Anna Luiza Silva Almeida Vicente

Perfil Molecular de Melanomas Cutâneos e de Mucosas

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação da Fundação Pio XII Hospital de

Câncer de Barretos para obtenção do Título de

Mestre em Ciências da Saúde.

Área de concentração: Oncologia

Orientador: Prof. Dr. Vinicius de Lima Vazquez

Barretos, SP 2016

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada por Martins Fideles dos Santos Neto CRB 8/9570 Biblioteca da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos

V632p Vicente, Anna Luiza Silva Almeida. Perfil molecular de melanomas cutâneos e de mucosas / Anna Luiza Silva Almeida Vicente. - Barretos, SP 2016.

69 f. : il. Orientador: Dr. Vinicius de Lima Vazquez Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) – Fundação Pio XII – Hospital

de Câncer de Barretos, 2016. 1. Melanoma. 2. MAPK. 3. Telomerase. 4. Mutação. 5. Sequenciamento. 6. Prognóstico. I. Autor. II. Vazquez, Vinicius de Lima. III. Título

CDD 571.6

SUPORTE À PESQUISA POR AGÊNCIA DE FOMENTO

Este trabalho recebeu apoio da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) através de Auxílio à Pesquisa – Regular (processo número 2012/4194-1). As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas neste material são de

responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão da FAPESP

“Esta dissertação foi elaborada e está apresentada de acordo com as normas da Pós

Graduação do Hospital de Câncer de Barretos – Fundação Pio XII, baseando-se no Regimento

do Programa de Pós-Graduação em Oncologia e no Manual de apresentação de Dissertações

e Teses do Hospital de Câncer de Barretos. Os pesquisadores declaram ainda que este

trabalho foi realizado em concordância com Código de Boas Práticas Científicas (FAPESP),

não havendo nada em seu conteúdo que possa ser considerado como plágio, fabricação ou

falsificação de dados. As opiniões, hipóteses e conclusões ou recomendações expressas

neste material são de responsabilidade dos autores e não necessariamente refletem a visão

da Fundação Pio XII – Hospital de Câncer de Barretos”.

“Embora o Núcleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Câncer de Barretos tenha

realizado as análises estatísticas e orientado sua interpretação, a descrição da metodologia

estatística, a apresentação dos resultados e suas conclusões são de inteira responsabilidade

dos pesquisadores envolvidos”.

Dedico este trabalho aos meus pais e irmão, cujo

amor e gratidão superam o número de timinas,

adeninas, citosinas e guaninas existentes em toda a

Terra.

AGRADECIMENTOS

Registro neste documento o quanto sou grata e aprecio a cada um de vocês. É uma forma simples, porém única, que eu tenho de agradecer o apoio que me deram ao longo desses dois anos. E me senti extremamente sortuda por ter tido tantas pessoas incríveis que caminharam ao meu lado na busca por esse sonho. A gratidão, na minha opinião, é um dos maiores deveres do ser humano, por isso peço a quem quer que esteja lendo essa tese, que não se importe com a extensão destes agradecimentos. Aos pacientes com melanoma que concederam o uso de suas informações genéticas e clínicas para o meu estudo. Foi me permitido com isso conhecer um mundo intrigante, o qual eu acabei me interessando imensamente. Grande parte deste trabalho eu realizei com inúmeros tubinhos contendo DNA tumoral, mas eu procurei nunca esquecer o quanto aquilo significava sofrimento e dor para muitas famílias, para que eu pudesse sempre amadurecer e crescer como profissional, afim de que algum dia eu contribua significativamente para que mude o cenário de sobrevida e qualidade de vida destes pacientes. Ao Dr. Vinicius de Lima Vazquez, meu orientador, por ter visto naquela pessoa insegura e nervosa, um potencial que nem eu mesma via. Obrigada por ter contribuído positivamente para essa experiência. Sou especialmente grata por ter me orientado quando preciso, mas por ter me deixado livre o suficiente para que eu aprendesse a caminhar com as minhas próprias pernas, o que me fez crescer enormemente como pessoa e profissional. Agradeço por tantas vezes ter reconhecido o meu esforço, por responder meus e-mails o mais rápido possível e por nunca ter medido esforços para me ajudar, mesmo nos feriados. Obrigada pelas inúmeras oportunidades profissionais, por sempre ter me respeitado e por ter feito da nossa relação a melhor possível, o que me deu ainda mais prazer e tranquilidade para concluir este trabalho. Registro aqui a minha enorme admiração e gratidão por você. Ao Dr. Rui Manuel Reis pela co-orientação, mesmo que tenha sido extra-oficialmente. Obrigada por todos os ensinamentos, discussões e por ter me acolhido no seu grupo, o que contribuiu profundamente para o meu crescimento científico. Sou especialmente grata por, junto com o Dr. Vinicius, ter acreditado em mim e me concedido a oportunidade de trabalhar no CPOM. Ao Dr. Gilles Landman e a Dra. Márcia Chiquitelli, por terem feito parte da minha banca de acompanhamento, dispensando tempo para ler a minha tese, contribuir com o meu trabalho e me auxiliar a crescer nessa jornada. À minha mãe, Liliana Vicente, por sempre ter segurado a minha mão, ao mesmo tempo em que era o vento em baixo das minhas asas. Esse paradoxo é a força que me torna capaz de conquistar tudo aquilo que eu desejo. Você faz tudo valer a pena e dá sentido para a minha existência. Obrigada por emergir neste meu sonho ao ponto de saber o que é uma PCR! Meu amor e gratidão por você são inexplicáveis. Ao meu pai, Welton Vicente, por sempre apoiar meus sonhos, por acreditar em mim, comemorar cada pequena vitória e por reconhecer meu esforço. Agradeço pelo seu amor,

dedicação e por ter me ensinado os valores que eu carrego sempre com muito orgulho no meu coração e que procuro praticar no dia-a-dia. Ao meu irmão, Welliton Vicente, por ser meu companheiro de vida, pela lealdade, cumplicidade, amor e por sempre ter a palavra certa que acalma meu coração e minha alma. Obrigada por me incentivar a ser cada vez melhor como pessoa e profissional, mas também por aceitar meus defeitos e limitações. Sou especialmente grata por desde sempre você andar ao meu lado tornando a minha caminhada muito mais bonita e feliz. Sua inteligência, bondade, caráter e o modo como você enxerga a vida me inspiram. E o meu amor por você transborda. Agradeço especialmente ao meu avô Anagê (in memorian) por ter me concedido a oportunidade de estudar. Avó Mirley, obrigada por todo o amor e incentivo e a minha Avó Elmiria (in memorian) por ter construído em mim lindas memórias de infância. Ao meu avô José (in memorian) por estar sempre comigo, me guiando e me protegendo, desde sempre e para sempre. À Tata e a Tia Miltes, por serem a minha referência de família. Aquela que às vezes briga, discorda e se afasta. Mas, que sempre apoia, conforta, comemora, entende, não julga, ama e cuida. À Ana Lucia, João Carlos, Hugo, Rildo, Aurélia e agora a pequena Helena, por serem a minha referência de família que você ganha da vida. Obrigada pela torcida e companheirismo nesses longos anos de vizinhança. À toda a minha família, que mesmo sem entender o que eu faço, me apoiou e comemorou minhas conquistas. Duas pessoas possuem importância ímpar nessa minha caminhada: Matias Melendez, fica difícil agradecer por todas as vezes que você sentou comigo e me ensinou tantas coisas, que transcenderam a genética ou a biologia molecular. Você se tornou uma inspiração pessoal e profissional e eu jamais poderei agradecer a sua dedicação, carinho e paciência em me ajudar. E sou ainda mais grata pela oportunidade de ter podido trabalhar com você tantas vezes, o que me fez te admirar ainda mais e o que me permitiu crescer cientificamente. Adriana Cruvinel, eu nunca vou conseguir te agradecer pelo cuidado que você sempre teve comigo, por tudo que eu aprendi com você, por todas as vezes que você me ajudou, pela confiança e por você ter acreditado tanto na minha capacidade. Me sinto abençoada por ter tido vocês dois ao meu lado nesses dois anos. Sem dúvidas vocês foram meus alicerces nesta jornada. Ao André Lengert, por várias vezes ter dispensado o seu tempo para me ajudar e me ensinar. Pelas conversas de “meia hora”, que sempre duraram horas e que aconteceram quando eu mais precisava, que sempre me fizeram refletir e que acalmaram meus anseios. Te admiro imensamente e devo grande parte do meu amadurecimento científico a você. O trabalho de algumas pessoas incluía me ajudar de alguma forma. Como era trabalho, sei que era uma obrigação, mas foi feito com tanto carinho, que me fez ser extremamente

grata: Letícia, Path e Bia (Patologia), Silvana e Brenda (Pós-graduação), Cintia (Secretária - CPOM). Obrigada! À todas as pessoas do diagnóstico molecular por terem colocado as minhas placas no sequenciador um milhão de vezes e por terem me ajudado sempre que eu precisei: Gabi, Flávia, André e Cris. Obrigada pela enorme paciência e disponibilidade. Ao Gustavo Berardinelli, pela contribuição nas análises, por sempre vir falar comigo depois das minhas apresentações, afim de contribuir com o meu crescimento e pela disposição em me dar alíquotas de primers, sequências dos genes e protocolos. De coração, muito obrigada! À Camila Crovador, pela enorme ajuda sempre dispensada com muita competência e carinho. Admiro imensamente a profissional que você é. À Dra. Graziela Macedo, que tantas vezes reviu as minhas lâminas com tanto carinho e com a maior paciência me ensinou muito sobre histologia. Aos pesquisadores do CPOM Dra. Edenir Palmero, Dr. Daniel Vidal e Dr. Henrique Silveira, por todas as conversas de corredor e discussões no Journal, que sem dúvidas foram importantes na minha formação acadêmica. À Fernanda Cury, pelo companheirismo, parceria, pelas palavras que sempre me confortam e pelo apoio. Sou especialmente grata por você sempre tentar me entender, não julgando quem eu sou ou as minhas atitudes. Sua amizade sem dúvidas foi o maior presente que o mestrado me trouxe. À Maraisa Costa, por ter esse jeito doce e inocente, que fez e faz eu acreditar nas pessoas. Pelo seu jeito extrovertido e engraçado, que tantas vezes me fez rir e trouxe leveza para os dias pesados no laboratório. Como eu gosto de dizer, o CPOM sem você seria muito menos divertido. Ao Renato, Viviane, Tati, Marcela e Aline, por terem me acolhido tão bem no laboratório, pelas conversas, ensinamentos, paciência e por serem tão queridos comigo. Ao grupo de cabeça e pescoço do HCB, do qual me sinto um pouco parte: à Lidia, por ter parado para me ajudar quando eu precisei acelerar as análises do TERT e pelos momentos de descontração que tornaram os dias melhores. À Carolzinha, pela disponibilidade em sempre me ajudar. As minhas meninas, Bruna e Elisa, que com tanto companheirismo e amizade, estiveram comigo me apoiando e tornando a rotina muito mais feliz. Obrigada pela parceria! Vocês são muito especiais! À Úrsula, pelo eterno companheirismo! Por ter dividido a bancada comigo e, mais do que isso, ter dividido as angústias, problemas, alegrias, desesperos, risadas e conhecimento. Sou grata por cada ajuda que você me deu, especialmente pelo suporte emocional e por todos aqueles dias em que você sentou ao meu lado enquanto eu aplicava milhões de amostras em gel e conversando comigo, fez o tempo passar mais feliz!

À Nathalia Campanella, pela amizade, por toda ajuda e conselhos. Seu foco no trabalho, postura em algumas circunstâncias e determinação são, sem dúvidas, fontes de inspiração. Ao Gerson, Fabiana e Andressa, as pessoas que constituem o Núcleo de Educação em Câncer do Hospital de Câncer de Barretos (NEC), pela parceira e confiança, que me permitiram vivenciar uma das melhores experiências da pós-graduação. Participar do concurso de redação e ser responsável pelo estágio dos alunos dentro do laboratório instigou em mim uma vontade inexplicável de fazer a diferença por meio da educação. E isso mudou o rumo da minha vida, de quem eu sou e do que eu acredito. De coração, muito obrigada! À Dra. Simone Acrani, pelos conselhos durante a graduação, que me fizeram amadurecer e que me permitiram pensar mais longe. E à Dra. Mariangela Torreglosa Ruiz Cintra, por ter me concedido a primeira oportunidade de trabalhar em um laboratório de genética, por ter sido tão rígida e exigente, que me tornou uma pessoa capaz de conseguir a oportunidade que me fez chegar até a conclusão deste trabalho. Aos meus amigos de longa data, que já passaram comigo tantas etapas, obrigada pelos momentos de alegria que me renovaram e obrigada por terem comemorado cada conquista minha, como se de vocês fosse: Gean, Kubo, Kell, Bruno e Talita. A amizade de vocês é um tesouro que eu tenho na vida. Por fim, agradeço ao Felipe Barco, por ter feito parte da minha vida e por ter me proporcionado conhecer o amor, sentimento que achei que passaria pela vida sem sentir. Você entrou em minha vida, abriu os meus olhos e despertou o que de melhor havia em mim. Você encheu de vida meu coração. Agradeço por, tantas vezes, ter sido o motivo pelo qual eu não desisti de acreditar e de fazer inúmeras coisas em minha vida. Nessa caminhada, sempre fiz meu trabalho com cuidado e responsabilidade, porque nunca esqueci destas suas palavras no primeiro dia que entrei no Hospital. E elas foram decisivas para eu ter crescido e amadurecido tanto até aqui.

“Se hoje eu consigo enxergar mais longe, é porque

me apoiei no ombro de gigantes”

Isaac Newton

SUMÁRIO

1. Introdução....................................................................................................................................... 1

1.1. Transformação Maligna dos Melanócitos ............................................................................... 3 1.2. Epidemiologia do Melanoma ................................................................................................... 5 1.3. Fatores de Risco para Melanoma ............................................................................................ 8 1.4. Prevenção do Melanoma ....................................................................................................... 10 1.5. Subtipos Histopatológicos do Melanoma .............................................................................. 11 1.6. Diagnóstico, Estadiamento, Prognóstico e Tratamento do Melanoma ................................ 15 1.7. Alterações Moleculares e Terapia Alvo em Melanoma ......................................................... 22

1.7.1. BRAF .............................................................................................................................. 23 1.7.2. NRAS .............................................................................................................................. 25 1.7.3. KIT .................................................................................................................................. 26 1.7.4. PDGFRA ......................................................................................................................... 27 1.7.5. TERT ............................................................................................................................... 28

1.8. Justificativa ............................................................................................................................ 29 1.9. Objetivo Geral ........................................................................................................................ 29 1.10. Objetivos Específicos .............................................................................................................. 30 1.11. Casuística e Métodos ............................................................................................................. 30

1.11.1. Delineamento e População de Estudo .......................................................................... 30 1.11.2. Critérios de Inclusão e Exclusão .................................................................................... 30

2. Métodos ........................................................................................................................................ 30 2.1. Extração de DNA .................................................................................................................... 30 2.2. Análise Mutacional dos Genes Alvos ..................................................................................... 31 2.3. Associação dos Dados Moleculares com os Fatores Demográficos, Clínicos e Histopatológicos dos Pacientes ......................................................................................................... 33 2.4. Análise Estatística .................................................................................................................. 34 2.5. Questões Éticas ...................................................................................................................... 34

3. Resultados ..................................................................................................................................... 34 4. Discussão ....................................................................................................................................... 49

4.1. Caracterização demográfica, clínica e histopatológica dos pacientes e amostras ............... 49 4.2. Características moleculares e suas associações com as demais variáveis estudadas e a sobrevida ........................................................................................................................................... 51

5. Conclusão ...................................................................................................................................... 56 7. Anexos ........................................................................................................................................... 67

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - ESTRUTURA DO TECIDO EPITELIAL ..................................................................................................................... 1

FIGURA 2 - MODELO DE PROGRESSÃO DO MELANOMA ......................................................................................................... 4

FIGURA 3 - ESTIMATIVAS MUNDIAIS DE INCIDÊNCIA E PREVALÊNCIA DE MELANOMA ................................................................... 5

FIGURA 4 - 20 PAÍSES COM MAIOR ESTIMATIVAS DE INCIDÊNCIA E PREVALÊNCIA DE MELANOMA .................................................. 6

FIGURA 5 - ESTIMATIVA DE INCIDÊNCIA E MORTALIDADE DE MELANOMA NOS PAÍSES EUROPEUS ................................................... 7

FIGURA 6 - MELANOMA EXTENSIVO SUPERFICIAL. ............................................................................................................ 14

FIGURA 7 - MELANOMA LENTIGO MALIGNO. ................................................................................................................... 14

FIGURA 8 - MELANOMA NODULAR. ............................................................................................................................... 14

FIGURA 9 - MELANOMA LENTIGINOSO ACRAL. ................................................................................................................. 14

