PINHÃO-MANSO (Jatropha curcas L.): ASPECTOS …livros01.livrosgratis.com.br/cp120254.pdfFICHA...

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO E ESTUDOS EM RECURSOS NATURAIS

PINHÃO-MANSO (Jatropha curcas L.): ASPECTOS SÓCIO-ECONÔMICOS E A FISIOLOGIA DE SEMENT ES

MARCILENE DE JESUS CALDAS COSTA

2009

Livros Grátis

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO E ESTUDOS EM RECURSOS NATURAIS


PINHÃO-MANSO (Jatropha curcas L.): ASPECTOS SÓCIO-ECONÔMICOS E A FISIOLOGIA DE SEMENTES

Dissertação apresentada à UniversidadeFederal de Sergipe, como parte dasexigências do Curso de Mestrado emAgroecossistemas, área de concentraçãoSustentabilidade em Agroecossistemas,para obtenção do título de “Mestre”

Orientadora

Profa. Dra. Renata Silva-Mann

SÃO CRISTÓVÃOSERGIPE-BRASIL

2009

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRALUNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

C837pCosta, Marcilene de Jesus Caldas

Pinhão-manso (Jatropha curcas L.) : aspectos sócio-econômicos e a fisiologia de sementes / Marcilene de JesusCaldas Costa. – São Cristóvão, 2009.

80 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Agroecossistemas) – Núcleo dePós-Graduação e Estudos em Recursos Naturais, UniversidadeFederal de Sergipe, 2009.

Orientadora: Profª. Drª. Renata Silva -Mann.

1. Agroecossistemas. 2. Cultura do Pinhão -manso – Jatrophacurcas L. – Sergipe. 3. Biodiesel – Programa Nacional de Produçãoe Uso do Biodiesel (PNPB). 4. Desenvolvimento sustentável -Oleaginosas – Produção agrícola. I. Título.

CDU 504:633.85:662.6/.9(813.7)


SEMENTES DE PINHÃO-MANSO (Jatropha curcas L.): ASPECTOSSÓCIO-ECONÔMICOS E A FISIOLOGIA DE SEMENTES

Dissertação apresentada à UniversidadeFederal de Sergipe, como parte dasexigências do Curso de Mestrado emAgroecossistemas, área de concentraçãoSustentabilidade em Agroecossistemas,para obtenção do título de “Mestre”

APROVADA em de 2009

Profa. Dra Roberta Miranda FernandezUniversidade Federal de Sergipe

Prof. Dr. Robério Anastácio FerreiraUniversidade Federal de Sergipe

Profa. Dra. Renata Silva-MannUniversidade Federal de Sergipe

(Orientadora)

SÃO CRISTÓVÃOSERGIPE-BRASIL

Aos meus pais, Benedito e Maria de Jesus, pelo exemplo e apoioem todas as etapas de minha vida, pelos exaustivos

sacrifícios, às custas da minha ausência, pelo amor incondicional e pelos mais sábiosensinamentos.

Aos meus queridos irmãos pelo carinho e amizade .

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo na minha vida.

À Universidade Federal de Sergipe e à Pró-Reitoria de Pós Graduação e Pesquisa -POSGRAP.

Ao Núcleo de Pós-Graduação e Estudos em Recursos Naturais – NEREN,especialmente à Rogena Amaral e Dr. Arisvaldo Vieira Mello Junior , pela solicitude.

À Dra. Renata Silva-Mann, pela orientação prestada, pela atenção e apoio dispensado, epela confiança depositada durante toda a realização deste trabalho.

A todos os mestres do NEREN, especialmente, ao professor Dr. Robério AnastácioFerreira e Dra. Laura Jane Gomes, pela atenção.

Aos colegas do Mestrado em Agroecossistema s pelos bons momentos juntos, emespecial a Trícia Pergentino, que compartilhou comigo alegrias e angústias.

Ao Leandro Chaves pelo carinho, atenção, compreensão e apoio em todos os momentos.

À todos colegas da UFS, que estiveram dispostos a ajudar no que fosse preciso.

Aos colegas do Laboratório de Genética Molecular: Sheila Carvalho, Marília Freitas,Itamara Bonfim, Danilla Lemos, Glauber, Tallyta, Rafaela Montalv ão, Susi Alves, portoda paciência e ajuda em todos os momentos da realização deste trabalho.

Aos colegas do Laboratório de Tecnologia de Sementes: Marcus Vinicius, Michele,Ulisses, Andreza Oliveira, Thaiza Monteiro, Larissa Whitte, por toda paciência e ajudaem todos os momentos da realização deste trabalho.

Aos verdadeiros amigos, Fernanda Carla, Patrícia Olivei ra, Rita de Cássia, Noé VonAtzingen, pessoas que me ajudaram em todos os aspectos. Valeu pela compreensão,carinho e atenção. Sou grata.

Ao Prof. Dr.Kleber Oliveira pela ajuda no trabalho com o programa SPSS.

Aos agrônomos do PROQUERA, em especial Ânge la, Antonio, Ivenilson e Valdo pelosmomentos fantástico conhecendo o Estado de Sergipe.

SUMÁRIO

LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES iÍNDICE DE TABELAS iiÍNDICE DE FÍGURAS iiiRESUMO GERAL vABSTRACT vii

CAPÍTULO 1 11. INTRODUÇÃO GERAL 12. REFERENCIAL TEÓRICO 32.1 Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel (PNPB) 32.2 Sustentabilidade para a produção agrícola de oleaginosas 42.3 Espécie Jatropha curcas L. 52.4 Qualidade e germinação de sementes versus sustentabilidade 72.5 Fisiologia do estresse em sementes 92.6 Marcadores Bioquímicos em sementes submetidas ao estresse 102.7 Expressão gênica em sementes sob estresses 123-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 17

CAPÍTULO 2 PROGRAMA NACIONAL DE PRODUÇÃO E USO DEBIODIESEL (PNPB) E INDICADORES DE SUSTENTABILIDADEPARA O ESTADO DE SERGIPE 241. RESUMO 242. ABSTRACT 253. INTRODUÇÃO 264. MATERIAL E MÉTODOS 284.1 Caracterização da área de estudo 284.2 Coleta e Análise das Informações 294.2.1 Aplicação dos questionários 294.2.2 Seleção de indicadores de sustentabilidade 305. RESULTADOS E DISCUSSÃO 315.1 Características dos produtores e da área pesquisada 315.2 Atividades agrícolas desenvolvidas 325.3 Plantas oleaginosas conhecidas pelas famílias 345.4 Conhecimento do PNPB no Estado de Sergipe 385.5 A cultura do pinhão-manso (Jatropha curcas L.) 415.6 Seleção de Indicadores de Sustentabilidade 436. CONCLUSÕES 487. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 49

CAPITULO 3. AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA EM SEMENTESDE PINHÃO-MANSO (Jatropha curcas L.) SUBMETIDAS AO ESTRESSECOMBINADO DE RESTRIÇÃO HÍDRICA E TEMPERATURA

51

1. RESUMO 512. ABSTRACT 523. INTRODUÇÃO 534. MATERIAL E MÉTODOS 574.1 Ensaio 1 - Curva de embebição 57

4.2 Ensaio 2 - Curva de germinação de estresse térmico e restrição hídrica 584.3 Ensaio 3 - Estresse combinado de restrição hídrica e temperatura 584.4 Ensaio 4 - Análise eletroforética de proteínas resistentes ao calor 594.5 Ensaio 5 - Expressão gênica induzida por estresse combinado 605.RESULTADOS E DISCUSSÃO 635.1 Análise eletroforética de proteínas resistentes ao calor 675.2 Expressão gênica induzida por estresse combinado 696. CONCLUSÕES 737. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 74ANEXO 79

i

LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES

DNA Ácido desoxirribonucléicoDO Densidade ópticaGPS Sistema de Posicionamento Globalha HectaresmRNA RNA mensageiroOCDE Organização para a Cooperação e o Desenvolvimento Econômicopb Pares de basesPCR Reação em Cadeia da Polimerase, do inglês Polymerase Chain ReactionPEI/ER Metodologia Pressão – Estado – Impacto/Efeito – RespostaPNUMA Programa das Nações Unidas para o Meio AmbientePNPB Programa Nacional de Produção e Uso de BiodieselRNA Ácido RibonucléicoRNase RibonucleaseSDS Dodecil Sulfato de SódioSPSS Statistical Package for the Social SciencesRT Transcriptase Reversa

ii

ÍNDICE DE TABELAS

Número Título Página

TABELA 1 Localização, número tota l de produtores, porcentagem de produtoresentrevistados, área total, de cinco comunidades no Estado de Sergipe.Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão-SE,2009........................................................................................ .................... 30

TABELA 2 Dados em porcentagem dos agricultores dos cinco assentamentosentrevistados que plantam milho, feijão, macaxeira e laranja em suasterras, no Estado de Sergipe. UFS, São Cristóvão-SE, 2009..................... 37

TABELA 3 Dados de resposta em questionário aplicados aos Assentamentos sobreÁrea usada para cultivo versus plantio de pinhão-manso (Jatrophacurcas L.). UFS, São Cristóvão-SE, 2009. ..................... .......................... 37

TABELA 4 Seleção de descritores e indicadores de sustentabilidade em áreas compotencial para plantio de oleaginosas para a produção de biodiesel. SãoCristóvão, SE, UFS, 2009.. ....................................................................... 44

TABELA 5 Indicadores de sustentabilidade em áreas com potencial para plantio deoleaginosas visando à produção de biodiesel, empregando-semetodologia baseada na Matriz Pressão/Estado/Impacto/Efeito/Resposta– (PEI/ER). UFS, São Cristóvão-SE, 2009............................................... 44

TABELA 6 Tratamentos empregados em sementes de pinhão -manso (Jatrophacurcas L.) para o estudo da expressão gênica sob estresse combinado derestrição hídrica e temperatura. UFS, São Cristóvão -SE, 2009................. 59

TABELA 7 Primers específicos para Arabidopsis, que foram usados em reações deRT-PCR em RNA extraído de embriões submetidos a estressecombinado de temperatura e restrição hídrica de sementes de pinhão -manso (Jatropha curcas L.). UFS, São Cristóvão-SE, 2009..................... 62

iii

ÍNDICE DE FÍGURAS

Número Título Página

FIGURA 1 As três faixas climáticas, segundo Caron & Sabourin, 2003. Municípiosde Indiaroba, Monte Alegre, Estância, Simão Dias e Tobias Barreto noestado de Sergipe........................................................................................ 28

FIGURA 2 Distribuição dos 141 agricultores entr evistados, caracterizados pelaidade (anos) no estado de Sergipe, nos assentamentos Dom Helder, BelaVista, Retiro Dois, 27 de Outubro e Novo Marimbondo. UFS.SãoCristóvão,SE.2009.............................................................................. ........ 31

FIGURA 3 Grau de escolaridade dos agricultores nos Assentamentos Dom Helder,Bela Vista, Retiro Dois, 27 de Outubro e Novo Marimbondo no estadode Sergipe. UFS, São Cristóvão SE,2009......................................................... ................................................... 32

FIGURA 4 Porcentagem de homens (a) e mulheres (b) que conhecem plantasoleaginosas (P.O.) como a mamona, girassol, soja e pinhão-manso nosAssentamento Dom Helder, Bela Vista, Retiro Dois, 27 de Ou tubro eNovo Marimbondo. UFS, São Cristóvão-SE, 2009................. .................. 36

FIGURA 5 Porcentagem de homens (a) e mulheres (b) que conhecem o ProgramaNacional de Produção e uso de Biodiesel nos assentamentos. UFS, SãoCristóvão-SE, 2009.................................................................................... 39

FIGURA 6 Porcentagem de homens (a) e mulheres (b) que gostariam de participardo PNPB nos assentamentos. UFS, SãoCristóvão-SE,2009................................... ......................................................................... 40

FIGURA 7 Porcentagem de homens (a) e mulheres (b) que acreditam que o pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma boa alternativa para a produção deóleo. UFS, São Cristóvão-SE, 2009. ......................................................... 42

FIGURA 8 Peso das sementes (g) e germinação (%) durante embebição de sementesde pinhão-manso (Jatropha curcas L.). UFS, São Cristóvão-SE,2009............................................. ............................................................... 63

FIGURA 9 Curva de germinação de sementes de pinhão -manso (Jatropha curcasL.) em diferentes temperaturas. UFS, São Cristóvão -SE, 2009................. 65

FIGURA 10 Curva de germinação de sementes de pinhão-manso (Jatropha curcasL.) em diferentes condições de restrição hídrica promovida por soluçõesde polietilenoglicol 6000 em diferentes potenciais osmóticos. UFS, SãoCristóvão-SE, 2009.................................................. .................................. 66

FIGURA 11 Perfil eletroforético de proteínas resistentes ao calor em sementes depinhão manso (Jatropha curcas L.), submetidas ao estresse combinadode temperatura e restrição hídrica. Marcador de peso protéico (P) de 220a 10 KDa. UFS, São Cristóvão-SE, 2009................................................... 68

iv

RESUMO GERAL

COSTA, Marcilene de Jesus Caldas. SEMENTES DE PINHÃO-MANSO(Jatropha curcas L.): ASPECTOS SÓCIO-ECONÔMICOS E AFISIOLOGIA DE SEMENTES. 2009. 80 f. (Dissertação-Mestrado emAgroecossistemas). Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE.

Jatropha curcas L. é um arbusto grande, planta resistente a seca e de crescimentorápido em regiões de clima quente ; apresenta vastas utilidades, uma delas vem dasemente, com grande potencial como fonte de matéria prima para a produção debiodiesel. O plantio de áreas com essa espécie vem crescendo por incentivo criado peloGoverno Federal a partir do Programa Nacional de Produção e Uso de Bi odiesel(PNPB), principalmente pela parceria do setor produtivo com a PETROBRAS. Apesarde suas potencialidades, informações sobre o plantio dessa espécie bem como dadossobre germinação e fisiologia de suas sementes são escassos, o que limita o zoneamentoagroecológico, a adoção de políticas públicas de incentivo ao crédito e a padronizaçãode testes de avaliação da qualidade de sementes, um dos principais insumos. Estetrabalho foi dividido em dois capítulos. No capítulo primeiro, apresenta-se informaçõessobre o uso de sementes oleaginosas, visando apresentar o conhecimento dosagricultores para a espécie Jatropha curcas L. e outras oleaginosas, e o PNPB, bemcomo indicadores de sustentabilidade para a cultura , no estado de Sergipe dosMunicípios de Indiaroba, Monte Alegre, Estância, Simão Dias e Tobias Barreto. Nocapítulo segundo apresenta -se aspectos relacionados à fisiologia de sementes eexpressão de genes quando estas são submetidas a estresse combinado de temperatura erestrição hídrica. Para a avaliação fisiológica de sementes submetidas a estressecombinado, obteve-se a curva de embebição e germinação para os potenciais osmóticosde -0,2; -0,6 e -0,8 MPa e para as temperaturas de 25, 30, 35 e 40ºC. Posteriormente,avaliou-se a expressão gênica dos transcritos para sementes induzidas à restrição hídricanos potenciais osmóticos de -0,8; -1,0 e -1,2 , empregando soluções de polietilenoglicol6000, sob as temperaturas de 25ºC e 40ºC. Na análise sócio -econômica, mais de 60%dos entrevistados gostariam de participar do Programa Nacional de Produção e Uso doBiodiesel, e mais de 70% dos agricultores (homens e mulheres) plantariam sementes oumudas da oleaginosa em estudo. Quanto aos descritores e indicadores desustentabilidade foram propostos dez de cada um deles para a avaliação em áreas deplantio de sementes oleaginosas visando à produção de biodiesel no Estado de Sergipe.Quanto aos aspectos fisiológicos de sementes submetidas ao estresse, observou -se queas sementes de pinhão-manso, têm a protrusão da raiz após 48 horas de embebição. Opotencial máximo de germinação das sementes de pinhão -manso ocorre na temperaturade 25º C e o mínimo a 40ºC, sendo que as sementes germinaram em potencial osmóticode -0,2MPa, não havendo germinação em potenciais supe riores a este valor. Quanto àexpressão gênica para sementes submetidas ao estresse combinado de restrição hídrica etemperatura para as proteínas extraídas pelo calor ocorreu variação na intensidade debandas dos perfis; e na RT-PCR observou-se a amplificação de bandas difusas paraseqüências gênicas correspondentes a LEC1, sHSP, CDC2a, 18S, PKBA1, AB13, ACT,EM6, PER1 e CTS. Houve amplificação, provavelmente com homologia total paraseqüências 18S, e para as demais parcial, devido a perfil difuso de banda s. No entanto,

v

foi possível a observação de padrões de amplificação diferenciados para os tratamentos-0,8;-1,0 e -1,2MPa em temperaturas de 25ºC e 40ºC, confirmando a ativação de genesrelacionados ao ciclo celular e à tolerância ao estresse , que poderão ser empregadoscomo marcadores para o conhecimento sobre os mecanismos de propagação, eidentificação de genes úteis em programas de melhoramento assistido por marcadoresmoleculares e de transformação genética de plantas.

