PERFIL SOROLÓGICO EXPERIMENTAL DE … · Normas adotadas pelo periódico Memórias do Instituto...

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

LILIANE REGO GUIMARÃES

PERFIL SOROLÓGICO EXPERIMENTAL DE CAMUNDONGOS INFECTADOS COM A

CEPA CISTOGÊNICA ME-49, DE Toxoplasma gondii ANTES E PÓS-

TERAPÊUTICA ESPECIFICA.

Orientadora: Profa. Dra. Ana Maria de Castro

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Goiânia-GO, 2008.

Liliane Rego Guimarães/IPTSP-UFG

ii

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

LILIANE REGO GUIMARÃES

PERFIL SOROLÓGICO EXPERIMENTAL DE CAMUNDONGOS INFECTADOS COM A

CEPA CISTOGÊNICA ME-49, DE Toxoplasma gondii ANTES E PÓS-

TERAPÊUTICA ESPECIFICA.

Dissertação submetida ao PPGMT/UFG como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Medicina Tropical, área de concentração Parasitologia.

Orientadora:

Profa. Dra. Ana Maria de Castro

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Goiânia-GO, 2008.


iii

DEDICATÓRIA Aos meus pais, Haroldo e Nilzete, que sempre estiveram ao meu lado

e de quem tenho o maior orgulho de ser filha. Dedico todo este meu trabalho a

minha mãe, pelo seu exemplo de mulher, mãe e amiga.

Dedico também ao meu filho, pela grande felicidade de ser a sua mãe.


iv

AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por tudo que sou e por tudo que tenho. Por não deixar

perder a fé, e por ter me dado força para chegar até o fim.

A Professora Ana Maria de Castro, por ter acreditado e depositado

confiança em mim aceitando orientar este trabalho. Sou grata pela oportunidade e

por ter me conduzido com imensa tranqüilidade e sabedoria.

Aos meus amigos (Aline, Juliana, Miriam e Fabiana) agradeço pelo grande

apoio e estímulo. Obrigada por trilharem este caminho ao meu lado.

Aos funcionários do IPTSP pelo carinho e apoio técnico.

Aos meus pais (Haroldo e Nilzete), pelo amor, carinho e segurança em

todos os momentos difíceis ou não de minha vida.

Ao meu marido Jader e filho Jader Filho, que souberam compreender a

minha ausência. Deu-me força e apoio.


v

SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS...................................................................................VII LISTA DE FIGURA E GRÁFICOS .........................................................................VIII LISTA DE TABELAS E QUADRO ...........................................................................IX

RESUMO...................................................................................................................X

ABSTRACT..............................................................................................................XI

1- INTRODUÇÃO

1.1 Apresentação ................................................................................................ 13

1.2 Introdução .................................................................................................... 15

2- REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Histórico ........................................................................................................... 17

2.2. O agente........................................................................................................... 18

2.2.1. Taxonomia.................................................................................................. 18

2.3. Características Biológicas e Morfológicas ........................................................ 18

2.3.1. Cepas de T.gondii....................................................................................... 20

2.4. Ciclo Biológico do T.gondii ............................................................................... 22

2.4.1. Fase assexuada ou extra-intestinal ............................................................ 23

2.4.2. Fase sexuada ou ciclo entero-epitelial........................................................ 23

2.5. Prevalência e Transmissão .............................................................................. 24

2.6. Imunidade......................................................................................................... 25

2.7. Diagnóstico....................................................................................................... 26

2.7.1. Demonstração do agente ........................................................................... 26

2.7.1.1. Isolamento do agente ...................................................................... 26

2.7.1.2. P.C.R ............................................................................................... 27

2.7.2. Diagnóstico Sorológico.................................................................................. 28

2.7.3. Diagnóstico na gestante e no feto ................................................................. 31

2.7.4. Diagnóstico no recém-nascido ...................................................................... 33

2.8. Tratamento ....................................................................................................... 34


vi

3- OBJETIVOS 3.1. Objetivos Gerais............................................................................................. 38

3.2. Objetivos Específicos..................................................................................... 38

4- MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Origem das Cepas ......................................................................................... 40

4.2. Manutenção das Cepas ................................................................................. 40

4.3. Ensaio de infecção experimental ................................................................... 40

4.4. Manutenção da Cepa RH de T.gondii ............................................................ 41

4.5. Manutenção da Cepa ME-49 de T. gondii...................................................... 41

4.6. Curva Sorológica dos estoques isolados e da Cepa RH................................ 42

4.6.1. Estoques 3, 15 e 20 e RH ........................................................................ 42

4.6.2. Estudo da via de inoculação da Cepa ME-49 .......................................... 42

4.7. Curva Sorológica da Cepa ME-49.................................................................. 43

5- RESULTADOS ................................................................................................... 45

6- ARTIGO .............................................................................................................. 45

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 70

8- ANEXOS

8.1. Roteiro para preparação de Dissertação de Mestrado e Tese de Doutorado no

PPGMT ................................................................................................................... 85

8.2. Normas adotadas pelo periódico Memórias do Instituto Oswaldo Cruz.

www.fiocruz.br......................................................................................................... 87


vii

LISTA DE ABREVIATURAS:

Cepa RH - Cepa de Toxoplasma gondii RH

Cepa ME-49 - Cepa de Toxoplasma gondii ME-49

ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

HC- Hospital das Clinicas

HIV- Vírus da imunodeficiência humana CMV- Citomegalovírus HTLV- Vírus linfotrópico humanos para células T HVB- Hepatite B HVC- Hepatite C I-3 - Isolado 3

I-15 - Isolado 15

I-20 - Isolado 20

IgG – Imunoglobulina G

IgM - Imunoglobulina M

IPTSP – Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

LCR - Líquor

PCR - Polymerase Chain Reaction

RIFI - Reação Imunofluorescência Indireta

T.gondii – Toxoplasma gondii

UFG- Universidade Federal de Goiás


viii

LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS:

Figura 1: Principais formas evolutivas do T. gondii .............................................. 19 Figura 2: Ciclo epidemiológico do T. gondii, demonstrando as principais vias e

formas de transmissão, para o homem e para os outros animais ......................... 22

Figura 3: Inoculação por gavagem de 0,1ml de solução salina contendo 10 cistos

de T.gondii (cepa ME-49) ..................................................................................... 53

Figura 4: Inoculação intraperitoneal de 0,1ml de solução salina contendo 10 cistos

de T.gondii (cepa ME-49)...................................................................................... 53

Gráfico 1: Detecção dos níveis de anticorpos (IgM e IgG), nos soros de

camundongos, infectados com Cepa cistogênica ME-49 de T. gondii após 30 dias

de infecção............................................................................................................ 56

Gráfico 2: Perfil da Imunoglobulina da classe G (IgG), em um grupo de

camundongos isogênicos infectados com a cepa ME-49 de Toxoplasma gondii

tratados e não tratados com terapêutica especifica, acompanhados por 60 dias,

Grupo A tratado com pirimetamina, Grupo B tratado com pirimetamina e

sulfadiazina ........................................................................................................... 58


ix

LISTA DE TABELAS E QUADRO: Tabela 1: Percentual de sobrevida dos estoques I-3 I-15, I-20 e Cepa RH em

camundongos isogênicos inoculados Toxoplasma gondii .....................................52

Tabela 2: Sobrevida dos animais infectados com a Cepa ME-49, tratados com

diferentes esquemas terapêuticos específicos contra o Toxoplasmose e grupo

controle, durante curva sorológica ........................................................................55

Quadro 1: Resultados das diferentes vias de inoculação (oral e intraperitoneal) da

Cepa ME-49 em camundongos Balb/C .................................................................54


x

RESUMO: A Toxoplasmose é uma protozoose de alta prevalência mundial, causada pelo

Toxoplasma gondii. É transmitida pela ingestão de alimentos contaminados com

oocistos excretados em fezes de felinos, ou cistos, em carnes cruas ou mal

cozidas, congenitamente entre outros mecanismos. A doença é usualmente

assintomática, mas em fetos e/ou pacientes com imunodepressão, pode ser

devastadora. Neste trabalho foi avaliado o perfil sorológico experimental após

terapêutica especifica em camundongos isogênicos Balb/C infectados com cepa

cistogênica ME-49 de T. gondii. Cinqüenta animais foram inoculados

intraperitonealmente, individualmente, com 10 cistos da cepa ME-49 obtidos de

macerado de cérebros de camundongos previamente inoculados. Os

camundongos foram divididos em três grupos com 15 animais em cada grupo e

um grupo controle negativo de 5 animais (não infectados e não tratados). Todos

os animais foram acompanhados diariamente, observando-se sintomatologia, por

20 dias. Após este período dois grupos A e B, foram submetidos a esquemas

terapêuticos específicos; Grupo A: pirimetamina (12,5mg/kg/dia)+acido fólico;

grupo B: pirimetamina+acido fólico+sulfadiazina (500mg/kg/dia), por um período

de 10 dias consecutivos, por via oral, onde as drogas foram ministradas de acordo

com o peso dos animais. Após este período eles foram sacrificados, com intervalo

de 5 dias, o sangue coletado por punção cardíaca, e o soro separado para a

reação de imunofluorescência indireta. As amostras provenientes dos animais

tratados apresentaram diminuição significativa nos títulos de anticorpos (IgG)

avaliados com os dois esquemas, pela Reação de Imunofluorescência Indireta

(t=3.5, e t=7,6 respectivamente), em relação ao grupo controle. Entre os dois

esquemas terapêuticos não houve diferenças significativas (t=0,36). Nossos

resultados demonstraram que o tratamento experimental precoce reduz

significativamente os níveis de IgG, sugerindo uma diminuição do estimulo

antigênico, e conseqüentemente um melhor prognóstico para a toxoplasmose.

Palavras Chaves: T. gondii, Tratamento, cepa cistogênica ME-49


xi

ABSTRACT Toxoplasmosis is a protozoosis of high incidence in the world, caused by

Toxoplasma gondii, transmitted by the ingestion of food contaminated by oocysts

found in feline feces, or cists in raw or underdone meat, congenitally in other

instances. The disease is usually asymptomatic, but in embryos or in

imunodrepessive patients it may be devastating. In this work, the experimental

serologic profile has been evaluated after specific therapy in isogenies mice Balbc,

infected with a cystogenic lineage ME-49 of T. gondii. Fifty animals have been

intra-peritoneal inoculated with 10 cists of T. gondii (lineage ME-49) obtained from

the maceration of mice brains of previously inoculated mice. The mice have been

divided into three groups of 15 animals each and a negative control group (not

infected and not treated) of 5 animals. All the animals have been daily

accompanied, and the symptoms were verified during 20 days. After this period,

two groups of 15 animals underwent specific therapy schemes in which; group A:

pirimetamin (12,5mg/kg/day) + folic acid; group B: pirimetamin + folic acid +

sulfadiazine (500mg/kg/day), orally administrated during 10 consecutive days. After

this period, all animals have been scarified, with an interval of 5 days, and the

blood has been collected by a heart puncture and the serum separated for the

Indirect Immuno-fluorescence Reaction. The samples from the treated animals

presented a significant diminution in the quantity of (IgG) antibodies evaluated by

the two schemes by the indirect immuno-fluorescence reaction (t=3,5, and t=7,6

respectively), in relation to the control group. There have been no significant

differences between the two therapeutic schemes (t=0,36). Our results have shown

that the experimental precocious treatment reduces significantly the IgG levels,

suggesting a diminution of antigenic stimulus, and consequently a better prognosis

for toxoplasmosis.

Keywords: T.gondii, Treatment, ME-49 cystogenic lineage

1- Introdução


13

1.1- APRESENTAÇÃO São vários os agentes infecciosos que se transmitem congenitamente

(vírus, protozoários, bactérias), provocando milhares de abortos, natimortos,

crianças prematuras, desnutridas intra-útero e/ou mal formadas em todo o globo.