FIGURA 10 - RELAÇÃO ENTRE NÍVEIS DE CLARK E DE BRESLOW ............................................................................................ 17

FIGURA 11 - VIA DE SINALIZAÇÃO MAP QUINASE ............................................................................................................. 23

FIGURA 12 - EXEMPLOS DAS MUTAÇÕES ENCONTRADAS EM NOSSA CASUÍSTICA. ..................................................................... 37

FIGURA 13 - PADRÃO DE MUTAÇÃO NOS PACIENTES DURANTE A EVOLUÇÃO TUMORAL. ............................................................ 41

FIGURA 14 -DISTRIBUIÇÃO DAS MUTAÇÕES NOS PACIENTES COM MELANOMA INCLUÍDOS NO ESTUDO. ........................................ 42

FIGURA 15 - SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA DE 459 PACIENTES COM MELANOMA. ................................................................... 45

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - ESTADIAMENTO DO TUMOR PRIMÁRIO, SEGUNDO A AJCC – 2009. ......................................... 18

TABELA 2 - ESTADIAMENTO DA METÁSTASE À DISTÂNCIA, SEGUNDO A AJCC – 2009. ................................. 19

TABELA 3 - ESTADIAMENTO DA METÁSTASE LINFONODAL, SEGUNDO A AJCC – 2009. ................................ 19

TABELA 4 - ESTADIAMENTO DO MELANOMA SEGUNDO AJCC- 2009. ..................................................... 20

TABELA 5 - VIAS DE SINALIZAÇÃO ALTERADAS EM MELANOMA E SUAS RESPECTIVAS ALTERAÇÕES. ................... 22

TABELA 6 - INFORMAÇÕES DA PCR PARA OS GENES ALVOS. .................................................................... 33

TABELA 7 - CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS, CLÍNICAS E HISTOPATOLÓGICAS PATOLÓGICAS DOS 459

PORTADORES DE MELANOMA DO HOSPITAL DE CÂNCER DE BARRETOS. ............................................. 36

TABELA 8 - PERFIL MOLECULAR DOS PORTADORES DE MELANOMA DO HCB DE ACORDO COM O

DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA. ............................................................................................... 37

TABELA 9 - TIPOS DE MUTAÇÕES ENCONTRADAS NOS 459 PACIENTES DO HCB DE ACORDO COM OS GENES

ALVOS. ................................................................................................................................. 38

TABELA 10 - DISTRIBUIÇÃO DOS SÍTIOS ANALISADOS NOS PACIENTES INCLUÍDOS NO ESTUDO. ........................ 41

TABELA 11 - ASSOCIAÇÃO ENTRE OS DADOS DEMOGRÁFICOS DOS 459 PACIENTES DO HCB INCLUÍDOS NO

ESTUDO E AS MUTAÇÕES NOS GENES ALVOS. ................................................................................ 43

TABELA 12 - ASSOCIAÇÃO ENTRE OS DADOS CLÍNICOS DOS 459 PACIENTES DO HCB INCLUÍDOS NO ESTUDO E AS

MUTAÇÕES NOS GENES ALVOS. .................................................................................................. 44

TABELA 13 - SOBREVIDA ESPECÍFICA POR CÂNCER DOS 459 PACIENTES DO HCB DE ACORDO COM O STATUS

MUTACIONAL DOS GENES ALVOS. ............................................................................................... 46

TABELA 14 - SOBREVIDA ESPECÍFICA POR CÂNCER DOS 459 PACIENTES DO HCB DE ACORDO COM O STATUS

MUTACIONAL DOS GENES ALVOS E CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS. ............................................... 46

TABELA 15 - SOBREVIDA ESPECÍFICA POR CÂNCER DOS 459 PACIENTES DO HCB DE ACORDO COM O STATUS

MUTACIONAL DOS GENES ALVOS E CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS. ......................................................... 47

TABELA 16 - ANÁLISE MULTIVARIADA DE SOBREVIDA ESPECÍFICA POR MELANOMA DOS 459 PACIENTES DO HCB.

........................................................................................................................................... 48

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1 - FREQUÊNCIAS DAS ALTERAÇÕES ENCONTRADAS NO ÉXON 15 DO GENE BRAF. .......................... 38

GRÁFICO 2 - FREQUÊNCIAS DAS ALTERAÇÕES ENCONTRADAS NO GENE NRAS. ........................................... 19

GRÁFICO 3 - FREQUÊNCIAS DAS ALTERAÇÕES ENCONTRADAS NA REGIÃO PROMOTORA DO GENE TERT.. ......... 38

GRÁFICO 4 - FREQUÊNCIAS DAS ALTERAÇÕES ENCONTRADAS NO GENE KIT. .............................................. 38

GRÁFICO 5 - FREQUÊNCIAS DAS ALTERAÇÕES ENCONTRADAS NO GENE PDGFRA........................................22

LISTA DE ABREVIATURAS

BRAF – v-raf murina sarcoma viral oncogene homolog B

TERT – Telomerase reverse transcriptase

NRAS – Neuroblastoma RAS viral oncogene homolog

CDKN2A – Cyclin-dependent Kinase inhibitor 2A

PTEN – Phosphatase and tensin homolog

MTAP – Methylthiodenosine phosphorylase

PLA2G6 – Phospholipase A2 goup VI

IRF4 – Interferon regulator factor 4

MC1R – Melanocortin 1 receptor

cMAP – amp cíclico

ANVISA – Agência nacional de vigilância sanitária

DHL – Desidrogenase lática

AJCC – American Joint Committee on Cancer

DNA – Ácido desoxirribonucleico

RNA – Ácido ribonucleico

TCGA – The cancer genome atlas network

PDGFRA - Platelet derived growth factor receptor alpha

WT – Wild type

HCB – Hospital de Câncer de Barretos

PCR – Reação em cadeia da polimerase

LISTA DE SÍMBOLOS

≤ menor ou igual

≥ maior ou igual

% porcentagem

< menor

> maior

x vezes

µL microlitros

µg microgramas

˚C graus Celsius

nM nanomolar

mM milimolar

µM micromolar

U unidades

cm centímetros

RPM rotações por minuto

G gravidade

mL mililitro

M molar

ng nanograma

bp base pair

V volts

p valor de p

mm milímetros

mm2 milímetros quadrados

RESUMO Vicente, ALSA. Perfil Molecular de Melanomas Cutâneos e de Mucosas. Dissertação (mestrado). Barretos: Hospital de Câncer de Barretos; 2016. O melanoma é a forma mais agressiva de câncer de pele e surge a partir de células normais de pigmento, os melanócitos, localizadas na membrana basal de superfícies epiteliais. Pesquisas indicam que há um crescimento da incidência de melanoma nos últimos anos. O aumento do conhecimento da heterogeneidade da doença e do surgimento de terapias-alvo com sucesso em ensaios clínicos e aprovados como tratamento para melanoma em todo mundo, tornou necessário caracterizar o perfil molecular do melanoma na população brasileira, para nortear pesquisas futuras e melhorar o tratamento dos pacientes. Diante disso, 459 pacientes com melanoma diagnosticados no Hospital de Câncer de Barretos foram incluídos no estudo e sequenciados pelo método de Sanger para os hotspots dos genes alvos BRAF, NRAS, TERT, KIT e PDGFRA. Além disso, os achados moleculares foram associados com dados demográficos, clínicos e histopatológicos. Em nossa casuística, houve a predominância do subtipo nodular (38,9%) e disseminativo superficial (34,4%), sendo os membros a localização tumoral mais frequente (50,0%). Os fatores ulceração, nível de Clark, índice mitótico, Breslow e estádio TNM em nossa casuística foram associados ao prognóstico. As frequências de mutações para BRAF, NRAS, TERT, KIT e PDGFRA foram, respectivamente, 34,1%, 7,9%, 34,3%, 6,2% e 2,9%, sendo que os tipos de alterações ou localizações mais frequentes para cada gene foram V600E, Q61, C250T, éxon 11 e éxon 12, respectivamente. Mutações em BRAF foram associadas a pacientes mais novos (p= 0,014), assim como para mutações em TERT (p= 0,006) e mutações em PDGFRA a pacientes com cor da pele negra (p= 0,023). Além disso, mutações em BRAF e TERT estão associadas a diferentes localizações anatômicas, principalmente a região do tronco (p= 0,0001, para ambos) e ao subtipo tumoral disseminativo superficial e nodular, respectivamente (p= 0,0001, para ambos). Ainda, mutações em TERT estão associadas a ausência de ulceração (p= 0,037) e valor de DHL menor ou igual 400 U/L. O status mutacional dos genes alvos não foi associado a sobrevida dos pacientes. De forma geral, os pacientes possuem perfil molecular similar ao que se observa em outras populações e acreditamos que pacientes brasileiros podem se beneficiar das terapias-alvo já existentes e emergentes direcionadas a estas alterações mais frequentes.

Palavras-chave: Melanoma, MAPK, Telomerase, Mutação, Sequenciamento e Prognóstico.

ABSTRACT Vicente, ALSA. Molecular Profiling of Cutaneous and Mucosal Melanomas. Dissertation (Master´s Degree). Barretos: Barretos Cancer Hospital; 2016. Melanoma is the most aggressive form of skin cancer and it is originate from the melanocytes located in the basement membrane of epithelial surfaces and recent studies demonstrated its increasing incidence in the last years around the globe. The knowledge of heterogeneity and multiple specific molecular profile of the disease and development of successful target therapies, raise the question of the characterization of the molecular profile of melanoma in the Brazilian population. Thus, 459 patients diagnosed with melanoma in the Barretos Cancer Hospital were tested for specific molecular alterations by Sanger direct sequencing method of the hotspot region of BRAF, NRAS, TERT, KIT e PDGFRA. Beyond that, the molecular findings were correlated with demographic, clinical and histopathological data. We found predominance of the nodular subtype (38.9%) and superficial spreading melanoma (34.4%), and the limbs were the most frequent tumor location (50.0%) The factors such as ulceration, Clark level, mitotic index, Breslow and TNM stage were related to the prognosis. . The frequencies of mutations for BRAF, NRAS, TERT, KIT e PDGFRA were respectively, 34.1%, 7.9%, 34.3%, 6.2% and 2.9%. The most frequent types of changes or locations for each gene were V600E, Q61, C250T, éxon 11 e éxon 12, respectively. BRAF mutations were associated with younger patients (p = 0.014) as well as mutations in TERT (p = 0.006) and PDGFRA mutations in patients with black skin (p= 0.023). Furthermore, mutations in BRAF and TERT were associated with different anatomical locations, particularly the trunk (p= 0.0001, for both) and superficial spreading and nodular subtype respectively (p= 0.0001, for both). TERT promoter mutations were associated with absence of ulceration (p= 0.037) and less than or equal LDH levels of 400 U/L. The mutational status of target genes was not associated with survival. In general, patients have similar molecular profiling to that observed in other populations. Brazilian patients can benefit from targeted therapies already used and emerging ones directed to these more frequent alterations. Key words: Melanoma, MAPK, Telomerase, Mutation, Sequencing and Prognostic.

1

1. Introdução

A pele é o maior órgão do corpo humano, sendo composta por diversos tecidos, tipos

celulares e estruturas especializadas, tornando-se assim um órgão extremamente complexo

(Figura 1). Ela é constituída por uma porção epitelial mais externa de origem ectodérmica, a

epiderme, e uma porção conjuntiva intermediária de origem mesodérmica, a derme. Há

ainda uma estrutura inferior, a hipoderme, que embora não possa ser considerada parte da

pele é sob ela que as duas camadas já citadas repousam1.

A hipoderme é formada por tecido conjuntivo que varia do tipo frouxo ao denso e em

determinadas regiões do corpo contém células adiposas formando o panículo adiposo,

importante como reserva de energia, isolante térmico e para absorção de choques1.

A derme também é formada por tecido conjuntivo e é constituída por fibras de

colágeno, elastina e gel coloidal, sendo responsável pelas propriedades de elasticidade e

resistência que a pele apresenta. Ela possui inúmeros corpúsculos sensoriais e táteis e

Figura 1 - Estrutura do tecido epitelial1.

2

terminações nervosas, portanto é ricamente vascularizada, sendo inclusive, responsável pela

nutrição sanguínea da epiderme. A derme é subdividida em uma camada papilar, de tecido

conjuntivo frouxo que forma as papilas dérmicas e onde são encontradas fibrilas especiais

de colágeno que contribuem para prender a derme à epiderme, e uma camada reticular,

constituída por tecido conjuntivo denso1.

A epiderme é composta de quatro tipos celulares: os queratinócitos, células de

Langerhans, células de Merkel e os melanócitos. Os queratinócitos são derivados da

ectoderme, possuem função principal de síntese de queratina e são as células epidérmicas

mais populosas2. As células de Langerhans localizam-se em toda a epiderme entre os

queratinócitos, porém são mais frequentes na camada espinhosa1. Estas células se originam

de células precursoras da medula óssea que são transportadas pelo sangue circulante e

atuam como células apresentadoras de antígeno em respostas imunológicas2.

As células de Merkel possuem origem incerta e se localizam na parte profunda da

epiderme, apoiadas na membrana basal. Atuam como mecanoreceptores devido às

terminações nervosas aferentes se aproximarem destas células1.

Os melanócitos são células dendríticas localizadas no estrato basal da epiderme,

cujos prolongamentos penetram na camada espinhosa, mas não formam desmossomos com

os queratinócitos. Estas células se diferenciam a partir do melanoblasto, uma célula

precursora migratória da crista neural, controlado pelo ligante do fator de células-fonte

interagindo com o c-Kit, uma tirosinaquinase1. Estas células invadem a pele entre a 12ª e 14ª

semana da vida intrauterina e apresentam renovação mais lenta do que os queratinócitos e

se caracterizam por produzirem melanina1.

A melanina é derivada do aminoácido tirosina, o qual é transportado para dentro de

vesículas especializadas contendo tirosinase, conhecidas como melanossomas, derivadas da

rede trans-Golgi. No interior dessas melanossomas, a tirosinase converte tirosina em 3,4-di-

hidroxifenilalanina (dopa), a qual é transformada em dopaquinona e, finalmente, em

melanina2.

Os melanossomas seguem para aos prolongamentos dos melanócitos, os quais são

englobados e endocitados pelos queratinócitos dos estratos basal e espinhoso. Os

melanossomas liberados migram para as proximidades do núcleo do queratinócito de modo

a formar um capuz protetor contra os raios ultravioleta da radiação solar. Logo em seguida,

os lisossomas atacam e destroem os melanossomas2.

3

São três as principais neoplasias malignas da pele: o carcinoma de células basais, o

carcinoma de células escamosas e o melanoma maligno. A primeira consiste na mais comum

neoplasia maligna, ocorrendo em virtude da radiação ultravioleta e se desenvolve no estrato

basal, sendo as áreas cronicamente expostas da pele como a face, as mais acometidas. A

cirurgia é normalmente efetiva em 90% dos casos, sem recaída2.

O carcinoma de células escamosas ou carcinoma epidermóide está relacionado a

fatores ambientais, tais como radiação ultravioleta e os raios X, além de carcinógenos

químicos. Esta neoplasia origina-se nas células do estrato espinhoso e aparece clinicamente

como uma placa escamosa hiperqueratótica, com invasão profunda dos tecidos subjacentes,

frequentemente acompanhada por sangramento. A cirurgia neste caso, geralmente é o

tratamento de escolha2.

O melanoma, foco central deste estudo, é a forma mais agressiva dentre as

neoplasias de pele e surge a partir de células normais de pigmento, os melanócitos3, que se

tornam mitoticamente ativos e invadem a derme, podendo penetrar nos sistemas

circulatório e linfático para formar metástases em outros órgãos2.

Mais de 90% dos melanomas surgem na pele, em especial nos sítios expostos ao sol,

como membros, tronco e face. Em torno de 3 a 5% dos melanomas se originam de

melanócitos do trato uveal e raramente em superfícies epiteliais não cutâneas, incluindo

membranas mucosas dos seios, orofaringe, esôfago, reto e vagina. Em pessoas com pele

negra esta forma de câncer surge em geral em locais não expostos ao sol, como membranas

mucosas, região palmo-plantar e subungueal, com baixa frequência destas apresentações

clínicas na população de pele branca3.