Palavras-chave: Jatropha curcas L., polietilenoglicol, expressão gênica, ProgramaNacional de Produção e uso de Biodiesel.

vi

ABSTRACT

COSTA, Marcilene of Jesus Caldas. SEEDS OF PINHÃO-Manso (Jatropha curcasL.): THE SOCIO-ECONOMIC AND PHYSIOLOGY OF SEED .2009. 80 f.(Dissertation, Master in Agroecosystems). Federal University of Sergipe, São Cristóvão,SE.

Jatropha curcas L. is a large shrub, plant resistant to drought and rapid growth inregions of warm climate, has extensive facilities, is one of the seed, with great poten tialas a source of raw material for the production of biodiesel. The planting areas of thisspecies is growing incentive created by the Federal Government from the NationalProgram for Production and Use of Biodiesel (PNPB), mainly by the productive secto rpartnership with PETROBRAS. Despite its potential, information on the planting ofthese species, as well as on physiology and germination of its seeds are scarce, whichlimits the zoning agroecology, the adoption of public policies to stimulate the credi t andthe standardization of tests for assessing the quality of seed, one of the main inputs. Thiswork was divided into two chapters. In the first chapter, is about the use of oilseeds, toprovide the knowledge of farmers for the species Jatropha curcas L . and other oilseeds,and PNPB and indicators for sustainable culture. In the state of Sergipe Indiaroba,Monte Alegre, Estância, Simão Dias e Tobias Barreto . In the second chapter it is relatedto aspects of seed physiology and the expression of genes whe n they are subjected tocombined stress of temperature and water restriction. For the assessment ofphysiological seed subjected to combined stress, the curve obtained from soaking andgermination to osmotic potentials of -0.2, -0.6 and -0.8 MPa and for temperatures of 25,30, 35 and 40 º C. Subsequently, evaluating the gene expression of transcripts for seedinduced water restriction in the osmotic potential of -0.8, -1.0 and -1.2, using solutionsof polyethylene glycol 6000, under the temperatures of 25 º C and 40 º C. In socio-economic analysis, over 60% of respondents would like to participate in the NationalProgram for Production and Use of Biodiesel, and more than 70% of farmers (men andwomen) planted seeds or seedlings of the oil under study. As the descriptors andindicators of sustainability were proposed ten of each to the assessment of areas ofplanting seeds to the production of biodiesel in the state of Sergipe. As to thephysiological aspects of seeds subjected to stress, there is that seed of pinion-gentle,have a protruding root after 48 hours of imbibition. The maximum potential germinationof seeds of pinion-manso occurs at 25 º C and minimum at 40 º C, and the seedsgerminated in osmotic potential of -0.2 MPa, no germination potential in e xcess of thisvalue. As for gene expression in seeds subjected to combined stress of water restrictionand temperature for the proteins were extracted by heat variations in the intensity ofbands of the profiles, and RT-PCR amplification was observed for t he diffuse bandscorresponding to the LEC1 gene sequences, sHSP, CDC2a, 18S, PKBA1, AB13, ACT,EM6, PER1 and CTS of Arabidopsis thaliana L. There was amplification, probably withfull homology to 18S sequences, and the other part, because the profile of di ffuse bands.However, it was possible to observe patterns of amplification for the differenttreatments -0.8, -1.0 and -1.2 MPa at temperatures of 25 º C and 40 º C, confirming theactivation of genes related to cell cycle and the tolerance to stress which could be usedas markers for the understanding of the mechanisms of propagation, and identification

vii

of useful genes in breeding programs and by molecular markers and genetictransformation of plants.

Keyword: Jatropha curcas L., polyethylene glicol, gene expression, National Programof Biodiesel

1

CAPÍTULO I

1.INTRODUÇÃO GERAL

O Brasil possui uma grande diversidade de espécies vegetais oleaginosas , as

quais podem ser empregadas para produzir o Biodiesel, variando de acordo com o tipo

de clima e de solo de cada região.

Dentre as oleaginosas promissoras para a região nordeste, o pinhão-manso

(Jatropha curcas L.), hoje é apontado como um grande potencial, tanto no Brasil quanto

em outros países, mas ainda prescinde de um conhecimento agronômico mais

aprofundado nas diversas condições de clima e solos brasileiros, e em condições de

restrição hídrica, pois apesar de resistir a este tipo de estresse, perde suas folhas com

redução da produção, pela baixa disponibilidade de água para a planta.

Apesar deste fato, melhoristas de plantas têm buscado sele cionar genótipos

nativos que poderiam, por outro lado, manter -se produtivos, mesmo sob condições de

estresse. Todo programa de melhoramento se inicia com a busca de informações, que

permitam identificar o interesse e conhecimento do plantio da cultura pelo s produtores,

aliado ao conhecimento de peculiaridades da espécie, que se quer cultivar.

Para a seleção de genótipos a ser empregados em programas de melhoramento

existe a necessidade da identificação do conhecimento dos agricultores, da importância

do insumo semente, e aliado a isto, o conhecimento científico da fisiologia destas

sementes sob estresse. Alterações na fisiologia das sementes poderiam ser identificadas

com o uso de marcadores moleculares, que posteriormente poderiam ser empregados na

seleção de genótipos mais adaptados ou para a engenharia de genes.

Neste contexto, o interesse pela cultura do pinhão -manso no nordeste tem

aumentado significativamente devido a sua importância sócio -econômica, estando sua

produção ligada ao desenvolvimento e à industrialização do país. Como essa

importância econômica vem aumentando gradativamente, há necessidade de pesquisas e

difusão de tecnologias específicas.

O pinhão apresenta-se como uma possível oleaginosa para a agricultura familiar

como uma cultura adicional, dada a potencialidade de resistir aos regimes de estresse

2

hídrico; e ainda manter sua capacidade produtiva dentro de níveis economicamente

viáveis. É uma oleaginosa com bom potencial de geração de renda, em função das

expectativas de suas produtividade s, além de poder ser empregada em áreas degradadas

e aproveitar áreas de pouco uso nas propriedades familiares.

Cenário como esse incorporando metas espec íficas de geração de emprego e

renda, tecnologias, insumos, uso dos subprodutos e cons órcio entre oleaginosas e

culturas alimentares de agricultura familiar fazem parte de pr áticas para início de um

programa de melhoramento, que vise a sustentabilidade dos agroecossistemas.

A agricultura sustentável pode ser compreendida pela busca da maior

produtividade possível com menor dano ao meio ambiente, preservando o solo, a água e

o ar entre os ciclos produtivos . Com a busca de contribuir para uma agricultura

sustentável, existe hoje uma grande preocupação por parte dos pesquisadores e analistas

de sementes em conduzir estudos que forneçam informações sobre a qualidade das

sementes, especialmente no que diz respeito à padronização da análise destas, da pureza

genética para o aperfeiçoamento e estabelecimento de métodos de análise de rotina. Na

agricultura moderna soma a isto o conhecimento de genes, com potencialidade para

serem engenheirados. No caso específico do pinhão -manso, genes que estejam

relacionados aos mecanismos empregados por esta espécie para superar condições de

estresse são interessantes, pois poderã o ser transferidos para outros genótipos desta

espécie, ou para outras espécies via transgenia.

Sendo assim, o objetivo neste trabalho foi estudar a cultura do pinhão-manso nos

seus aspectos relacionados ao conhecimento pelo produtor desta cultura, e aspectos da

fisiologia da germinação das sementes de pinhão-manso quando as sementes estão

submetidas à estresse combinado de temperatura e restrição hídrica, visando à

compreensão do comportamento destas , em agroecossistemas como o semi -árido

nordestino.

3

2.REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel (PNPB)

O biodiesel é um combustível renovável que pode ser obtido a partir de óleos

vegetais brutos, óleos usados, gorduras e resíduos do processo de tratamento de esgoto

(TORRES et al., 2006).

A produção e o uso do biodiesel foram implantados e regulamentados no país

com o Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel (PNPB), estabelecido como

uma ação estratégica para o país e que marca a introdução desse novo biocombustí vel

na matriz energética brasileira (PNPB, 2008).

O PNPB tem como principal objetivo implan tar a produção e o uso do biodiesel

de forma sustentável, técnica e economicamente (PNPB, 2008). O programa tem ainda a

preocupação de fomentar a fixação das famí lias de agricultores no campo, por meio da

expansão da agricultura e aproveitamento de solos inadequados para a produção de

culturas alimentícias (CARVALHO, 2006). Esse componente social está presente no

Selo Combustível Social (SCS), um dos principais ins trumentos instituídos pelo

programa. O selo é concedido pelo Ministério de Desenvolvimento Agrário (MDA) ao

produtor de biodiesel que cumpre os critérios enumerados na Instrução Normativa n º 1.

Dentre os critérios, o mais importante se refere ao custo de a quisição da matéria-prima

adquirida do agricultor familiar. O percentual mínimo de aquisição, calculado em

relação ao custo de aquisições anuais totais, é de 50% para a Região Nordeste e semi -

árido, 30% para as regiões Sudeste e Sul e 10% para as regiões N orte e Centro-Oeste.

A região Nordeste conta com o Estado de Sergipe, que é um estado de

mesorregiões: Agreste, Sertão e Leste sergipano, cada uma com capacidades agrícolas e

problemas sócio-econômicos distintos.

A Mesorregião Agreste, com 399.680 ha (IB GE, 2008) concentra a maior parte

da produção agrícola sergipana com condições edafoclimáticas que favorecem à

produção de grãos em regime sequeiro.

Nessas regiões, algumas oleaginosas como o girassol, mamona e pinhão-manso

são opções agrícolas promissoras. Entretanto, devido à conhecida facilidade de

adaptação a diversos ambientes, estas oleaginosas podem vir a ser uma opção para todo

o estado.

4

Grupos de trabalho no Estado de Sergipe vêm realizando pesquisas e e laborando

propostas para começar a produzir matéria-prima para a produção de biodiesel. Essa

produção tem como matérias -primas diversas oleaginosas como, mamona, amendoim,

soja, dendê, nandiroba e pinhão-manso. Estes grupos estão inseridos na Rede Sergipe

Biodiesel e no Programa Sergipe Biodiesel- PROBIOSE, que tem como objetivo

identificar alternativas, desenvolver ações para estimular a produção e o

desenvolvimento tecnológico da cadeia produtiva de biodiesel do Estado de Sergipe. A

rede é formada por mais de 30 instituições de diversos segmentos , que vem otimizando

experiências em torno da produção de Biodiesel com foco para a agricultura familiar e

camponesa (VITAL BRAZIL, 2008) .

Inicialmente os trabalhos da PROBIOSE estão direcionados ao cultivo do

girassol, podendo ser diversificado para outra s culturas como o pinhão-manso e a

mamona, na medida em que ocorra interesse dos agricultores. Cerca de cinco mil

famílias de 45 municípios estão sendo cadastradas para participar dos trabalhos com

plantio de girassol destinado à produção de biodiesel em S ergipe. Em 2008 foram

cultivados 3.150 ha com girassol, cultura escolhida por sua alta produtividade quando

associada às condições climáticas favoráveis. Em 2008, 3.150 famílias participaram do

Programa (SERGIPETEC, 2009) .

2.2 Sustentabilidade para a produção agrícola de oleaginosas

O Brasil possui uma grande diversidade de espécies vegetais oleaginosas das

quais se podem produzir o Biodiesel, variando de acordo com o tipo de clima e de solo

de cada região. Entre as mais comuns com potencialidades estão a mamona, o girassol,

o nabo forrageiro, a soja, o algodão e qualquer outra que produza óleo, inclusive as

palmáceas, como o dendê e outras culturas perenes, como o pinhão-manso (Jatropha

curcas L.).

O pinhão-manso, hoje é apontado como um grande potencial , tanto no Brasil

quanto em outros países, mas ainda prescinde de um conhecimento agronômico mais

aprofundado nas diversas condições de clima e solos br asileiros (BELTRÃO e

CARTAXO, 2006). É uma oleaginosa com bom potencial de geração de renda, em

função das expectativas de suas produtividades, além de poder ser empregada em áreas

degradadas e aproveitar áreas de pouco uso nas propriedades familiares.

5

No que se pode ser mencionado quanto à importância da agricultura familiar

nesta cadeia produtiva, podemos considerar alguns pontos para sua efetiva

competitividade: empregar, como fonte de financiamento agrícola, as diversas linhas de

crédito do Programa Nacional de Fortalecimento da Agricultura Familiar – PRONAF;

promover incrementos crescentes de ampliação d a produção e melhoria de

produtividade das oleaginosas; efetividade nos contratos entre agricultores familiares e

as empresas fabricantes de biodiesel, objetivando relações comerciais mais justas, com

lucros auferidos a ambos os lados; e efetiva dotação de assistência técnica aos

agricultores familiares (CARMÉLIO, 2006).

Cenário como esse incorporando metas espec íficas de geração de emprego e

renda, tecnologias, insumos, uso dos subprodutos e cons órcio entre oleaginosas e

culturas alimentares de agricultura familiar fazem parte de práticas para a

sustentabilidade do agroecossistema.

2.3 Espécie Jatropha curcas L.

Jatropha curcas L. pertencente à família Euforbiáceas é um arbusto grande, de

crescimento rápido, cuja altura normal é de dois a três metros, podendo alcançar até

cinco metros em condições especiais. O diâmetro do tronco atinge aproximadamente 20

cm; caule liso de lenho mole; floema com longos canais que se estendem até as ra ízes,

nos quais circula o látex; possui raízes curtas e pouco ramificadas . O tronco é dividido

desde a base, em compridos ramos, com numerosas cicatrizes produzidas pela queda das

folhas na estação seca, as quais ressurgem logo após as primeiras chuvas (BRASIL,

1985; KUMAR e SHARMA, 2008).

As folhas são verdes e brilhantes, lar gas, com 3 a 5 lóbulos mucronados,

alternas, pecioladas, cordiformes na base, glabras e palminerviais. As nervuras são

esbranquiçadas e salientes na face inferior (BRASIL, 1985; KUMAR e SHARMA,

2008). As flores são amarelo-esverdeadas, monóicas, unissexuai s e produzidas na

mesma inflorescência. A inflorescência é axilar paniculad a, e as flores femininas

apresentam-se com pedúnculo longo, não articulado, com três células elípticas, ovário

com três carpelos, cada um com um lóculo que produz um óvulo com três estigmas

bifurcados separados, isoladas, em menor número que as masculinas, as quais se

localizam nas ramificações, com dez estames, cinco unidos na base e cinco unidos na

6

coluna (SATURNINO et al., 2005). As flores são polinizadas por insetos especialmente

abelhas melíferas. Cada inflorescência produz de aproximadamente 10 ou mais frutos.

O fruto é uma cápsula ovóide, achatado nas extremidades, indeiscente, verde

inicialmente, passa a amarelo, castanho e por fim preto, quando atinge o estado de

maturação. As sementes são oblongas e elipsóides, relativamente grandes e quando

secas medem de 1,5 a 2 cm de comprimento e 1,0 a 1,3 cm de largura; tegumento rijo,

quebradiço, de fratura resinosa (BRASIL, 1985).

A origem do pinhão-manso é bastante discutida . De acordo com Heller (1996)

esta espécie foi provavelmente, distribuída por portugueses marítimos

provenientes das ilhas de Cabo Verde a outros países como a África e a

Índia. Alguns relatos afirmam ser proveniente da América do Sul (PEIXOTO,

1973). Outros afirmam que é natural do Estado do Ceará, no Brasil, outros,

informam ser da América Latina (FERNANDEZ, 1993). As opiniões quanto à

origem do pinhão-manso tendem para América tropical (LORENZI, et al., 2003).

