent mechanism The Journal of Biological Chemistry v 280 n 43 p 36510-36517 2005

LOU YP TAKEYAMA K GRATTAN KM LAUSIER JA UEKI IF AGUSTIacute C NADEL JA Platelet-activating factor induces goblet cell hyperplasia and mucin gene expression in airways American Journal of Respiratory and Critical Care

Medicine v 157 n 6 p 1927-1934 1998

LUNDBORG M BOUHAFS R GERDE P EWING P CAMNER P DAHLEacuteN

SE JARSTRAND C Aggregates of ultrafine particles modulate lipid peroxidation and bacterial killing by alveolar macrophages Envrionmental Research v 104 n 2 p 250-257 2007

LUNN DP BREATHNACH C SOBOLL G Immunology and Immunopathology In McGORUM BC DIXON PM ROBINSON NE SCHUMACHER J Equine

Respiratory Medicine and Surgery Philadelphia Elsevier 2007 p 71-81

MALIKIDES N Epidemiological studies on inflammatory airway disease (IAD)

in young Thoroughbred racehorses Sydney Austraacutelia 2003 Tese (Universidade de Sydney)

MALIKIDES N HUGHES KJ HODGSON JL Comparison of tracheal aspirates

before and after high-speed treadmill exercise in racehorses Australian Veterinary Journal v 85 n 10 2007

MANOHAR M GOETZ TE L-NAME does not affect exercise-induced pulmonary hypertension in Thoroughbred horses Journal of Applied Physiology v 84 p 1902-1908 1998

MANOHAR M GOETZ TE Pulmonary vascular pressures of strenously exercising Thoroughbreds during intravenous infusion of nitroglycerin American Journal of

Veterinary Research v 60 n 11 p 1436-1440 1999

MANOHAR M GOETZ TE HASSAN AS Nitric oxide synthase inhibition in

thoroughbred horses augments O2 extraction at rest and submaximal exercise but not during short-term maximal exercise Equine Veterinary Journal Supplement v 36 p 481-486 2006

107

MARATHE GK PRESCOTT SM ZIMMERMAN GA McINTYRE TM Oxidized

LDL contains inflammatory PAF-like phospholipids Trends in Cardiovascular Medicine v11 p139-142 2001

MARR KA FOSTER AP LEES P CUNNINGHAM FM PAGE CP Effect of antigen challenge on the activation of peripheral blood neutrophils from horses with chronic obstructive pulmonary disease Research in Veterinary Science v 62 p

253-260 1997

MARR KA LEES P CUNNINGHAM FM Antigen challenge increases adherence

of circulating neutrophils in horses with chronic obstructive pulmonary disease Equine Veterinary Journal v 34 n 1 p 65-70 2002

MASTALOUDIS A MORROW JD HOPKINS DW DEVARAJ S TRABER MG Antioxidant supplementation prevents exercise-induced lipid peroxidation but not inflammation in ultramarathon runners Free Radical Biology amp Medicine v 36

n 10 p 1329-1341 2004

MAZAN MR HOFFMAN AM Clinical Techniques for diagnosis of inflammatory

airway disease in the horse Clinical Techniques in Equine Practice v 2 n 3 p 238-257 2003

McGORUM BC DIXON PM Clinical examination of the respiratory tract In McGORUM BC DIXON PM ROBINSON NE SCHUMACHER J Equine Respiratory Medicine and Surgery Philadelphia Elsevier 2007 p 103-117

McKANE SA CANFIELD PJ ROSE RJ Equine bronchoalveolar lavage cytology survey of thoroughbred racehorses in training Australian Veterinary

Journal v 70 n11 p 401-404 1993

McPHERSON EA THOMSON JR Chronic obstructive pulmonary disease in the

horse 1 Nature of the disease Equine Veterinary Journal v 15 n3 p 203-206 1983

MEYER TS FEDDE MR GAUGHAN EM LANGSETMO I ERICKSON HH

Quantification of exercise-induced pulmonary haemorrhage with bronchoalveolar lavage Equine Veterinary Journal v 30 n4 p 284-288 1998

MICHELOTTO JUacuteNIOR PV BIAVA JS GONCcedilALVES RC CASSOU F BONFAacute AF MACHADO CD Aspirado traqueal de cavalos clinicamente sadios da raccedila quarto de milha apoacutes prova de trecircs tambores Archives of Veterinary Science

v 12 n 2 p 1-7 2007

MILLS PC HIGGINS AJ Oxidant injury nitric oxide and pulmonary vascular

function implications for the exercising horse The Veterinary Journal v 153 p125-148 1997

MILLS PC MARLIN DJ DEMONCHEAUX E SCOTT C CASAS I SMITH NC HIGENBOTTAM T Nitric oxide and exercise in the horse The Journal of Physiology v 495 p863-874 1996

108

MIYAZAKI H OH-ISHI S OOKAWARA T KIZAKI T TOSHINAI K HA S

HAGA S JI LL OHNO H Strenous endurance training in humans reduces oxidative stress following exhausting exercise European Journal of Applied Physiology v 84 n 1-2 p 1-6 2001

MORI E MORI CMC DELLA LIBERA AMMP LARA MCCSH FERNANDES WR Evaluation of alveolar macrophage function after experimental

infection with equine herpesvirus-1 in horses Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaacuteria e Zootecnia v 55 n 3 p 271-278 2003

MUEHLMANN LA ZANATTA AL FARIAS CLA BIEBERBACH EW MAZZONETTO AC MICHELOTTO JR PV FERNANDES LC NISHIYAMA A Dietary supplementation with soybean lecithin increases pulmonary PAF bioactivity in

asthmatic rats The Journal of Nutritional Biochemistry Apr 14 2009 [Epub ahead of print]

NAKAJIMA T ITO M TCHOUA U TOJO H HASHIMOTO M Phopholipase A2-mediated superoxide production of murine peritoneal macrophages induced by chrysotile stimulation The International Journal of Biochemistry amp Cell Biology

v 32 p 779-787 2000

NEVIN BJ BROADLEY KJ Nitric oxide in respiratory diseases Pharmacology amp

Therapeutics v 95 p 259-293 2002

NEWTON JR WOOD JL Evidence of an association between inflammatory

airway disease and EIPH in young Thoroughbreds during training Equine Veterinary Journal Suppl v 34 p 417-424 2002

NOUROOZ-ZADEH J TAJADDINI-SARMADI J WOLFF S Measurement of plasma hydroperoxide concentrations by ferrous oxidation-xylenol orange assay in conjunction with triphenylphosphine Analytical Biochemistry v 220 p 403-409

1994

OHAR JA WALLER KS PANTANO J DEMELLO DE DAHMS TE Chronic platelet-activating factor induces a decrease in pulmonary vascular compliance

hydroxyproline and loss of vascular matrix American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine v 149 n6 p 1628-1634 1994

OWEN JS BAKER PRS O‟FLAHERTY JT THOMAS MJ SAMUEL MP WOOTEN RE WYKLE RL Stress-induced platelet-activating factor synthesis in human neutrophils Biochimica et Biophysica Acta v 1733 p120-129 2005

PARK JY FERRELL RE PARK JJ HAGBERG JM PHARES DA JONES JM BROWN MD NADPH oxidase p22phox gene variants are associated with

systemic oxidative stress biomarker responses to exercise training Journal of Applied Physiology v 99 p 1905-1911 2005

PEREZ-MORENO CI COUEumlTIL LL PRATT SM OCHOA-ACUNtildeA HG RASKIN RE RUSSELL MA Effect of furosemide and furosemide-carbazochrome combination on exercise-induced pulmonary hemorrhage in Standardbred

racehorses Canadian Veterinary Journal v 50 n 8 p 821-827 2009

109

PETERS-GOLDEN M The alveolar macrophage the forgotten cell in asthma

American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology v 31 p 3-7 2004