1.1. Transformação Maligna dos Melanócitos

Melanomas se desenvolvem a partir de um dos melanócitos num processo marcado por

sucessivas alterações genéticas. Ainda não existe um consenso sobre o padrão de

desenvolvimento da doença4, no entanto, um artigo recente publicado por Shain e

colaboradores (2015)5, mostrou com os dados de sequenciamento de 37 melanomas

primários, em um total de 150 áreas, com histologias distintas de lesões precursoras, que a

evolução da doença a partir dessas lesões realmente se estabelece com o acúmulo de

mutações somáticas, enquanto que variações no número de cópias do DNA é um processo

4

importante para a metastização. Além disso, propuseram um modelo de progressão da

doença (Figura 2), onde a radiação ultra-violeta possui papel importante desde o surgimento

da lesão benigna, até se tornar invasivo e que a maioria dessas lesões possui mutações

condutoras (driver mutations) importantes, que levam ao desenvolvimento da doença. Eles

postulam três possíveis caminhos de surgimento do melanoma. O primeiro é quando a lesão

benigna já possui a mutação V600E do gene BRAF (v-Raf murine sarcoma viral oncogene

homolog B) e a mutação na região promotora do TERT (telomerase reverse transcriptase) é a

responsável pela transição da lesão intermediária para o melanoma in situ. A segunda e

terceira teoria é a existência de uma lesão intermediária entre a lesão benigna e o

melanoma in situ, que surge por mutações no NRAS (neuroblastoma RAS viral oncogene

homolog) mais TERT ou por BRAF V600K mais TERT, respectivamente. O fato é que a

transição do melanoma in situ para invasivo, independente das três teorias, seria em virtude

de alterações no gene CDKN2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), importante supressor

tumoral, que leva a perda da função do gene e alterações nos genes SWI/SNF, responsáveis

por mecanismos epigenéticos de enovelamento da cromatina nas histonas. E a metastização

do tumor provavelmente se estabelece por perda de função de PTEN (phosphatase and

tensin homolog) e P53.

Figura 2 - Modelo de progressão do melanoma5.

5

1.2. Epidemiologia do Melanoma

Estudos indicam que há uma incidência crescente de melanoma em todo mundo6. A

Sociedade Americana de Câncer estima cerca de 76.380 novos diagnósticos de melanomas

na população norte-americana em 2016, em torno de 46.870 em homens e 29.510 em

mulheres. Além disso, estima que 10.130 pessoas morram pela doença neste mesmo ano7.

Segundo as estimativas do Globocan 2012 em todo o mundo aproximadamente

232.000 novos casos de melanoma seriam diagnosticados. Ainda segundo esta estimativa a

incidência e prevalência mundial de melanoma não diferem entre os gêneros, é maior nos

países desenvolvidos (Figura 3), sendo que os vinte com maior estimativa de incidência e

prevalência são: EUA, Alemanha, Reino Unido, Austrália, Itália, França, Rússia, China,

Canadá, Holanda, Espanha, Brasil, Suécia, Suíça, Nova Zelândia, Ucrânia, Polônia, República

Tcheca, Bélgica e Dinamarca (Figura 4)8.

Figura 3 - Estimativas mundiais de incidência e prevalência de melanoma8.

6

Figura 4 - 20 países com maior estimativas de incidência e prevalência de melanoma8.

7

Segundo a EUCAN (Figura 5), em 2012, os cinco países com maior estimativa de

incidência de melanoma na Europa incluem Suíça, seguida de Noruega, Holanda, Dinamarca

e Suécia. Enquanto que o país com maior estimativa de mortalidade é Noruega, seguida de

Eslovênia, Suécia, Holanda e Islândia9.

Figura 5 - Estimativa de incidência e mortalidade de melanoma nos países europeus9.

8

Na Austrália o melanoma é o terceiro câncer mais incidente e as estimativas em 2016

é de 15.270 novas casos10. Em 2011 ocorreram 1.544 mortes por este tipo tumoral neste

país, sendo que a sobrevida é maior em homens. A incidência de melanoma entre 1982 e

2007 na Austrália foi de 47 a cada 100.000 pessoas e a taxa de mortalidade neste período foi

de 5.7 a cada 100.000 pessoas11.

No Brasil, em 2006 a Sociedade Brasileira de Dermatologia publicou dados

decorrentes de uma Campanha Nacional de Prevenção do Câncer de Pele, que ocorreu entre

1999 e 2005. Embora não sejam dados frutos de uma pesquisa, a análise destes pode dar

uma ideia do panorama geral. Nos sete anos que durou a campanha 205.869 exames

dermatológicos foram feitos e 1.057 melanomas foram diagnosticados12.

Em 2011 foi publicado um estudo epidemiológico de melanoma, que avaliou a

incidência deste câncer em 30 anos na cidade de Blumenau. Entre os anos de 1980 e 2009

foram encontrados 10.981 casos de câncer de pele, dos quais 1.002 melanomas. A incidência

passou de 4.4 para 22 por 100.000 habitantes entre os anos de 1980 e 200913. Enquanto que

Moreno e colaboradores mostraram em 2012 que entre 2002 e 2009 a incidência de

melanoma aumentou em Santa Catarina de 7.4 para 9.3 por 100.000 habitantes14.

Segundo o Instituto Nacional do Câncer, embora a incidência de melanoma na

população brasileira seja baixa, sua letalidade é alta. As estimativas deste câncer em 2016,

segundo este mesmo órgão nacional, são 3.000 casos novos em homens e 2.670 em

mulheres. A cidade de Porto Alegre possui a maior estimativa de incidência de melanoma do

país, sendo 9.41 a cada 100.000 homens e 7.45 a cada 100.00 mulheres. Essa baixa

incidência quando comparada ao panorama mundial, muito provavelmente, é em virtude da

subnotificação15. A sobrevida por melanoma no Brasil é baixa comparada a população

mundial, muito devido ao diagnóstico tardio que pode ser relacionado à dificuldade de

acesso da população ao sistema de saúde16.

1.3. Fatores de Risco para Melanoma

Os fatores de risco associados ao desenvolvimento do melanoma incluem: exposição

intermitente ao sol, dificuldade no bronzeamento, xeroderma pigmentoso, história familiar

de melanoma, nevos melanocíticos congênitos, múltiplos nevos displásicos, dentre outros17.

9

A exposição intermitente ao sol é o maior fator de risco para melanoma. Alguns

estudos demonstram que p53, p21, p16 e a proteína retinoblastoma são importantes na

estabilidade genômica quando os melanócitos são expostos a radiação ultra-violeta e,

consequentemente, na prevenção da transformação maligna destas células18.

Há fortes evidências de que um padrão de exposição intermitente ao sol (curta e

intensa, em virtude de banhos de sol e recreações ao ar livre) aumenta o risco de melanoma,

enquanto que a exposição crônica (contínua, principalmente ocupacional) demonstra menor

associação com o risco de melanoma. Isto pode ser em virtude da exposição crônica ao sol

promover o espessamento epitelial e em conjunto com um efeito de bronzeamento poder

oferecer uma modesta proteção contra a exposição à radiação solar mais tarde19.

Além disso, há evidências que sugerem que o risco de melanoma continua a

aumentar com o acúmulo da exposição intermitente ao sol. Meta-análises relatam o

aumento do risco de melanoma com o aumento do número de queimaduras solares durante

todos os períodos da vida (infância, adolescência e idade adulta), sem diferenças

significativas entre queimaduras solares na infância e na idade adulta20.

O xeroderma pigmentoso é uma doença autossômica recessiva que ocorre em

virtude de mutações em genes de reparo do DNA21. Levando-se em consideração isto, torna-

se fácil entender que tendência ao fácil bronzeamento e xeroderma pigmentoso constituem

fatores de risco ao desenvolvimento do melanoma porque tornam os indivíduos mais

susceptíveis à radiação ultra-violeta.

Em relação ao melanoma familiar, de 25 a 40% estão associados a mutações em

CDKN2A, sendo este classicamente um supressor tumoral, acarretando assim uma perda de

função. Este gene codifica a proteína p16 e p14, ambas envolvidas na regulação do ciclo

celular, supressão tumoral e senescência dos melanócitos17. A proteína p16 inibe a atividade

de CDK4 e CDK5 e influencia a proteína retinoblastoma a regular a progressão de G1 para a

fase S. A proteína p14 afeta a via do p53, impedindo o ciclo celular e induzindo a apoptose22.

O nevo melanocítico congênito é uma alteração benigna que se origina entre a 5ª e 24ª

semana de gestação e acredita-se que ocorra em virtude de um erro morfológico na

neuroectoderma durante a embriogênese, levando ao crescimento descontrolado de

melanoblastos, as células precursoras dos melanócitos. Há evidências claras na literatura de

que indivíduos portadores de nevos congênitos possuem de 5 a 10% a chance de

desenvolver melanoma23.

10

O número de nevos displásicos é um dos maiores fatores de risco para melanoma19.

Há uma ampla discussão sobre os critérios histopatológicos para os nevos displásicos na

literatura patológica e dermatopatológica, entretanto, de forma geral, pode-se definir como

uma desordem estrutural e uma atipia citológica24. Uma meta-análise conduzida em 2005

por Gandini e colaboradores com 10.499 casos e 14.256 controles, em um total de 47 bancos

de dados, demonstrou que os indivíduos com mais de 100 nevos displásicos estão em um

risco quase sete vezes maior de desenvolver melanoma do que os indivíduos com poucos

(≤15) nevos25. Ainda, há evidências de que polimorfismos nos genes IRF4 (interferon

regulatory factor 4), MTAP (methylthioadenosine phosphorylase) e PLA2G6 (phospholipase

A2 group VI) em nevos displásicos estão associados ao risco à doença26.

Além desses fatores de risco, algumas variantes do gene MC1R (melanocortin 1

receptor), por sua característica polimórfica, podem estar relacionadas à maior

susceptibilidade ao melanoma19. Também foi demonstrado que este gene está super-

expresso em melanomas quando comparados a qualquer tecido saudável. Inclusive há

muitos estudos que já discutem o seu papel no diagnóstico e condução de tratamento para

este tipo tumoral. Este gene codifica um receptor acoplado à proteína G, cuja ativação

resulta na elevação dos níveis intracelulares de AMP cíclico (cAMP), numa cascata de

transdução de sinal que termina com a produção de melanina26.

1.4. Prevenção do Melanoma

As intervenções se baseiam principalmente na informação e educação, por meio de

políticas públicas e órgãos não governamentais, em ambientes que vão desde locais de

recreação ao ar livre, creches, escolas e em locais de trabalho. A prevenção do melanoma

tem se baseado, principalmente, em precaver queimaduras solares, reduzir o tempo de

exposição ao sol e o uso de fotoprotetor19.

Em alguns países o uso de bronzeamento artificial é uma prática comum, entretanto,

muitos estudos já demonstraram que esses equipamentos podem ser um causador do

melanoma, portanto, intervenções no sentido de conscientizar sobre essa prática, também

vêm sendo empregadas27.

11

Segundo a Sociedade Brasileira de Dermatologia não há nenhuma medida fotoprotetora

que, de forma independente, garante fotoproteção adequada. Sendo assim, a combinação

do maior número possível de medidas é a estratégia mais correta. As recomendações do

consenso brasileiro sobre fotoproteção incluem evitar a exposição solar entre 10:00 e 15:00,

sendo que no nordeste a exposição deve ser evitada a partir das 9:00 e no centro-oeste até

as 16:00, devido a posição geográfica. Este consenso ainda indica para pessoas calvas o uso

de chapéus e fotoprotetor no couro cabeludo, a atenção para fotoproteção das orelhas, o

uso de óculos de sol com proteção solar, bem como o uso de produtos com fotoproteção

nos lábios28 e recomenda que os protetores solares indicados por dermatologistas estejam

de acordo com a legislação da ANVISA (Agência nacional de vigilância sanitária) e que a

população seja orientada a aplicá-los de forma correta 28. O Consenso brasileiro afirma que o

bronzeamento artificial deveria ser proibido no país, embora a radiação artificial possa ser

empregada para o tratamento de algumas doenças, desde que haja a indicação e orientação

de um dermatologista. E que fotoproteção mecânica, como bonés, chapéus e guarda-chuvas,

devem ser estimulados28.

1.5. Subtipos Histopatológicos do Melanoma

A classificação do melanoma que é amplamente utilizada tanto por clínicos e

pesquisadores, bem como pela Organização Mundial de Saúde foi estabelecida por Clark em

1969 e se baseia nos padrões microscópicos de crescimento e está associada às

características clínicas, tais como localização anatômica do tumor primário e idade do

paciente. Esta classificação distingue quatro subtipos principais de melanoma29:

Melanoma Extensivo Superficial (MES): é um subtipo de melanoma que

tende a ocorrer na pele e é caracterizado por uma fase de crescimento radial composto de

neoplasia com grandes melanócitos que se estendem entre os queratinócitos30. Além disso,

é o subtipo mais frequente, compreendendo 2/3 de todos os melanomas e exposição solar

aguda na infância, bem como exposição intermitente na vida adulta, constituem fatores

importantes na sua etiologia31.

12

O MES (Figura 6) pode ocorrer em todo corpo, sendo mais frequentemente

observado nas pernas em mulheres e no tronco em homens. Um dos primeiros sinais clínicos

é a variação de cor, decorrente à presença de melanócitos nas diferentes camadas da

epiderme, e de melanófagos na derme. Outros reconhecimentos clínicos desta lesão incluem

assimetria, irregularidade das bordas e diâmetro maior do que 6.0mm30.

O MES tem uma incidência elevada de mutações no oncogene BRAF e alterações

cromossômicas incluem, principalmente, perda do 9, 10, 6q, 8p e ganhos de cromossomos 1,

6p, 7, 8q e 20. A perda do cromossomo 9 geralmente inclui o locus 9p21 onde se encontra o

gene CDKN2A, já discutido como sendo importante supressor tumoral31.

Melanoma Lentigo Maligno (MLM): é uma forma de melanoma que ocorre na

pele de idosos em regiões cronicamente expostas ao sol, principalmente na face (Figura 7).

Caracteriza-se histologicamente por proliferação melanocítica linear e aninhado, ao longo da

junção derme-epiderme, cuja lesão está associada à atrofia epidérmica e elastose solar. Nos

países de população predominantemente branca, estima-se que esse subtipo compreende

de 4 a 15% dos melanomas30.

O MLM surge como uma extensa mácula irregular, de limites imprecisos, com uma

pigmentação heterogênea em tons variáveis de cinza, marrom ou preto. Normalmente, as

lesões apresentam uma proliferação de melanócitos atípicos, confluentes ao longo da junção

dermo-epiderme, com fusão das cristas epiteliais, atrofia epidérmica e extensa elastose,

como já dito31.

Quanto às alterações moleculares deste subtipo, parece que mutações no oncogene

BRAF são menos frequentes e as perdas cromossômicas mais comuns envolvem o

cromossomo 13 e menos frequentemente o 1030.

Melanoma Nodular (MN): é o segundo subtipo mais frequente entre os

melanomas e cuja etiologia se assemelha a descrita para o MES. O componente dérmico é

caracterizado por um nódulo coeso ou pequenos ninhos de células tumorais que têm um

padrão expansivo de crescimento (Figura 8). As células tumorais são frequentemente mais

epitelióide, mas outros tipos de células, incluindo células fusiformes, podem predominar ou

haver uma mistura entre elas. Além disso, os nucléolos são proeminentes e índices mitóticos

são altos31.

13

É mais comum para MN começar “de novo” do que ser proveniente de um nevo pré-

existente. Em relação às alterações genéticas, ainda não há uma alteração que o defina

como um tipo único30.

Melanoma Lentiginoso Acral (MLA): é um subtipo de melanoma cutâneo com

características histopatológicas bem distintas e acomete as palmas das mãos, plantas dos

pés e regiões subungueais (Figura 9). A incidência desse subtipo de melanoma varia

enormemente de acordo com a raça e etnia, sendo que na população branca compreende

aproximadamente 2% dos melanomas, mas chegando a 80% na população negra e 77% na

população asiática30.

A incidência de MLA permaneceu estática, embora a incidência mundial de melanoma

esteja aumentando ao longo dos últimos anos. Esse subtipo ocorre em pacientes idosos,

com pico na sétima década de vida e em população onde MLA é mais comum, este tumor é

mais frequente em homens do que em mulheres31.

Clinicamente o MLA na fase radial é caracterizado por acantose, alongamento das

cristas epiteliais e proliferação de melanócitos atípicos com grandes prolongamentos

dendríticos ao longo da epiderme basal. O componente intraepidérmico apresenta

melanócitos com grandes núcleos e nucléolos, e citoplasma preenchido com grânulos de

melanima. Embora acometam sítios que, muitas vezes, não recebem alta incidência de

radiação ultra-violeta, esta constitui um fator de risco para MLA somando-se a isto, um

número alto de nevos30.

As alterações genéticas em MLA se diferem em relação aos outros subtipos de

melanoma. Alteração em BRAF é menos comum em comparação ao MES, MN e MLM,

enquanto que mutações em KIT, NRAS e PDGFRA parecem ser importantes na etiologia

deste subtipo31.

14

Figura 9 - Melanoma Lentiginoso Acral.

Figura 8 - Melanoma Nodular.

Figura 7 - Melanoma Lentigo Maligno.

Figura 6 - Melanoma Extensivo Superficial.

15

Além dessas quatro formas clássicas de melanoma, há ainda formas mais raras, como

o melanoma de mucosas, ocular, desmoplásicos, associados a nevos congênitos, infantil,

nevóide, persistente e associado a nevo azul30.