No mundo há vários, programas voltados para a saúde da mulher,

principalmente na fase procriativa, mas na maioria das localidades, o sistema de

atenção ao pré-natal ainda é precário e muitas vezes inexistente para a maioria da

população feminina. Mas em nosso meio contamos com um serviço de proteção a

gestante, uma assistência pré-natal de qualidade, que atende toda grávida que

freqüenta a rede pública de saúde no Estado de Goiás. Neste serviço é realizado

um rastreamento de rotina para varias infecções que se transmitem ao produto

conceptual (sífilis, toxoplasmose, chagas, HIV, HTLV, HVB, HVC, CMV, rubéola).

Além disso, este programa conta com um projeto de apoio para o controle da

toxoplasmose congênita, suporte para o diagnóstico precoce desta infecção

durante o período gestacional ou imediatamente após o nascimento. Este projeto

é uma ação da Universidade para a comunidade, contando com o apoio das

Secretarias Municipais e Estaduais de Saúde, com suporte técnico do Hospital das

Clinicas (HC) da Universidade Federal de Goiás (UFG) e diagnóstico no Instituto

de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP) da UFG, através de seu laboratório

de Protozoologia, do setor de Parasitologia.

O diagnóstico dessas infecções congênitas é difícil porque a maioria dos

recém-nascidos não apresenta sinais clínicos ao nascimento e quando os

apresenta, são sinais que não permitem diferenciar os vários agentes, porque são

semelhantes. Além disso, a presença de anticorpos específicos da classe IgM não

é freqüente em função da saturação dos sítios de ligação da IgM pelos altos títulos

de IgG. Outro fator que dificulta o diagnóstico da infecção congênita é a presença

da IgG específica, que atravessa a barreira placentária materna e não tem valor

diagnóstico, exceto quando o recém-nascido apresenta valores em torno de quatro

vezes os títulos maternos.


14

Após estágio no laboratório de protozoologia, e participando da linha de

pesquisa de minha orientadora, Dra Ana Maria de Castro, fiquei intrigada com uma

questão levantada pela Dra Mariza Martins Avelino, sobre a negativação da

resposta imune nos infectados quando tratados de forma prolongada com a

associação sulfadiazina, pirimetamina e acido folínico, mesmo nas crianças com

seqüelas (oculares e/ou cerebrais) levantando o questionamento da possibilidade

de cura da toxoplasmose congênita.

No laboratório desenvolvemos técnicas parasitológicas, como a PCR e a

inoculação em camundongos com o objetivo de demonstrar e isolar o parasito,

através de inoculação em camundongos de material biológico suspeito (sangue

fetal, liquido amniótico, sangue periférico de recém-nascido (RN) e liquor

cefalorraquidiano do recém-nascido). Assim surgiu o objetivo desta dissertação,

demonstrar experimentalmente, as observações que a Dra Mariza observou na

clinica pediátrica ao longo de 20 anos de trabalho, tratando recém nascidos e

crianças com toxoplasmose congênita.


15

1.2- INTRODUÇÃO A Toxoplasmose é uma zoonose de alta prevalência no Brasil, causada por

um protozoário intracelular obrigatório denominado Toxoplasma gondii. Esse

parasita pode infectar tanto o homem quanto animais domésticos e selvagens

(Dubey & Thulliez, 1993), sendo os felinos jovens os hospedeiros definitivos

(Amato Neto et al, 1995).

A infecção nos animais e no homem, geralmente, ocorre através da

ingestão de alimentos ou água contaminados com oocistos ou carnes cruas ou

mal cozidos contendo cistos. (Amato Neto et al, 1995), no entanto raramente

provoca doença clinica (Sanchez et al, 1994). Entretanto se a infecção for

adquirida durante a gestação (transmissão transplacentária), esta pode-se

apresentar como doença grave e disseminada (Remington 1995) e pode também

não ter manifestação intra-uterina imediata onde mesmo casos assintomáticos

podem desenvolver seqüelas graves ao longo da vida (Frenkel, 1991). Uma vez

diagnosticada, a doença é tratada, e há redução das seqüelas segundo Derouin

(2001), o que torna essencial o diagnóstico e tratamento precoces.


16

2- Revisão da Literatura


17

2- REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Histórico

Toxoplasma gondii, agente responsável pela toxoplasmose, foi reconhecido

pela primeira vez num coelho de laboratório em São Paulo, no Brasil, por

Splendore, em julho de 1908. Ao mesmo tempo, na Tunísia, Nicole & Manceaux

(1908) observaram organismo semelhante em células mononucleares do baço e

fígado de um roedor norte africano, o Ctenodactylus gondii, sendo o parasito

posteriormente denominado Leishmania gondii.

O parasito considerado por esses autores inicialmente, como pertencente

ao gênero Leishmania, foi caracterizado em 1909 por Nicole & Manceaux como

uma nova espécie, Toxoplasma gondii.

Em 1923, em Praga, Janku fez a primeira descrição da transmissão vertical

do Toxoplasma gondii em humanos, em uma criança falecida aos 11 meses de

idade com hidrocefalia e cegueira, (toxoplasmose congênita) cuja necropsia,

evidenciou a presença de parasitas na retina (Amato Neto et al, 1995). Mas,

somente em 1937 a toxoplasmose ganhou maior projeção na medicina. Wolf &

Cowen nos Estados Unidos, descreveram um caso fatal de um lactente com

encefalite granulomatosa. Eles também realizaram a primeira transmissão

experimental de toxoplasmose humana para animais, tendo ainda demonstrado

um agente infeccioso produzindo doença intra-uterina ( Amato Neto et al, 1995).

Na década de 40, Pinkerton & Weinman (1940) relataram a toxoplasmose

aguda em adultos. Em 1948, Sabin & Feldman criaram o teste do corante de

Sabin-Feldman, permitindo que inúmeros pesquisadores estudassem os aspectos

clínicos e epidemiológicos da toxoplasmose, demonstrando esta ser uma doença

de alta prevalência em todo mundo, porém assintomática na maioria dos casos.

A partir de 1957 foi introduzida a reação de hemaglutinação por Jacobs et

al. (1960), em 1962, a imunofluorescência indireta por Kelen et al.


18

Frenkel et al. (1970) nos EUA, e Hutchison et al. (1971), na Escócia

descobriram que o felino (jovem) era o hospedeiro definitivo do T. gondii. E esta

descoberta foi importante para o avanço epidemiológico e as estratégicas de

prevenção, principalmente em mulheres grávidas.

2.2. O agente

2.2.1. Taxonomia

O nome do gênero foi derivado de toxon, palavra grega que significa arco e

se refere à forma como os taquizoítas se apresentam in vitro. O nome da espécie

se deve ao roedor Ctenodactylus gondii, de onde foi isolado pela primeira vez.

T. gondii pertence ao REINO Protista, SUBREINO Protozoa, FILO

Apicomplexa, CLASSE Sporozoea, SUBCLASSE Coccidia, ORDEM Eucoccidiida,

SUBORDEM Eimeriina, FAMILIA Sarcocystidae, SUBFAMILIA Toxoplasmatinae,

GÊNERO Toxoplasma, ESPÉCIE (única) Toxoplasma gondii.

2.3. Características biológicas e morfológicas

T.gondii, parasito intracelular obrigatório, foi isolado em vários tecidos e

células nucleadas e também em líquidos orgânicos, como: sangue, linfa, saliva,

leite (colostro), exsudatos, esperma e liquido peritoneal (Neves 2005, Diniz et al.

1991, Amato Neto et al. 1995).

Este agente é capaz ainda de invadir e multiplicar-se em eritrócitos imaturos

de mamíferos e em culturas de células (Kasper & Mineo 1994), podendo ser

mantido em culturas celulares ou passagens em animais (Park et al. 1993).

O parasito apresenta anel polar, conóide, microtúbulos, micronemas,

microporo, grânulos densos, roptrias e dupla membrana, características estas que

o difere de outros protozoários. Estas estruturas protéicas estão relacionadas com


19

a invasão, formação do vacúolo parasitóforo e manutenção do parasito no interior

da célula hospedeira (Dubey & Thulliez 1993, Smith 1995).

T. gondii pode apresentar três formas evolutivas principais: oocistos,

taquizoítas e bradizoítas, as quais podem infectar os hospedeiros.

Figura 1 - Principais formas evolutivas do T. gondii – (Taquizoítas, Oocisto e Cisto tecidual)

Os oocistos são formas imaturas, não esporuladas, produzidas no epitélio

intestinal dos felídeos e eliminadas junto com as fezes no meio ambiente.

Apresentam-se arredondados, medem de 10 a 13 μm de largura por 9 a 11 μm de

comprimento e com uma parede responsável por sua resistência ás condições

adversas do meio ambiente. Após a sua evolução no meio ambiente, com

temperatura e umidade adequadas, passam a apresentar, em seu interior, quatro

esporozoítas dentro de cada um dos dois esporocistos (Zaman 1970).

Taquizoítas são formas de multiplicação rápida, características de fase

aguda, encontradas no interior de várias células nucleadas. A multiplicação ocorre

por sucessivas endodiogenias, dentro de vacúolos parasitóforos, formados pela

célula hospedeira. Apresentam forma alongada, ligeiramente arqueada, de 2 a 4

μm de largura por 4 a 8 μm de comprimento, com extremidade anterior mais

afilada que a posterior (Frenkel 1975, Amendoeira et al. 1999).

Os bradizoítas também podem ser chamados de cistozoítas (Dubey et al,

1998); são encontrados, geralmente, no interior de cistos teciduais no organismo

do hospedeiro, caracterizando a fase crônica da infecção. Sua reprodução ocorre

por endodiogenia, de maneira lenta, no interior dos cistos (Caruana, 1974). Os

principais tecidos onde os cistos com bradizoítas podem ser encontrados são;


20

nervoso, muscular esquelético e cardíaco, assim como na retina (Amendoeira et

al. 1999, Hill & Dubey, 2002). Os cistos crescem com o tempo, mas permanecem

intracelulares (Dubey et al, 1998).

Os taquizoítas e bradizoítas desenvolvem-se em quase todas as células e

tecidos de mamíferos e aves, o que faz do T. gondii um dos parasitos de menor

especificidade para células e tecidos (Neves, 2005).

Segundo Frenkel et al. (1970), o ciclo biológico do parasito, divide-se em

duas fases: fase assexuada (extra intestinal), que ocorre nos hospedeiros

intermediários e definitivos, e a fase sexuada (entero-epitelial), que ocorre

somente nos hospedeiros definitivos.

2.3.1. Cepas de T.gondii

Diferentes cepas de T. gondii têm sido isoladas, sendo estas geralmente

classificadas como virulentas ou avirulentas, com base na sua patogenicidade

e/ou antigenicidade para o modelo experimental camundongo, que por sua vez

será resistente ou susceptível (Bohne et al.1993).

Howe and Sibley (1995) determinaram a estrutura genética populacional do

T.gondii e demonstraram a existência de três tipos clonais predominantes: tipo I, II

e III. Cepas do tipo I estão relacionadas à toxoplasmose humana congênita e a

virulência aguda em camundongos, cepas do tipo II relacionam-se aos casos de

reativação da infecção crônica em humanos e as cepas do tipo III estão

associadas às infecções animais.

As cepas tipo I de T.gondii são extremamente virulentas, produzindo altos

níveis de parasitemia, com um aumento do risco de transmissão transplacentária e

da gravidade da infecção em fetos, já as cepas tipo II e III guiam o

desenvolvimento de uma infecção crônica e produzem cistos teciduais em

camundongos.