PICK E MIZEL D Rapid microassays for the measurement of superoxide and

hydrogen peroxide production by macrophages in culture using an automatic enzyme immunoassay reader Journal of Immunological Methods v 46 n 2 p 211-226 1981

PICKLES K PIRIE RS RHIND S DIXON PM McGORUM BC Cytological analysis of equine bronchoalveolar lavage fluid Part 1 comparison of sequential and

pooled aliquots Equine Veterinary Journal v 34 n 3 p 288-291 2002a

PICKLES K PIRIE RS RHIND S DIXON PM McGORUM BC Cytological

analysis of equine bronchoalveolar lavage fluid Part 2 comparison of smear and cytocentrifuged preparations Equine Veterinary Journal v 34 n 3 p 292-296 2002b

PICKLES K PIRIE RS RHIND S DIXON PM McGORUM BC Cytological analysis of equine bronchoalveolar lavage fluid Part 3 the effect of time

temperature and fixatives Equine Veterinary Journal v 34 n 3 p 297-301 2002c

PINHO RA CHIESA D MEZZOMO KM ANDRADES ME BONATTO F GELAIN D DAL PIZZOL F KNORST MM MOREIRA JCF Oxidative stress in chronic obstructive pulmonary disease patients submitted to a rehabilitation program

Respiratory Medicine v 101 p 1830-1835 2007

PIRRONE F ALBERTINI M CLEMENT MG LAFORTUNA CL Respiratory

mechanics in Standardbred horses with sub-clinical inflammatory airway disease and poor athletic performance The Veterinary Journal v 173 p 144-150 2007

PORTIER K de MOFFARTS B FELLMAN N KIRSCHVINK N MOTTA C LETELLIERW C RUELLAND A van ERCK E LEKEUX P COUDER J The effects of dietary N-3 and antioxidant supplementation on erythrocyte membrane fatty acid composition and fluidity in exercising horses Equine Veterinary Journal

Supplement v 36 p 279-284 2006

RACKESTRAW P HACKETT R DUCHARME N NIELAN G ERB H Arytenoid

cartilage movement in resting and exercising horses Veterinary Surgery v 20 p 122ndash177 1991

RAHMAN I BISWAS S KODE A Oxidant and antioxidant balance in the airways and airway diseases European Journal of Pharmacology v 533 p 222-239 2006

RAIDAL SL LOVE DN BAILEY GD ROSE RJ The effect of high intensity exercise on the functional capacity of equine pulmonary alveolar macrophages and

BAL-derived lymphocytes Research in Veterinary Science v 68 p 249-253 2000

110

RAIDAL SL ROSE RJ LOVE DN Effects of training on resting peripheral blood

and BAL-derived leucocyte function in horses Equine Veterinary Journal v 33 n 3 p 238-243 2001

RAKER CW BOLES CL Pharyngeal lymphoid hyperplasia in the horse Journal of Equine Medicine and Surgery v 2 p 202-207 1978

RAMIREZ R CHONG T VICTORINO GP Angiotensin II effect on hydraulic permeability interaction with endothelin-1 nitric oxide and platelet activating factor The Journal of Surgical Research v 134 n 2 p 259-264 2006

REDINGTON AE Modulation of nitric oxide pathways therapeutic potential in asthma and in chronic obstructive pulmonary disease European Journal of

Pharmacology v 533 p 263-276 2006

RICHARD EA FORTIER GD LEKEUX PM ERCK EV Laboratory findings in

respiratory fluids of poorly-performing horse The Veterinary Journal 2009 [Epub ahead of print]

RIIHIMAumlKI M RAINE A ELFMAN L PRINGLE J Markers of respiratory inflammation in horses in relation to seasonal changes in air quality in a conventional racing stable The Canadian Journal of Veterinary Research v 72 p432-439

2008a

RIIHIMAumlKI M LILLIEHOumlOumlK I RAINE A BERG M PRINGLE J Clinical

alterations and mRNA levels of IL-4 and IL-5 in bronchoalveolar cells of horses with transient pulmonary eosinophilia Research in Veterinary Science v 85 p 52-55 2008b

ROBINSON NEWorkshop summary In HOFFMAN A ROBINSON NE WADE JF Proceedings of a Workshop on Inflammatory Airway Disease Defining the

Syndrome Havemeyer Foundation Monograph Series n 9 R amp W Publications p 89-91 2003

ROBINSON NE BERNEY C DEFEIJTER-RUPP H JEFCOAT AM

CORNELISSE C GERBERV Mucus cough airway obstruction and inflammation In HOFFMAN A ROBINSON NE WADE JF Proceedings of a Workshop on Inflammatory Airway Disease Defining the Syndrome Havemeyer Foundation

Monograph Series n 9 Newmarket UK R amp W Publications p13-15 2003

ROBINSON NE Tracheal mucus and inflammation prevalence and consequences

in midwestern horses Proceedings of the Third World Equine Airways Symposium Cornell University July 20-22 p45-48 2005

ROBINSON NE KARMAUS W HOLCOMBE SJ CARR EA DERKSEN FJ Airway inflammation in Michigan pleasure horses prevalence and risk factors Equine Veterinary Journal v 38 n 4 p 293-299 2006

ROBINSON NE How horses breathe the respiratory muscles and the airways In McGORUM BC DIXON PM ROBINSON NE SCHUMACHER J Equine


111

ROSEN H GORDON S Monoclonal antibody to the murine type 3 complement

receptor inhibits adhesion of myelomonocytic cells in vitro and inflammatory cell recruitment in vivo The Journal of Experimental Medicine v 166 p 1685-1701 1987

SAacuteNCHEZ A COUEumlTIL LL WARD MP CLARK SP Effect of airway disease on blood gas exchange in racehorses Journal of Veterinary Internal Medicine v

19 p 87-92 2005

SANTUS P SOLA A CARLUCCI P FUMAGALLI F GENNARO AD

MONDONI M CARNINI C CENTANNI S SALA A Lipid peroxidation and 5-lipoxygenase activity in chronic obstructive pulmonary disease American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine v 171 p 838-843 2005

SHAO MXG NADEL JA Neutrophil elastase induces MUC5AC mucin production in human airway epithelial cells via a cascade involving protein kinase C reactive

oxygen species and TNF-α-converting enzyme The Journal of Immunology n175 p4009-4016 2005

SHIBAMOTO T YAMAGUCHI Y HAYASHI T Jr SAEKI Y KAWAMOTO M KOYAMA S PAF increases capillary pressure but not vascular permeability in isolated blood-perfused canine lungs American Journal of Physiology v 264

pH1454-H1459 1993

SHIBAMOTO T LIU W CUI S ZHANG W TAKANO H PAF rather than

histamine participates in mouse anaphylatic hypotension Pharmacology v 82 p 114-120 2008

SHINDO K KOIDE K FUKUMURA M Platelet-activating factor increases leukotriene B4 release in stimulated alveolar macrophages from asthmatic patients European Respiratory Journal v 11 p 1098-1104 1998

STAFFORINI DM McINTYRE TM ZIMMERMAN GA PRESCOTT SM Platelet-activating factor a pleiotrophic mediator of physiological and pathological processes Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences v 40 n 6 p 643-

672 2003

STUEHR DJ MARLETTA MA Mammalian nitrate biosynthesis mouse

macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America v 82 n 22 p 7738-7742 1985

SUMITA C YAMANE M MATSUDA T MAEDA M NARIAI T FUJIO Y AZUMA J Platelet activating factor induces cytoskeletal reorganization through Rho

family pathway in THP-1 macrophages FEBS Letters v 579 p 4038-4042 2005

THACKER EL Lung inflammatory responses Veterinary Research v 37 p 469-

486 2006

THORNTON DJ SHEEHAN JK From mucins to mucus toward a more coherent

understanding of this essential barrier Proceedings of the American Thoracic Society n1 p54-61 2004