O melanoma de mucosas se caracteriza por acometer a região de cabeça e pescoço,

genitália feminina, região anorretal e urinária. Clinicamente se apresenta frequentemente

multifocal e com pigmentação escura irregular. São mais frequentes no sexo feminino e

geralmente incidem na sétima década de vida. Por ser um subtipo raro, poucos estudos

investigaram até o momento suas alterações genéticas. Entretanto, sabe-se que mutações

em KIT ocorrem em 40% desse subtipo32 e parece haver um papel importante do gene NRAS

em sua etiologia dependendo do sítio acometido33.

1.6. Diagnóstico, Estadiamento, Prognóstico e Tratamento do Melanoma

O diagnóstico do melanoma é eminentemente clínico e o uso da dermatoscopia

(equipamento óptico para visão ampliada) ajuda a observação mais detalhada da lesão.

Além disso, o exame histopatológico é fundamental para confirmação diagnóstica, do

subtipo de melanoma e para programar o tratamento adequado31.

Vários métodos têm sido utilizados na interpretação dos achados dermatoscópicos,

sejam por meio de métodos semiquantitativos como a regra do ABDCE e dos setes pontos,

ou qualitativos, como método de Menzies e análise dos padrões31.

A regra do ABCDE avalia a lesão com base em cinco parâmetros34:

1- Assimetria: são traçados dois eixos perpendiculares entre si, para análise

da simetria em cada metade, quanto à forma, estrutura e cor. Esse critério

possui peso 1.3, então se a lesão for assimétrica em um eixo, multiplica-se

um eixo de assimetria por 1.3 e se obtém 1.3. Entretanto, se a lesão for

assimétrica em dois eixos, então multiplica-se dois eixos de assimetria por

1.3 e se obtém 2.6.

16

2- Borda: são traçados quatro eixos sobre a lesão, perpendiculares dois a

dois, dividindo-se em 8. Então, para cada octante com interrupção brusca

de borda é multiplicado o peso de 0.1.

3- Cores: para cada cor que a lesão apresentar, multiplica-se por 0.5.

4- Diferentes Estruturas: multiplica-se por 0.5 a presença de cada uma dessas

estruturas: rede pigmentada, estrias, glóbulos, pontos e área sem

estrutura.

5- Evolução: ampliação ou evolução da lesão.

Assim, considera-se a lesão como benigna quando o escore varia entre 1.0 e 4.75,

suspeita entre 4.75 e 5.45, e altamente suspeita quando o escore é maior do que 5.4534.

A regra dos sete pontos descrita por Argenziano avalia e pontua sete critérios, divididos

em maiores e menores. Os critérios maiores valem dois pontos cada e incluem véu branco-

azulado e padrão vascular atípico, enquanto que os critérios menores valem um ponto cada

e incluem estrias irregulares, pigmentação irregular, glóbulos/pontos irregulares e estruturas

de regressão. Assim, escore maior do que 3 é diagnóstico para melanoma31.

No método descrito por Menzies, pelo menos um dos seguintes critérios deve estar

presente para o diagnóstico do melanoma, entretanto, apenas um critério não é suficiente,

devendo se considerar o contexto da lesão: pigmentação assimétrica, ausência de uma única

cor, véu branco-azulado, múltiplos pontos marrons, pseudópodes, estrias radiais, rede

pigmentada negativa, despigmentação irregular, despigmentação crucial, pontos e glóbulos

pretos periféricos, múltiplas cores, múltiplos pontos azul-acinzentado e rede alargada35.

A análise de padrões descrita por Pehamberger se dividem em: padrões globais, padrões

específicos, critérios adicionais e padrões relacionados à localização. Os padrões

multicomponentes e inespecíficos são indicativos de melanoma, enquanto que padrões

regular, globular e homogêneo azul-acinzentada, são sugestivos de lesão benigna. Além

disto, atividade melanocítica irregular, resultando em assimetria na cor e na distribuição das

estruturas, bem como presença de véu-branco-azulado, estrias radiais e pseudópodes. Esse

método praticamente se sobrepõe ao de Menzies31.

Apesar da importância inicial dos achados dermatoscópicos, os principais fatores

prognósticos estão relacionados aos dados histopatológicos, sendo o nível de Clark e

espessura de Breslow os mais clássicos em melanoma (Figura 10). O primeiro determina a

17

invasão do tumor nas camadas da pele e está relacionado, portanto, a extensão da

espessura do tumor, sendo que quanto menor o nível histopatológico da lesão, melhor o

prognóstico31.

Assim, o nível I de Clark corresponde à epiderme; enquanto que o nível II corresponde à

invasão parcial da derme papilar; o nível III corresponde à invasão definitiva da derme

papilar, estendendo-se à interface derme papilar; o nível IV corresponde à invasão definitiva

da derme reticular; e o nível V corresponde à invasão do tecido subcutâneo35.

Enquanto que a espessura de Breslow é complementar aos níveis de Clark e determina

diferentes prognósticos em relação à espessura vertical máxima do melanoma medido em

milímetros através de uma régua acoplada ao microscópio na análise histopatológica36.

Além disso, a ulceração está associada a maior agressividade tumoral, com maior

probabilidade de metástase e menor sobrevida. Assim como o índice mitótico é um

importante fator prognóstico para melanomas “finos” (espessura inferior a 1mm)36. A DHL

(dehidrogenase lática) está envolvida na síntese de energia celular e a sua super-expressão

correlaciona-se com o metabolismo anaeróbio tumoral e reduz a dependência celular de

oxigênio37. Há um tempo pesquisas demonstram que o nível de DHL encontra-se aumentado

no soro de pacientes com melanoma e que está associado com uma menor sobrevida

naqueles com doença avançada38. Esses achados levaram à incorporação de DHL nos

critérios prognósticos estabelecidos pela AJCC (American Joint Committee on Cancer)38.

O estadiamento do melanoma é crucial para a orientação clínica do paciente, sendo um

sistema de classificação que leva em conta fatores prognósticos já discutidos. Neste

Figura 6 - Relação entre níveis de Clark e de Breslow33

.

18

momento o estadiamento dos tumores malignos é regido por normais internacionais do

AJCC, que publica regulamente o livro TNM – Classification of Malignant Tumors. A última

revisão ocorreu em 2009 e é a que está atualmente em vigor36.

O sistema TNM visa à análise da extensão anatômica da doença e possui como base a

avaliação de três componentes: T - a extensão do tumor primário; N - a ausência ou

presença e a extensão de metástase em linfonodos regionais; e M - a ausência ou presença

de metástase à distância. A adição de números a estes três componentes indica a extensão

da doença maligna36.

Existe a classificação TNM clínica (cTNM) que se baseia nas evidências obtidas antes do

tratamento, em virtude do exame físico, diagnóstico por imagem, endoscopia, biópsia,

exploração cirúrgica e outros exames relevantes. Também existe a classificação TNM

patológica (pTNM), cujas bases são as evidências conseguidas antes do tratamento,

complementadas ou modificada pela evidência adicional conseguida através da cirurgia e do

exame histopatológico39.

Dessa forma, os estadiamentos clínicos ou patológicos categorizam os portadores de

melanoma localizado sem evidência de metástase (estadios I e II), em portadores de

metástase regionais (estádio III) ou portadores de metástase distantes (estádio IV)31. As

Tabelas de 1 a 4 representam de forma geral os estadios clínicos do melanoma segundo a

versão de 2009 da AJCC36. Vale ressaltar que nesta versão o índice mitótico distingui as

categorias T1a e T1b, sendo a primeira com índice mitótico ≥1 mm2 e a segunda < 1mm2.

Além disso, desde 2010 o nível de Clark é facultativo19.

Classificação T Espessura do Tumor Fatores de prognóstico adicionais

TX Tumor não avaliável Estádio não determinável

Tis Melanoma in situ Melanoma in situ, sem invasão da derme

a: sem ulceração e menos de uma mitose/ mm2

b: com ulceração e/ou com uma ou mais mitose/ mm2

a: sem ulceração

b: com ulceração

a: sem ulceração

b: com ulceração

a: sem ulceração

b: com ulceração>4.0mmT4

Menor ou igual a 1mmT1

T2 1.01-2.00mm

T3 2.01-4.00mm

Tabela 1 - Estadiamento do tumor primário, segundo a AJCC – 2009.

19

Classificação M Local da Metastização Nível sério de LDH

MX avaliação de metástase à distância não executada

M0 sem metástase à distância

M1apele, tecido celular subcutâneo ou ganglionares não loco-

regionaisNormal

M1b Pulmão Normal

M1c Outros órgãos viscerais Normal/Elevada

Classificação N N° de Linfonodos Metastáticos (LM) Extensão da Metástase Linfonodal

Nx Não avaliáveis

N0 Sem metástase linfonodal

a: Micrometástase

b: Macrometástase

a: Micrometástase

b: Macrometástase

c: Metástase em trânsito/satelitose sem metástase

linfonodais

N3

≥ 4 LM; conglomerado linfonodal;

combinação de metástase em

trânsito/satélites com metástases linfonodais

1 LM

2-3 LMN2

N1

Tabela 3 - Estadiamento da metástase linfonodal, segundo a AJCC – 2009.

Tabela 2 - Estadiamento da metástase à distância, segundo a AJCC – 2009.

20

Estádio Tumor Primário (pT) Linfonodos loco-regionais (N)Metástase à

distância (M)

0 Tumor in situ N0 M0

IA ≤1.0mm, não ulcerado, IM <1/mm2 NO M0

≤1.0mm, com ulceração ou IM ≥1/mm2 NO M0

1.01-2.0mm sem ulceração NO M0

1.01-2.0mm com ulceração NO M0

2.01-4.00mm sem ulceração NO M0

2.01-4.00mm com ulceração NO M0

> 4.00mm, sem ulceração NO M0

IIC > 4.00mm, com ulceração NO M0

IIIA Qualquer espessura sem ulceração N1a, N2a M0

Qualquer espessura com ulceração N1a, N2a M0

Qualquer espessura sem ulceração Até 3 macrometástases (N1b, N2b) M0

Qualquer espessura sem ulceraçãoMetástase em trânsito/satelitose sem

metástases linfonodaisM0

Qualquer espessura com ulceração Até 3 macrometástases (N1b, N2b) M0

Qualquer espessura com ou sem ulceração

N3 (≥4 linfonodos; conglomerado

linfonodal; combinação de metástase em

trânsito/satélites com metástases

linfonodais)

IV Qualquer T Qualquer N M1

IB

IIIB

IIA

IIB

IIIC

IM = Índice Mitótico.

Tabela 4 - Estadiamento do melanoma segundo AJCC- 2009.

21

O objetivo do tratamento inclui o controle local da doença evitando quando possível

a disseminação à distância. O principal tratamento do melanoma ainda é a cirurgia31.

Nas fases iniciais (estadios I e II) o tratamento é cirúrgico e o prognóstico é favorável,

enquanto que para estadios avançados, a literatura demonstra benefícios na sobrevida

global em pacientes submetidos a ressecção completa, embora muitos pacientes não são

elegíveis a cirurgia, quer pelo estado geral e/ou por co-morbidades associadas3.

A pesquisa de linfonodo sentinela é a maneira atual de diagnóstico de doença

linfonodal metastática. Nesta técnica identifica-se com o auxílio de injeção perilesional de

contrastes radioativos e outros pigmentos com tropismo para a via linfática, os primeiros

linfonodos que drenam a região acometida. Com isto pode-se fazer diagnóstico de

metástases linfonodais subclínicas (micrometástases) e o tratamento com cirurgia

complementar de resseção completa da cadeia linfonodal. Metástases linfonodais

diagnosticadas clinicamente também são tratadas com cirurgia e o prognóstico é

relacionado com a carga tumoral linfonodal. A presença de maior acometimento linfonodal é

indicador de menores taxas de sobrevivência16, 40-42.

O melanoma é um tumor considerado radio resistente e a radioterapia é utilizada em

situações específicas, principalmente para tratamento paliativo e eventualmente adjuvante,

sendo que esta deve ser indicada para pacientes considerados de alto risco para recaída

locorregional ou naqueles em que a localização da lesão limita o tratamento cirúrgico

adequado43.

Nas últimas três décadas, a dacarbazina foi o gold-standard do tratamento do

melanoma metastático, apesar de nunca ter sido demonstrado um aumento consistente da

sobrevida global. Este quimioterápico é um análogo das purinas, que inibe a síntese de DNA

(ácido desoxirribonucleico) e RNA (ácido ribonucleico). Desde 2011 este tratamento deixou

de ser considerado a primeira opção para terapia sistêmica do melanoma, devido ao

advento de terapia alvo e imunoterapias mais eficientes, que serão discutidas mais a frente6.

Junto com o avanço de inibidores de alterações específicas relacionadas à

carcinogênese do melanoma, houve mais recentemente grande avanço na imunoterapia

para este tipo tumoral. Ipilimumabe é um anticorpo monoclonal de imunoglobulina humana

(IgG1) que bloqueia totalmente CTLA-4 (linfócito citotóxico associado a antigeno-4) e

promove imunidade antitumoral44. Foi o primeiro agente a demonstrar uma melhoria na

sobrevida global em um estudo randomizado de fase III em pacientes com melanoma

22

avançado45. O PD-1 (proteína de morte celular programada 1) está envolvido na regulação

imune, mediada pela ligação de PD-1 e os seus ligantes PD-L1/PD-L2. O desenvolvimento de

anticorpos PD-1 já mostrou benefício clínico em pacientes com melanoma, bem como uma

ampla variedade de tipos de tumores46. Assim, os tratamentos direcionados e novos avanços

na imunoterapia vêm se mostrando eficientes em melhorar a sobrevida e são agora uma

parte do atendimento clínico de rotina dos pacientes com melanoma em vários países e

devem em futuro próximo ser incorporados ao arsenal terapêutico brasileiro45.

1.7. Alterações Moleculares e Terapia Alvo em Melanoma

Um número grande de vias celulares encontra-se alterada em melanoma (Tabela 5)47. A

via MAP quinase (Figura 11) é uma das mais importantes no desenvolvimento do melanoma,

sendo que esta é ativada por um receptor de tirosina quinase, que fosforila e ativa a família

RAF, consequentemente NRAS, MEK, ERK, que migra para o núcleo onde ativa vários fatores

de transcrição, incluindo ELK-1, ETS e c-MYC47.

Vias de Sinalização Genes Alterados Tipo de Alteração

KIT Mutação/amplificação

EGFR Ativação

MET Ativação

ERBD4 Mutação

FGFR Amplificação

Integrinas/sinalização ECM NEDD9/HEF Amplificação

NRAS Mutação

BRAF Mutação

MEK1 Mutação

PIK3CA Mutação

PTEN Mutação

AKT1, AKT2 Mutação rara

AKT3 Amplificação

NF1 (PI3K + MAPK) NF1 Mutação

RAC Mutação

MAP3K5 e MAP3K9 Mutação

PREX Mutação

GRIN2A Mutação

GRM3 Mutação

GNAQ Mutação

GNA11 Mutação

Apoptose BCL2A1 Amplificação

WTN/β-catenina CTNNB1 Mutação

CDK4 Mutação/amplificação

CCND1 Amplificação

P14ARF (CDKN2A) Mutação/deleção

MDM4 Amplificação

RB1 P116INK4A (CDKN2A) Mutação/deleção

MITF processo transcricional MITF Mutação/amplificação

MYC processo transcricional MYC Amplificação/superexpressão

ETV1 processo transcricional ETV1 Amplificação

TERT Região promotora da subunidade catalítica Mutação

CDK

P53

Receptores de tirosina quinases

RAS/RAF/MEK/ERK

RAS/PI3K/PTEN/AKT/Mtor

RHO/RAC/ outros MAPKs

Receptores de Glutamato

Proteínas G exceto RAS, envolvidas na

MAPK

Fonte: SHTIVELMAN et al47

.

Tabela 5 - Vias de sinalização alteradas em melanoma e suas respectivas alterações.

23

1.7.1. BRAF

O BRAF codifica uma proteína quinase serina/treonina membro da família RAF, no

cromossomo 7q34, que ativa a MAP quinase47. No melanoma, BRAF é o gene mais

comumente mutado, com uma frequência de 50 a 70%. Análises de subtipos anatômicos

demonstraram que as mutações em BRAF são relativamente comuns em melanomas

cutâneos (42,5%), mas incomum em melanomas de mucosas (5,6%) e raras em melanoma

uveal (menos de 1%). Entre os melanomas cutâneos, mutações em BRAF são comuns em

melanomas extensivos superficiais (53%), mas é menos frequente em lentiginoso acral (18%)

e ocorre em apenas 9% do subtipo lentigo maligno48.