Classificar as diferentes cepas de T. gondii é extremamente importante para

a caracterização epidemiológica, pois permitirá a investigação da distribuição e da


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virulência de diferentes cepas de parasitos isoladas de populações animais e

humanos (Silva et al. 2001). Outro fator que altera a virulência do parasita seria a

sua passagem contínua numa mesma espécie animal (Jacobs 1964).

A cepa RH é muito utilizada como padrão na comparação entre cepas. Ela

foi isolada em 1939 de uma criança com quadro letal de encefalite toxoplásmica

(Howe & Sibley 1995). A cepa RH, quando injetada numa dose de 105 taquizoítos,

em camundongos alogênicos (SWISS) ou isogênicos (BALB/c), leva-os a morte

em 6 a 7 dias, e por isso é considerada como uma cepa virulenta.

A cepa ME-49 foi originalmente isolada da musculatura de carneiro. É uma

cepa cistogênica e considerada avirulenta ou de baixa virulência (Lunde & Jacobs

1983). Em camundongos BALB/c a cepa ME-49 de T.gondii produz cistos que são

evidentes no cérebro. O aparecimento de cistos caracteriza a fase crônica da

infecção que persiste por toda a vida destes camundongos.


22

2.4. Ciclo Epidemiológico do T. gondii

Figura 02: Ciclo epidemiológico do T. gondii, demonstrando as principais vias e formas de transmissão, para o homem e para os outros animais.

Congênita

http://www.sgi.co.yu/html/006/00613.html


23

2.4.1. Fase Assexuada ou Extra-Intestinal

Esta fase ocorre tanto nos hospedeiros definitivos quanto nos

intermediários, e está associada à ingestão de formas infectantes (taquizoítas,

bradizoítas e esporozoítas) por esses hospedeiros, iniciando assim uma

reprodução rápida por endodiogenia, dentro de qualquer célula nucleada. Após

intensa multiplicação, a célula rompe-se e deixa em liberdade os parasitos, que

podem invadir qualquer outra célula, ou ainda serem encontrados em qualquer

fluido biológico. O ritmo desta multiplicação pode ser alterado por fatores

relacionados principalmente a resposta imune do hospedeiro, onde a

endodiogenia passa a ocorrer de forma lenta pelos bradizoítas. Estas estruturas

são observadas no interior dos cistos encontrados geralmente no sistema nervoso

central e em músculos cardíacos ou esqueléticos. Numa fase inicial, os cistos

formados no meio intracelular, na medida em que vão crescendo, rompem a célula

hospedeira, porém mantém a sua própria parede (Dubey 1998, Tenter et al. 2000).

2.4.2. Fase sexuada ou Ciclo Entero-epitelial

O ciclo sexuado tem inicio quando um membro da família dos felídeos

ingere oocisto contendo esporozoítas ou cistos teciduais contendo bradizoítas. Os

processos digestivos levam a ruptura da parede cística e liberação dos bradizoítas

ou esporozoítas, que irão penetrar em células do intestino delgado, iniciando uma

fase de multiplicação assexuada por endodiogenia, produzindo micro e

macrogametas. A fusão dos gametas produz o zigoto que é eliminado com as

fezes como oocisto não esporulado (Dubey & Frenkel 1972). A esporogonia ocorre

no meio ambiente, de um a quatro dias após a liberação, em condições ideais de

temperatura e oxigenação e vai dar origem a um oocisto com dois esporocistos e

quatro esporozoítas no interior (Frenkel et al. 1970). Este oocisto, em condições


24

de umidade, temperatura e local sombreado favorável, pode manter-se infectante

por cerca de 12 a 18 meses.

2.5. Prevalência e Transmissão

A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição mundial, sendo encontrada

em todos os continentes, nos mais variados climas (Eckert, 1996; Amendoeira et

al. 1999; Rey, 2001). O T.gondii é um dos mais comuns parasitos encontrados em

todo o mundo e sua prevalência está estimada em 1 a 2 bilhões de pessoas

infectadas (Chang 1996), porém, a freqüência da infecção é extremamente

variável nas diferentes regiões do planeta. Esta variabilidade está ligada a

diversos fatores, tais como: padrões culturais da população, hábitos alimentares,

idade, procedência rural ou urbana, entre outros (Amendoeira et al. 1999, Spalding

et al. 2005).

As principais vias de disseminação do parasito são a transmissão

transplacentária, a ingestão de tecidos infectados com cistos contendo bradizoítas

ou a ingestão de alimentos ou água contaminada com oocistos maduros (Dubey

1976, Amendoeira et al. 1999, Tenter et al. 2000, Hill & Dubey 2002).

No Brasil, estima-se que aproximadamente 60% da população adulta tenha

entrado em contato com o parasita (Guimarães et al. 1993). No entanto, o T.gondii

raramente causa distúrbios nos indivíduos imunocompetentes, e nesse caso são

geralmente leves e temporários (Kasper & Buzoni-Gatel 1998).


25

2.6. Imunidade

A resposta imunológica do hospedeiro imunocompetente contra o T. gondii

no curso da infecção aguda adquirida é a responsável pelo encistamento do

parasita na musculatura esquelética, no cérebro e nos demais órgãos. Neste

aspecto, taquizoítas assumem a forma bradizoítica, a qual pode permanecer

latente por toda a vida do indivíduo sem causar-lhe dano ou morte. Esta fase

crônica e assintomática da toxoplasmose adquirida pode assumir uma forma de

reagudização ou recidiva, com conseqüências desastrosas para o hospedeiro, nos

casos em que este apresentar algum problema na imunidade celular, permitindo a

transformação dos bradizoítas encistados em taquizoítos passiveis de proliferação

e disseminação; ou por algum momento de deficiência imunológica, como por

exemplo, nos casos de imunossupressão induzida por drogas, de quimioterapia,

de transplantes de órgãos ou da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

(SIDA/AIDS) (Sharma 1990).

O T. gondii provavelmente, usa a resposta imune do hospedeiro para

sinalizar transformação para cistos teciduais (Dubey et al. 1998). Ao invadir as

células ativamente, através das estruturas do complexo apical, o parasito libera a

membrana externa, utilizando seus sistemas de penetração na criação de um

vacúolo híbrido na célula hospedeira que bloqueia assim, o contato dos sistemas

celulares de controle do hospedeiro, como lisossomos e peroxissomos (Black &

Boothroyd 2000).

Não obstante a imunidade mediada por células tenha sido apontada como

principal fator de defesa na infecção pelo toxoplasma (Mckerrow & Heyneman

1994), a imunidade humoral dependente de células T acompanha o curso da

infecção crônica, com títulos baixos de anticorpos, por toda a vida do individuo.

Além disso, indivíduos cronicamente infectados pelo parasito são aparentemente

resistentes a reinfecção (Sharma 1990).

O intenso estimulo humoral, causado pela grande quantidade de antígenos

liberados na penetração, gera altos níveis de anticorpos específicos, inicialmente


26

das classes M ou G, mas de baixa avidez que são substituídos por anticorpos IgG

de alta afinidade com a evolução da infecção (Kasper & Khan 1998).

2.7. Diagnóstico

O diagnóstico da toxoplasmose pode ser clinico epidemiológico ou

laboratorial; sendo que o diagnóstico clínico é difícil, principalmente na

toxoplasmose adquirida, onde esta se apresenta assintomática na maioria dos

casos e quando sintomática, normalmente apresenta sinais e sintomas genéricos,

que são indicativos de uma série de processos infecciosos. Portanto para que se

tenha um diagnóstico fiel é necessário o uso de técnicas laboratoriais

padronizadas para a sua confirmação (Amendoeira et al. 1999).

2.7.1. Demonstração do Agente

2.7.1.1. Isolamento do Agente

Os métodos parasitológicos baseiam-se no crescimento e isolamento do

patógeno em culturas celulares com células de mamíferos (T. gondii não cresce

em meios de cultura livres de células), embrião de galinha e o método clássico de

inoculação em animais. Dentre os animais sensíveis à inoculação, citam-se

hamsters, cobaias, camundongos e coelhos. Destes, os camundongos são os de

escolha por serem os mais suscetíveis a infecção por inoculação peritoneal,

chegando a fornecer cifras de milhões de taquizoítas por mililitros no curto espaço

de tempo de três dias (Pfefferkonr 1990, Dubey & Thulliez 1993, Amato Neto et al.

1995). Esse método não é usado em rotina laboratorial, devido à dificuldade de se

manter no laboratório animais para inoculação, além da necessidade de prazos


27

longos para a obtenção de resultados, de 30 ou mais dias, porém são

compensados pela alta sensibilidade do teste (Camargo 2001).

A inoculação em camundongos utiliza o sangue do paciente, de preferência

a camada leucocitária, ou sedimento do centrifugado de liquido cefalorraquidiano,

líquido amniótico, lavado brônquico-alveolar, suspensões de triturados de biópsia

ou de placenta, que são inoculados via intraperitoneal em camundongos

isogênicos (Remington et al. 1994). A positividade é indicada pela soroconversão

do animal e confirmada pelo achado de taquizoítos no líquido peritoneal ou de

microcistos no cérebro e outros órgãos.

Uma vez isolada, a cepa de T. gondii, pode ser mantida para fins

experimentais mediante reinoculação em camundongos. Entretanto, a

criopreservação in vitro tem sido um método prático para se evitar tanto a perda

inesperada de camundongos infectados e da cepa, quanto a necessidade

constante de inoculações, que despendem tempo, material e pessoal

tecnicamente treinado. Desta forma, taquizoítas podem ser mantidos, sem perda

de viabilidade e virulência, entre –20°C e –60°C no máximo por 8 semanas, a –

70°C por pelo menos 200 dias e, em nitrogênio liquido (-196°C), por pelo menos

450 dias até um prazo de 8 anos, após terem sido submetidos a congelamento

gradual (Kozojed et al. 1985, Lin et al. 1995).

2.7.1.2. PCR

A PCR baseia-se na detecção de DNA do T. gondii em fluidos corporais ou

fragmentos de tecidos (Howe et al. 1997). Os ensaios mais investigados têm sido

os que utilizaram iniciadores para o gene rDNA, SAG (Mondragon et al. 1998,

Aubert et al. 2000), e o gene B1 (Hohlfeld et al. 1994), com sensibilidade variável.

A PCR baseia-se na ampliação das seqüências especificas de DNA, um teste

sensível (Holliman 1994), pois pode detectar o parasito mesmo que ele esteja em

número reduzido ou até mesmo lisado.


28

2.7.2. Diagnóstico Sorológico

A sorologia é a principal abordagem para estabelecer um diagnóstico de

toxoplasmose. Este é baseado na pesquisa de anticorpos de diferentes classes de

imunoglobulinas especificas anti-T. gondii. A presença destes anticorpos anti-

toxoplasma no curso da infecção, permite a analise de perfis sorológicos, seja de

infecção recente, em fase aguda, ou de infecção antiga, em fase de latência ou

crônica (Contreras et al. 2000). Em indivíduos imunocompetentes os testes

sorológicos com pesquisa de IgM e IgG são suficientes para o diagnóstico, por

serem sensíveis, específicos e de fácil execução (Camargo 2001). Já para o

diagnóstico em indivíduos imunocomprometidos e na infecção fetal, há

necessidade da realização de testes parasitológicos.

• Reação de Sabin-Feldman: ou teste do corante (Dye test), foi o

método sorológico clássico de diagnóstico da toxoplasmose. Foi a

primeira prova de alta sensibilidade desenvolvida, capaz de

evidenciar e quantificar, por diluição do soro, anticorpos antiparede.