112

TSANGARIS I LEKKA ME KITSIOULI E CONSTANTOPOULOS S NAKOS

G Bronchoalveolar lavage alterations during prolonged ventilation of patients without acute lung injury The European Respiratory Journal v 21 n 3 p 495-501 2003

UHLIG S GOumlGGEL R ENGEL S Mechanisms of platelet-activating factor (PAF)-mediated responses in the lung Pharmacological Reports v 57 p 206-221 2005

URSO ML CLARKSON PM Oxidative stress exercise and antioxidant supplementation Toxicology v 189 p 41-54 2003

VALKO M LEIBFRITZ D MONCOL J CRONIN MTD MAZUR M TELSER J Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease The International Journal of Biochemistry amp Cell Biology v 39 p 44-

84 2007

VANDENPUT S DUVIVIER DH VOTION D ART T LEKEUX P

Environmental control to maintain stable COPD horses in clinical remission effects on pulmonary function Equine Veterinary Journal v 30 n 2 p 93-96 1998

VICINO C Ocorrecircncia de hemorragia pulmonary induzida por esforccedilo em cavalos cavalos de salto no estado de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2007 66p Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Curso de Medicina Veterinaacuteria Universidade de Satildeo Paulo

VIEL L HEWSON J Bronchoalveolar Lavage In ROBINSON NE Current Therapy in Equine Medicine 5ed St Louis Saunders 2003 p407-411

VOYNOW JA FISCHER BM MALARKEY DE BURCH LH WONG T LONGPHRE M HO SB FOSTER WM Neutrophil elastase induces mucus cell

metaplasia in mouse lung American Journal of Physiology and Lung Cell Molecular Physiology n 287 p L1293-L1302 2004

WEST JB Pulmonary capillary stress failure Journal of Applied Physiology v 89 p 2483-2489 2000

WEST JB MATHIEU-COSTELLO O JONES JH BIRKS EK LOGEMANN RB PASCOE JR TYLER WS Stress failure of pulmonary capillaries in racehorses with exercise-induced pulmonary hemorrhage Journal of Applied Physiology v 75 n3 p 1097-1109 1993

WEST JB MATHIEU-COSTELLO O Stress failure of pulmonary capillaries as a mechanism for exercise induced pulmonary haemorrhage in the horse Equine

Veterinary Journal v 25 n 6 p 429-431 1994

WEST JB MATHIEU-COSTELLO O Stress failure of pulmonary capillaries as a

limiting factor for maximal exercise European Journal of Applied Physiology Occupational Physiology v 70 n 2 p 99-108 1995

WEST JB TYLER WS BIRKS EK MATHIEU-COSTELLO O Exercise-induced pulmonary hemorrhage In RANTANEN NW HAUSER ML Dubai International Equine Symposium The Diagnosis and Treatment of Respiratory

Disease USA Neyenesch Printers Inc 1997 p 353-368

113

WEST JB MATHIEU-COSTELLO O Structure strength failure and remodeling

of the pulmonary blood-gas barrier Annual Review of Physiology v 61 p 543-572 1999

WILSHER S ALLEN WR WOOD JL Factors associated with failure of thoroughbred horses to train and race Equine Veterinary Journal v 38 n 2 p 113-118 2006

WOOD JLN NEWTON JR CHANTER N MUMFORD JA Inflammatory airway disease nasal discharge and respiratory infections in young British

racehorses Equine Veterinary Journal v 37 n3 p 236-242 2005

WOOD LG GIBSON PG GARG ML Biomarkers of lipid peroxidation airway

inflammation and asthma European Respiratory Journal v 21 p 177-186 2003

WOODS PS ROBINSON NE SWANSON MC REED CE BROADSTONE

RV DERKSEN FJ Airborne dust and aeroallergen concentration in a horse stable under two different management systems Equine Veterinary Journal v25 n 3 p 208-213 1993

XU W ZHENG S DWEIK RA ERZURUM SC Role of epithelial nitric oxide in airway viral infection Free Radical Biology amp Medicine v 41 n1 p 19-28 2006

ZHANG Y GU Y LUCAS MJ WANG Y Antioxidant superoxide dismutase attenuates increased endothelial permeability induced by platelet-activating factor

Journal of the Society for Gynecologic Investigation v 10 n1 p 5-10 2003

ZHU L SCHWEGLER-BERRY D CASTRANOVA V HE P Internalization of

caveolin-1 scaffolding domain facilitated by Antennapedia homeodomain attenuates PAF-induced increase in microvessel permeability American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology v 286 p H195-H201 2004





Tese apresentada ao Curso de Poacutes-

Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular

aacuterea de concentraccedilatildeo Fisiologia Setor de

Ciecircncias Bioloacutegicas Universidade Federal do

Paranaacute como requisito parcial agrave obtenccedilatildeo do

tiacutetulo de Doutor em Fisiologia

Orientadora Profa Dra Anita Nishiyama

CURITIBA

2010



original

Albert Einstein






DEDICATOacuteRIA





AGRADECIMENTOS








responsabilidade
























SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS XV

RESUMO XVI

ABSTRACT XVII








2 OBJETIVOS 40





32 ANIMAIS 41























4 RESULTADOS 59



























5 DISCUSSAtildeO 83
















IL-1 Interleucina-1

IL-4 Interleucina-4

IL-8 Interleucina-8

IL-9 Interleucina-9




LTB4 Leucotrieno B4

LTE8 Leucotrieno E8



























ASMA 31



A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35


(BAC) 36




FARINGE 44




ENDOSCOacutePICO 45










BN52021 64






BN52021 65





BN52021 66

































LISTA DE TABELAS






DE I A IV 60









(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61



(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63





RESUMO















ABSTRACT
























2006)







2007)








RUSH 2007)






19








(FIGURA 1)













20


































21











piquetes
























22



































23
































24






















25

















26
































al 2005)



27



HAYWARD et al 2009)





























28


ROBINSON 2005)





e SHEEHAN 2004)




























29



SHAO e NADEL 2005)















2007)













(FIGURA 4)

30












2006)





31











32

















33







(DEATON 2006)














MARLIN 2003)







34


































35











36

















37





arterial pulmonar

























m




38



















39






















2 OBJETIVOS

21 OBJETIVOS GERAIS



























32 ANIMAIS




















42



































43





























44






anormais























oclusatildeo nasal

Grau IV

(Hemiplegia

Laringeana)





45



(FIGURA 10)







HODGSON 2003)














46







VIEL e HEWSON 2003)




nucleadas (NTCN)










317 e 318)









2009)

47













anteriormente)













mais duas vezes






48














estufa





viaacuteveismL










37oC por 45 minutos



49



































50
















51
















sua cor















52

































53







Satildeo Paulo)


























54






























55


2000)








potro














Alveolar)







56

































57


















58












4 RESULTADOS




















Grupos Tosse

Espontacircnea

Corrimento

Nasal

Linfonodos


Pulmonar

CN 034

(0)

1534

(441)

1334

(382)

136

(28)

DA 045

(0)

1145

(244)

1045

(222)

745

(156)

EX 834

(235)a

1534

(441)

1334

(382)

326

(115)

aP=0002 vs DA

60







CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)

DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)

EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)














CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)

DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)

EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)

61


TABELA 4


Grupos 0 1 2 3 4 5

CN 233

(61)

933

(273)

933

(273)

1133

(332)

233

(61)

033

(0)

DA 742

(167)

1242

(286)

1242

(286)

742

(167)

342

(70)

142

(24)

EX 327

(111)

727

(259)

727

(259)

627

(223)

427

(148)

027

(0)









