Pesquisas em genoma funcional - O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados - O genoma de...
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Pesquisas em genoma funcional
- O genoma de 45 microorganismos já foram sequenciados
- O genoma de duas plantas completamente sequenciado
- Genoma de Drosophila completamente sequenciado
Grande numero de programas de sequenciamento aleatorio de sequencias (EST) Expressas está em andamento em vários diferentes organismos e espécies
Fatos:
- Barateamento do preço dos sequenciamento
“Revolução” da pesquisa na área de ciências biológicas
Quando? Década de 90
Porque? Universalização e desenvolvimento das técnicas de DNA recombinante
Desenvolvimento de novas tecnologias para sequenciar DNA e proteinas
- Sequenciamento do genoma humano proximo de seu termino
- Genoma do camundongo completamente sequenciado
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Consequências atuais
- Grande quantidade de informação disponível
- Formação de grandes consórcios de pesquisa: Projeto 2010
- Análise científica mais holística
Consequências futuras:
- Predição dos fenótipos que resultariam de mudancas genéticas específicas
- Identificar quais mudanças genéticas poderiam acelerar a domesticação de espécies selvagens
Facilitar a manipulacao genética que garantiria a manutenção e expansão das bases de germoplasma
Descrição dos mecanismos responsáveis pela heterose; habilidade de utilizar este fenômeno mais efetivamente
Melhor compreensão da base genética da plasticidade fenotípica
Caracterização do grupo mínimo de genes para o funcionamento de um organismo
Compreensão da base genética da evolução::: melhor compreensão da diversidade da vida na terra
Compreensão das interações entre os organismos e seu ambiente a nível de ecosistema
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Montagem de uma combinação de genótipos em plantas transgênicas
Estudos genéticos
Testes funcionais
Estudos de expressão in situ
Estudos das interações
Clonagem e sequênciamentoData mining
Posição no mapa gen. ou físico;Baseado na inserção de
sequência alvo
Estratégia de Genoma funcional: Ex: tolerância a estresses abióticos
Descoberta de genes
Homologia como critério para identificar genes em bancos de sequências EST e genômicas
Estudo expressão gênica em larga escala
cDNA macro/microarrays; genechips
Seleção de mutantes
EMS, radiação, T-DNA, transposons
Criação e análise de um banco de dados
Complementação leved.
Mutante em Arabidopsis
Superexpressão
Antisenso.
Supressão por RNAi
Sistema duplo-hibrido de leveduras
Phage display
Interação in vitro (crom. Afinidade, imunoprecipitação
AlelismoAditividade
EpistasiaSupressãoFusão proteína com GFP
Expressão GFP ou luciferina com o promotor
Construção de modelos de controle dos processos envolvidos
Modificação de plantas de interesse agrícola baseados nesses modelos: modificação simultâneada expressão de vários genes
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Transcriptoma:
Análise dos níveis de RNAde varios genes simultaneamente
Um genoma possui variostranscriptomas
…varios transcriptomas temporais
Ex: tempo apos sujeicao a um estresse
Ex: tempo apos uma determinada fase do desenvolvimento
…varios transcriptomas espaciais
Ex: transcriptoma celular-especifico
Ex: transcriptoma tecido-especifico
Ex: transcriptoma orgao-especifico
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Etapas para a realizacao de um transcriptoma
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1) Filme Macroarray.mov
2) Filme oligochip.mov
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Isolamento de DNAdo banco de cDNA
1a Etapa de um transcriptoma
Preparacao do Micro/Macroarranjo(Micro/macroarray)
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2a Etapa de um transcriptoma: produção da sonda
Duraçãodo protocolo: 5 horas
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2a Etapa de um transcriptoma: hibridação
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3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem
Typhoon: Fosforescência,quimioluminescência; fluorescênica
DNA alvo imobilizado: cDNA do genótipo toleranteSonda marcada com o fluorocromo “verde”: genótipo tolerante na ausência do estresseSonda marcada com o fluorocromo “vermelho”: genótipo tolerante na presença do estresse
Gene com reduzida expressãona presença do estresse
Gene expressão acentuadana presença do estresse
Genes sem alteraçãona expressão
a
bd
Nível de expressão na presença do estresse:a) + x%
b) + y% (y>x)c) -z%
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3a Etapa de um transcriptoma: obtenção e análise da imagem
11
2 3
4
5
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Descoberta da função de genes desconhecidos
Análise da homologia das sequênciasAnálise da biologia molecular do gene: co-regulação?