As mutações em BRAF ocorrem particularmente com maior frequência em

melanomas cutâneos com exposição intermitente ao sol, como aqueles situados nos

membros, do que aqueles com exposição crônica, como no rosto25. Mais de 90% dessas

mutações resultam em uma substituição da valina por ácido glutâmico na posição 600

(Val600Glu ou V600E). BRAF V600E conduz à ativação da ERK, resultando em proliferação e

vantagem de sobrevivência de células de melanoma6.

Um artigo recente fruto dos dados do TCGA (The Cancer Genome Atlas Network)

mostrou que 52% dos 331 pacientes analisados possuíam mutações em BRAF, das quais

Figura 7 - Via de sinalização MAP quinase29

.

24

74,7% eram V600E, 10,8% V600K, 1,8% V600R e 12,7% eram mutações em outras

localizações do gene49. Além disso, este artigo e outros demonstraram que mutações nesse

gene são mutuamente exclusivas com mutações em NRAS e são mais frequentes em

pacientes mais jovens5, 45, 49.

A descoberta dessa alta frequência da mutação V600E em melanoma fez desta

proteína oncogênica um alvo ideal para a terapia. O objetivo da pesquisa molecular-alvo tem

sido identificar alterações moleculares relevantes em pacientes individuais e usar este

conhecimento para orientar as decisões de tratamento50.

PLX4032 (Vemurafenibe) é um inibidor que induz a parada do ciclo celular, a

proliferação e inicia a apoptose em células exclusivamente portadoras da mutação V600E50.

Os primeiros ensaios clínicos com esta terapia-alvo demonstraram até 80% de taxa de

resposta clínica em portadores de melanoma metastático com esta mutação em BRAF51. Em

contraste, o uso de Vemurafenibe associou-se ao crescimento das lesões nos pacientes

portadores do gene selvagem e em particular naqueles com mutação em NRAS52.

Enquanto esta alta taxa de resposta global foi sem precedentes para um único agente

em melanoma, vários pacientes desenvolveram resistência após a resposta inicial, sendo

observada recidiva e/ou progressão do tumor. A duração média da resposta à PLX4032 é de

aproximadamente sete meses48.

Em 17 de agosto de 2011 a instituição governamental norte-americana “Food and

Drug Administration” (FDA) aprovou o ZelborafTM (Vemurafenibe) para o tratamento de

melanomas inoperáveis ou metastáticos com a mutação BRAF V600E. A FDA também

aprovou o Teste de Mutação Cobas 4800 BRAF V600E®, um teste de diagnóstico

desenvolvido pela empresa Roche para identificar os pacientes elegíveis para o tratamento.

ZelborafTM foi o primeiro medicamento personalizado para melanoma aprovado pelo FDA,

demonstrando os benefícios da abordagem de medicina personalizada53.

Posteriormente a isto, outro inibidor de BRAF chamado Dabrafenib mostrou

resultados promissores42. Foi demonstrado que pacientes com melanoma com mutação

BRAF V600E eram mais sensíveis ao tratamento, com uma taxa de resposta confirmada de

57% em comparação com 37% em pacientes com mutações V600K. Pacientes com mutação

V600E ou V600K tiveram sobrevida livre de doença semelhante, com médias de 5,5 e 5,6

meses, respectivamente54.

25

No geral, foi comprovado que pacientes tratados com Dabrafenibe apresentaram

taxas de resposta e sobrevida livre de doença em taxas significativamente mais elevadas,

juntamente com um perfil de toxicidade bem tolerada em pacientes com melanoma

metastático com mutação BRAF V600E50, 55.

O desenvolvimento de Trametinibe, um inibidor MEK, também parte da mesma via

de sinalização mudou o interesse de identificação de inibidor desta via em melanomas

metastáticos com mutações em BRAF. Trametinibe possui o desempenho melhor do que

qualquer outro inibidor MEK avaliados até agora, permitindo, além disso, uma otimização da

inibição da sinalização MAPK55.

Isto foi observado no estudo clínico fase II conduzido por Keith e colaboradores

(2012)56, no qual os pacientes que receberam a terapia de combinação com 150mg de

Dabrafenibe e 2mg de Trametinibe mostraram taxa de sobrevida livre de doença

estatisticamente diferente daqueles que foram tratados apenas com Dabrafenibe, sendo 9,4

e 5,8 meses, respectivamente (taxa de risco de progressão ou morte 0.39, IC 95%, 0.25-0.62,

p < 0.001). A terapia de combinação também induziu maior extensão de regressão do tumor,

com uma resposta de 76%, em comparação com 54% da monoterapia (p < 0.03).

Diante destas evidências, a FDA aprovou em maio de 2013 a monoterapia de

Dabrafenibe e Trametinibe e, em janeiro de 2014, a terapia de combinação destas duas

drogas em pacientes com melanoma metastático com mutação V600E e V600K57.

1.7.2. NRAS

Mutações ativadoras no NRAS podem estimular tanto a via MAP quinase quanto as

vias PI3K/AKT, entretanto estas mutações são mutuamente exclusivas com mutações em

BRAF, como mencionado anteriormente49, 58.

Em torno de 90% das mutações que ocorrem em NRAS nos melanomas estão nas

posições 12/13 e 61, possuindo esta última maior frequência6. Os dados do TCGA

demonstraram que 28% dos 331 pacientes possuíam mutações em NRAS, sendo que 86 das

88 mutações encontradas, se localizavam em uma região hotspot. Destas, 91,9% no códon

61 e 8,1% do códon 12/13 de NRAS49.

Estudos demonstram que frequências de mutações neste gene em melanoma sejam

diferentes entre os subtipos, sendo que cerca de 26% de melanomas cutâneos apresentam

26

mutações no NRAS, enquanto melanomas de mucosas apresentam frequência em torno de

14% e melanoma uveal menos de 1%51. Dentre os melanomas cutâneos, a frequência de

mutações em NRAS parece ser em torno de 22% em melanomas extensivos superficiais, 28%

em nodulares, 4% em lentiginoso acral e 0% em lentigo maligno54.

Devido à ausência de inibidores específicos da família RAS, atualmente não existem

ensaios clínicos registados para a avaliação de inibidores de NRAS. A próxima quinase na via,

MEK, tem provado ser um alvo mais favorável59. Um estudo conduzido por Jaykumar e

colaboradores (2014) testou a eficácia de inibidores MEK em sete linhagens primárias de

melanoma com mutação em NRAS e concluíram que elas eram particularmente sensíveis ao

inibidor MEK16260. Devido a essa e outras evidências, um ensaio clínico de fase II foi

conduzido utilizando o inibidor de MEK1/2 (MEK 162) e demonstrou que pacientes

metastáticos com NRAS mutado possuíam uma taxa de resposta de 25% e que possuíam

uma sobrevida livre de progressão semelhante àqueles pacientes com melanoma

metastático BRAF mutado61.

1.7.3. KIT

O gene KIT codifica um receptor tirosina-quinase e é composto por cinco domínios

imunoglobulina extracelular, uma região transmembrana, um domínio justamembrana e um

domínio citoplasmático. Esta quinase ativa as vias de sinalização MAPK, PI3K e AKT6.

A amplificação de KIT foi identificada em 8% de melanomas de mucosa e em 7% de

lentiginoso acral. Número de cópias aumentadas deste gene foi encontrado em 6% de

melanomas cutâneos com evidências de danos causados pela exposição crônica ao sol. Além

disso, cerca de 21% de melanomas de mucosa possuem mutações neste gene, enquanto que

em melanoma lentiginoso acral essa frequência é de 11% e 0% em melanomas cutâneos sem

danos causados pela exposição crônica ao sol48.

Os dados do TCGA mostram a importância de mutações, amplificações e rearranjos

complexos do gene KIT naqueles melanomas que são WT para BRAF e RAS49. Em um artigo

do nosso grupo, com parte desta casuística, mostramos que 20,7% de 48 pacientes com

melanoma acral, possuem mutação em KIT, corroborando que este gene é importante na

oncogênese deste subtipo62.

27

Um dos inibidores de KIT testado foi o Sunitinibe, que também possui efeito sob os

receptores do VEGF59. Um estudo conduzido por Minor e colaboradores (2012) verificou a

ação deste inibidor em quatro pacientes com mutação em KIT no éxon 11 (W557G, V559G

ou L576P) demonstrando respostas diferentes ao tratamento. Um deles apresentou uma

remissão completa por quinze meses, um por sete meses, outro por um mês e um

apresentou a progressão da doença63.

Imatinibe é uma pequena molécula ATP-competitiva inibitória da tirosina-quinase

BCR-ABL, KIT, PDGFRA e PDGFRB6. Em 2011, Guo e colaboradores64 administraram 400 mg

de Imatinibe ao dia para 43 pacientes com melanoma metastático com mutações ou

amplificações em KIT. As respostas parciais foram observadas em 10 pacientes (23,3%);

doença estável em 13 pacientes (30,2%) e progressão da doença em 20 pacientes (46,5%). A

média de sobrevida livre de doença para os 43 pacientes foi de 3.5 meses e uma taxa global

de sobrevida em um ano de 51%. A taxa global de controle da doença foi de 53,5%. Este

estudo concluiu que Imatinibe aumentou a taxa global de sobrevida livre de doença, a taxa

de resposta e a sobrevida global em pacientes que apresentam mutações em KIT nos éxons

11 e 13.

Dasatinibe é uma droga alvo responsável pela inibição da família de quinases src e foi

aprovado pela FDA em 2010 para o tratamento de leucemia mielóide crônica59. Um estudo

de fase II selecionou 17 pacientes com melanoma avançado para o tratamento com

Dasatinibe. A taxa de resposta objetiva foi de 5%, com evidências de regressão do tumor

após quatro ciclos de terapia. A média de sobrevida livre de doença foi de oito semanas. Este

estudo revelou que o Dasatinibe teve atividade limitada em pacientes com melanoma

avançado ou inoperável65. No artigo resultado dos dados do TCGA os autores recomendam o

uso de Imatinibe e Dasatinibe para aqueles pacientes com melanoma cutâneo e com

mutação ou amplificação em KIT49.

1.7.4. PDGFRA

O fator de crescimento derivado de plaquetas receptor α (PDGFRA), localizado em

4q12, codifica um receptor transmembrana tirosina-quinase, o PDGFRA. Embora o estado

mutacional de PDGFRA em melanoma não seja intensamente investigado, esse gene é um

candidato potencial para a terapia-alvo baseada em inibidores de tirosina-quinases66.

28

Um estudo do final de 2013 analisou 351 amostras de tecido de melanoma quanto à

presença de mutações no éxon 12, 14 e 18 do gene PDGFRA. Além disso, verificaram a

resposta de linhagens celulares com mutação em PDGFRA a Imatinibe e Crenolanibe. Dai e

colaboradores verificaram que a frequência de mutações deste gene em melanomas é de

4,6% e que são mais comuns nos subtipos lentiginoso acral e de mucosas e concluíram que

pacientes com melanoma com mutações em PDGFRA podem eventualmente se beneficiar

do tratamento com estas duas drogas66.

Os dados do TCGA mostram que as amplificações em PDGFRA ocorrem em

concomitância com amplificações em KIT naqueles pacientes WT (wild type) para BRAF e

RAS. Um estudo recente mostrou que de 137 pacientes com melanoma cutâneo e 14 com

melanoma de mucosas, apenas 0,7% possuíam mutação em PDGFRA67 e dados do nosso

grupo mostram que 14,8% de 43 pacientes com melanoma acral, possuem mutação neste

gene62.

1.7.5. TERT

O gene TERT codifica a subunidade catalítica da telomerase. Mutações somáticas na

região codificante deste gene são infrequentes em tumores humanos. Mas, mutações

somáticas e germinativas na sua região promotora foram recentemente encontradas com

uma alta frequência em melanomas (71%) e em 16% das linhagens celulares primárias de

câncer68.

Simultaneamente a esta publicação, Horn e colaboradores (2013)69 identificaram que

85% dos melanomas metastáticos, 33% de melanomas primários e 74% de linhagens

celulares derivadas de melanoma metastático, possuem mutações na região promotora do

TERT. Posteriormente, Vinagre e colaboradores (2013)70 avaliaram o perfil mutacional desta

região do TERT em alguns tipos de câncer, encontrando a frequência de 43% em cânceres do

sistema nervoso central, 59% de bexiga, 10% de tireóide e 29% de melanomas cutâneos. Nos

três estudos as mutações mais frequentes eram C228T e C250T, sendo estas mutuamente

exclusivas.

Após essas publicações, alguns trabalhos surgiram com o intuito principal de

caracterizar a frequência dessas mutações em diversos subtipos de melanoma e em diversas

29

populações. Foi evidenciado que mutações neste gene são infrequentes em melanomas

sinonasal (8%)71, possui uma frequência que varia entre 671 e 9,3%62 em melanomas acrais e

que mutações germinativas na região promotora deste gene são raras em melanoma

familial72. No TCGA 64,4% dos 115 pacientes possuíam mutações neste gene, sendo que

23,5% eram C228T e 40,9% eram C250T49.

Uma série de estudos demonstrou que estas mutações são fatores prognósticos

independentes em melanomas cutâneos68, 69, 73, 74. Em conjunto, eles podem indicar que a

presença de mutações na região promotora de TERT seja um potencial preditor biológico de

maior mortalidade e também pode representar um preditor de metástases em pacientes

com melanoma cutâneo73.

1.8. Justificativa

Praticamente não existe informação do perfil molecular dos portadores de melanoma

no Brasil e a população brasileira possui uma característica marcante: a heterogeneidade

étnica regional. O Hospital do Câncer de Barretos (HCB) é um dos maiores hospitais de

câncer no Brasil e abriga uma grande coleção de melanomas de pacientes provenientes de

todos os estados brasileiros, na qual nenhuma análise genética foi realizada.

A definição das características moleculares dos pacientes com melanoma no Brasil

poderá nortear pesquisas futuras no país, a fim de melhorar o tratamento dos pacientes.

Além disso, a definição molecular e evolução clínica dos pacientes brasileiros com melanoma

vão permitir comparações objetivas com os resultados obtidos em outros países.

1.9. Objetivo Geral

Caracterizar o perfil clínico e mutacional de genes alvos de pacientes brasileiros

portadores de melanoma

30

1.10. Objetivos Específicos

1. Avaliar a frequência de mutações nos genes BRAF, NRAS, KIT, PDGFRA e TERT;

2. Associar as mutações com parâmetros demográficos, clínicos e

histopatológicos;

3. Associar as mutações com a sobrevida dos pacientes.

1.11. Casuística e Métodos

1.11.1. Delineamento e População de Estudo

O presente estudo trata-se de uma coorte retrospectiva, cuja casuística é

quatrocentos e cinquenta e nove pacientes com melanomas diagnosticados na instituição

entre 2001 e 2012.

1.11.2. Critérios de Inclusão e Exclusão

Material biológico armazenado no departamento de patologia do HCB, bem como ter

sido diagnosticado entre os anos de 2001 e 2012 constituem critérios de inclusão, enquanto

que os de exclusão são material biológico insuficiente ou tratamento antes de 2001 ou

depois de 2012.

2. Métodos

2.1. Extração de DNA

Ao menos uma lâmina corada com hematoxilina e eosina foi revisada por um

patologista em cada amostra para assegurar a presença de ao menos 70% de células

tumorais viáveis para a realização das análises. Para a extração de DNA, foi utilizado 3 cortes

de 10 micra para a macrodissecção da região tumoral.

31

A extração de DNA foi realizada utilizando o kit de extração de DNA (QIAamp DNA

MicroKit - Qiagen), seguindo as instruções do fabricante. De forma geral, o protocolo inclui

desparafinização a 80 °C por vinte minutos, seguido por dois banhos de Xilol, cada um por

cinco minutos, reidratação do tecido tumoral com banhos de etanol em concentrações

crescentes (100, 70 e 50%), cada um por um minuto, e banho em água Milli-Q pelo mesmo

período de tempo.

Em seguida, foi realizada a macrodissecção da área tumoral com agulha hipodérmica

e o tecido tumoral foi incubado overnight à 56 °C e 700 rpm, com 80 µL de ATL, 1 µL de RNA

Carrier e 15 µL de proteinase K. Após, adicionou-se mais 15 µL de proteinase K e incubação

por pelo menos uma hora na mesma temperatura e agitação. Então, houve incubação de 20

minutos, à 98 °C e 600 rpm. Em seguida, adicionou-se 110 µL de tampão AL, 110 µL de

etanol 100% e incubação por 5 minutos. Então, transferiu-se o volume para a coluna e após

2 lavagens com tampões AW1 e AW2, à 14.000 rpm, por 1 minuto, a eluição do DNA foi feita

em 30 µL de água Milli-Q. O DNA foi quantificado no equipamento NanoDrop2000 (Thermo

Scientific).

Já foi relatado que a melanina é um inibidor da PCR (Reação em Cadeia da

Polimerase), por reduzir a capacidade da polimerase em sintetizar DNA ou por diminuir o

tempo de interação entre a enzima e o DNA molde75. Então, para ultrapassar esta

dificuldade testamos sete protocolos para chegarmos naquele cuja qualidade de DNA fosse

melhor e cuja técnica fosse mais viável (Anexo 1).