CN 429plusmn63 75

plusmn19

76

plusmn29

12

plusmn07

002

plusmn02

05

plusmn02

02

plusmn01

201

plusmn56

0

DA 591

plusmn41

141

plusmn24

85

plusmn23

11

plusmn05

0 01

plusmn01

11

plusmn02a

161

plusmn48

0

EX 593

plusmn42

134

plusmn23

171

plusmn49

09

plusmn03

0 05

plusmn03

08

plusmn03

71

plusmn32

09

plusmn04


62









CTCN

(ceacutelulasmicroL

de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Macroacutef

Multi

Hemosid

CN 395

plusmn 38

673

plusmn 17

294

plusmn 15

23

plusmn 04

05

plusmn 03

005

plusmn 004

04

plusmn 01

0

DA 343

plusmn 24

698

plusmn 14

281

plusmn 13

09

plusmn 02

12

plusmn 01

002

plusmn 002

11

plusmn 01d

0

EX 456

plusmn 28a

676

plusmn 18

229

plusmn 15

54

plusmn 11b

15

plusmn 07c

02

plusmn 01

13

plusmn 02

22

plusmn 06









63








64



65





FIGURAs 16 a 18


66



67











20

CN DA EX000

002

004

006

008

010 a

Re

laccedil

atildeo

34

03

80

nm



68

0 50 100

150

200

0

1

2

3

4

Tempo (segundos)


ela

ccedilatildeo

3403

80n

m







(FIGURA 21)

69








70








71


CN DA EX0

50

100

150a

b

nm

ole

s

mg

de

pro

teiacuten

as






DA (FIGURA 24)

72







(P=0006) (FIGURA 25)

73













74











75










76



subgrupo HPIE neg









de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Siderof

Grupo EX

456 plusmn 28

676 plusmn 18

229 plusmn 15

47 plusmn 10

13 plusmn 06

02 plusmn 01

22 plusmn 35

HPIE pos

571

plusmn 78a

645

plusmn 22b

240 plusmn 20

56 plusmn 12

09 plusmn 07

02 plusmn 02

34 plusmn 37

HPIE neg

348 plusmn 38

725 plusmn 30

207 plusmn 25

35 plusmn 18

19 plusmn 11

03 plusmn 01

00








77






78






79






80




estudados





(FIGURA 32)




81








neg (FIGURA 33)




82


5 DISCUSSAtildeO










treinamento







DUCHARME 2007)















84



1993)
































85



































86


































presente estudo

87

































do grupo EX

88


































89


































90


nossos






grupo EX


























91















momento




















92










subgrupo HPIE pos














no presente estudo











93


































HIGGINS 1997)

94



































95










e HIGGINS 1997)






































processo




















98














Record v 139 n 13 p 308-313 1996








99

















1997




100























101



















v 226 n 1 p 497-509 1957

102















Chemistry v 260 n6 p 3440-3450 1985







103











Medicine v 10 p 280-289 1996









p 119-150



104






457









Immunology v 172 n 11 p 7095-7102 2004









105




v 91 n6 p 2674-2678 2001










2008








7257-7265 2006

106








Medicine v 157 n 6 p 1927-1934 1998














107




253-260 1997




n 10 p 1329-1341 2004





Journal v 70 n11 p 401-404 1993






v 12 n 2 p 1-7 2007




108








v 32 p 779-787 2000






1994








109






















110










2008a













111




19 p 87-92 2005






pH1454-H1459 1993





672 2003






486 2006



112






84 2007















113

















original

Albert Einstein






DEDICATOacuteRIA





AGRADECIMENTOS








responsabilidade
























SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS XV

RESUMO XVI

ABSTRACT XVII








2 OBJETIVOS 40





32 ANIMAIS 41























4 RESULTADOS 59



























5 DISCUSSAtildeO 83
















IL-1 Interleucina-1

IL-4 Interleucina-4

IL-8 Interleucina-8

IL-9 Interleucina-9




LTB4 Leucotrieno B4

LTE8 Leucotrieno E8



























ASMA 31



A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35


(BAC) 36




FARINGE 44




ENDOSCOacutePICO 45










BN52021 64






BN52021 65





BN52021 66

































LISTA DE TABELAS






DE I A IV 60









(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61



(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63





RESUMO















ABSTRACT
























2006)







2007)








RUSH 2007)






19








(FIGURA 1)













20


































21











piquetes
























22



































23
































24






















25

















26
































al 2005)



27



HAYWARD et al 2009)





























28


ROBINSON 2005)





e SHEEHAN 2004)




























29



SHAO e NADEL 2005)















2007)













(FIGURA 4)

30












2006)





31











32

















33







(DEATON 2006)














MARLIN 2003)







34


































35











36

















37





arterial pulmonar

























m




38



















39






















2 OBJETIVOS

21 OBJETIVOS GERAIS



























32 ANIMAIS




















42



































43





























44






anormais























oclusatildeo nasal

Grau IV

(Hemiplegia

Laringeana)





45



(FIGURA 10)







HODGSON 2003)














46







VIEL e HEWSON 2003)




nucleadas (NTCN)










317 e 318)









2009)

47













anteriormente)













mais duas vezes






48














estufa





viaacuteveismL










37oC por 45 minutos



49



































50
















51
















sua cor















52

































53







Satildeo Paulo)


























54






























55


2000)








potro














Alveolar)







56

































57


















58












4 RESULTADOS




















Grupos Tosse

Espontacircnea

Corrimento

Nasal

Linfonodos


Pulmonar

CN 034

(0)

1534

(441)

1334

(382)

136

(28)

DA 045

(0)

1145

(244)

1045

(222)

745

(156)

EX 834

(235)a

1534

(441)

1334

(382)

326

(115)

aP=0002 vs DA

60







CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)

DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)

EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)














CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)

DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)

EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)

61


TABELA 4


Grupos 0 1 2 3 4 5

CN 233

(61)

933

(273)

933

(273)

1133

(332)

233

(61)

033

(0)

DA 742

(167)

1242

(286)

1242

(286)

742

(167)

342

(70)

142

(24)

EX 327

(111)

727

(259)

727

(259)

627

(223)

427

(148)

027

(0)









CN 429plusmn63 75

plusmn19

76

plusmn29

12

plusmn07

002

plusmn02

05

plusmn02

02

plusmn01

201

plusmn56

0

DA 591

plusmn41

141

plusmn24

85

plusmn23

11

plusmn05

0 01

plusmn01

11

plusmn02a

161

plusmn48

0

EX 593

plusmn42

134

plusmn23

171

plusmn49

09

plusmn03

0 05

plusmn03

08

plusmn03

71

plusmn32

09

plusmn04


62









CTCN

(ceacutelulasmicroL

de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Macroacutef

Multi

Hemosid

CN 395

plusmn 38

673

plusmn 17

294

plusmn 15

23

plusmn 04

05

plusmn 03

005

plusmn 004

04

plusmn 01

0

DA 343

plusmn 24

698

plusmn 14

281

plusmn 13

09

plusmn 02

12

plusmn 01

002

plusmn 002

11

plusmn 01d

0

EX 456

plusmn 28a

676

plusmn 18

229

plusmn 15

54

plusmn 11b

15

plusmn 07c

02

plusmn 01

13

plusmn 02

22

plusmn 06









63








64



65





FIGURAs 16 a 18


66



67











20

CN DA EX000

002

004

006

008

010 a

Re

laccedil

atildeo

34

03

80

nm



68

0 50 100

150

200

0

1

2

3

4

Tempo (segundos)


ela

ccedilatildeo

3403

80n

m







(FIGURA 21)

69








70








71


CN DA EX0

50

100

150a

b

nm

ole

s

mg

de

pro

teiacuten

as






DA (FIGURA 24)

72







(P=0006) (FIGURA 25)

73













74











75










76



subgrupo HPIE neg









de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Siderof

Grupo EX

456 plusmn 28

676 plusmn 18

229 plusmn 15

47 plusmn 10

13 plusmn 06

02 plusmn 01

22 plusmn 35

HPIE pos

571

plusmn 78a

645

plusmn 22b

240 plusmn 20

56 plusmn 12

09 plusmn 07

02 plusmn 02

34 plusmn 37

HPIE neg

348 plusmn 38

725 plusmn 30

207 plusmn 25

35 plusmn 18

19 plusmn 11

03 plusmn 01

00








77






78






79






80




estudados





(FIGURA 32)