J. curcas é uma planta com vastas utilidades. O óleo d a semente é

potencialmente valioso, podendo ser uma ótima solução como biodiesel ( OPENSHAW,

2000). Além de produzir óleo, o pinhão -manso também pode ser utilizado como cerca

viva, suporte para plantas trepadeiras como a baunilha ( Vanilla aromatica), visto que o

tronco possui casca lisa e macia e como fixador de dunas na orla marítima ( PEIXOTO,

1973).

As sementes são utilizadas como purgativo, verificando -se casos de intoxicação

em crianças e adultos quando as ingere em excesso, o que pode ser perigoso e a té fatal.

Atribui-se as propriedades tóxicas do pinhão a uma globulina, a curcina e também ao

ácido jatrófico de toxicidade igual ou superior a ricinina. A ingestão de uma única

semente fresca pode causar vômito e diarréia ( PEIXOTO, 1973).

Mediante as características e vantagens expostas, o pinhão-manso é considerado

uma opção agrícola para a região N ordeste por ser uma espécie nativa, exigente em

insolação e com forte resistência a seca, desenvolvendo -se sob condições climáticas

diversas (SEVERINO et al., 2006), sua viabilidade para obtenção do biodiesel produz

duas toneladas de óleo por hectare, levando de três a quatro anos para atingir a idade

produtiva, que pode se estender por 40 anos. A espécie é propagada principalmente por

sementes obtidas a partir de plantas matrizes selecionadas por produtores, que

7

comercializam as sementes (CARNIELLI, 2003). A comercialização de sementes é feita

com base nos resultados de testes de germinação, que deve m ser conduzidos em

condições ideais para espécie e que possibilitem sua padronização.

A padronização de testes de avaliação do comportamento das sementes em testes

de germinação e vigor das sementes , se exige adaptações para avaliar e garantir o bom

vigor das plântulas e seu desempenho em campo. Pouco é o conhecimento sobre a

planta e somente nos últimos 30 anos foram iniciados estudos agronômicos sobre a

espécie (SATURNINO et al., 2005).

Para avaliar a qualidade de sementes em laboratório, é necessário dispor de um

padrão de germinação para cada espécie, pois cada u ma apresenta sementes com

características distintas quanto ao seu comportamento fisiológico e germinativo

(WIELEWICKI et al., 2006). Dessa forma, pesquisas que contribuam para a geração de

conhecimentos técnicos de espécies nativas, bem como métodos para u ma padronização

dos testes de vigor e germinação dessas espécies são essenciais ( ABDO e PAULA,

2006).

2. 4 Qualidade e germinação de sementes versus sustentabilidade

A germinação é definida como a capacidade da semente produzir uma plântula

que, pelas características das estruturas essenciais do embrião, demonstra aptidão para

produzir uma planta normal sob condições de campo ( BRASIL, 1992).

Os estudos de germinação de sementes são geralmente realizados, dentre outros

objetivos, para ampliar os conhecim entos sobre o comportamento fisiológico da

espécie, e suas respostas aos fatores ambientais. Também são usados visando definir

metodologias para avaliação da viabilidade de sementes sob condições favoráveis

(CARVALHO e NAKAGAWA, 2000).

Atualmente, existe uma grande preocupação por parte dos pesquisadores e

analistas de sementes em conduzir estudos que forneçam informações sobre a qualidade

das sementes, especialmente no que diz respeito à padronização, agilização,

aperfeiçoamento e estabelecimento de método s de análise. Na Regras para Análise de

Sementes (BRASIL, 1992), existem recomendações para a condução do teste de

germinação de espécies cultivadas. No entanto, um grande número de espécies nativas

ainda não estão incluídas nas referidas regras, como a es pécie estudada neste trabalho.

8

Convém salientar que a produção e comercialização de sementes ou de mudas de

pinhão manso foram regulamentadas no País, segundo a Instrução Normativa nº 4, de 14

de janeiro de 2008, editada pelo Ministério da Agricultura, Pecu ária e Abastecimento

(Mapa).

De acordo com o Mapa, embora a espécie ainda não tenha sido totalmente

domesticada, não conte com nenhum programa de melhoramento genético, muito

menos um sistema de produção minimamente validado a campo, fundamental para sua

forma de propagação e condução. A regulamentação e aprovação de plantio foi

necessária diante da sua adaptação e difusão entre os agricultores, principalmente de

Minas Gerais e do Nordeste. O Ministério justificou a decisão com base na demanda

por material de propagação para o estabelecimento de cultivos comerciais do pinhão

manso, gerada pela procura por óleos vegetais para atender o PNPB.

Por outro lado, o termo de compromisso, firmado entre o produtor de material de

propagação vegetal e o agricultor, ser á exigido até que seja possível estabele cer os

padrões de identidade e de qualidade de suas sementes, como material de propagação

vegetal da cultivar, para isto, deve-se padronizar testes em sementes. U m dos testes

mais utilizados para a avaliação da quali dade de sementes é a avaliação do processo

germinativo, que inicia-se com o ressurgimento das atividades paralisadas por ocasião

da maturação fisiológica das sementes. Faz se necessário algumas exigências básicas

como as sementes estarem viáveis e as condi ções ambientais serem favoráveis.

Para que uma semente viável possa germinar são necessários: suprimento de

água em quantidade suficiente; temperatura e uma composição de gases adequada, bem

como de luz para determinadas espéc ies (CARVALHO e NAKAGAWA, 2000), a

escolha do substrato também tem fundamental importância nos resultados obtidos no

teste de germinação (BRASIL, 1992).

Estudos sobre a influência da temperatura, da luz e da água na germinação das

sementes são essenciais para entender os aspectos ecol ógicos, bioquímicos e

fisiológicos do processo (BEWLEY e BLACK, 1994). E estudos são efetivamente o

ponto de partida para utilização e exploração de forma racional das espécies nativas,

cujos trabalhos sobre germinação ainda são escassos (CABRAL et al., 2003).

9

2.5 Fisiologia do estresse em sementes

O estresse pode ser definido como um fator externo, que exerce influência

desvantajosa sobre a planta (TAIZ e ZEIGER, 2006). Pode-se citar como estresse a

restrição hídrica e de temperatura elevada, que afetam a produtividade das culturas e

limitam a expansão da agricultura em muitas regiões do mundo , e pelo ponto de vista

agrícola esse estresse pode ser resumido como ambiente desfavorável, levando a

diminuição na produtividade e comprometendo desta forma sua sustentabilidade

(SONG et al., 2005).

As plantas são acometidas por diversos tipos de estresses bióticos e abióticos,

mas lançam uma rede de eventos que inicia com a percepção do estresse e termina com

a expressão de um conjunto de genes alvo , fazendo uso de rotas e componentes comuns

em resposta ao estresse e permitindo às plantas se adaptarem a uma s érie de diferentes

estresses após exposição a um estresse específico (PASTORI e FOYER, 2002).

Alguns trabalhos trazem exemplos de estresses em plantas e seme ntes, como: a

deficiência hídrica em sementes de feijão ( Phaseolus vulgaris, L) induzida por

diferentes agentes osmóticos nos poten ciais de -0,6, -1,2 e -1,8MPa (MACHADO

NETO et. al., 2006); o excesso de calor e salinidade em sementes de trigo ( Triticum

aestivum L ) submetidos a -0,2;-0,4;-0,6 e -0,8MPa de NaCl em temperaturas de 15, 25

e 30ºC (SONG et al., 2005); estresse de frio em variedade de arroz ( Oryza sativa L. cv.

Wasetoittu) submetidas a refrigeração e ao estresse hídrico de manitol 0,5 M

(TAKAHASHI et al., 1994) e radiação UV-B em melão (Melo sativus Sager. Cv.

Torpeda) (BORISOVA et al., 2001). A deficiência hídrica muitas vezes está associada à

salinidade na biosfera das raízes e ao estresse por calor nas folhas, enquanto o

resfriamento e o congelamento levam a reduções na atividade hídr ica e estresse

osmótico (TAIZ e ZEIGER, 2006).

A água é o fator que exerce a mais determinante influência sobre o processo de

germinação, pois confere estabilidade estrutural às membranas e às proteínas, particip a

ativamente dos processos metabólicos , que culminam com o fornecimento de energia e

de nutrientes necessários para a retomada de crescimento por parte do eixo embrionário

(CARVALHO e NAKAGAWA, 2000). Quando é removida, abaixo do limite

suportado pela célula, pode ocorrer o aumento da concentração dos solutos, a alteração

do pH da solução intracelular, a aceleração de reações degenerativas, a desnaturação de

proteínas e a perda da integridade das membranas (SUN e LEOPOLD, 1997). A

10

diminuição do potencial hídrico do meio influencia a absorção de água ( BANSAL et al.,

1980) e reduz ou impede a protrusão da raiz primária (LOPES et al., 1996).

O estresse hídrico, geralmente, atua diminuindo a velocidade e a percentagem de

germinação de sementes, sendo que para c ada espécie existe um valor de potencial

hídrico, abaixo do qual a germinação não ocorre (ADEGBUYI et al., 1981). Em

condições de laboratório, por conveniência, realizam -se estudos de germinação com o

uso de soluções aquosas de sacarose, sais, manitol e po lietilenoglicol, a fim de simular

condições padronizadas de estresse hídrico para seleção de espécies mais tolerantes

(SANTOS et al., 1992).

O polietilenoglicol (H-(OCH-2CH)-OH) tem sido utilizado com sucesso em

trabalhos de pesquisa para simular os efeito s do déficit hídrico nas plantas, por não

penetrar nas células, não ser degradado e não causar toxidez, devido ao seu alto peso

molecular (HASEGAWA et al., 1984; VILLELA et al., 1991).

Outro fator que influencia a germinação é a temperatura, tanto por agir sobre a

velocidade de absorção de água, como sobre as reações bioquímicas que determinam

todo o processo; afeta, portanto, não só o total de germinação, co mo também a

velocidade (BEWLEY e BLACK, 1994; CARVALHO e NAKAGAWA, 2000).

A temperatura adequada para a germinação de sementes de espécies oleaginosas

vem sendo determinada por alguns pesquisadores. Dantas et al( 2007) constataram que

a temperatura de 25ºC, foi mais favorável para a germinação de sementes de pinhão-

manso. Já para Pereira et al (2007), o potencial máximo de germinação foi obtido nas

temperaturas de 30 ou 35ºC; e Martins et al (2008) concluíram que o teste de

germinação em pinhão-manso deve ser realizado na temperatura alternada de 20 -30ºC.

A otimização do processo germinativo nas con dições de temperaturas alternadas de 20 -

30ºC também pode ser sugerido em sementes de outras euforbiáceas como a mamoneira

e o leiteiro (BRASIL, 1992).

2.6 Marcadores Bioquímicos em sementes submetidas ao estresse

As substâncias de reservas (carboidratos, lipídeos e proteínas) armazenadas nas

sementes são mobilizadas após a germinação, durante o desenvolvimento das plântulas

e seus produtos de degradação são usados para diferentes propósitos, como a geração de

11

energia e a produção de matéria prima como proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e

lipídeos (MARCOS FILHO, 2005).

As proteínas executam um papel essencial na modulação da resposta da planta

ao estresse. As temperaturas elevadas podem direta ou indireta mente causar danos as

proteínas, pela inativação de enzimas, por alterações na conformação de polipeptídeos

ou por desestruturação de complexos protéicos em membranas (FERGUSON et

al.1990).

Grandes e importantes avanços têm sido realizados, no entendimento das

respostas moleculares a temperaturas alt as ou choque de calor (VIERLING, 1991). Em

resposta a elevações repentinas de temperatura de 5 a 10°C as plantas produzem um

conjunto único de proteínas, identificado como proteínas de choque térmico ( HSP; do

inglês, heat shock proteins). A maior parte das HSPs auxilia as células a suportar o

estresse térmico, funcionando como chaperonas moleculares. Em células induzidas à

síntese de HSPs observa-se o desenvolvimento da tolerância térmica e podem tolerar

exposição a temperaturas que, do contrário, são letai s. Algumas HSPs não estão

relacionadas exclusivamente ao estresse por temperatura alta , mas podem ser também

induzidas por condições ambientais bem diferentes, incluindo déficit hídrico, injúria

física, temperatura baixa e salinidade (TAIZ e ZEIGER, 2006).

Nepomuceno et al. (2002) verificaram que u ma das funções das proteínas de

choque térmico está relacionada à prevenção da desnaturação durante a desidrata ção

celular.

As proteínas de choque térmico são expressas durante o desenvolvimento das

sementes, em resposta ao calor e outros estresses, amenizando os problemas causados

pela agregação e má estruturação de proteínas. Segundo Vertucci e Farrant (1995), a

função das HSPs está relacionada à preservação e ao reparo das estruturas

macromoleculares durante a desidratação ou re-hidratação. Estas proteínas têm,

geralmente, seu peso molecular conhecido e é representado em kDa, como as Hsp60;

Hsp70; Hsp90 e Hsp100 (GURLEY, 2000). Dentre elas, as pequenas proteínas de

choque térmico-sHSPs são as que mais ocorrem em plantas (MANSFIELD, 1987) e

apresentam baixo peso molecular, variando de 15 a 28 kDa (SUN et al., 2002;

VIERLING, 1991).

Gallardo et al. (2001) observaram que a quantidade de algumas proteínas LEA

(Latter Embryogenesis Abundant ) e Hsp70 reduziram com o final do processo de

12

germinação, ao passo que outras permaneceram constantes, durante todo esse processo,

indicando que algumas LEAs e HSPs podem exercer uma função protetora, não somente

durante a maturação das sementes, mas também ao longo de todo o proc esso

germinativo.

2.7 Expressão gênica em sementes sob estresses

A cada geração os melhoristas e fisiologistas de plantas se tornam mais

interessados na melhoria de características como: resistência a patógenos, qualidade da

semente ou do produto comercial, produtividade, tolerância a diferentes estresses

fisiológicos etc., pois nenhuma cultura preenche todos os parâmetros agronômicos ao

mesmo tempo.

Com o conhecimento de bases moleculares e dos mecanismos bioquímicos que

regulam características agronômicas importantes, entender estas interações por meio da

expressão dos genes, constitui um pré-requisito para determinar os eventos moleculares

envolvidos na diferenciação e desenvolvimento da célula , bem como para definir

estratégias de alteração genética de proteínas celulares específicas. A capacidade de

alterar o estado normal do organismo pela introdução de mutações tem sido importante

na elucidação de mecanismos regulatórios (DELÚ FILHO, 1999), no entanto, em

espécies nativas os conhecimentos são escasso s, e, portanto, localizar e identificar genes

diferencialmente expressos é essencial para o entendimento de eventos biológicos,

envolvendo mudanças no padrão de expressão gênica (McCLLELAND et al. 1995).

Diversas técnicas foram desenvolvidas para avaliar a expressão de genes em

tecidos e células, tais como, Differential Display (LIANG e PARDEE, 1992), SAGE

(Serial Analysis of Gene Expressio n) (VELCULESCU et al., 1995), RT-PCR (Reverse

Transcriptase - Polymerase Chain Reaction ) qualitativo e quantitativo em tempo real

(GIBSON et al., 1996), cDNA-AFLP (BACHEM et al., 1996) e Hibridação Subtrativa

Supressiva (DIATCHENKO et al. 1996), dentre outros.

Dentre esses métodos, a RT-PCR é um dos mais sensíveis e versáteis. Esta

técnica pode ser usada para determinar a presença ou ausência de transcritos, para

estimar o nível de expressão e para clonar produtos de cDNA sem a necessidade da

construção e seleção de bibliotecas de cDNA (S AMBROOK, 2001), e em particular, no

caso de proteínas codificadas por famílias multigê nicas (ORSEL, et al., 2002), como as

sugeridas para estudo neste trabalho .

13

A RT-PCR, em teoria, é capaz de detectar a presença de uma única cópia de uma

sequência na amostra de RNAm. Na prática, no entanto, este nível de sensibilidade está

fora de alcance principalmente devido à ineficiência ligada a primeira fase da técnica, a

conversão do RNA em cDNA (SAMBROOK, 2001).

Na PCR, por ser um processo exponencial de multiplicação de moléculas de

DNA ou cDNA, poucas diferenças na eficiência de amplificação entre amostras pode

afetar a intensidade do sinal obtido (S AMBROOK, 2001), prejudicando a comparação

do nível de acúmulo de transcritos entre amostra , o que torna a técnica ainda mais

interessante.