A reação tem como fundamento o fato de que taquizoítos do

exsudato peritoneal de camundongos corados pelo azul de metileno,

em meio alcalino (pH 11), vistos a microscopia óptica apresentarem-

se com intensa coloração que assume forma arredondada ovóide,

mas, quando incubados em presença do denominado fator

acessório, o fenômeno é impedido pela presença de anticorpos

específicos no sangue sob análise. Os parasitos extracelulares

perdem sua afinidade tintorial, ficando o núcleo corado, o citoplasma

incolor e morfologicamente mais delgado, falciforme. O resultado

corresponde à diluição do soro que impede a coloração. O fator

acessório é soro humano sem anticorpos, possuidor de propriedades

capazes de tornarem possível a ocorrência do fenômeno básico da

reação (Sabin e Feldman, 1948). Esse método é pouco prático, além


29

de sofrer influência de critérios de observação variáveis entre

diferentes técnicos (Camargo 2001).

• Reação de Fixação de Complemento (RFC): Este é um método

que caiu em desuso por ser muito trabalhoso e necessitar de um

grande número de reagentes de difícil padronização, já que depende

do consumo de complemento exógeno em sistemas padronizados

(Sanchez 1996).

• Teste de Hemaglutinação Indireta (HAI): A reação de

Hemaglutinação Indireta baseia-se na utilização de hemácias

taninizadas, usualmente não aglutinantes com o soro humano, como

as de ave, revestidas por antígenos do parasito que ao reagirem com

anticorpos específicos apresentam uma aglutinação visível que pode

ser quantificada pela diluição seriada do soro. Contudo, a HI

depende muito do tipo de reagente utilizado e das condições

experimentais, incluindo-se a leitura subjetiva da reação, o mesmo

valendo para partículas de látex revestidas com antígenos (Sanchez

1996).

• Teste de aglutinação direta (AD): O teste é usado para a

detecção de anticorpos antitoxoplasma, com suspensões de

toxoplasmas fixados por formaldeído ou por acetona (Thulliez et al.

1986). A aglutinação dos taquizoítas fixados por acetona é

característica das infecções recentes, sendo utilizada para distingui-

las de infecções latentes. Para o teste de aglutinação do látex são

utilizadas partículas recobertas por antígenos do parasito, seu uso

sendo bastante restrito.

• Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI): Tem a eficácia

comparável à reação de Sabin-Feldman com a vantagem de

apresentar maior rapidez de execução, reprodutividade e

preservação dos reagentes (Sanchez 1996). Essa reação utiliza

toxoplasmas preservados, fixados em lâminas de microscopia,

tornando-o muito mais prático e seguro para a rotina laboratorial,


30

quando comparada ao Dye test. Além do mais, esse teste permite a

identificação dos anticorpos segundo as classes de imunoglobulinas

e pode também apresentar resultados falso-positivos para os

anticorpos IgM pela interferência de fatores reumatóides, presentes

no soro. Os testes para anticorpos IgM podem também revelar

resultados falso negativos, devido a competição entre anticorpos IgG

e IgM, impedindo que estes se fixem aos antígenos parasitários

(Camargo et al. 1972).

• Ensaio Imunoenzimático (ELISA): Utilizam antígenos solúveis do

parasito que se ligam às superfícies adsorventes de placas,

permitindo a adesão dos anticorpos específicos a um substrato

sólido. Após lavagem, estes anticorpos podem reagir com anticorpos

secundários específicos ligados a uma enzima, que permite, pela

reação enzimática a produtos coloridos, quantificar os anticorpos

aderidos, o que têm se mostrado muito especifico (Pelloux et al.

1998). Pela sua praticidade, este método permite variações, como

por exemplo, a captura de classes especificas de imunoglobulinas ou

uso de substratos fluorescentes de alta sensibilidade (Venkatesan &

Wakelin 1993). Apesar dos ELISAs e congêneres serem os testes

mais sensíveis e permitirem automação, sua alta sensibilidade

prejudica a determinação temporal da época da infecção.

Usualmente, utilizando-se os testes menos sensíveis como a IFI,

pode-se determinar a evolução da resposta humoral da

toxoplasmose. A maior sensibilidade dos ELISAs confunde este

padrão classicamente definido e dificulta a interpretação de amostras

isoladas.

• Reação de Aglutinação por Imunoabsorção (ISAGA): É utilizada

para identificação de anticorpos IgM, sendo importante no

diagnóstico de infecção aguda. Os antígenos adicionados ás placas

constituem-se em uma suspensão de Toxoplasmas, que se


31

aglutinam na presença especifica do anticorpo (Desmonts et al.

1981).

2.7.3. Diagnóstico na gestante e no feto

O diagnóstico de toxoplasmose na gestante é confirmado em pacientes

soronegativas que apresentam soroconversão e naquelas com perfil sorológico de

toxoplasmose recém-adquirida. Devido ao grande número de gestantes que não

apresentam anticorpos anti-toxoplasma e a necessidade de repetição dos testes a

cada quatro ou cinco semanas naquelas que permanecem soronegativas, são

necessários testes sensíveis para a triagem, porém de baixo custo e de execução

simples, capazes de detectar anticorpos IgM e IgG e de fornecer resultados em

curto prazo.

De acordo com os resultados, a gestante será considerada como: Imune:

na presença de IgG positiva e IgM negativa, suscetível: quando IgG e IgM são

negativos, imune ou portadora de infecção aguda: se IgG e IgM estiverem

positivas.

A maior dificuldade no diagnóstico sorológico ocorre nos casos em que a

IgM está positiva por ocasião da primeira consulta pré-natal. A sua presença nem

sempre indica uma infecção aguda recente, porque com o aumento da

sensibilidade dos testes sorológicos para toxoplasmose, a IgM pode ser detectada

por períodos superiores a um ano após a infecção aguda. Por isso recorre-se a

outros métodos sorológicos para tentar estabelecer, retrospectivamente o

momento da soroconversão. O diagnóstico da infecção aguda nestes casos exige

a demonstração de aumento nos títulos de anticorpos, maior ou igual a três

diluições, em duas amostras colhidas com intervalos de três semanas e testadas

em paralelo. Às vezes há necessidade da realização de outros testes como

dosagem de IgA, IgE ou o teste de avidez de IgG (Camargo et al. 1991). Ideal

seria utilizar uma combinação de dois testes para confirmação diagnóstica

(Remington et al. 2001).


32

Nas gestantes com quadro clínico sugestivo de toxoplasmose, realizam-se

testes que detectam anticorpos IgM específicos, tais como DS-ELISA IgM e

ISAGA IgM. Estes se positivam usualmente na primeira ou segunda semanas de

infecção e podem persistir por meses ou anos. Um teste negativo para IgM

virtualmente afasta a possibilidade de infecção atual ou recente (Wallon et al.

1999).

Se os resultados indicam infecção materna aguda, o estabelecimento do

envolvimento fetal torna-se crítico (Wong & Remington 1994). O diagnóstico da

infecção fetal pelo T. gondii, classicamente, baseava-se na análise conjunta do

sangue fetal e do líquido amnióticos, colhidos a partir da 20ª semana de gestação,

aliada à avaliação de ultra-sonografia da morfologia fetal (Daffos et al. 1988). Os

achados ultra-sonográficos que podem surgir devido à infecção incluem:

hidrocefalia, calcificações intracranianas, aumento da circunferência abdominal

pela hepatoesplenomegalia, ascite fetal e aumento da espessura placentária. A

analise do sangue fetal obtido por cordocentese após a 20ª semana de gravidez

pode demonstrar a presença de IgM especifica para toxoplasmose, assim como

no liquido amniótico. Utilizando esses parâmetros, Daffos et al. (1988) puderam

diagnosticar 90% dos fetos acometidos intra-útero. No entanto, os inúmeros

estudos têm demonstrado que sua presença é rara no feto e no liquido amniótico.

Por isso para o diagnóstico da infecção fetal, há necessidade de testes para

a detecção do T.gondii. Esta detecção pode ser feita por cultura em células ou

inoculação em camundongos, para determinação dos antígenos parasitários

através de técnica imuno-histoquímica ou, principalmente por seqüências de

ácidos nucléicos através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) em

qualquer tipo de tecido ou fluido corporal (Grover et al. 1990, Cazenave et al.

1992, Hohlfeld et al. 1994).


33

2.7.4. Diagnóstico no recém-nascido

O diagnóstico da toxoplasmose no recém-nascido baseia-se principalmente

no acompanhamento sorológico, interpretado de forma criteriosa e sempre

associado aos dados clínicos e epidemiológicos (Holliman 1990). A pesquisa de

anticorpos IgM tem sido amplamente executada como marcador de toxoplasmose

congênita pós-natal. Devido ao seu peso molecular, a IgM não atravessa a

barreira placentária integra. E, mesmo em caso de lesão de placenta, sua meia

vida é de somente cinco dias. Por esse motivo a IgM é ideal para o diagnóstico de

infecção neonatal aguda, porque permite a separação dos anticorpos IgM

produzidos pela criança daqueles anticorpos IgG transferidos passivamente pela

mãe (Naessens et al. 1999), mas sua presença é rara no sangue do recém-

nascido.

As melhores técnicas para sua detecção compreendem o S-ELISA e o

ISAGA, que detectam anticorpos específicos IgM em cerca de 80% dos casos

enquanto que para o teste de imunofluorescência esse valor é de 25% (Wallon et

al. 1999).

Na ausência da IgM, o achado da IgG anti-toxoplasma no soro do recém

nascido assintomático não apresenta maior significado diagnóstico, pois pode

representar simples transferência passiva de anticorpos maternos. Neste caso,

geralmente ocorre queda dos títulos da IgG após o quarto mês de vida, com

tendência a negativação do exame até o final do primeiro ano (Alford et al. 1974,

Thulliez et al. 1992). Entretanto se o recém-nascido apresenta indícios clínicos

sugestivos de toxoplasmose, com persistência ou elevação dos títulos de IgG

após o primeiro ano, existe alto valor preditivo para toxoplasmose congênita

(Joynson 1990, Boyer & Campbell 2001).

Após a confirmação diagnóstica materna e/ou neonatal, o tratamento é

instituído o mais rápido possível.


34

2.8. Tratamento

Há aproximadamente 30 anos, esquemas terapêuticos têm sido usados no

tratamento da toxoplasmose aguda (Derouin 2001). O número de recém-nascidos

infectados de mães tratadas com Espiramicina foi reduzido significantemente em

relação aos de não tratadas (Stray-Pedersen & Jenun 1992), mas isso não elimina

o risco de transmissão para o feto (Bader et al. 1997). Um estudo mostrou a

eficácia da associação de outras drogas como a sulfadiazina e pirimetamina para

minimizar o efeito da infecção no recém-nascido (Hollfeld et al. 1989). Segundo

um estudo retrospectivo, o tratamento realizado durante a gravidez pode reduzir

sintomas clínicos em crianças infectadas (Foulon et al. 1999).

Apesar de o tratamento conseguir controlar as formas de rápida

proliferação, não existe nenhuma droga capaz de eliminar os cistos teciduais

latentes em humanos e animais, que se mantêm viáveis por longo período,

podendo reativar a infecção (Beaman et al. 1992). No caso de infecção fetal,

preconiza-se terapia especifica para o feto, através da associação da

Pirimetamina a Sulfadiazina, acompanhado de ácido fólinico, alternado com a

espiramicina, que segundo alguns estudos, geralmente não atravessa a placenta

(Daffos et al. 1988, Jones et al. 2001). A pirimetamina é uma substância

antagonista do ácido fólico, e em situações normais não é recomendada para

gestantes, pois pode produzir depressão gradual e reversível na medula fetal com

leucopenia, anemia e plaquetopenia (Diniz et al. 1991). Já os pacientes

imunocompetentes habitualmente são tratados quando apresentam sintomatologia

extensa e prolongadas ou com comprometimento ocular ou visceral significativo

(Amato Neto et al. 1995).