81








neg (FIGURA 33)




82


5 DISCUSSAtildeO










treinamento







DUCHARME 2007)















84



1993)
































85



































86


































presente estudo

87

































do grupo EX

88


































89


































90


nossos






grupo EX


























91















momento




















92










subgrupo HPIE pos














no presente estudo











93


































HIGGINS 1997)

94



































95










e HIGGINS 1997)






































processo




















98














Record v 139 n 13 p 308-313 1996








99

















1997




100























101



















v 226 n 1 p 497-509 1957

102















Chemistry v 260 n6 p 3440-3450 1985







103











Medicine v 10 p 280-289 1996









p 119-150



104






457









Immunology v 172 n 11 p 7095-7102 2004









105




v 91 n6 p 2674-2678 2001










2008








7257-7265 2006

106








Medicine v 157 n 6 p 1927-1934 1998














107




253-260 1997




n 10 p 1329-1341 2004





Journal v 70 n11 p 401-404 1993






v 12 n 2 p 1-7 2007




108








v 32 p 779-787 2000






1994








109






















110










2008a













111




19 p 87-92 2005






pH1454-H1459 1993





672 2003






486 2006



112






84 2007















113















DEDICATOacuteRIA





AGRADECIMENTOS








responsabilidade
























SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS XV

RESUMO XVI

ABSTRACT XVII








2 OBJETIVOS 40





32 ANIMAIS 41























4 RESULTADOS 59



























5 DISCUSSAtildeO 83
















IL-1 Interleucina-1

IL-4 Interleucina-4

IL-8 Interleucina-8

IL-9 Interleucina-9




LTB4 Leucotrieno B4

LTE8 Leucotrieno E8



























ASMA 31



A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35


(BAC) 36




FARINGE 44




ENDOSCOacutePICO 45










BN52021 64






BN52021 65





BN52021 66

































LISTA DE TABELAS






DE I A IV 60









(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61



(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63





RESUMO















ABSTRACT
























2006)







2007)








RUSH 2007)






19








(FIGURA 1)













20


































21











piquetes
























22



































23
































24






















25

















26
































al 2005)



27



HAYWARD et al 2009)





























28


ROBINSON 2005)





e SHEEHAN 2004)




























29



SHAO e NADEL 2005)















2007)













(FIGURA 4)

30












2006)





31











32

















33







(DEATON 2006)














MARLIN 2003)







34


































35











36

















37





arterial pulmonar

























m




38



















39






















2 OBJETIVOS

21 OBJETIVOS GERAIS



























32 ANIMAIS




















42



































43





























44






anormais























oclusatildeo nasal

Grau IV

(Hemiplegia

Laringeana)





45



(FIGURA 10)







HODGSON 2003)














46







VIEL e HEWSON 2003)




nucleadas (NTCN)










317 e 318)









2009)

47













anteriormente)













mais duas vezes






48














estufa





viaacuteveismL










37oC por 45 minutos



49



































50
















51
















sua cor















52

































53







Satildeo Paulo)


























54






























55


2000)








potro














Alveolar)







56

































57


















58












4 RESULTADOS




















Grupos Tosse

Espontacircnea

Corrimento

Nasal

Linfonodos


Pulmonar

CN 034

(0)

1534

(441)

1334

(382)

136

(28)

DA 045

(0)

1145

(244)

1045

(222)

745

(156)

EX 834

(235)a

1534

(441)

1334

(382)

326

(115)

aP=0002 vs DA

60







CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)

DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)

EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)














CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)

DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)

EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)

61


TABELA 4


Grupos 0 1 2 3 4 5

CN 233

(61)

933

(273)

933

(273)

1133

(332)

233

(61)

033

(0)

DA 742

(167)

1242

(286)

1242

(286)

742

(167)

342

(70)

142

(24)

EX 327

(111)

727

(259)

727

(259)

627

(223)

427

(148)

027

(0)









CN 429plusmn63 75

plusmn19

76

plusmn29

12

plusmn07

002

plusmn02

05

plusmn02

02

plusmn01

201

plusmn56

0

DA 591

plusmn41

141

plusmn24

85

plusmn23

11

plusmn05

0 01

plusmn01

11

plusmn02a

161

plusmn48

0

EX 593

plusmn42

134

plusmn23

171

plusmn49

09

plusmn03

0 05

plusmn03

08

plusmn03

71

plusmn32

09

plusmn04


62









CTCN

(ceacutelulasmicroL

de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Macroacutef

Multi

Hemosid

CN 395

plusmn 38

673

plusmn 17

294

plusmn 15

23

plusmn 04

05

plusmn 03

005

plusmn 004

04

plusmn 01

0

DA 343

plusmn 24

698

plusmn 14

281

plusmn 13

09

plusmn 02

12

plusmn 01

002

plusmn 002

11

plusmn 01d

0

EX 456

plusmn 28a

676

plusmn 18

229

plusmn 15

54

plusmn 11b

15

plusmn 07c

02

plusmn 01

13

plusmn 02

22

plusmn 06









63








64



65





FIGURAs 16 a 18


66



67











20

CN DA EX000

002

004

006

008

010 a

Re

laccedil

atildeo

34

03

80

nm



68

0 50 100

150

200

0

1

2

3

4

Tempo (segundos)


ela

ccedilatildeo

3403

80n

m







(FIGURA 21)

69








70








71


CN DA EX0

50

100

150a

b

nm

ole

s

mg

de

pro

teiacuten

as






DA (FIGURA 24)

72







(P=0006) (FIGURA 25)

73













74











75










76



subgrupo HPIE neg









de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Siderof

Grupo EX

456 plusmn 28

676 plusmn 18

229 plusmn 15

47 plusmn 10

13 plusmn 06

02 plusmn 01

22 plusmn 35

HPIE pos

571

plusmn 78a

645

plusmn 22b

240 plusmn 20

56 plusmn 12

09 plusmn 07

02 plusmn 02

34 plusmn 37

HPIE neg

348 plusmn 38

725 plusmn 30

207 plusmn 25

35 plusmn 18

19 plusmn 11

03 plusmn 01

00








77






78






79






80




estudados





(FIGURA 32)




81








neg (FIGURA 33)




82


5 DISCUSSAtildeO










treinamento







DUCHARME 2007)















84



1993)
































85



































86


































presente estudo

87

































do grupo EX

88


































89


































90


nossos






grupo EX


























91















momento




















92










subgrupo HPIE pos














no presente estudo











93


































HIGGINS 1997)

94



































95










e HIGGINS 1997)






































processo




















98














Record v 139 n 13 p 308-313 1996








99

















1997




100























101



















v 226 n 1 p 497-509 1957

102















Chemistry v 260 n6 p 3440-3450 1985







103











Medicine v 10 p 280-289 1996









p 119-150



104






457









Immunology v 172 n 11 p 7095-7102 2004









105




v 91 n6 p 2674-2678 2001










2008








7257-7265 2006

106








Medicine v 157 n 6 p 1927-1934 1998














107




253-260 1997




n 10 p 1329-1341 2004





Journal v 70 n11 p 401-404 1993






v 12 n 2 p 1-7 2007




108








v 32 p 779-787 2000






1994








109






















110










2008a













111




19 p 87-92 2005






pH1454-H1459 1993





672 2003






486 2006



112






84 2007















113















AGRADECIMENTOS








responsabilidade
























SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS XV

RESUMO XVI

ABSTRACT XVII








2 OBJETIVOS 40





32 ANIMAIS 41























4 RESULTADOS 59



























5 DISCUSSAtildeO 83
















IL-1 Interleucina-1

IL-4 Interleucina-4

IL-8 Interleucina-8

IL-9 Interleucina-9




LTB4 Leucotrieno B4

LTE8 Leucotrieno E8



























ASMA 31



A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35


(BAC) 36




FARINGE 44




ENDOSCOacutePICO 45










BN52021 64






BN52021 65





BN52021 66

































LISTA DE TABELAS






DE I A IV 60









(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61



(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63





RESUMO















ABSTRACT
























2006)