Confirmação pela genética reversa
6626 genes alvos19 sondas
197 genes orgão-específicosraiz=64
folha=94flor=36
influorescencia=3
Matriz da expressãonos orgaos
Analise da abundância do transcrito
Agrupamento deexpressão global
Exemplo de data mining
Agrupamento
Dinamica daexpressao
Identificação de sequências regulatórias
Caracterizacaogene/rota
347 genes constitutivos
5247 genes alvossondas: 5 pontos temporais
8300 genes alvos
Sondas:
folha =6raizes=4flores=2
Siliqua=3Influorescencia=2
Plantula=2
Zhu et al. (2001) Plant Physiol Biochem 39,221-241
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Exemplos de análise dos dados de um transcriptoma
Análise de agrupamento da expressão de fatores transcripcionais na resposta a diferentes estresses
ambientais em Arabidopsis
Comparação dos transcriptomas na presença de dois diferentes estresses
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Análise de Grupos: 2 genótipos
Genótipo sensível ao estresse salino: IR29 (direita)
Genótipo tolerante ao estresse salino: Pokkali (esquerda)
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Comparação de diferentes transcriptomas temporais durante um processo celular
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Diferentes Transcriptomas de genes que responde a estresses abióticos
Classe 1: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos associada ao f ator
transcripcional DREB1A
Classe 2: genes da rota de transdução de sinal à estresses abióticos independente do f ator
transcripcional DREB1A
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Confirmação dos resultados do transcriptoma: análise por Northern Blot
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Classes de genes afetadas pelo estresse salino
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Análise de grupos: Transcriptomas da resposta a patógeno
Sonda 1e 2: Mutantes na síntese de ácido salicílico
Sonda 3: Mutantes na síntese de ácido jasmônico
Sonda 4: Mutantes na síntese do etileno
DNA alvo: fatores transcricionais do genoma de Arabidopsis
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Kits completos com microarranjos com oligonucleotideos e sonda de referencias
Vantagens:oligonucleotideos escolhidos baseados em regioes com baixa homologia a outros genes
- estringencias das pos-lavagens pode ser maior: menor nivel de hibridizacao cruzada
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Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic and cold stress
8100 genes (Genechip)
Genes > 2x = Total 2678 Genes
ControleMeio Fresco
741 genes
4oC
2086 genes
58% 42%
Manitol(200 mM)
NaCl(100 mM)
1123 genes
46% 53%
1008 genes
Raízes: 3 horas após
NaCl Manitol
4oC
85
235
106
65
78 29
375
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Folhas: 3 horas após
NaCl Manitol
4oC
279
243
68
65
78 29
120
Raízes: 3 horas após
NaCl Manitol
4oC
85
235
106
65
78 29
375
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Raízes: 27 horas após
NaCl Manitol
4oC
63
1111
9
5
59 23
87
Folhas: 27 horas após
NaCl Manitol
4oC
82
1094
4
19
47 90
59
Folhas: 3 horas após
NaCl Manitol
4oC
279
243
68
65
78 29
120
Raízes: 3 horas após
NaCl Manitol
4oC
85
235
106
65
78 29
375
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Raízes: Sobreposição entre 3 e 27h
NaCl Manitol
4oC
6
173
4
2
9 8
22
Folhas: Sobreposição entre 3 e 27h
NaCl Manitol
4oC
40
188
4
8
5 40
5
Estresse salino: sobreposição 3-27 h na raizEstresse por frio: sobreposição 3-27h
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Estresses regula a expressão de mais de 370 genes cuja função é totalmente desconhecidaÇPistas: especificidade de tecido e regulação por múltiplos estresses: CBF1 e ABA2 sim folha, não raiz
Maioria das mudanças são estimulo-específicas: sob. De 5% e 0,5% (3-27h)
200 mM Manitol=100 mM NaClÇ 40% sobreposição foi observada em folhas (sem contato)
Frio alterou 2 vezes mais a expressão gênica do que os outros estressesMais induzido gene ELIP: liga a chl a
Maioria das sobreposições foram específicas à folhas ou raízes
Sobreposições podem ser perdidas em experimento que examina um limitado número de pontos temporais ou ignora as diferenças tecido-específicas
3 -> 27h: redução em 4 vezes nas respostas comuns: respostas mais específicas a cada estresse se seguem após o choque inicial
Transcriptoma do estresse ao frio: movimento para um novo e diferente “steady-state”
Raízes e folhas apresentam diferentes modificações no seu transcriptoma para cada estresse:ExÇ 86% das mudanças induzidas pelo frio não são compartilhadas entre folhas e raízes
Maioria 2409 genes reg. pelo estresse: não tem seq tipicas dos fat. transc. CBF1 e DREB1:a) Presença de outros elementos importantes nas sequências dos promotores
b) Um grande número de mudanças podem ser causadas por diferenças na estabilidade do RNA ao invés da reg transc.
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Segregacao alelica
Transcriptoma
Caracteriz. do fenotipo
Proteoma
Caracteriz. do genotipo
Identificacao degenotipos tolerantes
e susceptiveis
Transcriptoma e proteoma
Identificacao de genes eproteinas associados a tolerancia
Mapeamento de populacoes
QTL
Locus genico candid.
Locus quant. transcrito
Locus quant. proteina
Mapa genetico
Identificacao de genes/marcadores
ligados a tolerancia
Selecao assistida por marcadores
Transformacao
Melhoramentomolecular
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Sugestao de proposta para elaboracao de projeto genoma funcional na UFV: 1) transcriptoma
Em colaboracao:Instituto de Quimica USP
Embrapa-CenargemUnicamp
UNESP-Araraquara
Realizado na UFV
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Múltiplas repetições : teste de repetibilidade: anãlise estatística : seq. diferentes
Melhores resultados
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