O tratamento da criança infectada sintomática ou assintomática deve ser

iniciado precocemente e prolongar-se até no mínimo um ano de idade. Ininterrupto

até os dois anos de vida nas crianças que tiverem nascido com seqüelas oculares,

auditivas e cerebrais, pois pode minimizá-las e melhorar o prognóstico. O

esquema de Couvreur (1984) é o mais difundido e consiste no emprego alternado

de espiramicina com sulfadiazina e pirimetamina durante um ano, de acordo com


35

o estado clínico, como descrito abaixo. Os seguintes esquemas terapêuticos

podem ser usados:

1. Toxoplasmose congênita sintomática: Pirimetamina (1mg/kg/dia) e

sulfadiazina (85mg/kg/dia) nos primeiros seis meses, associados ao acido

folínico injetável na dose de 5mg a cada três dias e, após, ciclos de 30 dias

alternados de pirimetamina + sulfadiazina e espiramicina (100mg/kg/dia ) até

1 ano.

2. Toxoplasmose congênita sintomática com evidencia de processo inflamatório:

(coriorretinite e/ou proteinorraquia elevada – maior que 1g/dl em crianças com

menos de um mês): esquema 1 associado a prednisona 1,5mg/kg/dia, até

estabilização do processo inflamatório.

3. Toxoplasmose congênita assintomática: Pirimetamina + sulfadiazina durante

seis semanas e, após, espiramicina por seis semanas intercalada com quatro

semanas de pirimetamina + sulfadiazina até completar um ano.

4. Recém-nascido assintomático: com resultado sorológico inconclusivo, cuja

mãe teve infecção comprovada durante gestação: sulfadiazina + pirimetamina

durante um mês e reavaliação clinica e sorológica para definir a continuidade

ou suspensão do tratamento.

5. Recém-nascido assintomático de mãe com sorologia sugestiva de infecção

recente, mas sem dados para definir se a infecção ocorreu durante a

gestação: espiramicina durante um mês e reavaliação posterior como no item

4.

Mais recentemente, estudo multicêntrico realizado em Chicago (Mc Auley et

al. 1994) estabeleceu outro protocolo de tratamento para crianças com infecção

congênita sintomática. A proposição desse esquema foi motivada por relatos de

casos adultos com imunodeficiência que desenvolveram encefalite pelo T.gondii

na vigência de profilaxia com espiramicina e somente apresentaram resolução

das lesões após o uso de múltiplas doses de pirimetamina e sulfadiazina (Leport

et al. 1986).

Os autores partiram da hipótese de que em crianças em fase de maturação

imunológica, o uso combinado de sulfadiazina e pirimetamina por um ano


36

permitiria um melhor controle das lesões teciduais causadas pelo parasito. Após

o acompanhamento por quatro anos de 44 crianças tratadas com este ultimo

esquema em comparação aquelas não tratadas descritas por Eichenwald (1959),

observou-se redução significativa de deficiência motora (69% vs 22%), de

convulsões (81% vs 11%), de retardo mental (86% vs 32%), e de hidrocefalia e

microcefalia (32% vs 26%), sem haver, no entanto diferença na incidência de

deficiência auditiva grave (59% vs 58%) (Roizen et al. 1995). A morbidade e a

mortalidade perinatal associada a toxoplasmose adquirida na gestação, assim

como as repercussões dela decorrentes justificam que programas de prevenção

sejam instituídos em nosso meio.

O esquema abaixo foi proposto por Mc Auley et al. (1994), para tratamento

de recém-nascidos com toxoplasmose congênita sintomática:

• Pirimetamina: 2mg/kg/dia por 2 dias e após, 1mg/kg/dia diariamente por

2 a 6 meses (crianças com acometimento severo) e após, 1mg/kg/dia 3

vezes por semana até completar 1 ano.

• Sulfadiazina: 100mg/kg/dia até completar um ano.

• Acido folínico: 5mg 3vezes/semana; 10mg 3vezes/semana nas crianças

com idade maior que 1 mês ou peso de 4,5 kg. Na presença de

neutropenia (750 a 900/nm), a dose deve ser aumentada para 10 mg

diariamente. Se neutrófilos inferiores a 500/nm deve-se suspender a

pirimetamina e elevar a dose de acido folínico para 10 a 20mg/dia.

• Prednisona: 1mg/kg/dia, 2 doses ao dia, quando há hiperproteinorraquia

(1g/dl) e coriorretinite ativa, até a resolução do processo inflamatório.

3- Objetivos


38

3- OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral Estudar o comportamento biológico dos estoques I-3, I-15 e I-20 e o perfil

sorológico experimental da cepa cistogênica ME-49 em camundongos Balb/C

tratados e não tratados.

3.2. Objetivos Específicos - Padronizar o número mínimo de parasitos capaz de infectar os camundongos,

com os diferentes estoques 3, 15, 20 e cepas RH e ME-49.

- Comparar a via intraperitoneal e a via oral (gavagem) para infecção dos

camundongos pela cepa ME-49

- Comparar o comportamento sorológico experimental dos camundongos

infectados com a cepa ME-49 de T. gondii, não tratados com os tratados com dois

esquemas de tratamento (Pirimetamina + Ácido Fólico e Pirimetamina +

Sulfadiazina + Ácido Fólico).

4- Materiais e Métodos


40

4- MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Origem dos Estoques

Foram isolados três estoques de T.gondii em material humano no

laboratório de protozoologia do IPTSP/UFG, em Goiânia.

Identificadas inicialmente como estoque 3 de origem: sangue periférico de

recém nascido, estoque 15 de origem: líquido amniótico, e estoque 20 de origem:

sangue fetal.

4.2. Manutenção das Cepas

As cepas foram mantidas criopreservadas em nitrogênio líquido, sendo

reativadas através de inoculações intraperitoneais em camundongos Balb/C,

criados no biotério do IPTSP/UFG, separadamente, pesando de 20 a 30 gramas;

com aproximadamente 30 dias.

4.3. Ensaio de Infecção Experimental

Para padronização dos ensaios sorológicos, foram realizadas infecções

experimentais em camundongos Balb/C, onde foram inoculados os estoques que

se encontravam criopreservadas (estoque 3, 15 e 20), para a sua reativação. Os

animais foram acompanhados diariamente, por cerca de 5 a 7 dias após o inóculo;

os que apresentaram sintomatologia foram sacrificados e através da lavagem

intraperitoneal com 4ml de solução salina estéril, colhido o exsudado peritoneal.

Os exsudatos peritoneais com menor grau de contaminação (bactérias,

hemácias ou outros tipos celulares) e maior quantidade de parasitas foram


41

selecionados para repique e utilizados nos experimentos desenvolvidos neste

trabalho.

Os taquizoítos foram contados na câmara de Newbauer, separadamente, e

reinoculados em novos grupos de camundongos, com o número mínimo de

parasitos, anteriormente padronizado no laboratório, para sobrevivência dos

camundongos, para todos os estoques (3, 15 e 20), e para a cepa RH.

4.4. Manutenção da Cepa RH de T.gondii

Para comparação de comportamento das cepas isoladas foram usadas as

cepas RH, tipo I, já caracterizadas e de comportamento virulento e não

cistogênica.

A cepa RH de T. gondii, foi mantida através de inoculações intraperitoneais

em camundongos Balb/C. Foi realizado o lavado peritoneal dos animais infectados

e os taquizoítos quantificados na câmara de Newbauer, 0,1ml de lavado contendo

103 taquizoítos por ml re-inoculados em camundongos.

4.5. Manutenção da Cepa ME-49 de T.gondii

Foi usada a cepa ME-49, tipo II, para comparação das cepas isoladas, e por

se tratar de cepa cistogênica.

A cepa ME-49 de T.gondii, foi mantida através de inoculações por via oral

de cistos teciduais em camundongos Balb/C.

Os camundongos foram inoculados por via oral, com 10 cistos de T. gondii

da cepa ME-49 dois meses antes do sacrifício. O cérebro foi coletado, macerado

com solução salina estéril, até formar uma solução homogênea. Desta retirou-se

25μl, que foram depositados em lâmina para microscopia, cobertos com lamínula,

e o número de cistos de T.gondii quantificados (Fux et al 2003). Os cistos foram


42

utilizados como inóculo em outros camundongos Balb/C para manutenção da cepa

ME-49 e nos experimentos desenvolvidos neste trabalho.

4.6. Curva sorológica dos estoques isolados e da Cepa RH Após reativação de todos os estoques e cepas, que foram utilizadas neste

trabalho, foi padronizado o menor inoculo capaz de promover a infecção e manter

os animais vivos por um tempo maior, e assim pode realizar o estudo do perfil

sorológico de cada amostra.

4.6.1. Estoques 3, 15, 20 e Cepa RH

Os parasitos obtidos através do lavado peritoneal foram diluídos em

solução salina estéril, para os estoques 3, 15 e a cepa RH a quantidade de 100

parasitos em 0,1ml de solução, e para o Estoque 20, 50 parasitos em 0,1ml de

solução, (quantidade esta suficiente, para infectar os animais e não mata-los).

Cada inóculo e a cepa RH foram inoculados em grupos de 18

camundongos acompanhados diariamente, para exame clinico.

Os animais foram sacrificados, por deslocamento cervical, a cada 5 dias, e

o sangue retirado por punção cardíaca, centrifugado e o soro separado para a

realização da imunofluorescência indireta por um período de 60 dias.

4.6.2. Estudo da via de inoculação da Cepa ME-49 (Via Gavagem e Via Intraperitoneal)

Para a comparação das vias de infecção (gavagem e intraperitoneal), foram

utilizados dois grupos formados por 5 camundongos Balb/C, pesando de 20 a 30

gramas e com aproximadamente 30 dias. Estes grupos foram:


43

Grupo A, camundongos inoculados por via oral com 0,1ml de salina

contendo 10 cistos de T. gondii.

Grupo B, camundongos inoculados por via intraperitoneal com 0,1ml de

solução salina contendo 10 cistos de T. gondii.

4.7. Curva Sorológica da Cepa ME-49

Foram utilizados um total de 50 camundongos, divididos primeiramente em

dois grupos: 45 camundongos foram infectados por via intraperitoneal com 0,2ml

de macerado de cérebro contendo este cerca de 10 cistos e os outros cinco

animais não foram infectados, mantidos para controle negativo. Todos os animais

foram acompanhados diariamente, observando-se aspectos clínicos.

Após 20 dias da infecção, os 45 animais infectados foram subdivididos em

três grupos de 15 camundongos, sendo um grupo não tratado, e dois grupo (A e

B) tratados por 10 dias consecutivos.

No grupo A os animais foram tratados com pirimetamina e acido fólico, o

medicamento foi manipulado de acordo com o peso do camundongo, ou seja, 1mg

por 1kg. Camundongos pesando 30 gramas receberam 0,03mg da droga, que foi

diluída em 0,1ml de solução salina, e inoculados por via oral diariamente, por um

período de 10 dias. Camundongos do grupo B foram tratados com pirimetamina,

ácido fólico e sulfadiazina, em 0,1ml de solução por dia via gavagem, totalizando

10 dias, o ácido fólico foi ministrado de acordo com o peso dos animais.

A partir do quinto dia de infecção os animais do grupo infectado e não

tratado começaram a ser sacrificados, um animal a cada 5 dias. Os camundongos

dos grupos tratados começaram a ser sacrificados no quinto dia após o final do

tratamento de 10 dias. Uma amostra de sangue de cada animal sacrificado foi

coletada por punção cardíaca e o soro separado para a RIFI.

Posteriormente os resultados encontrados foram analisados através de

testes estatísticos.

5- Resultados


45

5- RESULTADOS

Os resultados serão apresentados na forma de artigo, as figuras, as

tabelas, o quadro e os gráficos estão inseridos no texto para facilitar a leitura da

banca examinadora.

A ser submetido ao Periódico Memórias do Instituto Oswaldo Cruz.