2007)








RUSH 2007)






19








(FIGURA 1)













20


































21











piquetes
























22



































23
































24






















25

















26
































al 2005)



27



HAYWARD et al 2009)





























28


ROBINSON 2005)





e SHEEHAN 2004)




























29



SHAO e NADEL 2005)















2007)













(FIGURA 4)

30












2006)





31











32

















33







(DEATON 2006)














MARLIN 2003)







34


































35











36

















37





arterial pulmonar

























m




38



















39






















2 OBJETIVOS

21 OBJETIVOS GERAIS



























32 ANIMAIS




















42



































43





























44






anormais























oclusatildeo nasal

Grau IV

(Hemiplegia

Laringeana)





45



(FIGURA 10)







HODGSON 2003)














46







VIEL e HEWSON 2003)




nucleadas (NTCN)










317 e 318)









2009)

47













anteriormente)













mais duas vezes






48














estufa





viaacuteveismL










37oC por 45 minutos



49



































50
















51
















sua cor















52

































53







Satildeo Paulo)


























54






























55


2000)








potro














Alveolar)







56

































57


















58












4 RESULTADOS




















Grupos Tosse

Espontacircnea

Corrimento

Nasal

Linfonodos


Pulmonar

CN 034

(0)

1534

(441)

1334

(382)

136

(28)

DA 045

(0)

1145

(244)

1045

(222)

745

(156)

EX 834

(235)a

1534

(441)

1334

(382)

326

(115)

aP=0002 vs DA

60







CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)

DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)

EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)














CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)

DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)

EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)

61


TABELA 4


Grupos 0 1 2 3 4 5

CN 233

(61)

933

(273)

933

(273)

1133

(332)

233

(61)

033

(0)

DA 742

(167)

1242

(286)

1242

(286)

742

(167)

342

(70)

142

(24)

EX 327

(111)

727

(259)

727

(259)

627

(223)

427

(148)

027

(0)









CN 429plusmn63 75

plusmn19

76

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12

plusmn07

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plusmn02

05

plusmn02

02

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201

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DA 591

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141

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plusmn05

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plusmn01

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161

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EX 593

plusmn42

134

plusmn23

171

plusmn49

09

plusmn03

0 05

plusmn03

08

plusmn03

71

plusmn32

09

plusmn04


62









CTCN

(ceacutelulasmicroL

de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Macroacutef

Multi

Hemosid

CN 395

plusmn 38

673

plusmn 17

294

plusmn 15

23

plusmn 04

05

plusmn 03

005

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04

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0

DA 343

plusmn 24

698

plusmn 14

281

plusmn 13

09

plusmn 02

12

plusmn 01

002

plusmn 002

11

plusmn 01d

0

EX 456

plusmn 28a

676

plusmn 18

229

plusmn 15

54

plusmn 11b

15

plusmn 07c

02

plusmn 01

13

plusmn 02

22

plusmn 06









63








64



65





FIGURAs 16 a 18


66



67











20

CN DA EX000

002

004

006

008

010 a

Re

laccedil

atildeo

34

03

80

nm



68

0 50 100

150

200

0

1

2

3

4

Tempo (segundos)


ela

ccedilatildeo

3403

80n

m







(FIGURA 21)

69








70








71


CN DA EX0

50

100

150a

b

nm

ole

s

mg

de

pro

teiacuten

as






DA (FIGURA 24)

72







(P=0006) (FIGURA 25)

73













74











75










76



subgrupo HPIE neg









de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Siderof

Grupo EX

456 plusmn 28

676 plusmn 18

229 plusmn 15

47 plusmn 10

13 plusmn 06

02 plusmn 01

22 plusmn 35

HPIE pos

571

plusmn 78a

645

plusmn 22b

240 plusmn 20

56 plusmn 12

09 plusmn 07

02 plusmn 02

34 plusmn 37

HPIE neg

348 plusmn 38

725 plusmn 30

207 plusmn 25

35 plusmn 18

19 plusmn 11

03 plusmn 01

00








77






78






79






80




estudados





(FIGURA 32)




81








neg (FIGURA 33)




82


5 DISCUSSAtildeO










treinamento







DUCHARME 2007)















84



1993)
































85



































86


































presente estudo

87

































do grupo EX

88


































89


































90


nossos






grupo EX


























91















momento




















92










subgrupo HPIE pos














no presente estudo











93


































HIGGINS 1997)

94



































95










e HIGGINS 1997)






































processo




















98














Record v 139 n 13 p 308-313 1996








99

















1997




100























101



















v 226 n 1 p 497-509 1957

102















Chemistry v 260 n6 p 3440-3450 1985







103











Medicine v 10 p 280-289 1996









p 119-150



104






457









Immunology v 172 n 11 p 7095-7102 2004









105




v 91 n6 p 2674-2678 2001










2008








7257-7265 2006

106








Medicine v 157 n 6 p 1927-1934 1998














107




253-260 1997




n 10 p 1329-1341 2004





Journal v 70 n11 p 401-404 1993






v 12 n 2 p 1-7 2007




108








v 32 p 779-787 2000






1994








109






















110










2008a













111




19 p 87-92 2005






pH1454-H1459 1993





672 2003






486 2006



112






84 2007















113





























SUMAacuteRIO



LISTA DE TABELAS XV

RESUMO XVI

ABSTRACT XVII








2 OBJETIVOS 40





32 ANIMAIS 41























4 RESULTADOS 59



























5 DISCUSSAtildeO 83
















IL-1 Interleucina-1

IL-4 Interleucina-4

IL-8 Interleucina-8

IL-9 Interleucina-9




LTB4 Leucotrieno B4

LTE8 Leucotrieno E8



























ASMA 31



A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35


(BAC) 36




FARINGE 44




ENDOSCOacutePICO 45










BN52021 64






BN52021 65





BN52021 66

































LISTA DE TABELAS






DE I A IV 60









(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61



(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63





RESUMO















ABSTRACT
























2006)







2007)








RUSH 2007)






19








(FIGURA 1)













20


































21











piquetes
























22



































23
































24






















25

















26
































al 2005)



27



HAYWARD et al 2009)





























28


ROBINSON 2005)





e SHEEHAN 2004)




























29



SHAO e NADEL 2005)















2007)













(FIGURA 4)

30












2006)





31











32

















33







(DEATON 2006)














MARLIN 2003)







34


































35











36

















37





arterial pulmonar

























m




38



















39






















2 OBJETIVOS

21 OBJETIVOS GERAIS



























32 ANIMAIS




















42



































43





























44






anormais























oclusatildeo nasal

Grau IV

(Hemiplegia

Laringeana)





45



(FIGURA 10)







HODGSON 2003)














46







VIEL e HEWSON 2003)




nucleadas (NTCN)










317 e 318)









2009)

47













anteriormente)













mais duas vezes






48














estufa





viaacuteveismL










37oC por 45 minutos



49



































50
















51
















sua cor















52

































53







Satildeo Paulo)


























54






























55


2000)








potro














Alveolar)







56

































57


















58












4 RESULTADOS




















Grupos Tosse

Espontacircnea

Corrimento

Nasal

Linfonodos


Pulmonar

CN 034

(0)

1534

(441)

1334

(382)

136

(28)

DA 045

(0)

1145

(244)

1045

(222)

745

(156)

EX 834

(235)a

1534

(441)

1334

(382)

326

(115)

aP=0002 vs DA

60







CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)

DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)

EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)














CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)

DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)

EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)

61


TABELA 4


Grupos 0 1 2 3 4 5

CN 233

(61)

933

(273)

933

(273)

1133

(332)

233

(61)

033

(0)

DA 742

(167)

1242

(286)

1242

(286)

742

(167)

342

(70)

142

(24)

EX 327

(111)

727

(259)

727

(259)

627

(223)

427

(148)