Em alguns trabalhos, são usadas variações da RT -PCR como a RT-PCR

quantitativa ou semi-quantitativa com o uso de primers (iniciadores) competitivos entre

si para o RNAm de interesse e para o RNAm usado como padrão interno, o que torna o

trabalho mais complicado devido à construção destes primers. Nestes casos, geralmente

é usado como padrão o RNA ribossomal (OHWAKI, et al., 2005) que encontra-se em

grande quantidade. No entanto, esta técnica pode ser usada de uma forma mais simples,

sem o uso de primers competitivos, usando primers para transcrição reversa e

amplificação da mesma forma para a seq uência de interesse e para a o RNAm usado

como padrão, usando como padrões internos genes constitutivos que não são expressos

em níveis muito altos, como o da ubiquitina (OLIVEIRA e CORUZZI,1999).

Muitos trabalhos têm empregado sequências construídas para a espécie vegetal

modelo, o Arabidopsis. Em Arabidopsis, a aplicação de RT-PCR usando primers

específicos para dois transportadores de nitrato de alta afinidade pertencentes à família

NRT2 revelou que há a expressão de dois genes em plantas jovens aos 10 dias após o

plantio, porém não antes (ZHUO et al., 1999). Em milho, foi possível verificar

diferenças no nível de expressão de genes que codificam para duas isoformas de H +-

ATPases, em resposta ao fornecimento de nitrato, usando como padrão interno RNAm

do gene que codifica para α-tubulina 5, possibilitando observar a contribuição da H +-

ATPases para absorção de nitrato por essas plantas (S ANTI, et al., 2003).

Assim, a RT-PCR torna-se uma ferramenta relativamente simples e de grande

utilidade para estudos de expressão gênica, poss ibilitando verificar a presença de

transcritos de expressão relativa do gene.

14

O gene ABI3 (ácido abscisico insensitivo) é um dos mais estudados durante o

desenvolvimento de sementes. Ele é especificamente expresso em sementes (PARCY et

al., 1994) e sua proteína é um membro de um grande grupo de fatores de transcrição que

atuam como intermediários na regulação de genes responsivos ao ABA durante o

desenvolvimento da semente. Em mutantes de Arabidopsis, vários aspectos da

maturação das sementes, tais como a degradação de clorofila e acúmulo de compostos

de armazenamento são abolidos, levando as sementes a dormência e apresentam uma

pobre longevidade (KOORNNEEF et al., 1984; LÉON -KLOOSTERZIEL et al., 1996;

ZENG et al., 2003).

O gene LEC1 é um dos genes em Arabidopsis, que também afetam o

desenvolvimento embrionário. RNAm de LEC1 se acumulam especificamente durante o

desenvolvimento da semente (LOTAN et al., 1998), no embrião, suspensor e

endosperma, e podem ser detectados em órgão vegetativos ou em botões flo rais antes da

antese (HARADA, 2001). Várias características de mutantes LEC mostram que o gene

toma papel crítico durante a fase de maturação. Em mutantes LEC, embriões exibem

síntese defectiva ao acúmulo de reservas, bem como maior sensibilidade a desseca ção.

Embriões mutantes de LEC1 apresentam características, tais como ativação de

meristemas apicais de parte aérea e raiz e a expressão de genes, que normalmente são

expressos após a germinação. Os cotilédones são em geral não bem definidos e revertem

parcialmente para um órgão como uma folha, com tricomas. A viviparidade ocorre

ocasionalmente (WEST et al., 1994; HARADA, 2001).

Outro gene relacionado ao desenvolvimento, e que pode ser ligado é o Comatose

(CTS). O CTS age, no mínimo em parte, por afetar prof undamente o metabolismo de

lipídios armazenados. Ele regula a germinação potencial pelo incremento após o

amadurecimento, da sensibilidade a giberilinas e pré -chilling, e pela repressão da

atividade de locos que ativam a maturação do embrião (HOLDSWORTH et al., 2001).

A expressão aumenta rapidamente após a embebição durante a germinação. Em

Arabidopsis, a mutação em CTS especificamente, bloqueia a germinação potencial. Tal

mutação requer a priori a ação de ABA1, ABI3, FUS3 e LEC1 para induzir dormência no

embrião, sugerindo que estes locos são suprimidos por CTS (RUSSEL et al., 2000).

Vários genes relacionados ao estresse têm sido associados à tolerância a

dessecação em sementes ortodoxas, tais genes codificam para proteínas abundantes na

embriogênese (LEA), heat shock proteins (HSPs), peroxiredoxinas (Prx) e quinases

15

responsivas a ABA (PKABA). Se assume geralmente que genes para a LEA tomam um

papel no estabelecimento da tolerância a dessecação durante o desenvolvimento

(DELSENY et al., 2001). As proteínas L EA têm propriedades físicas consistentes no

papel da tolerância a dessecação, isto é, elas são extremamente hidrofílicas e resistentes

à desnaturação (OLIVER et al., 2000).

Os genes HSPs são envolvidos no correto dobramento e arranjo das proteínas

que são parcialmente desnaturadas por choque térmico (DELSENY et al., 1994).

Contudo sua importância se estende além da proteção ao estresse de altas temperaturas

(VIERLING, 1991), uma vez que assumen um papel importante também preservando e

reparando as estruturas macromoleculares durante a desidratação ou reidratação,

respectivamente (HELM e ABERNETH Y, 1990). As proteínas HSPs são membros de

superfamílias de multi-genes, nas quais nem todos os membros são regulados por

aquecimento (VIERLING, 1991).

As proteínas quinases são importantes componentes nas rotas metabólicas de

transdução de sinal levando a ajustes celulares em respostas a mudanças nas condições

extracelulares (HOLAPPA e WALKER -SIMMONS, 1995). Em embriões, o acúmulo

de transcritos de proteínas quinase 1 responsivas ao ABA (PKABA1) correlaciona com

os níveis de ABA como nas sementes maduras, implicando em um papel do gene

PKABA1 no controle da tolerância à dessecação ou à dormência de sementes (XIONG e

ZHU, 2001).

Além da embebição de sementes ortodoxas não dormentes, o metabolismo é

rapidamente resumido com atividades celulares elementares tais como respiração,

atividade de organela e enzima, e RNA e síntese de proteínas (BEWLEY e BLACK,

1994). Com esta mudança do estado de quiescência, ou seja, quando u m dos fatores

necessários a germinação falta para o de crescimento da plântula, para um estado de

germinação, neste último é como se milhares de genes fossem ligados e desligados

(BRADFORD et al., 2000). O ciclo celular que é regulado pela atividade de qui nases

ciclina-dependentes (CDKs) (HUNTLEY e MURRAY, 1999), se resume também

durante a germinação ou precocemente no crescimento da plântula quando a síntese de

DNA e a divisão celular são requeridas. Os microtúbulos e os filamentos de actina, os

dois componentes do citoesqueleto, são reconstituídos durante a germinação de

sementes e crescimento pós -germinativo, os quais estão envolvidos com o

16

posicionamento de organelas, elongação celular e divisão celular (J ING et al., 1999;

KOST et al., 2002; FARIA et al., 2005).

Desta forma, o conhecimento de todos estes eventos em sementes de pinhão

manso submetido a estresse bem como os aspectos da cultura relacionados ao

conhecimento pelo produtor é de extrema importância e estão relacionados ao estado -

da-arte em pesquisas com sementes.

17

3.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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24

CAPÍTULO 2

PROGRAMA NACIONAL DE PRODUÇÃO E USO DE BIODIESEL(PNPB) E INDICADORES DE SUSTENTABILIDADE PARA O ESTADO DE

SERGIPE

1. RESUMO

COSTA, Marcilene de Jesus Caldas. Programa Nacional de Produção e Uso deBiodiesel e Indicadores de sustentabilidade para o Estado de Sergipe. SãoCristóvão: UFS, 2009. (Dissertação - Mestrado em Agroecossistemas).

A produção de biodiesel além dos benefícios ambientais e das vanta genseconômicas é um instrumento importante na geração de emprego e renda no meio rural.O objetivo desse trabalho foi avaliar a aceitabilidade do s agricultores familiares para asações do Programa Nacional de P rodução e uso de Biodiesel no Estado de Sergipe epropor indicadores de sustentabilidade baseado no pensamento sistêmico para os novosagroecossistemas a serem implantados . Tal conhecimento aliado a pesquisa emmelhoramento vegetal podem contribuir sobremaneira para os trabalhos de pesquisacom culturas oleaginosas, que são matéria prima para este programa. A pesquisa f oiconduzida nos municípios sergipanos de Indiaroba, Estância, Simão Dias, TobiasBarreto e Monte Alegre, com visitas as comunidades e aplicação de questionário semi -estruturado, onde se coletou informações sobre características dos agricultores, dapropriedade, do conhecimento ao Programa Nacional de Produção e uso de Biodiesel(PNPB). Para a construção de indicadores, a metodologia usada foi proposta pelaOrganização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE), a partir daconstrução da matriz de indicadores Pressão -Estado-Impacto-Resposta (PEIR).Observou-se que não houve diferença significativa na idade dos produtores,possibilitando ainda por longo tempo um trabalho de capacit ação para produção debioenergia, com os chefes de famílias. A maioria dos entrevistados conhece plantasoleaginosas, no entanto, poucos conhecem o PNPB, e mesmo sem conhecer, 67,7%gostaria de participar e 67,5% plantariam o pinhão-manso na propriedade, de formaconsorciada. Visando a avaliação da sustentabilidade ao longo do tempo nas áreas deestudo, antes e depois do estabelecimento de plantios de oleaginosas para o PNPB,foram propostos 10 descritores e 10 indicadores de sustentabilidade (Descritores -Indicadores): Área – Área cultivada com espécie melhorada (ha); Mercado -Custo doproduto (R$), quantificação do produto (t/ano); Adaptabilidade – Quantidade de plantascultivadas por área plantada (nº. de plantas/área plantada); Disponibilidade de sementese mudas melhoradas - Quantidade de sementes e mudas melhoradas para plantio (nº.);Linhas de crédito – Financiamento (R$); Composição da força de trabalho – Quantidadee tipo de trabalhador (nº. e gênero); Acesso a educação – Nível de escolaridade (% depessoas alfabetizadas); Qualidade do Solo – Agroquímicos (ppm); Consórcio comoutras culturas – Quantidade de culturas consorciadas (nº.)

Palavras-chaves: Agroecossistemas, agricultura familiar, assentamentos

25

2.ABSTRACT

COSTA, Marcilene of Jesus Caldas. National Program of Production and Use ofBiodiesel and indicators of sustainability in the State of Sergipe . São Cristóvão:UFS,2009. (Dissertação - Mestrado in Agroecosystems).

The production of biodiesel addition to environmental benefits and economicadvantages is an important tool in the generation of employment and income in ruralareas. The aim of this study was to evaluate the acceptability of family farmers for theactions of the National Program for Production and use of biodiesel in the state ofSergipe and propose indicators of sustainability based on systemic thinking for the newagroecosystems to be implemented. This knowledge combined with research in plantbreeding can contribute considerably to the work of research on oilseed crops, which areraw materials for this program. The research was conducted in the municipalitiesIndiaroba, Simão Dias, Tobias Barreto and Monte Alegre, visits to the communities andimplementation of semi-structured questionnaire, which collected information oncharacteristics of farmers, property, knowledge of the National Program Production anduse of Biodiesel (PNPB). For the construction of indicators, the methodology used wasproposed to the Organization to Cooperation and Economic Development (OCDE),from the construction of the matrix of indicators Pressure -State-Impact-Response(PEIR). It was observed that there was no significant difference in age of the producer,even allowing for a long time to work training for the production of bioenergy, with theheads of families. Most known plant oil, however, few know the PNPB, and evenwithout it, 67.7% would like to participate, and 67.5% plant the pinion -quiet on theproperty, so associated. To evaluate the sustainability over time in areas of study, beforeand after the establishment of plantations of oil to the PNPB, 10 descriptors wereproposed and 10 indicators of sustainability (Keywords indicators): Area - Area plantedwith improved species ( ha) Cost of product -market (U.S. $), quantification of theproduct (t / year); Adaptability - Number of crops planted by area (no.. Plant / plantedarea), availability of improved seeds and seedlings - Number of improved seeds andseedlings for planting (no.) Lines of credit - Funding (U.S. $) Composition of theworkforce - the quantity and type of worker (No. and gender); Access to education -level of education (% of people analphabet), Soil Quality - Agrochemicals (ppm);Consortium with other cultures - Number of crops in consortium (No).

Word-key: Agroecosystems, family farming, settlings

26

3. INTRODUÇÃO

O Brasil apresenta condições de diversidade edafoclimáticas para o plantio de

oleaginosas, com o propósito de produzir biodiesel com profundas repercussões sociais,

ambientais e econômicas (SLUSZZ e MACHADO, 2006). Entre as culturas mais

citadas estão, a mamona, dendê, pinhão-manso, amêndoa do coco de dendê, amêndoa

do coco de babaçu, semente de girassol, amêndoa do coco de praia, caroço de algodão,

grão de amendoim, semente de canola, semente de linhaça, o nabo forr ageiro, dentre

muitas outras (HOLANDA, 2004).

O Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel (PNPB), lançado no final

do ano de 2004, inseriu esse combustível na matriz energética brasileira e elegeu o

produtor familiar como seu maior fornecedor de ma térias-prima, ganhando um papel de

destaque na cadeia produtiva do biodiesel (SOUSA et al., 2005).

A existência de uma certificação sócio-ambiental é fundamental para o sucesso

de um programa de biodiesel voltado para a inclusão social (SACHS, 2007). Esta

certificação é retratada no PNPB, por meio do Selo Combustível Social, que permite

que os produtores possam usufruir das vantagens pertinentes ao regime tributário do

biodiesel, pela Instrução Normativa 1, de 05 de julho de 2005 do Ministério do

Desenvolvimento Agrário (MDA), que estabelece os critérios e procedimentos relativos

à obtenção, manutenção, sustentação e cancelamento do mesmo (PRATES et al ., 2007).

O governo Federal ao lançar o PNPB, apoiou -se na crescente demanda por

combustíveis de fontes renováveis e no potencial brasileiro para atender parte

expressiva dessas necessidades, gerando empregos e renda na agricultura familiar,

reduzindo disparidades regionais e contribuindo para a economia e melhor ia das

condições ambientais (CHING e RODRIGUES, 2007).

Algumas regiões podem vir a se tornar grandes produtoras de culturas

oleaginosas, no entanto, é necessária a identificação de indicadores que possam ser

utilizados para interpretar especificidades locais dos fenômenos naturais que permitem

estabelecer relações de causa-efeito e previsões sobre o comportamento, a médio e

longo prazo, quanto a sustentabilidade do agroecossistema, principalmente levando -se

em conta melhorias nas culturas, com melhoramento vegetal, e a aceitabilidade da

cultura pelo produtor. Os dados devidamente armazenados e organizados podem

contribuir para identificar pontos críticos de funcionamento do agroecossistema,

estabelecer correlações entre diferentes eventos, levantar hipóteses para embasar novas

27

pesquisas com o objetivo final de averiguar a validade dos indicadores escolhidos

(POGGIANI et al.,1998).

O modelo bastante utilizado para monitorar impactos usando indicadores é o de

Pressão – Estado – Impacto/Efeito – Resposta (P.E.I.R), que considera as interações

entre a sociedade e o meio ambiente (WINOGRAD, 1996). A matriz P.E.I.R é oriunda

da estrutura conceitual para a seleção de indicadores que foram sistematizados em

Pressão-Estado-Resposta (PER), criada pela Organização para Cooperação e

Desenvolvimento Econômico (OCDE), e m 1993 e adaptada em 1995 para Pressão -

Estado-Impacto/Efeito-Resposta pelo Programa das Nações Unidas para o Meio

Ambiente.

Nesse contexto objetivou-se apresentar as informações obtidas em

questionamentos feitos aos agricultores do Estado de Sergipe, em áreas que que se

ajustam ao sugerido pelo MDA, ou seja, de agricultura familiar para a produção de

oleaginosas com potencial para a produção de biodiesel e os indicadores de

sustentabilidade para os novos agroecossistemas a serem impl antados.

A estrutura fundiária no Estado de Sergipe apresenta -se constituída por uma

maioria de pequenas propriedades (3.052m2) de agricultura familiar e camponesa, com

mais de 180 assentamentos de Reforma Agrária (INCRA), e o Programa Biodiesel

apresenta-se como um bom potencial para o desenvolvimento rural e inclusão social dos

assentamentos, principalmente pelos incentivos para compra da produção garantida pelo

governo Federal.