6- ARTIGO

PERFIL SOROLÓGICO EXPERIMENTAL DE CAMUNDONGOS INFECTADOS COM A CEPA

CITOGÊNICA ME-49 DE Toxoplasma gondii ANTES E APÓS-TERAPÊUTICA ESPECIFICA.

Liliane Rego Guimarães1, Aline Almeida Barbaresco1 & Ana Maria de Castro2.

(1)Mestrandas em Medicina Tropical na área de Parasitologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Publica IPTSP-UFG. (2) Profª. Adjunto da disciplina de Parasitologia e, orientadora desse estudo dentro do PPGMT no IPTSP-UFG.

Autor para correspondência: Profª. Dra. Ana Maria de Castro [email protected]. Laboratório de Biologia, Fisiologia e Imunologia de Protozoários de interesse Humano DMIPP/IPTSP-UFG. Rua 235 esq/1°Av.s/n Setor Leste Universitário, Goiânia Goiás-74605-050 Fone: (62) 3521-1840 Fax:(62) 3521-1837.


46

RESUMO

A Toxoplasmose é uma protozoose de alta prevalência no Brasil, causada pelo T.

gondii, sendo transmitida pela ingestão de alimentos contaminados com oocistos,

excretados em fezes de felinos, ou cistos, em carnes cruas ou mal cozidas. A

doença é usualmente assintomática, mas em fetos ou pacientes com

imunodepressão, podem ser devastadora. Neste trabalho foi avaliado o perfil

sorológico experimental após terapêutica especifica em camundongos isogênicos

Balb/C infectados com cepa cistogênica ME-49 de T. gondii. Cada animal foi

inoculado intraperitonealmente com 10 cistos de T. gondii (cepa ME-49) em cada

animal. Os camundongos foram divididos em três grupos com 15 animais em cada

grupo e um grupo controle negativo de 5 animais (não infectados e não tratados).

Os animais infectados foram acompanhados diariamente, observando

sintomatologia, durante 20 dias. Após este período dois grupos A e B, foram

submetidos a esquemas terapêuticos específicos; grupo A: pirimetamina

(1mg/kg/dia) +acido fólico (adicionada na dieta); grupo B: pirimetamina

(1mg/kg/dia) +acido fólico + sulfadiazina (100mg/kg/dia) por um período de 10 dias

consecutivos, por via oral. Após este período todos os animais foram sacrificados,

um a cada 5 dias, submetidos a punção cardíaca é retirado o sangue para análise

do soro por RIFI. Os animais tratados com os dois esquemas apresentaram

diminuição significativa nos títulos de anticorpos (IgG) avaliados pela reação de

imunofluorescência indireta, em relação ao grupo controle. Entre os dois

esquemas terapêuticos não houve diferença significativa. Mostrando assim que o

tratamento precoce na toxoplasmose reduz rapidamente os níveis de IgG,

sugerindo uma possível cura desta parasitose.

Palavras Chaves: T. gondii, Tratamento, cepa cistogênica ME-49


47

ABSTRACT

Toxoplasmosis is a protozoosis of high incidence in the world, caused by the

Toxoplasma gondii, transmitted by the ingestion of food contaminated by oocysts

found in feline feces, or cists in raw or underdone meat, congenitally in other

instances. The disease is usually asymptomatic, but in embryos or in

imunodrepessive patients it may be devastating. In this work, the experimental

serologic profile has been evaluated after specific therapy in isogenies mice Balbc,

infected with a cystogenic lineage ME-49 of T. gondii. Fifty animals have been

intra-peritoneal inoculated with 10 cists of T. gondii (lineage ME-49) obtained from

the maceration of mice brains of previously inoculated mice. The mice have been

divided into three groups of 15 animals each and a negative control group (not

infected and not treated) of 5 animals. All the animals have been daily

accompanied, and the symptoms were verified during 20 days. After this period,

two groups of 15 animals underwent specific therapy schemes in which; group A:

pirimetamin (12,5mg/kg/day) + folic acid; group B: pirimetamin + folic acid +

sulfadiazine orally administrated during 10 consecutive days. After this period, all

animals have been scarified, with an interval of 5 days, and the blood has been

collected by a heart puncture and the serum separated for the Indirect Immuno-

fluorescence Reaction. The samples from the treated animals presented a

significant diminution in the quantity of (IgG) antibodies evaluated by the two

schemes by the Indirect Immuno-fluorescence Reaction (t=3,5, and t=7,6

respectively), in relation to the control group. There have been no significant

differences between the two therapeutic schemes (t=0,36). Our results have shown

that the experimental precocious treatment reduces significantly the IgG levels,

suggesting a diminution of antigenic stimulus, and consequently a better prognosis

for toxoplasmosis.

Keywords: T.gondii, Treatment, ME-49 cystogenic lineage


48

INTRODUÇÃO:

A toxoplasmose, zoonose decorrente da infecção pelo Toxoplasma. gondii

(Nicolle & Manceaux 1909), tem sido considerada por Aptl (1973) como a

parasitose mais freqüente na espécie humana e, provavelmente, entre todos os

animais homeotérmicos. De natureza cosmopolita, apresenta uma prevalência

global média, a julgar pelos inquéritos sorológicos. Na maioria das vezes, o

T.gondii parasita o hospedeiro sem produzir sintomas e a exposição ao agente

infeccioso é suficiente para garantir, na maioria dos casos, sua instalação e

persistência no organismo parasitado, face à capacidade que apresenta de formar

cistos nos diversos tecidos (Mc Kinney 1973, Jones 1973), com conseqüente

indução da imunidade contra a reinfecção (Remington & Krahenbuhl 1982). Mas,

apesar da elevada freqüência de infecção inaparente, essa zoonose pode

manifestar-se como doença sistêmica severa, tal é o caso da forma congênita

(Remington 1968, Desmonds & Covreur 1974), ou da forma adquirida em

pacientes imunodeprimidos (Frenkel et al. 1975, Ruskin & Remington 1976). Desta

forma, sua importância no âmbito da saúde pública reside no fato de representar

uma apreciável causa de morbidade neonatal, com ocorrência de lesões oculares,

de intensidade variável, e alterações cerebrais graves (Frenkel 1973).

Em se tratando da transmissão congênita, o diagnóstico precoce, assim

como o tratamento antiparasitário adequado da mãe, têm demonstrado serem

capazes de reduzir a taxa de transmissão para o feto e também a gravidade das

seqüelas, nos casos em que a infecção intra-uterina já ocorreu (Hohlfeld et al.

1990, Foulon et al. 1994).


49

A confirmação da infecção materna é baseada no perfil sorológico, através

da pesquisa de anticorpos específicos e suas classes. Uma vez diagnosticada a

doença, esta é tratada com terapêutica especifica, que consiste na associação da

sulfadiazina e pirimetamina (Derouin 2001). No entanto, existem casos em que se

faz necessária a pesquisa direta de antígenos de T. gondii no material clínico, a

fim de se fazer o diagnóstico diferencial entre os vários estágios da toxoplasmose.

Temos situações onde nem sempre a pesquisa de imunoglobulinas IgG e IgM é

capaz de dar ao clinico a idéia exata da fase da infecção, se primária ou já for

reativação de cistos latentes, necessitando realizar testes em laboratórios de

pesquisa, como a inoculação em camundongos que é uma prática laboratorial

utilizada como complemento ao diagnóstico sorológico em fetos e recém-nascidos.

Acompanhando-se recém-nascidos infectados (diagnosticados e tratados

com terapêutica especifica prolongada) no Hospital das Clinicas/ UFG, observou-

se que estes apresentaram em muitos casos uma negativação da sorologia

durante e após o tratamento. Partindo dessa observação, realizou-se o bioensaio

experimental com três estoques de T.gondii isolados de material biológico,

estoque 3 (originado de sangue periférico de recém nascido), estoque 15 (de

liquido amniótico) e o estoque 20 (de sangue fetal), e acrescidos das cepa

cistogênica (cepa ME-49) e não cistogênica (Cepa RH) de Toxoplasma com a

intenção de repetir experimentalmente a curva sorológica da toxoplasmose antes

e pós tratamento especifico.


50

MATERIAIS E MÉTODOS:

Origem dos estoques: Os três estoques 03, 15 e 20 foram isolados de material

humano e mantidos criopreservadas, assim como as cepas RH e cepa ME-49.

Ensaio de infecção experimental: Foram realizadas infecções experimentais em

camundongos Balb/C, onde foram inoculados os estoques 03,15, 20 e a cepa RH

para a sua reativação. Os animais foram acompanhados diariamente e, após uma

semana da inoculação, apresentaram sintomatologia, sendo então sacrificados por

deslocamento cervical e, procedida lavagem do exudato peritoneal com solução

salina estéril, para coleta dos parasitas. Os taquizoítos presentes nos exsudatos

peritoneais foram contados na câmara de Newbauer e reinoculados em

camundongos, com aproximadamente 30 dias e pesando, em média, 30 gramas,

com inóculo mínimo de parasitos para cada estoque, que anteriormente foi

padronizado no laboratório pela curva de sobrevida dos camundongos infectados.

. Este inóculo refere-se a quantidade mínima de parasitos capazes de causar

infecção nos animais e mantê-los vivos por um tempo maior.

Curva sorológica dos estoques isolados e da cepa RH: O material inoculado

foi retirado de lavado peritoneal diluído em solução salina estéril. Para os estoques

03, 15 e a cepa RH, foi utilizada a quantidade de 100 parasitos diluída em 0,1ml

de solução salina estéril, enquanto para o estoque 20 a quantidade de 50

parasitos diluídos em 0,1ml de solução salina estéril. Foram inoculados em grupos

de 18 camundongos, sendo estes acompanhados diariamente.


51

Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical, a cada 5 dias e

colhido o sangue por punção cardíaca, sendo separado o soro para a realização

da RIFI.

Estudo da via de inoculação da cepa ME-49 (Via gavagem e via

intraperitoneal): Para estudo da via de inoculação, (gavagem ou intraperitoneal)

da cepa ME-49, foram utilizados dois grupos formados por 5 camundongos Balb/C

cada. O primeiro grupo recebeu por via oral 10 cistos, cada animal (obtidos T.

gondii macerado cerebral diluídos) em 0,1ml de solução salina. O segundo grupo

recebeu, por cada animal e por via intraperitoneal, 10 cistos de T.gondii diluídos

em 0,1ml de solução salina.

Curva sorológica da cepa ME-49: Foram utilizados 50 camundongos, onde 45

animais foram infectados por via intraperitoneal com 0,2ml de macerado cerebral,

(contendo 10 cistos), em cada animal, e cinco animais não foram infectados.

(mantidos como controle negativo). Os animais foram acompanhados diariamente,

observando sintomatologia. Após 20 dias de infecção os 45 animais infectados

foram divididos em três grupos de 15 animais, sendo um grupo formado de

animais infectados e não tratados (controle), e outro de animais tratados (grupo A

e grupo B). O tratamento foi instituído por 10 dias consecutivos. O grupo A foi

tratado com pirimetamina (1mg/kg/dia) e acido fólico (compondo a dieta), e o

grupo B com pirimetamina (1mg/kg/dia), acido fólico (compondo a dieta) e

sulfadiazina (100mg/kg/dia). As drogas foram diluídas com solventes adequados

em farmácia de manipulação (Farmadoro), e administradas por gavagem, de

acordo com o peso dos animais, num volume de 0,1ml de solução. Após os vinte

dias de infecção, mais os dez dias no qual os grupos A e B sofreram tratamentos,


52

os animais começaram a ser sacrificados por deslocamento cervical a cada 5 dias,

com coleta de uma amostra de sangue de cada animal por punção cardíaca,

sendo os soros separados para a RIFI.