Desta forma, o protocolo final e que nos deu o melhor resultado para a purificação da

melanina foi utilizar o OneStep PCR Inhibitor Removal Kit (Zymo Research), que inclui

remover a tampa, quebrar a base da coluna e adicionar 400 µL de água Milli-Q caso a mesma

esteja seca. Em seguida, acoplá-la a um tubo coletor e centrifugar à 8.000g por 3 minutos.

Por fim, colocar a coluna em um tubo 1,5 mL devidamente identificado, transferir o DNA

para a coluna e centrifugar na mesma rotação e tempo.

2.2. Análise Mutacional dos Genes Alvos

Para a análise de mutações nos éxons hotspots dos genes BRAF (éxon 15), NRAS (códon

12, 13 e 61), KIT (éxon 9, 11, 13, 17), PDGFRA (éxon 12, 14, 18) e região promotora do TERT

foi utilizado o sequenciamento de Sanger. O primeiro passo consistiu em amplificar as

32

regiões de interesse utilizando a técnica de PCR, cujas sequências de primers, tamanhos dos

fragmentos e temperatura de annealing estão descritas na Tabela 6.

A reação de PCR foi realizada com um volume final de 15 µL, sob as seguintes condições:

1,5 µL tampão (Qiagen); 2 mM MgCl2 (Qiagen); 200 µM dNTPs (Invitrogen); 0,3 mM de

primer, sense e anti-sense (Sigma Aldrich), 0,5 unidade de Platinum Taq DNA polimerase

(Qiagen) e 50 ng de DNA. A ciclagem da reação consistiu em 15 minutos à 96 °C, 45 segundos

à 96 °C, annealing de 45 segundos e temperatura variável de acordo com o primer, extensão

por 45 segundos à 72 °C e extensão final por 10 minutos na mesma temperatura, sendo que

a reação foi repetida por 45 vezes. Para a análise da PCR foi realizada eletroforese em gel de

agarose 1,5% por 40 minutos à 100 Volts.

Então, 5 µL do produto da PCR foi purificado com 2 µL ExoSap-IT (GE Techonology) por

15 minutos à 37 °C e 80 °C pelo mesmo período de tempo. Para a reação de sequenciamento

foi utilizado 0,3 µL de BigDye (Applied Biosystems), 2,0 µL de tampão para sequenciamento

(Applied Biosystems, USA) e 1 µL de primer (3,2 µM). A ciclagem da reação consistiu em 10

segundos à 96 °C, 5 segundos à 50 °C e 60 °C por 4 minutos, 30 vezes.

A reação de sequenciamento foi purificada com 25 µL de EDTA (125 mM), 1µL de etanol

100% e 1 µL de citrato de sódio (3 M). Então, houve agitação por 2 minutos, seguido de 15

minutos de incubação e centrifugação por 45 minutos à 2.000g. Após, a placa foi invertida

para descartar os reagentes não consumidos, então adicionou-se 35 µL de etanol 70%,

centrifugação por 15 minutos à 1.650g e, após nova inversão, incubou-se a placa por 30

minutos em temperatura ambiente. Em seguida, a reação foi ressuspendida em formamida

HiDi (Applied Biosystems). O sequenciamento foi realizado no equipamento 3500 series

Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Todas as mutações foram confirmadas por duas

reações independentes.

33

2.3. Associação dos Dados Moleculares com os Fatores Demográficos, Clínicos e

Histopatológicos dos Pacientes

A partir dos registros hospitalares dos pacientes foram levantados os dados

demográficos (data de nascimento, gênero, cor e local de nascimento), data do tumor

primário e suas características (localização, subtipo histopatológico, índice de Breslow, Clark,

ulceração e índice mitótico), presença ou ausência de metástases linfonodais regionais e

características de metástases distantes (localização e DHL sérica).

O tempo livre de progressão e a sobrevida específica por melanoma foram

calculados, sendo os pacientes categorizados de acordo com critérios diagnósticos validados

(classificação TNM). A sobrevida global e a sobrevida livre de doença foram calculadas da

data do diagnóstico do tumor primário, da metástase regional e da metástase distante até o

último evento (avaliação ou óbito). Estes dados foram associados com os eventos

moleculares.

Gene Sequência do Primer Tamanho do Fragamento Temperatura de Annealing

Forward- 5'-AGTGGATTCGCGGGCACAGA-3'

Reverse- 5'-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3'

Forward- 5'-ATGACTGAGTACAAACTGGT-3'

Reverse- 5'-CTCTATGGTGGGATCATATT-3'

Forward- 5'-TCTTACAGAAAACAAGTGGT-3'

Reverse- 5'-GTAGAGGTTAATATCCGCAA-3'

Forward- 5'-AGAGTAAGCCAGGGCTTTTG-3'

Reverse- 5'-AGACAGAGCCTAAACATCC-3'

Forward- 5'-CCAGAGTGCTCTAATGACTG-3'

Reverse- 5'-GGAGTTCCTTAAAGTCACTG-3'

Forward- 5'-CATGCGCTTGACATCAGTTT-3'

Reverse- 5'-TGACAGACAATAAAAGGCAGCTT-3'

Forward- 5'-GGTTTTCTTTTCTCCTCCAACC-3'

Reverse- 5'-GGATTTACATTATGAAAATCACAGG-3'

Forward- 5'-TCCAGTCACTGTGCTGCTTC-3'

Reverse- 5'-GCAAGGGAAAAGGGAGTCTT-3'

Forward- 5'-TGGTAGCTCAGCTGGACTGAT-3'

Reverse- 5'-GGGATGGAGAGTGGAGGATT-3'

Forward- 5'-ACCATGGATCAGCCAGTCTT-3'

Reverse- 5'-TGAAGGAGGATGAGCCTGACC-3'

Forward- 5'-AGTGGATTCGCGGGCACAGA-3'

Reverse- 5'-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3'TERT 235 bp 64°C

PDGFRA – exon14

PDGFRA – exon18

260 bp

245 bp

251 bp

58°C

58°C

58°C

56,5°C

58°C

58°C

58°C

58°C

PDGFRA – exon12

NRAS - códon 61

KIT – exon 9

KIT – exon 11

KIT – exon 13

KIT – exon 17

174 bp

272 bp

266 bp

212 bp

249 bp

BRAF - exon 15

NRAS - códon 12/13

254 bp 55,5°C

111 bp 56,5°C

Tabela 6 - Informações da PCR para os genes alvos.

34

2.4. Análise Estatística

Para identificar associações entre as características demográficas, clínicas,

histopatológicas e moleculares, o teste exato de Fisher ou qui-quadrado foram utilizados.

Associações das variáveis à sobrevida livre de doença e global foram avaliadas através de

construção de curvas de sobrevida estimadas com o método de Kaplan Meier e com o teste

de log-rank para avaliar as diferenças entre as curvas. Pacientes portadores de melanoma in

situ foram excluídos das análises de sobrevivência e para esta análise o paciente foi

considerado mutado para o gene quando pelo menos uma região ou sítio possuía alteração.

Análises multivariadas foram realizadas com o método de regressão de Cox para variáveis

que foram significantes na análise univariada ou consideradas de ajuste no modelo

multivariado.

2.5. Questões Éticas

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do HCB 548/2011 (Anexo 2). Por se

tratar de um estudo observacional, do ponto de vista ético é um projeto de baixo risco,

sendo os únicos riscos aos participantes a quebra acidental do sigilo das informações. Para

que isso não ocorresse, a equipe de pesquisa envolvida no estudo tomou todos os cuidados

para não expor as informações dos pacientes. Nenhum membro da equipe tinha ou tem

conflito de interesse quanto a realização da pesquisa.

3. Resultados

No presente estudo, não houve diferença na distribuição entre os gêneros, a maioria dos

pacientes se autodenominou da cor branca (96,5%), residente no ambiente urbano (89,2%) e

possuía idade média de 58 anos (Tabela 7). A localização tumoral mais frequente foi nos

membros (50%) e o subtipo mais predominante na casuística foi o nodular (38,9%), seguido

de disseminativo superficial (34,4%) e acrolentiginoso (21,1%).

35

A maioria dos pacientes possuía estadiamento TNM II ou III e as informações clínicas

mais relevantes, como nível de Clark, Breslow, ulceração e índice mitótico, demonstraram

que a maioria dos pacientes possuía prognóstico desfavorável.

A Figura 12 mostra um exemplo de mutações encontradas em nossa casuística, bem

como o padrão considerado mutado em nosso trabalho. Do total de pacientes, 308 casos

tiveram o gene BRAF sequenciado com êxito (67,1% do total de casos considerados), 290

NRAS (63,1%), 213 TERT (46,4%), 145 KIT (31,6%) e 139 (30,2%) o PDGFRA. O éxon 15 do

gene BRAF encontra-se mutado em aproximadamente 34,1% das amostras e mais da

metade das metástases, bem como das recorrências, apresentam alterações neste gene. Os

hotspots do gene NRAS (códon 12/13 e 61) encontram-se mutados em cerca de 8% das

amostras, sendo que 11% das metástases linfonodais possuem mutações nesse gene. O gene

TERT possui mutações em aproximadamente 34% das amostras, sendo que mais de 50% das

metástases apresentam alterações neste gene. E o gene KIT encontra-se mutado em cerca

de 6% das amostras, enquanto que o PDGFRA possui alterações em aproximadamente 3%

(Tabela 8).

36

Idade (média/DP) 58,3 (16,0) Clark n (%)

I 9 (2,5)

Gênero n (%) II 19 (5,3)

Masculino 242 (52,7) III 84 (23,3)

Feminino 217 (47,3) IV 157 (43,5)

V 92 (23,5)

Cor da Pele n (%)

Branca 438 (96,5) Breslow n (%)

Negra 16 (3,5) até 1 mm 53 (14,4)

1.0 a 2.0 mm 88 (23,9)

Ambiente de Moradia n (%) 2.1 a 4.0 mm 85 (23,1)

Rural 38 (10,8) > 4 mm 142 (38,6)

Urbana 313 (89,2)

Ulceração n (%)

Localização Anatômica n (%) Presente 158 (61,5)

Membros 215 (50,0) Ausente 99 (38,5)

Tronco 123 (28,6)

Cabeça e pescoço 86 (20,0) Índice Mitótico (mm2) - n (%)

Mucosas 6 (1,4) 0 10 (4,1)

1 46 (18,8)

Tipo Histológico n (%) >1 189 (77,1)

Acrolentiginoso 71 (21,1)

Nodular 131 (38,9) Estadio TNM n (%)

Disseminativo Superficial 116 (34,4) in situ 14 (3,1)

Lentigo Maligno 7 (2,1) I 73 (16,3)

Melanoma de Mucosa 10 (3,0) II 147 (32,9)

Ocular 2 (0,5) III 133 (29,8)

IV 80 (17,9)

Tabela 7 - Características demográficas, clínicas e histopatológicas patológicas dos 459 portadores de melanoma do Hospital de Câncer de Barretos.

37

.

Sítios

BRAF NRAS TERT KIT PDGFRA

Primário 28/127 (22,0%) 11/162 (6,8%) 29/118 (24,6%) 8/78 (10,3%) 4/73 (5,5%)

Metástase linfonodal 19/55 (34,5%) 7/66 (10,6%) 24/47 (51,1%) 0/29 (0%) 0/28 (0%)

Metástase à distância 26/51 (51,0%) 5/53 (9,4%) 18/39 (46,2%) 1/29 (3,4%) 0/29 (0%)

Recorrência 5/9 (55,5%) 0/9 (0%) 2/9 (22,2%) 0/9(0%) 0/9 (0%)

Sem informação 27/66 (40.9%) - - - -

Total 105/308 (34,1%) 23/290 (7,9%) 73/213 (34,3%) 9/145 (6,2%) 4/139 (2,9%)

Genes

Tabela 8 - Perfil molecular dos portadores de melanoma do HCB de acordo com o desenvolvimento da doença.

Figura 8 - Exemplos das mutações encontradas em nossa casuística.

38

A Tabela 9 descreve todas as mutações encontradas nos genes analisados. Em nossa

casuística a alteração mais comum em BRAF foi a V600E (Gráfico 1 ), o códon 61 abrange

81% de todas as alterações no gene NRAS (Gráfico 2), enquanto que aproximadamente 80%

das alterações na região promotora de TERT são C250T (Gráfico 3). Além disso, em torno de

45% das mutações em KIT ocorreram no éxon 11 (Gráfico 4 ) e 60% das alterações em

PDGFRA no éxon 12 (Gráfico 5

Tipo de Mutação n(%) Tipo de Mutação n(%)

BRAF KIT

V600E 87(89,7) Asp816Val 1(11,1)

V600K 8(8,3) Glu562Lys 1(11,1)

V600M 1(1,0) Glu635Lys 1(11,1)

T599I 1(1,0) Leu576Pro 1(11,1)

NRAS Lys642Glu 2(22,3)

G12A 1(4,8) Pro467Leu 1(11,1)

G12C 1(4,8) Pro551Leu 1(11,1)

G13A 2(9,5) Val559Ala 1(11,1)

Q61H 1(4,8)

Q61K 2(9,5)

Q61L 7(33,3) PDGFRA

Q61R 7(33,3) Arg590Lys 2(40,0)

TERT Val658Ile 1(20,0)

C228T 15(20,8) GIn828* 1(20,0)

C250T 57(79,2) Pro581Leu 1(20,0)

Tabela 9 - Tipos de mutações encontradas nos 459 pacientes do HCB de acordo com os genes alvos.

39

Gráfico 1 - Frequências das alterações encontradas no éxon 15 do gene BRAF.

Gráfico 2 - Frequências das alterações encontradas no gene NRAS.

Gráfico 3 - Frequências das alterações encontradas na região promotora do gene TERT.

Gráfico 4 - Frequências das alterações encontradas no gene KIT.

Gráfico 1 - Frequências das alterações encontradas no gene PDGFRA.

40

A Tabela 10 mostra a distribuição do tipo de amostra (tumor primário/metastático

linfonodal ou órgão distante) ente os pacientes. Um paciente que possuía amostra de tumor

primário, metástase linfonodal e à distância tinha o gene selvagem para BRAF, NRAS e TERT

nas três amostras e WT para KIT na doença linfonodal e metastática. Além disso, outro

paciente com estas três amostras possuía mutação V600E na doença linfonodal e ela se

manteve na metástase à distância, enquanto ele era WT para NRAS na metástase linfonodal

e à distância e WT para TERT nos três níveis da doença (Figura 13).

Um paciente adquiriu a mutação V600E na transição de doença linfonodal para

metastática, enquanto que outro adquiriu essa mesma mutação na transição de doença

primária para a linfonodal. Um paciente adquiriu mutação em NRAS na transição ente tumor

primário e linfonodal. Ao todo quatro pacientes tiveram discordância em relação ao status

mutacional de um gene no tumor primário em relação à doença linfonodal, sendo estes

NRAS, TERT e dois pacientes com discordância em KIT (Figura 13).

Em nossa casuística mutações em BRAF foram mutuamente exclusivas com mutações

em NRAS, ao passo que mutações em TERT ocorrem com uma frequência maior em conjunto

com mutações em BRAF, quando comparadas a NRAS. E mutações em KIT e PDGFRA estão

presentes em uma pequena fração de pacientes com melanoma (Figura 14).

41

Figura 9 - Padrão de mutação nos pacientes durante a evolução tumoral.

Sítio n(%)

Somente primário 143(40.8)

Somente metástase linfonodal 51 (14.5)

Somente metástase à distância 45 (12.9)

Somente Recorrência 8 (2.3)

Primário e metástase linfonodal 19 (5.4)

Primário e metástase à distância 12 (3.4)

Primário e recorrência 1 (0.3)

Metástase linfonodal e à distância 2 (0.6)

Primário, metástase linfonodal e à distância 3 (0.9)

Sem informação 66 (18.9)

Total 350 (100)

Pri

már

io

Lin

fon

od

o

Me

tást

ase

Pri

már

io

Lin

fon

od

o

Me

tást

ase

Pri

már

io

Lin

fon

od

o

Me

tást

ase

Pri

már

io

Lin

fon

od

o

Me

tást

ase

Pri

már

io

Lin

fon

od

o

Me

tást

ase

BRAF V600E V600E V600E V600E

NRAS G12A

TERT

KIT

PDGFRA

P1 P2 P3 P4 P5

Gene

Paciente

Lesão

Pri

már

io

Lin

fon

od

o

Me

tást

ase

Pri

már

io

Lin

fon

od

o

Me

tást

ase

Pri

már

io

Lin

fon

od

o

Me

tást

ase

Pri

már

io

Lin

fon

od

o

Me

tást

ase

BRAF

NRAS Q61H

TERT C250T

KIT Q635K Q562K

PDGFRA

P4P1 P2 P3

Gene

Paciente

Lesão

Não avaliado

WT

Mutado

Legenda

Tabela 10 - Distribuição dos sítios analisados nos pacientes incluídos no estudo.