027

(0)









CN 429plusmn63 75

plusmn19

76

plusmn29

12

plusmn07

002

plusmn02

05

plusmn02

02

plusmn01

201

plusmn56

0

DA 591

plusmn41

141

plusmn24

85

plusmn23

11

plusmn05

0 01

plusmn01

11

plusmn02a

161

plusmn48

0

EX 593

plusmn42

134

plusmn23

171

plusmn49

09

plusmn03

0 05

plusmn03

08

plusmn03

71

plusmn32

09

plusmn04


62









CTCN

(ceacutelulasmicroL

de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Macroacutef

Multi

Hemosid

CN 395

plusmn 38

673

plusmn 17

294

plusmn 15

23

plusmn 04

05

plusmn 03

005

plusmn 004

04

plusmn 01

0

DA 343

plusmn 24

698

plusmn 14

281

plusmn 13

09

plusmn 02

12

plusmn 01

002

plusmn 002

11

plusmn 01d

0

EX 456

plusmn 28a

676

plusmn 18

229

plusmn 15

54

plusmn 11b

15

plusmn 07c

02

plusmn 01

13

plusmn 02

22

plusmn 06









63








64



65





FIGURAs 16 a 18


66



67











20

CN DA EX000

002

004

006

008

010 a

Re

laccedil

atildeo

34

03

80

nm



68

0 50 100

150

200

0

1

2

3

4

Tempo (segundos)


ela

ccedilatildeo

3403

80n

m







(FIGURA 21)

69








70








71


CN DA EX0

50

100

150a

b

nm

ole

s

mg

de

pro

teiacuten

as






DA (FIGURA 24)

72







(P=0006) (FIGURA 25)

73













74











75










76



subgrupo HPIE neg









de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Siderof

Grupo EX

456 plusmn 28

676 plusmn 18

229 plusmn 15

47 plusmn 10

13 plusmn 06

02 plusmn 01

22 plusmn 35

HPIE pos

571

plusmn 78a

645

plusmn 22b

240 plusmn 20

56 plusmn 12

09 plusmn 07

02 plusmn 02

34 plusmn 37

HPIE neg

348 plusmn 38

725 plusmn 30

207 plusmn 25

35 plusmn 18

19 plusmn 11

03 plusmn 01

00








77






78






79






80




estudados





(FIGURA 32)




81








neg (FIGURA 33)




82


5 DISCUSSAtildeO










treinamento







DUCHARME 2007)















84



1993)
































85



































86


































presente estudo

87

































do grupo EX

88


































89


































90


nossos






grupo EX


























91















momento




















92










subgrupo HPIE pos














no presente estudo











93


































HIGGINS 1997)

94



































95










e HIGGINS 1997)






































processo




















98














Record v 139 n 13 p 308-313 1996








99

















1997




100























101



















v 226 n 1 p 497-509 1957

102















Chemistry v 260 n6 p 3440-3450 1985







103











Medicine v 10 p 280-289 1996









p 119-150



104






457









Immunology v 172 n 11 p 7095-7102 2004









105




v 91 n6 p 2674-2678 2001










2008








7257-7265 2006

106








Medicine v 157 n 6 p 1927-1934 1998














107




253-260 1997




n 10 p 1329-1341 2004





Journal v 70 n11 p 401-404 1993






v 12 n 2 p 1-7 2007




108








v 32 p 779-787 2000






1994








109






















110










2008a













111




19 p 87-92 2005






pH1454-H1459 1993





672 2003






486 2006



112






84 2007















113






















4 RESULTADOS 59



























5 DISCUSSAtildeO 83
















IL-1 Interleucina-1

IL-4 Interleucina-4

IL-8 Interleucina-8

IL-9 Interleucina-9




LTB4 Leucotrieno B4

LTE8 Leucotrieno E8



























ASMA 31



A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35


(BAC) 36




FARINGE 44




ENDOSCOacutePICO 45










BN52021 64






BN52021 65





BN52021 66

































LISTA DE TABELAS






DE I A IV 60









(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61



(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63





RESUMO















ABSTRACT
























2006)







2007)








RUSH 2007)






19








(FIGURA 1)













20


































21











piquetes
























22



































23
































24






















25

















26
































al 2005)



27



HAYWARD et al 2009)





























28


ROBINSON 2005)





e SHEEHAN 2004)




























29



SHAO e NADEL 2005)















2007)













(FIGURA 4)

30












2006)





31











32

















33







(DEATON 2006)














MARLIN 2003)







34


































35











36

















37





arterial pulmonar

























m




38



















39






















2 OBJETIVOS

21 OBJETIVOS GERAIS



























32 ANIMAIS




















42



































43





























44






anormais























oclusatildeo nasal

Grau IV

(Hemiplegia

Laringeana)





45



(FIGURA 10)







HODGSON 2003)














46







VIEL e HEWSON 2003)




nucleadas (NTCN)










317 e 318)









2009)

47













anteriormente)













mais duas vezes






48














estufa





viaacuteveismL










37oC por 45 minutos



49



































50
















51
















sua cor















52

































53







Satildeo Paulo)


























54






























55


2000)








potro














Alveolar)







56

































57


















58












4 RESULTADOS




















Grupos Tosse

Espontacircnea

Corrimento

Nasal

Linfonodos


Pulmonar

CN 034

(0)

1534

(441)

1334

(382)

136

(28)

DA 045

(0)

1145

(244)

1045

(222)

745

(156)

EX 834

(235)a

1534

(441)

1334

(382)

326

(115)

aP=0002 vs DA

60







CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)

DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)

EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)














CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)

DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)

EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)

61


TABELA 4


Grupos 0 1 2 3 4 5

CN 233

(61)

933

(273)

933

(273)

1133

(332)

233

(61)

033

(0)

DA 742

(167)

1242

(286)

1242

(286)

742

(167)

342

(70)

142

(24)

EX 327

(111)

727

(259)

727

(259)

627

(223)

427

(148)

027

(0)









CN 429plusmn63 75

plusmn19

76

plusmn29

12

plusmn07

002

plusmn02

05

plusmn02

02

plusmn01

201

plusmn56

0

DA 591

plusmn41

141

plusmn24

85

plusmn23

11

plusmn05

0 01

plusmn01

11

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161

plusmn48

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EX 593

plusmn42

134

plusmn23

171

plusmn49

09

plusmn03

0 05

plusmn03

08

plusmn03

71

plusmn32

09

plusmn04


62









CTCN

(ceacutelulasmicroL

de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Macroacutef

Multi

Hemosid

CN 395

plusmn 38

673

plusmn 17

294

plusmn 15

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plusmn 04

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plusmn 03

005

plusmn 004

04

plusmn 01

0

DA 343

plusmn 24

698

plusmn 14

281

plusmn 13

09

plusmn 02

12

plusmn 01

002

plusmn 002

11

plusmn 01d

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EX 456

plusmn 28a

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plusmn 18

229

plusmn 15

54

plusmn 11b

15

plusmn 07c

02

plusmn 01

13

plusmn 02

22

plusmn 06









63








64



65





FIGURAs 16 a 18


66



67











20

CN DA EX000

002

004

006

008

010 a

Re

laccedil

atildeo

34

03

80

nm



68

0 50 100

150

200

0

1

2

3

4

Tempo (segundos)


ela

ccedilatildeo

3403

80n

m







(FIGURA 21)

69








70








71


CN DA EX0

50

100

150a

b

nm

ole

s

mg

de

pro

teiacuten

as






DA (FIGURA 24)

72







(P=0006) (FIGURA 25)

73













74











75










76



subgrupo HPIE neg









de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Siderof

Grupo EX

456 plusmn 28

676 plusmn 18

229 plusmn 15

47 plusmn 10

13 plusmn 06

02 plusmn 01

22 plusmn 35

HPIE pos

571

plusmn 78a

645

plusmn 22b

240 plusmn 20

56 plusmn 12

09 plusmn 07

02 plusmn 02

34 plusmn 37

HPIE neg

348 plusmn 38

725 plusmn 30

207 plusmn 25

35 plusmn 18

19 plusmn 11

03 plusmn 01

00








77






78






79






80




estudados





(FIGURA 32)