RESULTADOS:

Curva sorológica dos estoques isolados e da cepa RH: As curvas sorológicas

dos estoques 3, 15, 20 e RH, não foi possível concluí-las, pois todos os

camundongos morreram em média uma semana após o inicio dos experimentos,

como demonstrado na tabela 1. O comportando dos estoques 3, 15 e 20 foi

semelhante ao da cepa RH tipo I virulenta, levando a morte todos os

camundongos inoculados, Tabela 1.

Tabela 1: Percentual de sobrevida dos estoques I-3, I-15, I-20 e Cepa RH em camundongos isogênicos inoculados Toxoplasma gondii Estoque Inóculo Mínimo por

animal

Dias/Sobrevida Mortalidade %

3 100 parasitos/animal 6 100

15 100 parasitos/ animal 7 100

20 50 parasitos/ animal 8 100

RH 100 parasitos/ animal 6 100

Estudo da via de inoculação da cepa ME- 49 (via gavagem e via

intraperitoneal): A via de inoculação da cepa ME-49 por gavagem (grupo I) e a

intraperitoneal (grupo II), não apresentaram diferenças, pois todos os animais

foram infectados. Os procedimentos estão demonstrados nas figuras 3 e 4:


53

Figura 2: Inoculação por gavagem de 0,1ml de

solução salina contendo 10 cistos de T.gondii

(cepa ME-49)

Figura 3: Inoculação intraperitoneal de 0,1ml de

solução salina contendo 10 cistos de T.gondii

(cepa ME-49)


54

Após a inoculação em cada grupo (grupo I e grupo II) estes animais foram

acompanhados diariamente, e no final de 30 dias, todos os animais foram

sacrificados, o sangue coletado e o soro utilizado para a RIFI, onde esta se

apresentou positiva nos dois grupos de estudo, ou seja, todos os animais foram

infectados, tanto por via gavagem quanto por via intraperitoneal, demonstrando

assim não haver diferença entre as duas vias de inoculação. A pesquisa de cistos

no cérebro de cada animal foi positiva, ou seja, confirmando assim a infecção

(Quadro 1).

Quadro 1: Resultados das diferentes vias de inoculação (oral e intraperitoneal) da cepa ME-49 em camundongos Balb/C. Grupo de camundongos

Vias de Inoculação

Inóculo RIFI Presença de cistos

Grupo A Gavagem 10 cistos/0,1 ml + +

Grupo B Intraperitoneal 10 cistos/0,1 ml + +

+ = Positivo

Não houve morte dos animais durante a realização da curva sorológica,

característica esta de cepa cistogênica, que cronifica e não leva a morte.

O esquema terapêutico é demonstrado segundo a tabela 2.


55

Tabela 2: Distribuição dos animais estudados segundo tratamento instituído.

Grupo de camundongos

Número de animais

Inóculo Tratamento Sobrevida

Infectados não tratados

15 10 cistos/ 0,1 ml de solução

NT 100%

Infectados Tratados Grupo A


Pirimetamina e Ácido Fólico

100%

Infectados Tratado Grupo B


Pirimetamina,Ácido Fólico

e Sulfadiazina

100%

Não infectado Grupo

Controle

5 SI NT 100%

NT= Não tratado, SI = Sem inoculo


56

Curva sorológica experimental da cepa ME-49 antes e pós terapêutica

especifica: De acordo com os dados obtidos, a resposta humoral inicia-se com a

detecção da IgM após o décimo dia de infecção, com seu pico e declínio logo a

seguir. A IgG começou a ser detectada a partir do 10º dia, com seu pico no 20º

dia apresentando titulo de 1/160, como demonstra o gráfico 1.

GGGráfico 1: Detecção dos níveis de anticorpos (IgM e IgG), nos soros de camundongos não tratados, infectados com cepa cistogênica ME-49 de T. gondii, durante o período de 30 dias.

A partir destes dados foram analisados apenas a produção de IgG, pois

esta imunoglobulina permanece na fase crônica, sendo assim possível o seu

estudo.

Já a imunoglobulina IgM é um marcador de fase aguda e aparece no inicio

da infecção. Mas há uma queda na titulação após 15 dias, não sendo possível


57

detectá-la por RIFI não sendo assim possível o seu acompanhamento por um

tempo maior.

Os camundongos infectados e não tratados apresentaram títulos de 1/160 a

1/320, mantendo estes títulos até o final do experimento, como demonstra o

gráfico 4, confirmando a manutenção da infecção.

Os camundongos infectados e tratados, tanto o grupo A quanto o grupo B

apresentaram uma diminuição nos títulos (níveis de IgG) no decorrer do tempo.

As amostras provenientes dos animais tratados apresentaram diminuição

significativa nos títulos de anticorpos (IgG) avaliados com os dois esquemas, pela

reação de imunofluorescência indireta (t=3.5, e t=7,6 respectivamente), em

relação ao grupo controle. Entre os dois esquemas terapêuticos não houve

diferenças significativas (t=0,36). Nossos resultados demonstraram que o

tratamento experimental precoce reduz significativamente os níveis de IgG,

sugerindo uma diminuição do estimulo antigênico, e conseqüentemente um melhor

prognóstico para toxoplasmose como demonstrado no gráfico 2.


58

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

160160160160

80

160160

80

160

80

40

320

80

40

160

4040

320

40

80

160

2040

320

4040

320

4020

320

4020

160

2020

160

0

50

100

150

200

250

300

350T ítulo

Dias

G rupo A G rupo B Infec . Não Tratatos

Gráfico 2: Perfil da Imunoglobulina da classe G (IgG), em um grupo de camundongos isogênicos infectados com a cepa ME-49 de Toxoplasma gondii tratados e não tratados com terapêutica especifica, acompanhados por 60 dias, Grupo A tratado com pirimetamina +acido folico, Grupo B tratado com pirimetamina, sulfadiazina e acido fólico.


59

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO:

Diante de nossos dados, optamos por uma discussão em duas fases

distintas, sendo que na primeira concentraremos no comportamento dos estoques

(I-3, I-15 e I-20) e da cepa RH durante o estudo do perfil sorológico, e na segunda

discutiremos o perfil sorológico da cepa ME-49, antes e pós-tratamento.

Diferenças na virulência de amostras de T. gondii têm sido relatados em

vários estudos, através da inoculação em animais de laboratório. Os resultados

obtidos no presente estudo demonstraram a alta virulência dos estoques isolados,

(I-3, I-15 e I-20), com comportamento semelhante ao demonstrado pela cepa RH

que apresenta alta virulência (Sabin 1941) e incapacidade de produzir cistos e

oocistos (Frenkel et al. 1970, Howe & Sibley 1995). Desta forma não foi possível

concluir as curvas sorológicas dos estoques isolados, pois todos os animais

morreram em média uma semana após o inóculo. Resultados compatíveis

também foram descritos por Derouin (1992), no estudo de vários isolados

comparados à cepa RH.

O aparecimento de anticorpos da classe IgM como primeira imunoglobulina

efetora da resposta imune, é descrito na esquistossomose (Kanamura 1978) e em

várias outras infecções, como toxoplasmose (Amato Neto 1972) e doença de

Chagas (Vattuone 1973). Segundo Camargo (1996), qualquer titulo de anticorpo

IgM traduz infecção recente independente da existência ou não de títulos de

anticorpos IgG. A presença da IgM pode ser uma marca de contágio recente onde

estes anticorpos aparecem e desaparecem logo, esse comportamento corrobora

com os dados obtidos neste trabalho,com a cepa ME-49, pois dos isolados


60

inoculados I-3, I-15 e I-20, a cepa RH não foi possível a avaliação da curva

sorológica pela rápida mortalidade dos animais,( máximo de sete dias).

A cepa ME-49 de T.gondii foi isolada originalmente da musculatura de

carneiro, é uma cepa cistogênica e considerada avirulenta ou de baixa virulência

(Lunde & Jacobs 1983). Foi analisada neste trabalho apenas o perfil sorológico da

cepa ME-49, pois com ela foi possível a detecção da IgM em torno do 10º dia e

seu rápido declínio, e surgimento da IgG, que permanece no soro por um tempo

maior, sendo possível assim o seu acompanhamento.

A curva sorológica da cepa ME-49 de T.gondii antes e pós-tratamento

especifico, nos mostrou que, com o tratamento, há uma diminuição na produção

de anticorpos IgG, provavelmente devido à diminuição de estimulo antigênico

(parasito). Estudos terapêuticos utilizando a associação azitromicina-pirimetamina,

em camundongos com toxoplasmose aguda, mostraram a eliminação dos

parasitos do sangue e pulmões de camundongos infectados, e redução da taxa de

mortalidade, revelando proteção significativa dos animais tratados quando

comparados com os controles infectados e não tratados (Amato Neto 1995).

Os resultados do presente estudo indicam que tanto, a pirimetamina quanto

a sulfadiazina associada à pirimetamina, promoveram um decréscimo na produção

da imunoglobulina IgG. E entre os animais tratados, nos dois esquemas

terapêuticos comparados com os não tratados, o tratamento mostrou eficiência

tanto na administração isolada quanto associada Bosch-Dresser 2002,

empregaram essa associação em pacientes com lesões oculares de toxoplasmose

e obtiveram resultados semelhantes aos da associação pirimetamina-sulfadiazina


61

com relação à eficácia, além de observarem menor incidência de efeitos

colaterais.

Embora já existam outros medicamentos com reconhecida atividade

antitoxoplasma, como a clindamicina, o sulfametoxazol, o trimetoprim e a

espirimicina, nenhum apresenta atividade contra os cistos do parasito. É, portanto,

prioritária na terapêutica da toxoplasmose, a descoberta de medicamentos que

possam eliminar o microorganismo, particularmente em sua forma cística (Luft &

Remington 1992), para evitar as recaídas de infecção.

Vários trabalhos sobre a associação de medicamentos, como citado acima,

demonstram a eficácia da terapêutica sobre a parasitemia, porém a avaliação dos

níveis de anticorpos não é citada. Nas infecções chagásicas crônicas, o

tratamento não interfere rapidamente nos níveis de anticorpos, (Cansado et al.

1976, Luquetti & Castro 1997) sendo que o seu declínio vai acontecendo ao longo

do tempo, mas isto não é o que aparentemente acontece com a toxoplasmose

humana, de acordo com os achados deste estudo.

O tratamento da gestante e do recém nascido com toxoplasmose congênita,

podem prevenir ou atenuar a doença. Este estudo evidenciou a diminuição do

estimulo antigênico após terapêutica precoce da infecção toxoplasmica. E pode

ser o inicio de outros trabalhos experimentais para estudo de camundongos

inoculados com as cepas agressivas do tipo RH, que reproduzem de forma mais

semelhante à infecção humana (tratados antes do 5°dia). E mostram a

necessidade de se fazerem estudos de tratamento mais prolongado em


62

camundongos infectados, para confirmação da negativação sorológica dos

mesmos e assim confirmar a cura dessa protozoose.


63

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CONCLUSÃO GERAL:

• Os estoques 3, 15, 20 possuem comportamento biológico semelhante à cepa

RH;

• Curva sorológicas ME-49, confirmou a dinâmica das imunoglobulinas IgM e IgG,

encontrada na infecção humana;

• No grupo dos camundongos infectados e não tratados, a IgG se manteve

elevada pelo período analisado;

• Nos grupos A e B, dos camundongos tratados foi observado uma diminuição dos

níveis de IgG, após 20º dia do tratamento;

• A associação da sulfadiazina ao esquema terapêutico, sugere uma maior inibição

da produção de IgG.

7- Referências Bibliográficas da Dissertação


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7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA DISSERTAÇÃO

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8.1. Roteiro para preparação de Dissertação de Mestrado e Tese de Doutorado no PPGMT.