42

BRAF

NRAS

TERT

KIT

PD

GFR

A

Lege

nd

a

Figu

ra 1

0 -

Dis

trib

uiç

ão d

as m

uta

ções

no

s p

acie

nte

s co

m m

elan

om

a in

clu

ído

s n

o e

stu

do

. N

A =

Não

Ava

liad

o.

43

De acordo com a Tabela 11, os pacientes com idade até 50 anos possuem frequência

maior de mutações em BRAF (p= 0,014), assim como em TERT (p= 0,006), ao passo que

mutações em PDGFRA ocorrem com maior frequência naqueles pacientes com cor da pele

negra (p= 0,023). Entre os principais parâmetros clínicos e histopatológico tradicionalmente

relacionados ao prognóstico, nota-se pela Tabela 12 que as mutações em BRAF e TERT estão

associadas a diferentes localizações anatômicas, principalmente a região do tronco (p=

0,0001, para ambos) e ao subtipo tumoral disseminativo superficial e nodular,

respectivamente (p= 0,0001, para ambos). Além disso, mutações em TERT estão associadas a

ausência de ulceração (p= 0,037) e valor de DHL menor ou igual 400 U/L.

*Teste exato de Fisher.

Gênero WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

Masculino 79 41 134 14 67 45 70 5 74 1

Feminino 64 28 113 7 58 27 56 4 56 3

Idade (anos)

≤ 50 36 29 82 8 33 33 36 2 37 1

> 50 106 40 164 13 91 39 89 7 92 3

Ambiente de Moradia WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

Rural 5 3 15 1 5 3 4 0 4 0

Urbana 69 35 140 11 47 39 27 4 27 4

Cor da pele WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

Branca 131 67 234 18 114 69 117 8 122 2

Negra 10 2 11 3 10 2 8 1 7 2

p= 0,344* p= 0,088* p= 0,217* p= 0,476* p= 0,023*

p= 0,014 p= 0,658* p= 0,006 p= 1,000* p= 0,872*

p= 1,000* p= 1,000* p= 0,728* p= 1,000* p= 1,000*

BRAF NRAS TERT KIT PDGFRA

p= 0,658 p=0,272 p= 0,236 p=1,000* p= 0,205*

Tabela 11 - Associação entre os dados demográficos dos 459 pacientes do HCB incluídos no estudo e as mutações nos genes alvos.

44

Breslow WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

até 1mm 7 5 21 0 11 4 8 0 8 0

1.1 a 2.0 mm 24 10 40 2 20 13 21 1 21 1

2.1 a 4,0 mm 27 20 47 6 26 16 23 5 25 3

>4 50 19 80 9 47 19 45 3 48 0

Índice mitótico (mm2) WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0

até 1 17 7 28 1 17 12 14 2 16 0

>1 80 34 108 7 75 25 75 7 79 3

Localização Anatômica WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

Membros 84 26 125 11 78 23 66 8 70 4

Tronco 19 29 59 6 18 28 26 0 26 0

Cabeça e pescoço 22 8 38 2 15 13 17 1 18 0

Mucosas 5 0 5 0 5 1 5 0 4 0

Tipo Histológico WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

Acrolentiginoso 50 8 53 7 53 6 45 7 48 4

Nodular 31 22 63 6 21 23 18 1 19 0

Disseminativo Superficial 24 23 53 3 26 19 33 1 34 0

Lentigo Maligno 1 0 2 0 0 1 0 0 0 0

Melanoma de Mucosa 8 0 8 0 9 0 9 0 8 0

Ocular 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0

Ulceração WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

Presente 58 20 84 8 49 19 45 6 48 3

Ausente 22 16 44 2 20 19 16 2 17 1

Estadio TNM WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

in situ 0 0 2 0 0 1 0 0 0 0

I 13 8 30 0 13 10 13 0 12 1

II 49 18 82 7 49 19 47 4 49 1

III 52 29 77 10 43 25 41 4 43 2

IV 26 14 50 4 18 15 22 1 23 0

Clark WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

I 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0

II 3 1 5 0 2 1 1 0 1 0

III 19 11 42 1 16 14 17 0 16 1

IV 40 29 82 11 46 22 41 4 42 3

V 42 13 54 5 33 15 34 5 39 0

DHL

≤400 47 20 61 8 52 18 61 6 65 1

>400 35 11 43 3 37 9 43 1 41 3

p= 0,072 p=0,496* p= 0,037 p=1,000* p=1,000*

p= 0,114* p=0,356* p= 0,593* p=0,484* p=0,339*

p= 0,627 p=0,361* p= 0,214* p=0,848* p=0,437*

p= 0,0001* p=0,710* p= 0,0001* p=0,381* p= 0,356*

p=0,303* p= 0,531*

p= 1,000* p= 0,511* p= 0,143* p=0,671* p= 1,000*

BRAF

p= 0,327*

NRAS

p= 0,347*

TERT

p= 0,0001* p= 0,840* p= 0,0001*

p= 0,090 p= 0,440* p= 0,001 p= 0,309* p= 0,307

KIT

p= 0,310*

PDGFRA

p= 0,088*p= 0,603

*Teste exato de Fisher.

Tabela 12 - Associação entre os dados clínicos dos 459 pacientes do HCB incluídos no estudo e as mutações nos genes alvos.

45

A sobrevida específica por câncer pode ser estimada em 459 pacientes, com média

de 88,8 meses (DP: 3,8), mediana de 68,2 meses (DP: 10.4) e em 5 anos de 51,1% (Figura 15).

Variáveis clínicas como ulceração (p= 0,101), idade (p= 0,078), índice mitótico (p= 0,542) e

valor de DHL (p= 0,397), não foram associadas a diferentes taxas de sobrevida. No entanto, o

estadiamento TNM (p= 0,001), o gênero (p= 0,0001), a localização anatômica (p= 0,0001), o

subtipo histológico (p= 0,0009), o nível de Clark (p= 0,0001) e espessura de Breslow (p=

0,0001), foram fatores associados a diferentes taxas de sobrevida.

Além disso, pela Tabela 13 nota-se que a presença ou ausência das mutações nos

cinco genes não conferem diferentes taxas de sobrevida por melanoma em cinco anos para

os pacientes. As Tabela 14 e 15 demonstram que também não há diferença na sobrevida

específica por câncer pela associação entre as mutações nos genes alvos com as

características demográficas, clínicas, e histopatológicas, respectivamente.

A análise multivariada demonstrou que o estadiamento TNM IV, a localização

anatômica e o nível de Clark foram associados de forma independente a diferentes taxas de

sobrevida (Tabela 16).

Figura 11 - Sobrevida livre de doença de 459 pacientes com melanoma.

46

Variável molecular Categoria n Sobrevida em 5 anos (%) p

WT 141 42,1

Mutado 69 33,3

WT 245 46,1

Mutado 21 31,6

WT 123 45,3

Mutado 72 39,5

WT 124 38,4

Mutado 9 48,6

WT 128 40,8

Mutado 4 0

0,619

0,587

0,251

0,898

0,553

BRAF

NRAS

TERT

KIT

PDGFRA

nc = não calculado pelo SPSS.

WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

Gênero

Masculino 78 41 133 14 66 45 69 5 73 1

Feminino 63 28 112 7 57 27 55 4 55 3

Idade

≤ 50 35 29 81 8 32 33 35 2 36 1

> 50 105 40 163 13 90 39 88 7 91 3

Ambiente da Moradia

Urbana 68 35 139 11 46 39 26 4 26 4

Rural 5 3 15 1 5 3 4 0 4 0

Cor da pele

Branca 129 67 232 18 112 69 115 8 120 2

Negra 10 2 11 3 10 2 8 1 7 2

p= 0,802 p= 0,544 p= 0,863 p= 0,151 p= 0,141

p= 0,511 p= 0,556 p= 0,400 p= 0,822 p= 0,547

p= 0,502 p= 0,273 p= 0,403 p= nc p= nc

BRAF NRAS TERT KIT PDGFRA

p= 0,686 p= 0,660 p= 0,400 p= 0,929 p= 0,528

Tabela 13 - Sobrevida específica por câncer dos 459 pacientes do HCB de acordo com o status mutacional dos genes alvos.

Tabela 14 - Sobrevida específica por câncer dos 459 pacientes do HCB de acordo com o status mutacional dos genes alvos e características demográficas.

47

WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado WT Mutado

Estadio TNM

I 13 8 30 0 13 10 13 0 12 1

II 47 18 80 7 47 19 45 4 47 1

III 52 29 77 10 43 25 41 4 43 2

IV 26 14 50 4 18 15 22 1 23 0

Breslow

até 1mm 7 5 21 0 11 4 8 0 8 0

1.1 a 2.0 mm 24 10 40 2 20 13 21 1 21 1

2.1 a 4,0 mm 26 20 46 6 25 16 22 5 24 3

>4 49 20 80 9 46 20 45 3 48 0

Tipo Histológico

Acrolentiginoso 48 8 51 7 51 6 43 7 46 4

Nodular 31 22 63 6 21 23 18 1 19 0

Disseminativo superficial 24 23 53 3 29 19 33 1 34 0

Melanoma lentigo maligno 1 0 2 0 0 1 0 0 0 0

Ocular 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0

Melanoma de mucosa 8 0 8 0 9 0 9 0 8 0

Clark

I 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0

II 3 1 5 0 2 1 1 0 1 0

III 18 11 41 1 14 14 16 0 15 1

IV 39 29 81 11 45 22 40 4 41 3

V 42 13 54 5 33 15 34 5 39 0

Ulceração

Presente 57 20 83 8 48 19 44 6 47 3

Ausente 21 16 43 2 19 19 15 2 16 1

Localização Anatômica

Membros 82 26 123 11 76 23 64 8 68 4

Tronco 19 29 59 6 18 28 26 0 26 0

Cabeça e pescoço 22 8 38 2 15 13 17 1 18 0

Mucosas 5 0 5 0 5 1 5 0 4 0

p= 0,922 p= nc p= 0,148 p= nc p= nc

p= 0,258 p= nc p= 0,222 p= nc p=nc

BRAF NRAS TERT KIT PDGFRA

p= nc p= nc p= nc p= nc p= nc

p= nc p= nc p= nc p= nc p= nc

p= 0,863 p= 0,056 p= 0,433 p= 0,702 p= 0,540

p= nc p= nc p= 0,276 p= nc p= nc

nc = não calculado pelo SPSS.

Tabela 15 - Sobrevida específica por câncer dos 459 pacientes do HCB de acordo com o status mutacional dos genes alvos e características clínicas.

48

Variável n HR 95% IC (HR) p-valor

Estadio TNM

I 65 0,116 0,055-0,245 < 0,001

II 109 0,181 0,105-0,310 < 0,001

III 97 0,333 0,201-0,553 < 0,001

IV 30 1,000 - -

Localização Anatômica

Membros 153 0,183 0,043-0,777 0,021

Tronco 98 0,255 0,060-1,091 0,065

Cabeça e Pescoço 48 0,344 0,078-1,507 0,157

Mucosas 2 1,000 - -

Clark

I 1 0,708 0,094-5,327 0,737

II 17 0,213 0,047-0,959 0,044

III 73 0,792 0,472-1,327 0,376

IV 135 1,000 - -

V 75 0,640 0,419-0,979 0,040

Idade 1,004 0,992-1,017 0,474

Tabela 16 - Análise multivariada de sobrevida específica por melanoma dos 459 pacientes do HCB.

49

4. Discussão

4.1. Caracterização demográfica, clínica e histopatológica dos pacientes e amostras

Os pacientes incluídos neste estudo fazem parte de um trabalho maior, cujo objetivo

principal se centrou em observar as características dos melanomas e seus fatores

prognósticos, em uma população pouco estudada anteriormente, no sentido de contribuir

com um esforço comum de caracterizar este tipo tumoral. Neste foram incluídos cerca de

mil pacientes de origem única hospitalar – Hospital de Câncer de Barretos, com parte deles

incluída nesta casuística16.

A média de idade dos pacientes incluídos neste estudo foi de aproximadamente 58 anos

e não houve diferença na distribuição da doença, de acordo com o gênero. A média de idade

encontrada em outros estudos foi similar14, 76-78, no entanto, apesar do nosso modelo

multivariado não demonstrar o gênero como fator prognóstico independente, outros

estudos demonstraram resultados apostos16, 77, 79.

Nossa casuística é predominantemente caucasiana (96,5%) e como encontrado

anteriormente nesta população, observamos uma prevalência do subtipo histológico

disseminativo superficial, seguido de melanoma nodular, no entanto, encontramos uma

frequência considerável do subtipo acrolentiginoso (21,1%), o que não é observado em

outros estudos78, 79. Este subtipo é mais comum em populações negras, com frequência em

torno de 30%80, 81, enquanto que em populações caucasianas, já foi relatado frequências em

torno de 10%78.

Um estudo realizado em 2008 com 354 pacientes com melanoma da população

brasileira, demonstrou uma frequência de 22,3% do subtipo acrolentiginoso82, sendo esta

similar ao encontrado no presente estudo. Já em um estudo mais extensivo já publicado

pelo nosso grupo de pesquisa, que incluiu cerca de mil pacientes, com parte deles incluída

nesta casuística, a porcentagem de subtipo acrolentiginoso foi de acordo com o esperado na

prevalência de populações caucasianas, cerca de 7%16. Portanto, a diferença encontrada na

frequência deste subtipo, provavelmente está associada ao tamanho amostral.

Em nosso estudo demonstramos que localização anatômica é um fator prognóstico

independente, como já descrito anteriormente83. Dados de uma meta-análise que abrangeu

vários continentes e localizações geográficas, demonstrou a possibilidade de existir

50

diferentes caminhos etiológicos de desenvolvimento do melanoma por localização

anatômica, isto em virtude das diferenças de risco observadas para o desenvolvimento da

doença em nevos e por padrões de exposição ao sol84. Foi demonstrado em outros estudos

uma predominância de extremidades (27,3%), seguido da região da cabeça e pescoço

(25,7%) e tronco (23,1%)40, 78, 76, entretanto, na população brasileira foi demonstrado pelo

nosso grupo16, assim como em outros estudos, a predominância da região dos membros,

seguido do tronco e região da cabeça e pescoço14, 77 e este trabalho vai de encontro aos já

publicados em nossa população.

O nível de Clark possui cinco estágios que medem a extensão do melanoma e,

segundo a AJCC, não é um critério prognóstico obrigatório, visto que quando se considera o

índice mitótico, ele não é um fator prognóstico independente. No entanto, ele ainda é

importante para aqueles melanomas finos83. No presente trabalho, quase 70% dos pacientes

possuíam nível de Clark entre IV e V, sendo que esta frequência alta também foi observada

no outro trabalho publicado pelo nosso grupo16, e o que vai de encontro com um estudo que

incluiu 430 pacientes brasileiros com melanoma e mostrou que a maioria deles possuía

predominantemente estes mesmos níveis14. Além disso, um outro estudo que incluiu 198

pacientes desta mesma população também demonstrou que 60% dos pacientes possuíam

níveis mais avançados de Clark77. Quando se observa outras populações, não parece haver

diferença neste padrão78.

O índice de Breslow mede a profundidade de invasão das células neoplásicas no tecido

epitelial, é considerado o principal fator prognóstico nos melanomas localizados14 com

relato que este índice está associado a recorrência e capacidade metastática do tumor83. Em

nossa casuística 38,6% dos pacientes possuíam Breslow acima de 4mm e esta variável está

associada a menores índices de sobrevida (p= 0,0001). No entanto, não apareceu como fator

prognóstico independente em nosso modelo multivariado, como já amplamente

conhecido83. Isso se deve ao Breslow fazer parte do componente T do estadiamento, que faz

parte da variável testada como estadio clínico.

Na literatura internacional, a espessura de Breslow menor do que 2mm é encontrado na

grande maioria dos trabalhos76, 78, 85, 86. Moreno e colaboradores, em 2012, encontraram em

462 pacientes brasileiros com melanoma uma maior frequência de índice de Breslow menor

do que 1 mm (45%)14, enquanto que um outro estudo com 199 pacientes demonstrou uma

frequência de mais de 70% dos pacientes com Breslow maior do que 1mm77. O primeiro

51

estudo foi conduzido na região sul do país, onde o índice de desenvolvimento humano

municipal é maior, quando comparado a região nordeste, alvo do segundo estudo87. Isto

pode significar maior acesso a saúde pública na primeira região, o que justificaria seu

achado.

Uma característica do nosso centro é ser altamente especializado no tratamento

oncológico e público, o que favorece o encaminhamento de pacientes com doença avançada

para tratamento de alta complexidade, o que pode explicar tanto a espessura média de

Breslow ser mais alta que a literatura internacional, bem como estádio TNM avançado, tal

como observado por nosso grupo e também no trabalho conduzido em uma região com

baixo índice de desenvolvimento humano municipal do nosso país16, 77.