28

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Caracterização da área de estudo

A pesquisa foi realizada no Estad o de Sergipe, nas três faixas climáticas no

sentido leste-oeste do território (CARON e SABOURIN, 2003), compreendendo os

municípios de Indiaroba (S 11º31’10” e W 37º30’37”), Monte Alegre (S 10°01'39" e W

37°33'36"), Estância ( S 11º36’15” e W 37º26’34”), Simão Dias (S 10º43'73.65” e W

37º48'28.44”) e Tobias Barreto (S 11º 10’46” e W 38º 00’00”) (Figura 1).

FONTE: /Google Earth, 2008

FIGURA 1 As três faixas climáticas, segundo Caron e Sabourin, 2003. Municípiosde Indiaroba, Monte Alegre, Estância, Simão Dias e Tobias Barreto noestado de Sergipe. UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

Segundo Caron e Sabourin (2003) as três faixas climáticas estão compreendidas

em: faixa litorânea – onde os cultivos de coco, cana -de-açúcar, culturas de subsistência,

além da citricultura são predominantes; faixa central - zona de transição climática

(agreste), onde a agricultura familiar tem grande importância na olericultura, produção

de mandioca, de grãos (milho e feijão), e exploração pecuá ria; faixa oeste-região semi-

árida do Estado, onde predominam os cultivos de subsistência, milho, feijão, abóbora

etc. e a pecuária bovina, caprina e ovina.

Monte Alegre

IndiarobaEstância

Simão Dias

Tobias Barreto

29

4.2 Coleta e Análise das Informações

4.2.1 Aplicação dos questionários

A pesquisa foi realizada no Estado de Sergipe, nos meses de fevereiro, março e

abril de 2008.

Para a obtenção de dados que subsidiaram a pesquisa, foram empregados

questionários (Anexo A), composto s de variáveis quantitativas e qualitativas e buscou -

se expressar, a característica dos produtores, da propriedade, o conhecimento pelo

Programa Nacional de Produção e uso de Biodiesel (PNPB), tipos de oleaginosas

conhecidas e a aceitabilidade pela cultura do pinhão -manso. As entrevistas foram

destinadas a 141 produtores.

Em cada município preocupou-se em definir o melhor horário e local para as

entrevista, em reuniões prévias com os dirigentes dos assentamentos. Em todos os

municípios optou-se pela entrevista em cada residência, onde o entrevistado era aquele

que dispunha de tempo e interesse pela pesquisa.

Como a pesquisa foi direcionada as três faixas climáticas no sentido leste -oeste

do território sergipano, foram realizadas entrevistas, em média com 50% dos produtores

de cada município, num total de 141 produtores, onde as ap licações dos questionários

foram feitas basicamente com o chefe de família, homem ou mulher, e algumas vezes a

outros membros da família (filhos).

As famílias residentes permanentes nos assentamentos constituem a unidade de

análise da pesquisa. Segundo Lopes (2006), considera-se como família o conjunto de

pessoas ligadas por laços de parentesco, dependência doméstica ou normas de

convivência, que residem na mesma unidade domiciliar e, também, a pessoa que more

só em uma unidade domiciliar. Entende -se por dependência doméstica a relação

estabelecida entre a pessoa de referência (responsável pela unidade domiciliar ou pela

família, ou que assim é considerada pelos demais membros) e agregados da família e

por normas de convivência, as regras estabelecidas para o convívio de pessoas que

morem juntas sem estarem ligadas por laços de parentesco ou dependência doméstica,

portanto, a entrevista se deu com o responsável da casa naquele momento.

Dos 141 produtores entrevistados, 16% residiam no Assentamento Dom Helder;

12% em no Assentamento Bela Vista, 18% no Assentamento Retiro, 14% no

Assentamento 27 de Outubro e 40% no Assentamento Novo Marimbondo (Tabela 1).

30

TABELA 1 Localização, número total de produtores, porcentagem de produtoresentrevistados, área total, de cinco comunidades no Estado de Sergipe.Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão-SE, 2009.

Assentamento Município Nº total deprodutores

Produtoresentrevistados

(%)

Área Total(ha)

Bela Vista Indiaroba 27 62,96 275,92

Dom Helder Estância 28 82,14 236

Novo Marimbondo Tobias Barreto 76 73,68 1.333

27 de Outubro Simão Dias 35 57,14 777,81

Retiro Dois Monte Alegre 46 54,34 354

Fonte: Dados da pesquisa; Sergipe 2008. UFS. São Cristóvão,SE.2009

Os dados das entrevistas foram tabulados e sistema tizados no programa

estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) (NORMAN e

HULL,1968) , no qual os resultados foram analisados em porcentagens.

4.2.2 Seleção de indicadores de sustentabilidade

Nas visitas as localidades foram levanta das informações sobre as atividades

agrícolas desenvolvidas nos assentamentos, número de famílias, área total dos

assentamentos e aspectos relacionados à assistência técnica, que subsidiaram a

elaboração de descritores e de uma matriz de indicadores de sus tentabilidade. Os

descritores possuem características significativas de um elemento com os principais

atributos de sustentabilidade de um determinado sistema, e os indicadores, são medidas

de efeito de uma operação do sis tema sobre o descritor (CAMINO e MULLER, 1996).

A matriz é oriunda da estrutura conceitual para a seleção de indicadores que

foram sistematizados em Pressão -Estado-Resposta (PER), criada pela Organização para

Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE), em 1993 e adaptada para Pressão -

Estado-Impacto/Efeito-Resposta pelo Programa das Nações Unidas para o Meio

Ambiente – PNUMA-CIAT, em 1996.

31

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Características dos produtores e da área pesquisada

Ao total foram realizadas 2 visitas em cada assentamento , 2 para aplicação dos

questionários, que por meio destes obteve -se características dos produtores, da

propriedade, o conhecimento pelo Programa Nacional de Produção e uso de Biodiesel

(PNPB), tipos de oleaginosas conhecidas e a aceitabilidade pela cultura do pinh ão-

manso.

Com relação à idade dos entrevistados, no assentamento Dom Helder 30,4% de

agricultores eram da faixa etária compreendida entre 40 a 50 anos, em Retiro Dois a

faixa etária dos agricultores corresponderam a 32% com idade entre 30 a 40 anos, para

Bela Vista 41,2% dos entrevistados observados estavam entre 50 a 60 anos, na

localidade 27 de Outubro os valor encontrado foi de 25% entre 40 a 50 e 50 a 60 anos,

em Novo Marimbondo 28,57% entre 40 a 50 e 50 a 60 anos (Figura 2).

FIGURA 2 Distribuição dos 141 agricultores entrevistados, caracterizados pelaidade (anos) no estado de Sergipe, nos assentamentos Dom Helder, BelaVista, Retiro Dois, 27 de Outubro e Novo Marimbondo . UFS. SãoCristóvão,SE.2009.

32

Com essa faixa etária pode-se inferir que esta informação possibilita um trabalho

de capacitação em produção e bioenergia com esses chefes de famílias, para contribuir

com a matriz energética sergipana. É importante salientar que os entrevistados que estão

com idade entre 50 a 60 anos, relataram que o cansaço físico acaba sendo um

empecilho; deixando as oportunidades que os programas federais podem trazer para os

filhos.

No que se refere a grau de escolaridade, 75% dos entrevistados em Novo

Marimbondo, 50% em 27 de Outubro, 44% em Retiro Dois, 41% em Bela vista e 30%

em Dom Helder relataram ter apenas o ensino fundamental. Segundo dados coletados

por meio dos questionários, o assentamento Retiro Dois apresentou o maior número de

analfabetos, correspondendo 36% em comparação c om os demais assentamentos

entrevistados. Na Figura 3 são apresentados os graus de escolaridade dos agricultores

entrevistados nos assentamentos do Estado de Sergipe.

FIGURA 3 Grau de escolaridade dos agricultores nos Assentamentos Dom Helder,Bela Vista, Retiro Dois, 27 de Outubro e Novo Marimbondo no estadode Sergipe. UFS, São Cristóvão SE, 2009.

5.2 Atividades agrícolas desenvolvidas

Os agricultores familiares dos assentamentos entrevistados , em sua totalidade,

trabalham com culturas permanentes e temporárias como milho, feijão, macaxeira,

abóbora, batata, laranja, banana, goiaba e caju.

Para uma maior produção, melhor aproveitamento da terra e facilidade no trato

cultural, 52% dos entrevistados em Dom Helder, 64,7% em Bela Vista, 52% em Retiro

33

Dois, 45% em 27 de Outubro e 75% em Novo Marimbondo disseram trabalhar com

consórcio, encontrando vantagens devido à diversidade nos cultivos, pois isto contribui

para a contínua fonte de renda, e independência da sazonalidade . Apenas para o

assentamento 27 de outubro 65% disse ram não haver vantagem trabalhar com

consórcio. Porém, é importante ressaltar que o cultivo consorciado possui grande

relevância na geração de renda e alimentação para pequenos produtores , e trata-se de

requisito básico para garantia de contratos de compras de sementes oleaginosas, no

PNB/MDA/PETROBRAS, que os agricultores produzem culturas que podem ser usadas

para alimentação e oleaginosas.

Uma média de 93,46% dos agricultores não fazem análise química do solo, em

suas terras. Nesse caso, o agricultor familiar trabalha sem saber a quantidade exata de

corretivos e fertilizantes que deve ser usada. Os assentamentos Novo Marimbondo, 27

de Outubro e Retiro Dois não sabem o que é análise de solo e nem sua utilidade. Os que

fazem análise desconhecem a importância de se fazer esta periodicamente e de avaliar a

disponibilidade de nutrientes para as plantas.

Os assentamentos 27 de Outubro e Novo Marimbondo têm como prática o uso

do adubo químico e compram sem conhecimento da qua ntidade necessária exigida pela

cultura, usando fórmulas existentes no mercado, por falta de um acompanhamento

técnico. Todos os assentamentos entrevistados usam adubo orgânico esporadicamente,

pois segundo eles as condições financeiras os impedem de usar como queiram, pois

veem esse adubo como o “melhor” para lavoura. Portanto, buscam usar em seus quintais

para a plantação de hortaliças e plantas medicinais, plantio este que é realizado pelas

mulheres.

A técnica utilizada para o plantio das espécies consi ste apenas no processo de

limpeza (capinas) e plantio diretamente no solo e que não é exatamente planejado, já

que não há preocupação com uma grande produção, quando, geralmente, se destina para

o próprio consumo.

No que tange diretamente à mulher na produ ção da agricultura familiar, percebe -

se o amplo conhecimento que detém, de modo também que são mais ricas nos detalhes

dos procedimentos com o trato da terra. Desse modo, elas descrev em sobre algumas das

técnicas que são utilizadas na agricultura, demonstr ando o conhecimento da dinâmica da

natureza, que garante a sustentabilidade do processo produtivo.

34

De acordo com Melo (2002), o trabalho da mulher na agricultura familiar é

gratuito e considerado “ajuda”, revelando que a atividade desenvolvida nessa forma de

produção pertence ao homem, é da sua responsabilidade, é sua obrigação. O trabalho da

mulher, não sendo reconhecido, ao contrário do desempenhado pelo homem, sugere que

ele não gere valor econômico e social.

A mulher participa de forma ativa no processo produtivo, que se dá desde o

preparo das mudas, limpeza da área a ser cultivada, na colheita, no beneficiamento e na

comercialização do produto final. Além disso, realiza trabalhos em outros componentes

como o sítio, onde elas desenvolvem a produção de espécies frutíferas e de plantas

medicinais, como, também, atuam diretamente em atividades culturais e sociais.

5.3 Plantas oleaginosas conhecidas pelas famílias

No Nordeste, os agricultores familiares em sua maioria, possuem uma área de

terra menor que o suficiente para gerar excedente de produção para a comercialização.

A maioria dos estabelecimentos agrícolas familiares do Nordeste caracteriza -se por ser

de pequeno tamanho, cerca de 60% tem menos de 5 ha (com área média de 1,7 ha)

(INCRA/FAO, 2000).

O plantio de oleaginosas pelos agricultores familiares para a produção de

biodiesel abre a perspectiva da organização de uma cadeia produtiva de biodiesel local

capaz de impulsionar o desenvolvimento econômico e social, promovendo a criação de

empregos rurais, agrícolas e não agrícolas e a inclusão social (MONTEIRO, 2001).

A maioria dos agricultores familiares em estudo conhece uma ou mais plantas

com potencial para a produção de óleo. Esse conhecimento é facilitado porque o Brasil

é um país com ampla diversidade de matérias-primas para a produção de biodiesel.

Nas entrevistas realizadas, apesar do número pequeno de mulheres entrevistadas,

elas demonstraram um maior conhecimento pelas oleaginosas. Em Dom Helder de

73,9% de homens entrevistados , 60,9% deles conhecem alguma oleaginosa e dos 26,1%

das mulheres entrevistadas, todas conhecem alguma oleaginosa. Em 27 de Outubro num

total de 85% de homens entrevistados , 80% deles mostraram conhecimento por

oleaginosa e 15% das mulheres entrevistas conhecem plantas oleag inosas. Muitas

relataram conhecer alguma utilidade medicinal ou alimentícia repassad a de geração a

geração.

35

Nas entrevistas as mulheres demonstraram conhecer plantas medicinais, dentre

elas o pinhão-manso (Jatropha curcas L.) que muitas vezes é cultivada c omo cerca

viva. As sementes, bem como o óleo retirado da espécie, são freq uentemente usados

como purgativo, no tratamento de afecções da pele (SHETTY et al., 2006; SALAS et

al., 1994). Para os assentamentos visitados houve rela to da ação cicatrizante do pinhão-

manso, sendo que a maioria das mulheres informou conhecer esta propriedade,

conhecimento pouco distribuído entre os homens. Apesar de terem o conhecimento da

importância na medicina popular , elas reconheceram a toxidade das sementes e que a

ingestão destas ou o uso do óleo como purgativo pode causar graves irritações e

envenenamento.

Destaca-se, dentre as principais plantas citadas pelos produtores; mamona

(Ricinus comunnis L.), girassol (Helianthus annuis L), amendoim (Arachis hypogaea

L), soja (Glycine max L Merrill) e o pinhão-manso ( J. curcas L.).

Apesar, da ocorrência do pinhão -manso em todas as regiões do Nordeste, de

forma dispersa, adaptando-se a condições edafoclimáticas variadas, e ser considerada

uma oleaginosa favorável à produção de biod iesel no semi-árido, em Monte Alegre, no

sertão sergipano, os agricultores não tem conhecimento sobre essa planta. Entre as

plantas mais conhecidas, o amendoim se destaca, pelo seu uso na alimentação humana.

Segundo Ching e Rodrigues (2007), possui uma po rcentagem de óleo em torno de 40 a

43%. A mamona, por ser uma das primeiras culturas a ser discutida para a produção de

biodiesel, cuja porcentagem de óleo vária de 43 a 45% e o girassol, por ser uma planta

que não exige muitos cuidados, de baixo custo, possui teor de óleo oscilando entre 38 a

48%.

Entre essas culturas oleaginosas, pode-se citar também a soja, usada na

alimentação humana, animal, por isso bastante conhecida na região do sertão, e usa-se

também na produção de energia, além de outras pouco ci tadas pelos camponeses, como:

algodão (Gassypium L.), dendê (Elaeis guineensis Jacq.) e o milho (Zea mays L.).

36

(a)

(b)

FIGURA 4 Porcentagem de homens (a) e mulheres (b) que conhecem plantasoleaginosas (P.O.) como a mamona, girassol, soja e pinhão-manso nosAssentamento Dom Helder, Bela Vista, Retiro Dois, 27 de Outubro eNovo Marimbondo. UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

As famílias dos assentamentos Novo Marimbondo, Bela Vista, Retiro Dois,

Dom Helder e 27 de Outubro disponibilizam , respectivamente, um número aproximado

de 1 ha a 6 ha de terra para plantio, em que se cultiva, milho, feijão, macaxeira, batata,

laranja, milho, dentre outras mais (Tabela 2).