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8.2. Normas adotadas pelo Periódico Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. www.fiocruz.br

ISSN 0074-0276 versão impressa

ISSN 1678-8060 versão on-line

INSTRUÇÕES AOS AUTORES

• Objetivos e política editorial • Formato e estilo

• Checklist para os manuscritos

Objetivos e política editorial

As Memórias do Instituto Oswaldo Cruz são uma revista multidisciplinar que publica pesquisas originais relativas aos campos da medicina tropical (incluindo patologia, epidemiologia de campo e estudos clínicos), parasitologia médica e veterinária (protozoologia, helmintologia, entomologia e malacologia) e microbiologia médica (virologia, bacteriologia e micologia). A revista aceita, especialmente, pesquisas básicas e aplicadas em bioquímica, imunologia, biologia molecular e celular, fisiologia, farmacologia e genética relacionada a essas áreas. Comunicações breves são também consideradas. Artigos de revisão só quando solicitados. Ocasionalmente, trabalhos apresentados em simpósios ou congressos são aparecem como suplementos.

Os artigos apresentados devem ser escritos preferencialmente em inglês. Quando neste idioma, devem ser checados por alguém que tenha o inglês como primeira língua e que, preferencialmente, seja um cientista da área.

A submissão de um manuscrito às Memórias requer que este não tenha sido publicado anteriormente (exceto na forma de resumo) e que não esteja sendo considerado para publicação por outra revista. A veracidade das informações e das citações bibliográficas é de responsabilidade exclusiva dos autores.

Os manuscritos serão analisados por pelo menos dois pareceristas; a aprovação dos trabalhos será baseada no conteúdo científico e na apresentação.

Todo o material deve ser enviado para a Produção Editorial, Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Av. Brasil 4365, Pavilhão Mourisco, sala 308, 21045-900 Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

Os manuscritos que não estiverem de acordo com estas instruções serão imediatamente devolvidos.


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Ao encaminhar um manuscrito para a revista, os autores devem estar cientes de que, se aprovado para publicação, o copyright do artigo, incluindo os direitos de reprodução em todas as mídias e formatos, deverá ser concedido exclusivamente para as Memórias. A revista não recusará as solicitações legítimas dos autores para reproduzir seus trabalhos.

Favor providenciar e checar cada item abaixo antes de submeter seu manuscrito para as Memórias do Instituto Oswaldo Cruz:

• Carta de submissão do trabalho, assinada por todos os autores, especificando o autor de contato, bem como endereço, telefone, fax e e-mail.

• O manuscrito (incluindo tabelas e referências) deve ser preparado em um software para edição de textos, em espaço duplo, fonte 12, impresso em papel padrão e paginado. As margens devem ser de pelo menos 3 cm.

• A seqüência do artigo deve ser: título resumido (com até 40 caracteres - letras e espaços), título (com até 250 caracteres), autores (sem títulos ou graduação), afiliação institucional (endereço completo somente do autor correspondente), resumo, palavras-chave, notas de rodapé indicando a fonte de financiamento ou mudanças de endereço, introdução, material e métodos, resultados, discussão, agradecimentos (os mínimos necessários), referências, tabelas (fora do texto e com título), e figuras (com legendas em folha separada).

• Só as referências citadas no texto devem aparecer nas lista e devem seguir o estilo do Index Medicus. Se a referência for de artigo ainda não publicado, mas já aceito, deverá ser apresentada carta da revista que publicará o manuscrito ou de outros autores autorizando a referida citação.

• Para maiores informações sobre o formato e o estilo da revista, favor consultar um número recente da Revista ou entrar em contato com a Editoria Científica pelo telefone (+55-21-2598.4335), fax (+55-21-2561.1442 / 2280-5048), ou e-mail ([email protected] / [email protected]).

Formato e estilo

O manuscrito deve ser organizado de acordo com a seguinte ordem: título corrente, título, nomes dos autores, afiliações institucionais, resumo, palavras-chave, introdução, materiais e métodos, resultados, discussão, agradecimentos e referências. Patrocínios devem ser mencionados em nota de rodapé na primeira página.

Resumo: Com até 200 palavras (100 palavras no caso de comunicações breves), o resumo deve apresentar os objetivos do estudo ou pesquisa, seus procedimentos básicos (seleção dos temas de estudo ou animais de laboratório; métodos analíticos ou de observação), as principais descobertas ou resultados (oferecendo dados específicos e seu significado estatístico, se possível), e as principais conclusões. Deve enfatizar novos e importantes aspectos do estudo ou observações.


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Palavras-chave: Devem ser fornecidos de 3 a 6 termos, de acordo com a lista Medical Subject Headings (Mesh) do Index Medicus.

Introdução: Deve determinar o propósito do estudo, oferecer um breve resumo (e não uma revisão de literatura) dos trabalhos anteriores relevantes, e especificar quais novos avanços foram alcançados através da pesquisa. A introdução não deve incluir dados ou conclusões do trabalho em referência.

Materiais e métodos: Deve oferecer, de forma breve e clara, informações suficientes para permitir que o estudo seja repetido por outros pesquisadores. Técnicas padronizadas bastam ser referenciadas.

Ética: Ao descrever experimentos relacionados a temas humanos, indicar se os procedimentos seguidos estiveram de acordo com os padrões éticos do comitê responsável por experimentos humanos (institucional ou regional) e de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, revisada em 1983. Não citar os nomes ou iniciais dos pacientes ou registros de hospitais, especialmente nos materiais ilustrativos. Ao relatar experimentos em animais, indicar se diretrizes de conselhos de pesquisa institucionais ou nacionais, ou qualquer lei nacional relativa aos cuidados e ao uso de animais de laboratório foram seguidas.

Resultados: Devem oferecer uma descrição concisa das novas informações descobertas, com o mínimo julgamento pessoal. Não repetir no texto todos os dados contidos em tabelas e ilustrações.

Discussão: Deve limitar-se ao significado de novas informações e relacionar as novas descobertas ao conhecimento existente. Somente as citações indispensáveis devem ser incluídas.

Agradecimentos: Devem ser breves e concisos e se restringir ao absolutamente necessário.

Referências: Devem ser precisas. Somente as citações que aparecem no texto devem ser referenciadas. Trabalhos não publicados, a não ser os já aceitos para publicação, não devem ser citados. Trabalhos aceitos para publicação devem ser citados como "in press"; nesse caso, uma carta de aceitação da revista deverá ser fornecida. Dados não publicados devem ser citados somente no texto como "unpublished observations"; nesse caso, uma carta com a permissão do autor deve ser fornecida. As referências ao final do manuscrito devem ser organizadas em ordem alfabética de acordo com o sobrenome do primeiro autor.

Os títulos de revistas devem ser abreviados de acordo com o estilo usado no Index Medicus. Consultar a List of Journals Indexed no Index Medicus publicada no número de janeiro do Index Medicus ou no website http://www.nlm.nih.gov/serials/lii.html.


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- No texto, usar o sobrenome dos autores e a data:

Lutz (1910) ou (Lutz 1910).

Com dois autores, a forma é

(Lutz & Neiva 1912) ou Lutz and Neiva (1912).

Quando há mais que dois autores, somente o primeiro é mencionado:

Lutz et al. (1910) ou (Lutz et al. 1910).

- No final do trabalho, usar os seguintes estilos:

Artigo de revista

Chagas C, Villela E 1922. Forma cardíaca da tripanosomiase americana. Mem Inst Oswaldo Cruz 14: 15-61.

Livro ou Tese

Morel CM 1983. Genes and Antigens of Parasites. A Laboratory Manual, 2nd ed., Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, xxii + 580 pp.

Capítulo de livro

Cruz OG 1911. The prophylaxis of malaria in central and southern Brasil. In R Ross, The Prevention of Malaria, John Murray, London. p. 390-398.

Ilustrações: As ilustrações devem ser limitadas ao mínimo necessário para exemplificar estruturas ou condições particulares, para sintetizar dados ou para registrar resultados quantitativos. Detalhes de resultados apresentados nessa forma não devem ser repetidos no texto. Figuras e tabelas devem ser compreensíveis sem a necessidade de referência ao texto.

- Figuras devem ser apresentadas em uma folha de mesmo tamanho que as do manuscrito. As fotografias devem ser bem nítidas, com alto contraste, ampliadas em preto e branco em papel brilhante. As fotografias e os desenhos devem ser marcados no verso com o nome do autor, o número da figura e uma seta indicando a parte de cima da ilustração. Se apresentadas lâminas, as figuras devem ser numeradas consecutivamente em algarismos arábicos. As escalas devem ser indicadas por uma linha ou barra na figura, e referenciadas, se necessário, na legenda (por exemplo, bar = 1 mm etc.). Lâminas e gráficos devem ajustar-se tanto em uma coluna (7 cm) ou na largura completa (14.5 cm) da página, e devem ser menores que a página para permitir a inclusão da legenda. As legendas devem ser encaminhadas em uma folha separada. As letras e


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números nas figuras devem ter tamanho legível após a redução ou a impressão. Ilustrações coloridas somente podem ser aceitas se os autores assumirem os custos. Por outro lado, uma fotografia colorida ilustra a capa de cada fascículo de Memórias, e os autores são convidados a submeter para consideração da revista ilustrações com legendas de seus manuscritos que poderão vir a ilustrar a capa sem custos para os autores.

- Tabelas devem complementar, e não duplicar, o texto. Elas devem ser numeradas em algarismos romanos. Um título breve e descritivo deve constar no alto de cada tabela, com quaisquer explicações ou notas de rodapé (identificadas com letras a, b, c etc.) colocadas abaixo.

Comunicações breves devem ser breves e diretas. Seu objetivo é comunicar com rapidez resultados ou técnicas particulares. As comunicações não devem ocupar mais do que quatro páginas impressas, incluindo figuras e/ou tabelas. Não devem conter referências em excesso. As referências devem ser citadas no final do texto, usando o mesmo formato para artigos originais. Um resumo breve e três palavras-chave devem ser apresentados.

Formato alternativo: Os manuscritos podem ser submetidos seguindo os "Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals" produzidos pelo International Committee of Medial Journal Editors, também conhecidos como Vancouver Style. Nesse caso, os autores devem seguir as diretrizes da quinta edição (Annals of Internal Medicine 1997; 126: 36-47, ou no website http://www.acponline.org/journals/resource/unifreqr/htm), sendo responsáveis por modificar o manuscrito onde diferir das instruções aqui apresentadas, se o manuscrito for aceito para publicação. Os autores também deverão seguir os Uniform Requirements para quaisquer outras diretrizes omitidas nestas instruções.

Uma vez que um trabalho seja aceito para publicação, os autores devem enviar:

um disquete contendo o texto completo da versão final aprovada do manuscrito (incluindo tabelas e gráficos), processado em um editor de texto como Word ou Word Perfect para Windows (formato Macintosh deverá ser convertido);

- uma declaração assinada por todos os autores afirmando que:

(i) todos os dados contidos no trabalho são precisos; (ii) todos os autores participaram do trabalho de forma substancial e estão preparados para assumir responsabilidade pública pelo seu conteúdo; (iii) o manuscrito ora apresentado a essa revista não está sendo publicado no todo ou em parte por outra revista, assim como não está sendo encaminhado para outra publicação. Autores de diferentes países ou instituições podem assinar em diferentes folhas que contenham a mesma declaração;


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- uma declaração de copyright fornecida pela produção editorial da revista, assinada pelo autor responsável pela correspondência.

Taxas: A revista não cobra taxas para publicação.

Provas: Serão enviadas provas tipográficas aos autores para a correção de erros de impressão. As provas devem retornar para a Produção Editorial na data estipulada. Outras mudanças no manuscrito original não serão aceitas nesta fase.

Separatas: Os autores receberão 30 separatas gratuitamente. Junto, um formulário de pedidos e uma lista de preços serão enviados aos autores, permitindo que novas separatas sejam solicitadas.

PERFIL SOROLÓGICO EXPERIMENTAL DE … · Normas adotadas pelo periódico Memórias do Instituto...

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