A ulceração é uma perda do epitélio no local do tumor, enquanto que o índice mitótico é

a mensuração da taxa de proliferação do tumor primário, ambos importantes fatores

prognósticos de melanoma, segundo a AJCC83. Em nossa casuística mais de 60% dos

pacientes apresentaram ulceração tumoral, enquanto que 70% destes apresentaram índice

mitótico maior do que um, o que esta associado, portanto, a menor sobrevida dos pacientes.

Nossos resultados são semelhantes com os encontrados em outros trabalhos conduzidos na

população brasileira14, 77, inclusive com o trabalho publicado pelo nosso grupo16. Além disso,

esta característica tumoral se manteve em estudos com outras populações78, 88.

Antes de mais nada, é importante frisar que um estudo retrospectivo sempre enfrenta

dificuldades em obter informações e material de qualidade. Esta é a maior explicação do

total de pacientes incluídos serem mais de 450 e apenas uma fração deste universo

apresentar dados clínicos e histopatológicos completos como amostra adequada e de

qualidade para análise de todos os genes de interesse.

4.2. Características moleculares e suas associações com as demais variáveis estudadas

e a sobrevida

O gene BRAF é o que possui papel mais importante na tumorigênese do melanoma,

sendo que a primeira terapia-alvo aprovada pelo FDA destinada a esta câncer é contra a sua

alteração mais frequente e que acontece neste gene, a mutação V600E53. No presente

trabalho a frequência de mutações em BRAF foi de aproximadamente 34%, sendo a mutação

V600E a mais comum, representando quase 90% das alterações. Muitos estudos visam

52

analisar a frequência deste genótipo mutante em BRAF em diversas populações, no entanto,

variações são comumente encontradas. Um estudo conduzido por Mazurenko e

colaboradores em 2015, mostrou que 55% dos 137 pacientes com melanoma possuíam

mutações em BRAF67, além disso, os dados do estudo do TCGA mostraram que 52% dos 331

pacientes, possuíam mutações neste gene49.

Estes estudos encontraram frequências maiores de mutações em BRAF, quando

comparado com o nosso estudo. Especificamente no caso do TCGA, provavelmente isto seja

em virtude da grande maioria das amostras ser metastática, sabidamente com frequências

maiores de mutações neste gene49, além disso, não foram incluídas amostras do subtipo

lentiginoso acral, visto que sabe-se que ele possui característica genética diferente dos

demais, com frequências menores de mutações em BRAF62.

Um estudo realizado na população japonesa mostrou que mutações neste gene ocorrem

em 30,4% dos 171 pacientes89, sendo esta frequência a mais próxima do nosso estudo,

embora nossa casuística seja maior. Ao observar a população deste estudo, nota-se que o

subtipo acrolentiginoso também possui uma representatividade importante, ao mesmo

tempo em que as amostras primárias representam a maioria da casuística, assim como no

presente trabalho, o que poderia explicar as frequências similares. Embora existam

diferenças nas frequências das mutações quando compara-se os trabalhos, em todos eles a

mutação V600E é mais frequente, seguida de mutações V600K49, 67, 89.

Muitos trabalhos mostram a predominância de mutações em BRAF em pacientes

jovens49, 89 e neste estudo encontramos associação entre pacientes até 50 anos e alterações

neste gene. Além disso, encontramos associação entre mutações em BRAF e localização

anatômica no tronco e ao subtipo disseminativo superficial. Um estudo que analisou 66

pacientes com tumores primários, encontrou associação entre mutações neste gene e

localização tumoral no tronco, no entanto, também demonstrou associação entre mutações

neste gene e melanomas finos e ausência de ulceração90, o que não foi observado no

presente estudo. Thomas e colaboradores em 2015 mostraram que em 812 tumores

primários de melanoma, as mutações em BRAF estavam associadas ao subtipo disseminativo

superficial e nodular, e também demonstraram associações desta mutação com índice

mitótico91, o que não foi observado em nosso estudo.

Estes dois artigos demonstraram que mutações em BRAF não estão associadas a

sobrevida específica por câncer90, 91 e este trabalho vai de encontro a estes achados. Quando

53

se analisa esses parâmetros em populações metastáticas, há evidência de que mutações em

BRAF também estão associadas aos subtipos histopatológicos disseminativo superficial e

nodular, bem como a localização no tronco92.

Em nosso estudo aproximadamente 8% das amostras possuíam mutações em NRAS,

entretanto, não encontramos associações entre mutações neste gene e características

clínicas e de sobrevida dos pacientes. Quando observamos os trabalhos que analisaram

tumores primários ou que estes eram mais predominantes na casuística, como em nosso

estudo, nota-se que a frequência de mutações em NRAS está entre 10,6%67 e 14%90, sendo

que o trabalho com maior casuística observou a frequência de 13% em 912 pacientes91. Ao

passo que Carlino e colaboradores, em 2014, encontraram uma alta frequência de mutações

em NRAS, sendo 32% dos 193 pacientes com metástase a distância93, assim como na

população analisada pelo TCGA, a frequência de mutações neste gente também foi alta,

aproximadamente 28% dos 331 pacientes analisados49. A diferença de frequências de

mutações observadas nos estudos em pacientes com tumor primário e metastáticos, pode

ser justificada pelo melanoma ser uma doença que se desenvolve pelo acúmulo de

mutações, logo, espera-se que tumores primários possuam frequências menores destas

alterações, quando comparado com tumores avançados5. Além disso, este trabalho

corrobora com outros que demonstraram que mutações em BRAF e NRAS são mutuamente

exclusivas e que o códon 61 é a localização mais frequentemente mutada neste gene.

Assim como no presente trabalho, outros não demonstraram associações entre

mutações em NRAS e características clínicas e de sobrevida89, 94, entretanto, Thomas e

colaboradores, em 2015, encontraram associação entre mutações neste gene e tumor

localizado nas extremidades, bem como presença de mitoses, mas não encontraram

associações com a sobrevida dos pacientes91, ao passo que Egberts e colaboradores, em

2016, encontraram relação entre mutações em NRAS e pacientes mais velhos, melanomas

mais profundos e sobrevida livre de metástase à distância90.

A importância de mutações na região promotora do gene TERT na tumorigênese de

melanoma foi recentemente descoberta68, 69 e este parece ser importante em estágios

iniciais da doença em tumores que se desenvolvem a partir de lesões precursoras5. Em

virtude de ser uma descoberta recente, ainda não há uma vasta gama de artigos que

analisou a frequência destas mutações em melanomas.

54

Apesar das variações de frequência entre os estudos, em comum encontra-se o fato de

que esta é elevada. O TCGA encontrou que 64,4%49 dos pacientes possuíam mutações na

região promotora deste gene, assim como Egberts e colaboradores, em 2016, mostraram

frequência de 47,3% em 96 pacientes e a análise de 362 melanomas mostrou uma

frequência de mutações de 43%95. Em nossa casuística, a frequência de mutações foi de

34,4%, que apesar de alta é bastante inferior aos demais estudos. Este achado pode ser

justificado por Liau e colaboradores, em 2014, demonstrarem que mutações nesta região do

gene TERT serem incomuns em melanomas acrolentiginoso (6%)96 e nossa casuística possuir

uma representatividade importante deste subtipo de melanoma. Na literatura, a mutação

mais frequente encontrada em TERT é a C250T e as duas mutações são mutuamente

exclusivas, bem como ocorrem em concomitância com mutações em BRAF49, 90,

características estas também encontradas neste estudo.

No presente trabalho encontramos associação entre mutações neste gene e idade

inferior a 50 anos, bem como associação com tumores localizados no tronco, ao passo que

foi demonstrado esta associação em pacientes mais velhos e tumores localizados na região

da cabeça e pescoço e extremidades90. Além disso, foi demonstrado a associação entre

estas mutações e melanoma nodular e disseminativo superficial95, bem como com doença

mais profunda90, 95, 97, no entanto, no presente estudo foi demonstrado somente associação

com o subtipo nodular.Um trabalho conduzido por Macerolla e colaboradores, em 2015, não

demonstrou relação entre as mutações e presença de ulceração, entretanto, houve

associação com índice mitótico, o que não foi observado em nosso estudo97.

Foi demonstrado em outro trabalho que mutações em TERT não estão relacionados a

sobrevida90, assim como o que foi encontrado neste estudo, ao passo que outros trabalhos

demonstram que esta alteração está associada a pior sobrevida global95, 98. Assim, um artigo

recente concluiu que mutação na região promotora de TERT é um potencial marcador

biológico preditor de mortalidade mais elevada, assim como preditor de metástases em

pacientes com melanoma cutâneo98.

O gene KIT encontra-se mutado, nesta casuística, em cerca de 6% dos pacientes e ocorre

de forma predominante em melanomas acrolentiginoso (88,9%), sendo que apenas um

paciente diferia do restante, apresentando o subtipo nodular. De forma similar, Yimalz e

colaboradores encontraram frequência de 8,5% e uma distribuição equivalente das

mutações nestes dois subtipos de melanoma99. Além disso, como em nosso estudo, eles não

55

encontraram relação com sobrevida e com variáveis clínicas, no entanto, também

demonstraram uma frequência maior de alterações no éxon 1199. Outros estudos prévios

também verificaram frequências de mutações parecidas, bem como predominância destas

no subtipo acrolentiginoso e no éxon 11100, 101, no entanto, um artigo na população Coreana,

demostrou uma frequência maior destas alterações no éxon 13 do gene KIT102.

Há na literatura uma grande escassez de estudos quanto à avaliação de mutações em

PDGFRA em melanomas. A maior análise deste gene na doença foi conduzida por Dai e

colaboradores, em 2013, onde eles observaram uma frequência de 4,6% de mutações em

351 pacientes e ausência de associação destas alterações com parâmetros clínicos,

entretanto, observaram a relação com o subtipo acrolentiginoso, o qual representava 56,2%

das alterações66. De forma semelhante, nosso estudo encontrou uma frequência de 2,9% e

relação com o subtipo acrolentiginoso. Foi relatado em outro estudo que alterações no gene

PDGFRA ocorrem em cerca de 4,0% dos 137 pacientes com melanoma67 e um estudo que

incluiu 17 pacientes da população japonesa não encontrou mutações neste gene103.

Em alguns pacientes o nosso estudo analisou as mutações em mais de um sítio, sendo

que em dois pacientes haviam concordância do status mutacional entre estes, o que sugere

que nestes pacientes o mecanismo de oncogênese se estabeleceu por alterações em outros

genes ou por outros tipos de modificações genéticas não analisadas neste estudo. Sabe-se

que o melanoma é um acúmulo de alterações genéticas, que durante o processo de

tumorigênese são selecionadas por conferirem vantagem proliferativa5. Neste sentido, dois

pacientes adquiriram a mutação durante o desenvolvimento da doença, o que sugere que

nestes pacientes, estas mutações contribuíram para potencializar a taxa proliferativa e a

capacidade de metastização da doença. Além disso, em nossa casuística quatro pacientes

diferiram quanto o status mutacional nos diferentes sítios, o que já foi observado em outros

estudos104, 105. Em um artigo recente de Bradish e colaboradores eles postularam duas

hipóteses para explicar este fenômeno, sendo a primeira a heterogeneidade tumoral e a

segunda a existência de dois melanomas primários que podem produzir resultados

discordantes se o primeiro melanoma primário é testado, enquanto que o segundo foi o

responsável por originar a metástase106.

Neste estudo a nossa casuística foi maior para os dados clínicos, visto a dificuldade de

amplificação das nossas amostras. Solucionamos parte do problema estabelecendo um

protocolo que eliminasse um dos inibidores desta reação, a melanina, no entanto, a

56

qualidade das amostras diminuiu consideravelmente, o que continuou dificultando a

amplificação e, muitas vezes, o sequenciamento. Além disso, em nossa instituição o formol

tamponado foi utilizado para armazenamento de tecido biológico somente a partir de

2005/2006, o que torna as amostras anteriores a este período um material de baixa

qualidade e altamente degradado. Para mostrar isto, de forma aleatória selecionados 10

amostras de 2001 a 2007 e realizamos uma PCR para o gene BRAF (Anexo 3). Observamos

uma baixa taxa de sucesso até 2004 e a partir de 2005 o número de amostras amplificadas

aumentou de forma considerável.

Devido a dificuldade de inserção do subtipo lentiginoso acral nos estudos, visto que ele

é uma forma rara de melanoma, pouco se conhece sobre suas alterações moleculares, o que

dificultou comparações mais profundas em relação a ele em nosso trabalho e o que nos fez

escolher por publicar nossos achados sobre este subtipo separadamente do restante desta

casuística (Anexo 4). Provavelmente a informação mais contundente seja que este possui

perfil molecular distinto dos demais subtipos de melanoma62. Nesse sentido, o TCGA, maior

análise molecular de melanomas em larga escala já realizado até este momento, não incluiu

este subtipo, o que corrobora para que tenhamos mais perguntas, do que respostas, e o que

justifica que outros trabalhos existam para respondê-las.

5. Conclusão

De acordo com nossos objetivos podemos concluir:

1. Conforme demonstrado, de forma inédita, avaliamos em uma população

brasileira portadora de melanoma, a frequência de mutações nos genes BRAF

(34,1%), NRAS (7,9%), KIT (6,2%), PDGFRA (2,9%) e TERT (34,2%);

2. De acordo com características demográficas, clínicas e histopatológicas

identificamos que mutações em BRAF estão associadas a pacientes mais

jovens, assim como mutações em TERT e mutações em PDGFRA a pacientes

com cor da pele negra. Além disso, mutações em BRAF e TERT estão

associadas a diferentes localizações anatômicas, principalmente a região do

tronco e ao subtipo tumoral disseminativo superficial e nodular,

respectivamente). Ainda, mutações em TERT estão associadas a ausência de

ulceração (p= 0,037) e valor de DHL menor ou igual 400 U/L.

57

3. A sobrevida dos pacientes teve associação com fatores prognósticos já

conhecidos em análise univariada e multivariada. Nenhuma mutação

estudada foi associada a diferenças de prognóstico.

Nosso estudo também pôde demonstrar que nossa população possui doença avançada e

fatores prognóstico desfavoráveis. De forma geral, os pacientes possuem perfil molecular

similar ao que se observa em outras populações, principalmente aquelas cuja casuística se

assemelha ao deste estudo, e as frequências dos tipos de mutações são semelhantes. Por

fim, devido a frequência expressiva das mutações estudadas, os portadores de melanoma

brasileiros podem se beneficiar das terapias-alvo já empregadas e futuras.

58

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67

7. Anexos

Anexo 1 – Padronização de protocolo de purificação da melanina testando a PCR para

BRAF éxon 15. Ao todo foram testados 7 protocolos, aqui apresentado aqueles que

funcionaram. Protocolo A- amostras purificadas por eletroforese e com o Kit Wizard® SV Gel

and PCR Clean-Up System (Promega); B- amostras purificadas por eletroforese e com o Kit

GeneJET™ PCR Purification Kit (Fermentas) e C- amostras purificadas com o Kit OneStep PCR

Inhibitor Removal Kit (Zymo Research).

PM= Peso Molecular = 100 bp. CP = Controle Positivo.

CN = Controle negativo.

A - PCR para BRAF éxon 15 das amostras

purificadas com o Kit Wizard® SV Gel and

PCR Clean-Up System (Promega).

Para este teste não houve amostra D, pois não havia mais

lâmina disponível para extração. Entretanto, este era um

caso que já havia funcionado pelo método convencional de

extração (Kit QIAmp DNA Micro Kit- Qiagen) e utilizado

apenas como comparativo. PM = Peso Molecular = 100 bp.

CP = Controle Positivo. CN = Controle negativo.

B – PCR para BRAF éxon 15 das amostras

purificadas com o Kit GeneJET™ PCR

Purification Kit (Fermentas).

PM= Peso Molecular = 100 bp. CP =

Controle Positivo. CN = Controle

negativo.

C – PCR para BRAF éxon 15 das

amostras purificadas com o Kit

OneStep PCR Inhibitor Removal

Kit (Zymo Research).

68

Anexo 2 - Aprovação do presente estudo pelo Comitê de Ética em pesquisa do HCB.

.

69

Anexo 3 – Teste para comparar a taxa de sucesso de amplificação de BRAF de amostras entre os anos de 2001 a 2007. Foram selecionadas 10 amostras de cada ano de forma aleatória.

A

B

C

D

E

F

G

PM = Peso molecular. A – amostras de 2001; B – 2002; C – 2003; D – 2004; E – 2005; F – 2006; G – 2007.

70

Anexo 4 - Artigo publicado pelo nosso grupo com dados preliminares deste trabalho, cujo objetivo foi analisar o perfil molecular de pacientes com o subtipo de melanoma lentiginoso acral.