37

TABELA 2 Dados em porcentagem dos agricultores dos cinco assentamentosentrevistados que plantam milho, feijão, macaxeira e laranja e m suasterras, no Estado de Sergipe. UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

Assentamento Agricultores queplantam milho

(%)

Agricultores queplantam feijão

(%)

Agricultores queplantam

macaxeira (%)

Agricultores queplantam laranja

(%)

Bela Vista 58,8 35,3 82,4 100

Dom Helder 56,5 34,8 91,3 17,4

NovoMarimbondo

98,2 98,2 37,5 5,4

27 de Outubro 95 90 0 0

Retiro Dois 100 88 0 0


Os agricultores entrevistados foram questionados sobre o plantio sobre o plantio

de pinhão-manso na forma de sementes, mudas ou ambas. O programa estatístico SPSS

cruzou as informações de área para cultivo e plantio de pinhão manso (Tabela 3). O que

foi observado de forma generalizada que com pouca área para plantio, os ag ricultores

familiares estão interessados em plantar pinhão manso.

TABELA 3 Dados de resposta em questionário s aplicados aos Assentados sobreÁrea usada para cultivo versus plantio de pinhão-manso (Jatrophacurcas L.). UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

Plantaria Pinhão-manso no Assentamento Dom HelderTotalSementes mudas Sem. e muda não

Área usadapara cultivo

Até 5 tarefas ContagemTotal (%)

521,7%

626,1%

730,4%

313,0%

2191,3%


0,0%

0,0%

0,0%

28,7%

28,7%

Total ContagemTotal (%)

521,7%

626,1%

730,4%

521,7%

23100,0%

Plantaria pinhão-manso no assentamento Bela VistaTotalSementes mudas Sem. e muda não



317,6%

423,5%

15,9%

317,6%

1164,7%


15,9%

15,9%

211,8%

0,0%

423,5%


0,0%

0,0%

0,0%

211,8%

211,8%


423,5%

529,4%

317,6%

529,4%

17100,0%

Plantaria pinhão-manso no assentamento Retiro DoisTotalsementes mudas Sem. e muda não



14,0%

28,0%

0,0%

416,0%

728,0%


0,0%

14,0%

0,0%

28,0%

312,0%


312,0%

28,0%

0,0%

28,0%

728,0%


312,0%

0,0%

0,0%

416,0%

728,0%

Até 50 tarefas Contagem 1 0 0 0 1

38

Total (%) 4,0% ,0% ,0% ,0% 4,0%


832,0%

520,0%

0,0%

1248,0%

25100,0%

Plantaria pinhão-manso no assentamento 27 de OutubroTotalsementes mudas Sem. e muda não



0,0%

0,0%

15,0%

315,0%

420,0%


315,0%

0,0%

0,0%

210,0%

525,0%


420,0%

0,0%

0,0%

0,0%

420,0%


15,0%

210,0%

15,0%

15,0%

525,0%


15,0%

15,0%

0,0%

0,0%

210,0%


945,0%

315,0%

210,0%

630,0%

20100,0%

Plantaria pinhão-manso no assentamento Novo MarimbondoTotalsementes mudas Sem. e muda não



1323,2%

712,5%

11,8%

916,1%

3053,6%


814,3%

23,6%

23,6%

35,4%

1526,8%


0,0%

23,6%

11,8%

58,9%

814,3%


23,6%

0,0%

0,0%

0,0%

23,6%


11,8%

0,0%

0,0%

0,0%

11,8%


2442,9%

1119,6%

47,1%

1730,4%

56100,0%


5.4 Conhecimento do PNPB no Estado de Sergipe

As motivações de natureza ambiental e econômica para a introdução do

biodiesel na matriz energética brasileira são muitas, e uma das formas é por meio do

PNPB, que apesar da criação do Selo de Combustível Social, para atender a agricultura

familiar, mostra muita fragilidade no que tange à inclusão social dos agricultores

familiares, mesmo porque, com a aplicação dos questionários, observou -se que apenas

uma pequena parcela da agricultura familiar conhece o programa, e parte dos que

conhecem, foi por meio da mídia falada (rádio ou TV) e alguns por técnicos que

prestam assistência técnica no local.

Por meio de diálogos durante a entrevista, para o assentamento 27 de Outubro

obteve-se informações de que técnicos - não souberam informar qual a instituição que

esteve no local dando informações sobre a cultura da mamona e sobre o PNPB .

Senhoras do local disseram estar desiludidas, pois os tais técnicos trouxeram

informações de que eles lucrariam muito com a plantação da mamona, mas não

retornaram mais ao local. O dirigente do assentamento informou que foi apenas uma

palestra sem nenhum compromisso. Porta nto, o assentamento 27 de Outubro com 60% é

39

o que tem maior destaque no conhecimento do programa, pois, já houve no local

discussão sobre o biodiesel. Na Figura 5 apresenta se as porcentagens em relação ao

gênero e conhecimento do PNPB.

FIGURA 5 Porcentagem de homens (a) e mulheres (b) que conhecem o ProgramaNacional de Produção e uso de Biodiesel nos assentamentos. UFS, SãoCristóvão-SE, 2009.

Nas Figuras 6a e 6b observa-se que 87% dos entrevistados (homens e

mulheres) do assentamento Dom Helder gostariam de participar do programa . Em Bela

Vista 88,2% dos homens entrevistados, 70,6% deles participariam e 11,8% das

(a)

b)

40

mulheres entrevistadas todas gostariam de participar. Retiro Dois com 64% dos

agricultores entre homens e mulheres, 27 de Outubro com 60% e Novo Marimbondo

com 5,4% de homens e 23, 2 de mulheres gostariam de participar do PNPB.

Como esse programa além de ser novidade no processo agrícola brasileiro, tem

o objetivo de incentivar a participação familiar, mais de 60% dos entrevistados gostaria

de participar, para aumentar a renda familiar, e por meio do consórcio com culturas

anuais, aumentar a diversidade na propriedade, e ter a oportunidade de conhecer novas

culturas, desde, que se tenha mais esclarecimento sobre o programa, e incentivo

político, por meio do governo, com crédito e compra dos produtos.

No entanto, não cabe somente ao governo a promoção de medidas capazes de

alterar os rumos da produção familiar. Devido a sua importânc ia no que diz respeito ao

bem estar da sociedade, todas as forças da sociedade civil organizada devem engajar -se

em tal tarefa, como os STRs (Sindicato dos trabalhadores Rurais), os movimentos

sociais do campo e as associações locais.

(a)

41

(b)

FIGURA 6 Porcentagem de homens (a) e mulheres (b) que gostariam de participardo Programa Nacional de Produção e uso de Biodiesel nosassentamentos. UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

Como os estabelecimentos familiares são pe quenos, utilizados na sua maioria

para a produção de subsistência, os agricultores que não gostariam de participar do

programa, apresentam como explicação a falta de área para trabalho, pois, não querem

atrapalhar os plantios tradicionais que garantem a re nda da família, e por possuir um

mercado indefinido para a compra de culturas oleaginosas, o que demonstram a falta de

conhecimento da parceria realizada com a PETROBRAS, que tem feito contratos de

compra com os agricultores.

5.5 A cultura do Pinhão-manso (Jatropha curcas L.)

O Brasil apresenta excelentes perspectivas de cultivos para várias oleaginosas,

mas nem todas dispõem de estudos sobre o zoneamento agrícola , e o pinhão-manso não

está contemplado nesse estudo (CHING e RODRIGUES 2007). Além de ser uma boa

alternativa de plantio para a agricultura familiar, por ser perene, e garantir mão de obra

a toda família. Apesar disto, já há uma aceitabilidade por parte dos produtores, onde,

mais de 50% dos entrevistados nos assentamentos de 27 de Outubro e Retiro Dois tem

interesse em trabalhar com essa oleaginosa, pois acreditam ser uma boa alternativa para

a produção do óleo (Figura 7a e 7b)

42

(a)

(b)

FIGURA 7 Porcentagem de homens (a) e mulheres (b) que acreditam que o pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma boa alternativa para a produção deóleo. UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

Nos assentamentos Dom Helder, Bela Vista, Retiro Dois, 27 de Outubro e

Novo Marimbondo respectivamente 78,3 ; 70,5; 100; 70 e 70% dos agricultores,

(homens e mulheres) plantariam sementes ou mudas da oleaginosa em estudo .

Alguns dos entrevistados não plantariam a espécie por não conhecer a cultura,

e por não saber da disponibilidade de compra, e a maior parte dos que plantariam seria

para plantio consorciado, pois esses agricultores querem manter a sua roça de

subsistência, e opinariam plantar em consórcio com: milho, feijão, mandioca,

amendoim, e outras poucas citadas, assim teriam uma produtividade diversificada com

menor custo. Porém, é importa nte ressaltar que o cultivo consorciado possui grande

relevância na geração de renda e alimentação para pequenos produtores , e somente os

43

que plantam culturas empregadas na alimentação, têm tido seus contratos de compra

efetivados.

5. 6 Seleção de Indicadores de Sustentabilidade

Por meio das visitas aos assentamentos pode -se avaliar os impactos das ações

naturais e antrópicas de ocorrência nas áreas, para estes impactos sugeriu-se descritores

e indicadores de sustentabilidade, que permitirão uma análise quantitativa de variáveis

antes e depois da implantação de oleaginosas para o PNPB nas áreas, e avaliados

periodicamente para monitoramento da sustentabilidade.

A partir da observação foram selecionados os seguintes descritores, a) mercado,

b) adaptabilidade c) disponibilidade de sementes e mudas melhoradas, d) produtividade,

e) linhas de crédito, f) composição da força de trabalho, g) acesso a educação, h)

qualidade do solo e i) consórcio com outras culturas.

Estes podem sugerir e permitir inferências, p or meio de observações sobre a

agricultura familiar do estado de Sergipe, e ainda auxiliar na implantação de programas

de melhoramento, pela identificação das comunidades onde se poderia testar novos

genótipos, que poderiam vir a se tornar cultivares. Os indicadores desenvolvidos estão

diretamente relacionados com cada descritor, e podem ser visualizados na Tabela 4.

44

TABELA 4 Seleção de descritores e indicadores de sustentabilidade em áreascom potencial para plantio de oleaginosas para a produção debiodiesel. São Cristóvão, SE, UFS, 2009.

Descritores IndicadoresÁrea Área cultivada (ha)Mercado Custo do produto (R$)

Quantificação do produto (t/ano)Adaptabilidade Quantidade de plantas cultivadas por área plantada (Nº de

plantas/área plantada)Disponibilidade de sementes e mudas Quantidade de sementes e mudas melhoradas para o cultivo

(Nº)Linhas de crédito Financiamento (R$)Composição da força de trabalho Quantidade e tipo de trabalhador (Nº e gênero)Acesso a educação

Nível de escolaridade (% de pessoas alfabetizadas)Qualidade do solo Agroquímicos (ppm)Consórcio com outras culturas Quantidade de culturas consorciadas (nº)


Na Tabela 5, estão expostos os indicadores na Matriz P EI/ER, (Pressão, Estado,

Impacto/Efeito e Resposta), evidenciando -se possíveis alternativas e soluções para a

cadeia de biodiesel no Estado.

São propostos dez descritores e dez indicadores de sustentabilidade, com o

intuito de se estimular futuros estudos desses agroecossistemas.

TABELA 5 Indicadores de sustentabilidade em áreas com potencial para plantio deoleaginosas visando à produção de biodiesel , empregando-semetodologia baseada na Matriz Pressão/Estado/Impacto/Efeito/Resposta – (PEI/ER). UFS, São Cristóvão-SE,2009.

Indicadores depressão (P)

Indicadores deEstado(E)

Indicadores de Impacto/Efeito/Resposta(R)

Área cultivada (ha)Custo do produto(R$)Quantificação doproduto (t/ano)

Quantidade de plantascultivadas por áreaplantada (Nº deplantas/área plantada)Quantidade de sementes emudas melhoradas para ocultivo (Nº)

Financiamento (R$)Quantidade e tipo de trabalhador (Nº e gênero)Nível de escolaridade (% de pessoasalfabetizadas)Agroquímicos (ppm)Quantidade de culturas consorciadas (nº )

Fonte: Dados da pesquisa; Sergipe 2008. UFS. São Cristóvão, SE.2009

45

Indicadores de pressão (P)

- Área cultivada (ha): observando-se o tipo de relevo e solo dos municípios e

realizando-se a avaliação conjunta das variáveis, a área usada para plantio, vantagem do

consórcio e análise química do solo, área ocupada com culturas anuais ; pode-se concluir

que os agricultores encontram baixa produtividade nas lavouras, cultivam pequenas

áreas somente para o seu sustento e para o trato dos animais, devido às re strições de

solo.

- Custo do produto (R$): os custos da produção pode variar pois o preço do produto

estará de acordo com contratos estabelecidos com a PETROBRAS. Devido aos custos

elevados da produção nacional, o Biodiesel até o momento apresenta viabil idade

econômica efetiva e características de desenvolvimento sustentado, apenas nos casos de

desenvolvimento local,

- Quantificação do produto (t/ano) : Um monitoramento regular da produção

evidenciaria os reais valores destas, que muitas vezes ficam masca rados em função da

informalidade e de outros aspectos. Esse indicador geraria dados para avaliação da

produtividade desses agroecossistemas, cujos dados atualmente são insuficientes para

realização de uma averiguação precisa, não refletindo a realidade des te.

Indicadores de Estado (E)

- Quantidade de plantas cultivadas por área plantada (Nº de plantas/área

plantada): O planejamento da área a ser plantada é muito importante, pois os

agricultores disponibilizam pouca terra, sendo estimado de 1 a 5 ha por família e as

mesmas são usadas com plantações de milho, feijão e mandioca. O planejamento

facilitaria o uso da sazonalidade para a tomada de decisão quanto a época de plantio,

bem como organização do plantio, tratos culturais e colheita, sendo este último

relacionado a entrega da produção ao contratante (Petrobras).

- Quantidade de sementes e mudas melhoradas para o cultivo (Nº): Na avaliação

conjunta das variáveis área usada para cultivo e plantio de sementes e mudas

melhoradas, a área disponível para a nova cultura é pequena, mas para a comunidade

46

local se o custo for favorável, há disponibilidade de terras , que poderiam ser trabalhadas

dentro do assentamento de forma coletiva, gerando rendimentos que seriam

ponderadamente divididos entre os participantes. Isto ainda contribui para o

fortalecimento dos trabalhos coletivos, tão fortemente incentivados pelos movimentos

sociais, e ainda, permitiriam o fortalecimento de associações e cooperativas de

produtores.

Indicadores de Impacto/Efeito/Resposta (R)

- Financiamento (R$): Apesar da existência de políticas públicas que incentivam e

estão diretamente ligadas as ações do PN PB, do MDA; a maioria dos agricultores se

encontra inadimplente junto aos órgão financiadores, o que o impede de ter acesso a

financiamentos.

- Quantidade e tipo de trabalhador (Nº e gênero): Dar viabilização ao trabalho da

mulher, não somente na agricultura familiar, mas também em outros setores, seja ele,

em atividades sócio-culturais, como na sustentabilidade ambiental.

- Nível de escolaridade (% de pessoas alfabetizadas): A população pesquisada possui

o Ensino Fundamental incompleto. Esta parcela da população teve acesso e permaneceu

na escola pelo menos nas séries iniciais, pois as escolas do interior do Município,

próximas às propriedades, oferecem Ensino Fundamental incompleto. A Secretaria

Municipal de Educação deve garantir a permanência das crianças na escola e oferecer

Ensino Supletivo, no interior do Município, para aqueles maiores de 14 anos que não

concluíram o Ensino Fundamenta l. Com o acesso à informação, a população terá

melhores condições de organização e garantia a seus direitos como cidadãos. Além

disso, o conhecimento permitirá aos agricultores a aceitação e compreenção de práticas

agrícolas diferenciadas.

-Agroquímicos (ppm): Conhecimento e manejo de agroquímicos, pois os agricultores

apresentaram grande desconhecimento do uso correto de agroquímicos, usando de

forma desenfreada, sem a utilização de Equipamentos de Proteção Individual (EPI),

muitas vezes devido a carância de técnicos disponíveis para instruí -los ou mesmo pela

47

resistência na aceitação de orientações técnicas. Os trabalhadores rurais estão expostos a

riscos muito diversificados, sobretudo à exposição direta à agrotóxicos, sujeitos à graves

problemas de saúde.

- Quantidade de culturas consorciadas (nº): As culturas a serem consorciadas ou os

sistemas a serem utilizados pelo produtor são determinados por aspectos econômicos

regionais e pelas próprias atividades produtivas na propriedade. A organização dos

produtores em cooperativas, ou a organização do plantio visando à diversidade de

culturas é um dos aspectos a se considerar para a sustentabilidade.