81








neg (FIGURA 33)




82


5 DISCUSSAtildeO










treinamento







DUCHARME 2007)















84



1993)
































85



































86


































presente estudo

87

































do grupo EX

88


































89


































90


nossos






grupo EX


























91















momento




















92










subgrupo HPIE pos














no presente estudo











93


































HIGGINS 1997)

94



































95










e HIGGINS 1997)






































processo




















98














Record v 139 n 13 p 308-313 1996








99

















1997




100























101



















v 226 n 1 p 497-509 1957

102















Chemistry v 260 n6 p 3440-3450 1985







103











Medicine v 10 p 280-289 1996









p 119-150



104






457









Immunology v 172 n 11 p 7095-7102 2004









105




v 91 n6 p 2674-2678 2001










2008








7257-7265 2006

106








Medicine v 157 n 6 p 1927-1934 1998














107




253-260 1997




n 10 p 1329-1341 2004





Journal v 70 n11 p 401-404 1993






v 12 n 2 p 1-7 2007




108








v 32 p 779-787 2000






1994








109






















110










2008a













111




19 p 87-92 2005






pH1454-H1459 1993





672 2003






486 2006



112






84 2007















113




























IL-1 Interleucina-1

IL-4 Interleucina-4

IL-8 Interleucina-8

IL-9 Interleucina-9




LTB4 Leucotrieno B4

LTE8 Leucotrieno E8



























ASMA 31



A 25 (A) E 100 mmHg (B-D) 35


(BAC) 36




FARINGE 44




ENDOSCOacutePICO 45










BN52021 64






BN52021 65





BN52021 66

































LISTA DE TABELAS






DE I A IV 60









(N=20) DA (N=19) E EX (N=15) 61



(n=45) DA (n=40) E EX (n=34) 63





RESUMO















ABSTRACT
























2006)







2007)








RUSH 2007)






19








(FIGURA 1)













20


































21











piquetes
























22



































23
































24






















25

















26
































al 2005)



27



HAYWARD et al 2009)





























28


ROBINSON 2005)





e SHEEHAN 2004)




























29



SHAO e NADEL 2005)















2007)













(FIGURA 4)

30












2006)





31











32

















33







(DEATON 2006)














MARLIN 2003)







34


































35











36

















37





arterial pulmonar

























m




38



















39






















2 OBJETIVOS

21 OBJETIVOS GERAIS



























32 ANIMAIS




















42



































43





























44






anormais























oclusatildeo nasal

Grau IV

(Hemiplegia

Laringeana)





45



(FIGURA 10)







HODGSON 2003)














46







VIEL e HEWSON 2003)




nucleadas (NTCN)










317 e 318)









2009)

47













anteriormente)













mais duas vezes






48














estufa





viaacuteveismL










37oC por 45 minutos



49



































50
















51
















sua cor















52

































53







Satildeo Paulo)


























54






























55


2000)








potro














Alveolar)







56

































57


















58












4 RESULTADOS




















Grupos Tosse

Espontacircnea

Corrimento

Nasal

Linfonodos


Pulmonar

CN 034

(0)

1534

(441)

1334

(382)

136

(28)

DA 045

(0)

1145

(244)

1045

(222)

745

(156)

EX 834

(235)a

1534

(441)

1334

(382)

326

(115)

aP=0002 vs DA

60







CN 133 (3) 1433 (424) 1833 (546) 0 (0)

DA 542 (119) 2542 (595) 1142 (262) 142 (24)

EX 226 (77) 1026 (384) 1226 (462) 226 (77)














CN 2733 (818) 633 (182) 0 (0) 0 (0)

DA 3942 (929) 342 (71) 0 (0) 0 (0)

EX 2427 (889) 327 (111) 0 (0) 0 (0)

61


TABELA 4


Grupos 0 1 2 3 4 5

CN 233

(61)

933

(273)

933

(273)

1133

(332)

233

(61)

033

(0)

DA 742

(167)

1242

(286)

1242

(286)

742

(167)

342

(70)

142

(24)

EX 327

(111)

727

(259)

727

(259)

627

(223)

427

(148)

027

(0)









CN 429plusmn63 75

plusmn19

76

plusmn29

12

plusmn07

002

plusmn02

05

plusmn02

02

plusmn01

201

plusmn56

0

DA 591

plusmn41

141

plusmn24

85

plusmn23

11

plusmn05

0 01

plusmn01

11

plusmn02a

161

plusmn48

0

EX 593

plusmn42

134

plusmn23

171

plusmn49

09

plusmn03

0 05

plusmn03

08

plusmn03

71

plusmn32

09

plusmn04


62









CTCN

(ceacutelulasmicroL

de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Macroacutef

Multi

Hemosid

CN 395

plusmn 38

673

plusmn 17

294

plusmn 15

23

plusmn 04

05

plusmn 03

005

plusmn 004

04

plusmn 01

0

DA 343

plusmn 24

698

plusmn 14

281

plusmn 13

09

plusmn 02

12

plusmn 01

002

plusmn 002

11

plusmn 01d

0

EX 456

plusmn 28a

676

plusmn 18

229

plusmn 15

54

plusmn 11b

15

plusmn 07c

02

plusmn 01

13

plusmn 02

22

plusmn 06









63








64



65





FIGURAs 16 a 18


66



67











20

CN DA EX000

002

004

006

008

010 a

Re

laccedil

atildeo

34

03

80

nm



68

0 50 100

150

200

0

1

2

3

4

Tempo (segundos)


ela

ccedilatildeo

3403

80n

m







(FIGURA 21)

69








70








71


CN DA EX0

50

100

150a

b

nm

ole

s

mg

de

pro

teiacuten

as






DA (FIGURA 24)

72







(P=0006) (FIGURA 25)

73













74











75










76



subgrupo HPIE neg









de LBA)

Macroacutef

Linfoacutec

Neutroacutef

Eosino

Masto

Siderof

Grupo EX

456 plusmn 28

676 plusmn 18

229 plusmn 15

47 plusmn 10

13 plusmn 06

02 plusmn 01

22 plusmn 35

HPIE pos

571

plusmn 78a

645

plusmn 22b

240 plusmn 20

56 plusmn 12

09 plusmn 07

02 plusmn 02

34 plusmn 37

HPIE neg

348 plusmn 38

725 plusmn 30

207 plusmn 25

35 plusmn 18

19 plusmn 11

03 plusmn 01

00








77






78






79






80




estudados





(FIGURA 32)




81








neg (FIGURA 33)




82


5 DISCUSSAtildeO










treinamento







DUCHARME 2007)















84



1993)
































85



































86


































presente estudo

87

































do grupo EX

88


































89


































90


nossos






grupo EX


























91















momento




















92










subgrupo HPIE pos














no presente estudo











93


































HIGGINS 1997)

94



































95










e HIGGINS 1997)






































processo




















98














Record v 139 n 13 p 308-313 1996








99

















1997




100























101



















v 226 n 1 p 497-509 1957

102















Chemistry v 260 n6 p 3440-3450 1985







103











Medicine v 10 p 280-289 1996









p 119-150



104






457









Immunology v 172 n 11 p 7095-7102 2004









105




v 91 n6 p 2674-2678 2001










2008








7257-7265 2006

106








Medicine v 157 n 6 p 1927-1934 1998














107




253-260 1997




n 10 p 1329-1341 2004





Journal v 70 n11 p 401-404 1993






v 12 n 2 p 1-7 2007




108








v 32 p 779-787 2000






1994








109






















110










2008a













111




19 p 87-92 2005






pH1454-H1459 1993





672 2003






486 2006



112






84 2007















113















PEDRO VICENTE MICHELOTTO JÚNIOR

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