48

6. CONCLUSÕES

A inclusão dos agricultores no PNPB provavelmente contribuirá para aumentar a

renda familiar, em plantios de consórcio de culturas anuais, com emprego de

oleaginosas melhoradas.

O plantio de oleaginosas em áreas de agricultura familiar do estado de Sergipe

pode ser avaliado quanto a sustentabilidade empregando os indicadores de

sustentabilidade.

49

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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51

CAPITULO 3

COSTA, Marcilene de Jesus Caldas. Avaliação da expressão gênica em sementes depinhão-manso (Jatropha curcas L.) submetidas ao estresse combinado de restriçãohídrica e temperatura. 2009 (Dissertação-Mestrado em Agroecossistemas).Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, SE.

1. RESUMO

Nas duas últimas décadas as condições climáticas têm mudado impredictivelmente emseus padrões de temperatura e pluviosidade. Isto seriamente afeta o cultivo e o uso devariedades. Visando contribuir para a compreensão do comportamento de sementes depinhão- manso (Jatropha curcas L.) sob tais condições realizou-se o presente trabalho.Para isto as sementes foram submetidas avaliações preliminares da sua fisiologia pormeio da curva de embebição, curva de germinação para sementes submetidas adiferentes temperaturas e restrição hídrica promovidas por meio do uso de soluções depolietilenoglicol 6000. Para avaliação da expressão gênica, sementes de pin hão mansoforam embebidas por 24, 48, 72 e 96h em potenciais osmóticos de -0,8;-1,0 e -1,2MPasob as temperaturas de 25ºC e 40ºC. Após estes tratamentos as sementes tiveram seusembriões extraídos, congelados em freezer -86°C e a seguir liofilizados. Deste sembriões se extraiu RNA e obteve -se cDNA visando à avaliação dos perfis de protéicosproteínas, bem como a avaliação da expressão de genes relacionados com odesenvolvimento embrionário (ABI3), ao ciclo celular (CDC2), ao citoesqueleto (ACT2)e a tolerância a estresses (PKABA1, sHSP18.2, EM6 e PER1). Inicialmente observou-sea protrusão da raiz após 24 horas de embebição . O potencial máximo de germinação sedeu a 25ºC e o mínimo a 40ºC, sendo esta temperatura empregada na indução doestresse. Com relação à restrição hídrica não houve germinação em potenciaisosmóticos superiores a -0,8MPa. Observou-se para as sementes submetidas ao estressecombinado de restrição hídrica e temperatura perfis diferenciados de heat shok proteins,sendo a expressão mais efetiva para os tratamentos em -1,0 e 1,2 MPa nas temperaturasde 25 e 40 ºC. Na expressão de genes relacionados ao desenvolvimento, observou -seatravés de RT-PCR a amplificação de seqüências gênicas correspondentes a LEC1,sHSP, CDC2a, 18S, PKBA1, AB13, ACT, EM6 e PER1, de forma diferenciada adepender do tratamento, sendo que ocorre maior expressão dos referidos genes nostratamentos -0,8 -1,0;-1,2MPa.

Palavras- chave: RNAm, embriões, desenvolvimento

52

2. ABSTRACT

COSTA, Marcilene of Jesus Caldas. Evaluation of gene expression in seed pinhao -manso (Jatropha curcas L.) subjected to combined stress of temperature and waterrestriction. 2009. 97p. (Dissertation, Master in Agroecosystems). Federal University ofSergipe, São Cristóvão, SE.

In the last two decades the climate has changed in their impredictivelmente patterns oftemperature and rainfall. This seriously affects the cultivation and use of varieties. Tohelp the understanding of the behavior of oilseeds of physic nuts (Jatropha curcas L.)under these conditions was carried out this work. For this the seeds were submittedpreliminary to imbibitions to access their physiology through the imbibition andgermination curve under different temperatures and water restriction promoted throughthe use of solutions of polyethylene glycol 6000. For evaluation of the gene expression,seeds were sampled at 24, 48, 72 and 96hs in osmotic potentia ls of -0.8, -1.0 and -1.2MPa with temperatures of 25ºC and 40ºC. After this treatment the embryos were takenfrom those seeds, frozen at -86°C freezer and then lyophilized. These embryos wereused for RNA extractiton and cDNA was obtained to evaluate the protein profiles ofproteins, as well to access the gene expression related to embryonic development(ABI3), the cell cycle (CDC2), the cytoskeleton (ACT2) and tolerance to stresses(PKABA1, sHSP18.2, EM6 and PER1). Initially it was observed root protrusion after 24hours of imbibition. The maximum potential for germination occurred at 25ºC andminimum at 40ºC, this temperature being employed BA induction of stress. Withrespect to water restriction no germination was observed at osmotic potentials above -0.8 MPa. It was observed for seeds under combined stress of water restriction andtemperature different profiles of heat shock proteins, being the most effective fortratamentos-1,0 e 1,2 MPa with temperatures of 25ºC and 40ºC. In the expression ofgenes related to development, was observed for the RT -PCR amplification of genesequences related to LEC1, sHSP, CDC2a, 18S, PKBA1, AB13, ACT, EM6 and PER1differently depending on the treatment . The gene expression occurs more effectively forthe treatments 0,8 -1,0;-1,2MPa.

Keywords: mRNA, embryos, development

53

3.INTRODUÇÃO

O pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é um arbusto grande, de folhas verdes e

largas, com flores amarelo-esverdeadas e o fruto é uma cápsula com três sementes

escuras e lisas (KUMAR e SHARMA, 2008). Planta resistente à seca e de crescimento

rápido em regiões de clima quente, trás op iniões quanto à sua origem para América

tropical (LORENZI et al., 2003). A espécie apresenta vastas utilidades, uma delas vem

da semente, com grande potencial como matéria-prima para a produção de óleo

combustível (OPENSHAW, 2000), pois produz no mínimo 2 toneladas d e óleo/ha,

levando de 3 a 4 anos para atingir a idade produtiva, que pode se estender por 40 anos

(CARNIELLI, 2003).

Com aumento da produção e comercialização destas sementes, torna -se

importante que sejam estabelecidos padrões e desenvolvimento de metodologias

adequadas para a avaliação da qualidade das sementes , bem como que se conheça o

comportamento destas sob condições de estresse, visando a seleção de genótipos

adaptados às condições do semi -árido.

Dentre os parâmetros de avaliação da qualidade de s ementes, o teste de

germinação é o principal utilizado para a avaliação da qualidade fisiológica das

sementes e permite conhecer o potencial de germinação de um lote em condições

favoráveis. Os resultados do testes são utilizados para determinar a taxa de semeadura,

para a comparação do valor de lotes e para a comercialização, pois possibilita a

obtenção de resultados comparávei s entre laboratórios (CARVALHO e NAKAGAWA,

2000).

Para a oleaginosa mamona já existe um procedimento padrão recomendado pela

RAS- Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992), publicação oficial que

normatiza a análise de sementes, para que a germinação ocorra nas condições ótimas de

cada espécie. No entanto, para pinhão -manso, a metodologia do teste ainda não foi

estabelecida.

Fatores ambientais influenciam o processo germinativo de sementes, a (in)

disponibilidade de água é um dos fatores essenciais a iniciação da germinação, que

desencadeia uma série de mudanças metabólicas, como a ativação do ciclo celular

(CASTRO et al., 2000) que culminam com a protrusão de radícula, quando se refere a

sementes viáveis não dormentes. Com a deficiência de água na germinação, geralmente

54

há elevação de sais solúveis do meio, que também pode influenciar significativamente a

resposta germinativa das espécies. A temperatura age sobre a velocidade de absorção

de água e também sobre as reações bioquímicas , que determinam todo o processo e em

conseqüência, afetam tanto a velocidade e uniformidade de germinação, como a

germinação total; esta só ocorre dentro de determinados limites de temperatura, nos

quais existe uma temperatura ótima, ou faixa de temperaturas, na qual o processo ocorre

com a máxima eficiência, obtendo -se o máximo de germinação no men or período

possível (CARVALHO e NAKAGAWA, 2000).

Sabendo-se que água e temperatura exercem influências sobre a germinação de

sementes, este trabalho objetivou realizar avaliações preliminares da qualidade

fisiológica de sementes de pinhão-manso com a obtenção da curva de embebição e

curva de germinação em sementes submetidas à diferentes temperaturas e à restrição

hídrica em diferentes potenciais osmóticos promovidos por meio do uso de soluções de

polietilenoglicol 6000.

A capacidade de órgãos, como sementes e p ólen de resistir a estresses bióticos e

abióticos é um fenômeno generalizado entre as plantas superiores. A planta Arabidopsis

thaliana L. tem sido muito útil para a biotecnologia , uma vez que estudos usando essa

planta permitiram o entendimento de como a germinação é controlada por genes que

têm o poder de ativar a germinação ou manter a dormência da semente. Pesquisas

subsequentes contribuíram para a compreensão da relação estreita entre esses genes e

aqueles que controlam o metabolismo da semente, após a germinação. Estudos

detalhados do controle genético da germinação em A. thaliana permitiu identificar mais

de 30 genes envolvidos neste processo. Alguns promovem a síntese de hormônios,

outros estão associados à emissão de sinais para hormônios específicos. Por exemplo, a

giberelina é um potente ativador da germinação e os genes associados com sua síntese

determinam o momento e a velocidade do processo germinativo.

O gene comatose, conhecido pela sigla CTS, foi identificado durante um estudo

de mutações genéticas que reduziam o potencial germinativo d e sementes. Verificou-se

que o CTS é fundamental para a transição da dormência /quiescência para a germinação.

O gene é responsável pela síntese de uma proteína transportadora, a qual regula o

metabolismo dos lipídios durante o processo germinativo (HOOKS et al., 2007).

A expressão da proteína codificada pelo CTS aumenta imediatamente após a

embebição de sementes de germinação normal, porém o fenômeno não se repete com

55

sementes de alta dormência. Essa observação sugere que o CTS é regulado por outro(s)

gene(s) diretamente ligado(s) à dormência ou quiescência, que funcionaria(m) como

uma chave "liga/desliga" do CTS (FOOTITT et al., 2002).

O fito-hormônio ABA (ácido abscíssico) media a resposta das plantas tolerantes

a estresses hídricos e também está envolvido na expressão da resistência induzida de

plantas ao ataque de pragas. Nas sementes, o ABA promove o desenvolvimento e a

maturação do embrião, a síntese das reservas das sementes (proteínas e lipídios), a

tolerância à seca, a inibição da germ inação (dormência) e a apoptose (FINKELSTEIN et

al.,2002; FINKELSTEIN, 2006). Os genes mais estudados com relação ao

desenvolvimento de sementes é o ABI3 (Acido Abscissico Insensível), o qual é expresso

especificamente nas sementes (PARCY, 1994) e suas proteínas são memb ros de um

grande grupo de fatores da transcrição que atuam como intermediários em regular genes

de ABA-responsivo no desenvolvimento de sementes .

Outro componente envolvido no processo de germinação de sementes é a ACT.

O citoesqueleto é uma importante característica estrutural comum a todas as células

eucarióticas, trata se de um extenso sistema de fibras de proteína. As dinâmicas do

citoesqueleto de microtúbulos consistem em filamentos de actina de plantas,

microtúbulos e actina trabalham em conjunto e f ornecem apoio estrutural, e são

envolvidos no transporte intracelulares e divisão celular (K OST et al., 2002;

WASTENEYS, 2002; WASTENEYS e GALWAY, 2003).

Um grupo particular de proteínas denominado proteínas de choque térmico

(Heat Shock Proteins- HSPs) tem importância na proteção ao estresse por altas

temperaturas (VIERLING, 1991), portanto, é visto como preservador ou reparador de

estruturas macromoleculares durante a desidratação ou reidratação (HELM e

ABERNETHY, 1990).

Como visto acima, o processo de germinação é controlado por genes, e a

expressão destes depende de fatores externos, podendo alterar os processos

germinativos. Desta forma visando o entendimento do comportamento de genes que

podem se expressar em sementes submetidas ao estresse, é que se realizou o presente

trabalho com sementes de pinhão-manso submetidas a estresse combinado de

temperatura e restrição hídrica, por meio da técnica de RT -PCR usando os primers

ABI3, CTS (relacionados com desenvolvimento), EM6, PER1, sHSP18.2 e PKABA

(relacionados ao estresse), CDC2 (relacionado ao ciclo celular) e ACT (relacionado ao

56

citoesqueleto). Em adição a expressão de proteínas submetidas ao estresse térmico foi

estudada pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições

desnaturantes.

57

4. MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi conduzido no ano de 200 9, no Laboratório de Tecnologia de

Sementes da Universidade Federal de Sergipe -UFS, e no Laboratório de Sementes da

Universidade Federal de Lavras. Foram utilizadas sementes de Jatropha curcas L.,

provenientes do Estado de Minas Gerais pela EPAMIG, que foram mantidas em câmara

fria em temperatura de 6ºC e umidade média de 64 -66% até a sua utlização. As

sementes foram inicialmente tratadas com hipoclorito de sódio a 4% para desinfestaç ão

superficial e, posteriormente lavadas com água corrente e secas sobre papel toalha.

Após a desinfecção as sementes foram submetidas à embebição em água visando a

construção da curva de embebição e germinação nas temperaturas de 25ºC, 30ºC, 35ºC

e 40ºC e nos potencias osmóticos de 0,0; -0,4; -0,8; -1,2 e -1,6 MPa.

4.1 Ensaio 1 - Curva de embebição

Para a determinação da curva de embebição das sementes de pinhão-manso, as

mesmas foram distribuídas em caixas plásticas, do tipo gerbox, entre duas folhas de

papel mata-borrão e uma folha de papel mata -borrão, sendo estes umedecidos com água

destilada por 2,5 vezes o peso do papel e mantidas em incubadora do tipo BOD na

temperatura de 25ºC, sem luz.

4.1.1 Procedimento estatístico

O delineamento estatístico empregado foi o inteiramente casualizado (DIC ) com

quatro repetições de 25 sementes.

4.1.2 Avaliações

As sementes foram colocadas para embeber e as avaliações referentes ao peso

das sementes de cada repetição foram realizadas a cada 2h nas primeiras doze horas e a

cada 4 horas nas seguintes horas até 48 horas. Após 48 horas de avaliação as sementes

foram avaliadas a cada 4 horas, sendo o tempo final de avaliação com 204 horas.

A curva de embebição foi construída obtendo-se a massa de água embebida em

função do tempo, identificando a quantidade total de água necessária para a germinação

das sementes.

58

4.2 Ensaio 2 - Curva de germinação de estresse térmico e restrição hídrica

Para obtenção da curva de restrição as sementes foram submetidas ao teste de

germinação em soluções de polietilenoglicol (PEG 6000) com diferentes potenciais

osmóticos 0,0; -0,4; -0,8; -1,2 e -1,6 MPa, preparadas segundo Villela et al.(1991),

embebendo duas folhas de papel mata -borrão com 3 vezes o peso do papel com esta

solução. Após distribuição das sementes sobre o papel as mesmas foram mantidas em

incubadora (BOD) a 25ºC na ausência de luz. Para obtenção da curva de estresse

térmico as sementes foram submetidas às temperaturas constantes 25, 30, 35 e 40ºC em

incubadoras do tipo BOD.

4.2.1 Procedimento estatísticoO delineamento utilizado foi inteiramente casualizado (DIC), em quatro

repetições de 25 sementes por tratamento.

4.2.2 AvaliaçõesA germinação foi avaliada diariamente pela protrusão da radícula. Ao final das

avaliações os dados de germinação foram plotados em gráfico para os diferentes

potenciais e para as diferentes temperaturas. Foram identificados os potenciais e as

temperaturas, em que as sementes mostraram 50% de germinação , estabelecendo este

ponto como médio, sendo abaixo do mesmo considerada restrição e acima não restrição.

4.3 Ensaio 3 - Estresse combinado de restrição hídrica e temperatura

As sementes foram submetidas ao estresse combinado de restrição hídrica

promovida por soluções de polietilenoglicol (PEG 6 000) nos potenciais de 0,0; 0,8; 1,0

e -1,2 MPa e temperatura de 25ºC e 40ºC em BOD sem iluminação em caixas tipo

gerbox. Para isto, as sementes foram dispostas entre duas folhas de papel mata-borrão,

abaixo, e uma folha de papel sobre estas. Estes papéis foram dispostos em caixas gerbox

e a seguir umedecidos com três vezes o peso do papel, com solução de PEG 6000.

Todas as caixas gerbox, contendo as sementes foram acondicionadas em sacos de

polietileno, para evitar o ressecamento dos papéis, e mantidos em germinador a 25ºC e

40ºC. Para cada tratamento foram utilizadas quatro repetições de 25 sementes cada.

59

4.3.1 Procedimento estatísticoO delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial

(2x4), em quatro repetições de 25 sementes, por tratamento, sendo 2 temperaturas (25ºC

e 40ºC) e 4 potenciais osmótico (0,0; 0,8; 1,0 e -1,2 MPa).

4.3.2 AvaliaçõesApós 24, 48 72 e 96h foram retiradas aleatoriamente 5 sementes de cada

repetição de cada tratamento e extraído os embriões (Tabela 6), sob baixa temperatura e

armazenados em freezer a 4ºC até a extração de proteínas e RNA.

TABELA 6 Tratamentos empregados em sementes de pinhão -manso (Jatrophacurcas L.) para o estudo da expressão gênica sob estresse combinado derestrição hídrica e temperatura. UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

Nº daamostra

Tratamento Nºda amostra Tratamento

1 0,0; 25ºC; 24hs 17 0,0; 40ºC; 24hs2 0,0; 25ºC; 48hs 18 0,0; 40ºC; 48hs3 0,0; 25ºC; 72hs 19 0,0; 40ºC; 72hs4 0,0; 25ºC; 96hs 20 0,0; 40ºC; 96hs5 -0,8(P.O); 25ºC; 24hs 21 -0,8(P.O); 40ºC; 24hs6 -0,8(P.O); 25ºC; 48hs 22 -0,8(P.O); 40ºC; 48hs7 -0,8(P.O); 25ºC; 72hs 23 -0,8(P.O); 40ºC; 72hs8 -0,8(P.O); 25ºC; 96hs 24 -0,8(P.O); 40ºC; 96hs9 -1,0(P.O); 25ºC; 24hs 25 -1,0(P.O); 40ºC; 24hs10 -1,0(P.O); 25ºC; 48hs 26 -1,0(P.O); 40ºC; 48hs11 -1,0(P.O); 25ºC; 72hs 27 -1,0(P.O); 40ºC; 72hs12 -1,0(P.O); 25ºC; 96hs 28 -1,0(P.O); 40ºC; 96hs13 -1,2(P.O); 25ºC; 24hs 29 -1,2(P.O); 40ºC; 24hs14 -1,2(P.O); 25ºC; 48hs 30 -1,2(P.O); 40ºC; 48hs15 -1,2(P.O); 25ºC; 72hs 31 -1,2(P.O); 40ºC; 72hs16 -1,2(P.O); 25ºC; 96hs 32 -1,2(P.O); 40ºC; 96hsTC sem tratamento

4.4 Ensaio 4 - Análise eletroforética de proteínas resistentes ao calor

Para análise eletroforética das proteínas resistentes ao calor foram pesado s 20

mg de eixo embrionário de cada tratamento em microtubos tipo eppendorf. A

metodologia utilizada seguiu o protocolo descrito por Blackman et al.(1991). A extração

das proteínas foi efetuada, adicionando tampão de extração (50mM tris -HCL, pH=7,5;

500 mM NaCl; 5mM MgCl2) na proporção de 1:10 (peso do material: volume de

tampão de extração) sob maceração. Em seguida, os microtubos foram agitados em

Vortex e centrifugados a 16.000xg por 30 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi incubado

em banho-maria a 85ºC, por 15 minutos e, novamente, centrifugado por 30 minutos a

60

16.000xg. Posteriormente, o sobrenadante foi vertido em microtubos e o precipitado

descartado.

A concentração protéica foi determinada, utilizando metodologia proposta por

Bradford (1976) usando soro albumina bovina (BSA) como padrão e todas as amostras

foram diluídas para uma concentração de 4mg/m L.

Um volume de 35ul de extrato de proteína diluído foi retirado e adicionado 20

uL do tampão da amostra (2,5mL de glicerol; 0,46g de SDS; 20mg de azul Bromofenol

e completado o volume para 20mL com tampão Tris -HCl pH 7,5). Em seguida, foram

levados ao banho-maria em ebulição por 5 minutos.

Em cada canaleta do SDS-PAGE a 12,5% (gel separador) e 6% (gel

concentrador) aplicou-se 30 uL de cada amostra. A corrida eletroforética foi realizada

com tampão de corrida Tris -glicina +SDS pH 8,0 a 150 V por 4 horas. Os géis foram

corados em Coomassie Blue (0,5g Coomassie Blue R -250; 250 mL de etanol; 50 mL de

ácido acético glacial, completando o volume até 500 mL com água destilada), durante

12 horas e descorados em solução de ácido acético 10% e etanol 5%, conforme Alfenas

(2006).

4.5 Ensaio 5 - Expressão gênica induzida por estresse combinado

4.5.1Extração do RNA

Para análise da expressão gênica, foi extraído RNA dos eixos embrionários de

sementes de pinhão-manso de cada tratamento nos períodos de 24, 48, 72 e 96 horas.

Para extração de RNA total empregou se o kit SV Total RNA Isolation System -

Promega, seguindo as recomendações do fabricante. Neste processo 30mg de embriões

de cada amostra foram macerados utilizando almofariz e pilão, adicionado 175uL de

RNA lise e transferidos para tubo livre de Rnase. O lisado foi transferido para uma

coluna que tem como função separar os restos celulares do RNA. O filtrado co ntendo o

RNA é então transferido para outra coluna de afinidade pelo RNA. Esta segunda coluna

é importante para que o RNA possa ser lavado, eliminando outros componentes

celulares, auxiliando na purificação da amostra. Todo o processo foi realizado com

material autoclavado.

61

Para se verificar a quantidade do RNA, foi feita uma eletroforese em gel de

agarose 1% p/v, em TBE 0,5. Logo após foi realizado a quantificação das amostras , no

Laboratório de Estudos em Meio Ambiente -LEMA/UCSAL, por absorbância a 230nm,

260 nm, 280 nm e 320nm no espectrofotômetro de ultravioleta ( Cary 59) em cubeta de

quartzo, diluição 1:1000 (RNA: água ultra pura) . A concentração do RNA quantificado

foi obtida por meio da seguinte formula:

[RNA] = A260xFcxFd/ 1000

Onde:

A260: absorbância da amostra sob o comprimento de onda de 260 nm corresponde a 40μg RNA mL-1 (SAMBROOK et al., 1989);

Fc: fator de conversão, no qual 1 unidade de absorbância a 260 nmFd: fator de diluição da amostra de leitura,1000 fator de correção para obtenção da concentração em μg μL-1.

A qualidade das amostras foi verificada com base na relação A260nm/A280nm,

sendo que valores entre 1,7 e 2,0 indicam boa qualidade do RNA extraído

(SAMBROOK et al., 1989).

4.5.2 Obtenção do cDNA

O RNA total foi usado para síntese de cDNA, foram utilizados 5u L de RNA, 6

uL de água ultra pura e 1uL de Oligo dt. (0,5 ug/μL) .O material foi incubado a 70 ºC

por 10minutos e imediatamente incubado em gelo por 1min uto. Em seguida, foram

adicionados 4uL de tampão de PCR 10X, 2uL de DTT(0,1M), 1uL de dNTP (10mM) e

0,5 da enzima transcriptase re versa (RT), incubando a 37°C por 50min e 70ºC por

15minutos.

4.5.3 Reação da Polimerase em Cadeia (PCR )

Para identificação dos transcritos de interesse, foi realizada a técnica de PCR

usando o cDNA preparado a partir do RNA de cada amostra de embrião de pinhão-

manso. Para um volume final de reação de 50 μL foram adicionados 3μL de cDNA, 1

μL de cada primer (forward e reverse);1 μL de dNTP(10mM),0,5 μL de Taq DNA

polimerase, 3 μL de MgCl2(25mM),5 μL do tampão de reação 10X, 35,5 μL de água

ultra-pura. O programa utilizado no t ermociclador (Biometra) para a realização da

62

reação foi: 30 ciclos de 94°C por 1 minuto (desnaturação), 50°C por 1 minuto

(anelamento do primer), 72°C por 10 minutos (extensão) e parada da reação a 4ºC. Os

primers específicos usados para J. curcas L. (Tabela 7) foram baseados nas seqüências

do gene disponíveis na base de dados de TIGR ( MtGI Release8.0;www.tigr.org/tigr-

scripts/tgi).

TABELA 7 Primers específicos para Arabidopsis, que foram usados em reações deRT-PCR em RNA extraído de embriões submetidos a estresse combinadode temperatura e restrição hídrica de sementes de pinhão -manso (Jatrophacurcas L.). UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

Nome Forward (5’→3’) Reverse (5’→3’)ABI3 ACCGGTGATTTTGTGAAAGC ATGGCGTGCCATTATTATCCACT TCCATCATGAAGTGCGATGT AACCTCCGATCCAGACACTGCDC2 ACCCCAGTTGATGTTTGGTC CCACGGTTGCTAGGTCCTTACTS GGTCTTCCACATGGCAAGTAA AAACCCAAGGCCAAGTAACAEM6 GGCAAAGCAAGGAGAGACTG ACCTTCCTCTTCAGCACGTTPKABA1 GGCGCTTATCCTTTTGAAGA CAGCTTCCACCTTCCCATTAPER1 GCACATACTCCAGGTGCAAA ACCACCCTCAGCACTTCATCsHSP18.2 CACGTGTGGACTGGAAAGAA TCTCTCAACACGATGCCACT18S TGACGGAGAATTAGGGTTCG CCTCCAATGGATCCTCGTTA

A identificação do produto de amplificação, obtido na reação de RT -PCR, foi

feita por meio de eletroforese em gel de agarose 1% (p/v) com tampão TBE 0,5X,

submetido à corrente de 80V por 1h. As bandas foram visualizadas sob luz ultravioleta

por meio de coloração com brometo de etídio (0,01 ng .μL-1). O marcador de peso

molecular 1 kb DNA Ladder (Promega) foi utilizado para a verificação do tamanho do

fragmento amplificado.

www.tigr.org/tigr-

63

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Durante a germinação de sementes elas passam por uma mudança de uma fase de

desenvolvimento para um programa de germinação (BEWLEY, 1997). Ocorre uma alta

atividade metabólica com a quebra de r eservas para suprimento de energia e síntese de

novo de componentes requeridos para o crescimento. Por definição, a germinação de

sementes está completa quando ocorre a protrusão da radícula. A partir desse momento

a semente germinada passa para o vegetati vo crescimento da plântula.

A embebição das sementes é o processo imprescindível para que a germinação

ocorra, sendo que, a quantidade de água requerida pela semente dependente da espécie e

das condições ambientais as quais a mesma é submetida, como tempe ratura e para

algumas sementes a existência de luz.

Neste trabalho submeteu-se as sementes a embebição contínua em água a

temperatura de 25°C, visando à construção da curva de embebição. Observou -se após

48 horas a protrusão da radícula, sendo que até est e período houve um ganho de 6,267g

do peso em água (Figura 8).

0

5

10

15

20

25

0 6 12 18 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132

Período de embebição (h)

Peso

das

sem

ente

s (g

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Ger

min

ação

(%)

Peso Emissão de raíz

FIGURA 8 Peso das sementes (g) e germinação (%) durante embebição de sementes

de pinhão-manso (Jatropha curcas L.). UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

64

Na germinação das sementes de pinhão -manso observou-se uma rápida absorção

de água até o período de 48 horas. Em avaliações obtidas nos experimentos conduzidos

por Souza et al.,(2008), foi observado em mamona ( Ricinus communis L.), um padrão

trifásico, que atingiu a fase I da germinação em 24hs. No entanto, deve-se levar em

conta que, mamoneira é uma espécie que vem sendo trabalhada em programas de

melhoramento por muito tempo, o que contribui para que os genótipos melhorados

apresentem menor tempo para embebição de suas sementes. Foi mostrado p or Dantas et

al. (2007) o modelo trifásico da germinação em sementes de espécies nativas da

caatinga e do cerrado, como Caesalpinia pyramidalis e Schinopsis brasiliensis

(DANTAS et al., 2008) e Jatropha curcas (DANTAS et al., 2007)

No gráfico das curvas de germinação para diferentes temperaturas observou -se

que, os maiores valores de porcentagem de germinação foram obtidos nas temperaturas

constantes de 25ºC e 30ºC (Figura 9 ), onde as médias de germinação chegaram a 58% e

43% respectivamente. Em geral, o s menores valores de germinação foram verificados

para sementes mantidas a 35ºC com 15% de sementes germinadas, além de ter sido

observado maior incidência de microrganismos nas semente s, o que contribui para

queda na porcentagem de germinação em sementes submetidas a temperatura de 35ºC .

As sementes de pinhão-manso mantidas a 40ºC não germinaram, sendo contados para

avaliação deste resultado um período de 30 dias.

A otimização do processo germinativo a temperatura de 30ºC foi citado por

Pereira et al.(2007), no entanto, as sementes de pinhão -manso também respondem bem

as condições de temperaturas alternadas de 20ºC e 30ºC, o que foi observado por

Martins et al(2008) e constatados em sementes de outras euforbiáceas como a

mamoneira e o leiteiro (BRASIL, 1992).

65

01020304050607080

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Dias após semeadura

Ger

min

ação

(%)

25ºC 30ºC 35ºC 40ºC

FIGURA 9 Curva de germinação de sementes de pinhão -manso (Jatropha curcas L.)em diferentes temperaturas. UFS, São Cristóvão -SE, 2009.

As sementes de pinhão-manso submetidas ao estresse hídrico apresentaram um

decréscimo na porcentagem de germinação com o aumento da restrição hídrica, sendo

os maiores valores encontrados para a testemunha (sem restrição) e para -0,2 MPa com

30% de germinação. Nos potenciais de -0,6 e -0,8 MPa as sementes de pinhão -manso

não germinaram (Figura 10), esta nulidade germinativa deve-se a uma disponibilidade

menor de água que acarreta reduções na atividade de algumas enzimas prejudicando o

metabolismo geral das sementes (BEWLEY e BLACK, 1994).

Apesar da espécie ser conhecida como uma planta resistente a seca , pela análise

dos resultados obtidos neste trabalho observou -se uma sensibilidade da espécie ao

déficit hídrico nas fases inicias do seu ciclo de vida.

66

0

5

10

15

20

25

0 6 12 18 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 168 192


Pes

o da

s se

men

tes

(g)

0

10

20

30

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50

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70

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100

Em

issã

o de

raíz

(%)

Peso Germinação

0

5

10

15

20

25

0 6 12 18 24 36 48 60 72 84 96 108

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192


Pes

o da

s se

men

tes

(g)

0

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30

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50

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70

80

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100

Ger

min

ação

(%)

Peso

0

5

10

15

20

25

0 6 12 18 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 168 192


Peso

das

sem

ente

s (g

)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100G

erm

inaç

ão(%

)

Peso

FIGURA 10 Curva de germinação de sementes de pinhão-manso (Jatropha curcasL.) em diferentes condições de restrição hídrica promovida porsoluções de polietilenoglicol 6000 em diferentes potenciais osmóticos.UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

-0,2 MPa

-0,6 MPa

-0,8 MPa

67

5.1 Análise eletroforética de proteínas resisten tes ao calor

Nas Figuras 4a e b, encontram-se os perfis eletroforéticos de proteínas

resistentes ao calor, para as sementes de pinhão -manso submetidas a estresse combinado

e avaliadas a 24, 48, 72 e 96h. Nas sementes embebidas em água e aos potenciais

osmóticos de 0,8;-1,0 e -1,2 todos sob temperaturas de 25ºC e 40ºC, houve variação nos

perfis das proteínas resistentes ao calor durante os períodos de avaliação, exceto para

sementes o tratamento empregando água por 72 e 96hs a 25ºC. Sementes submetidas

aos potencias de - 0,8; -1,0 e -1,2MPa, requerem de um esforço osmótico que pode

igualmente induzir ou realçar a expressão de grupos de genes que codificam as

chamadas proteínas LEA ou de genes para HSPs. Estes genes auxiliam as células a

suportar estresse térmico e de restrição. Nos tratamentos que as sementes foram

submetidas houve um aumento na produção de proteínas resistentes ao calor, foi

possível, observar ainda uma concentração das frações protéicas de peso molecular

entre 20 e 50 kDa, bem como intensidades de bandas menores de peso molecular 120

kDa (Figura11 a e b). Para sementes de milho nas linhagens classificadas como

tolerantes observou se ainda uma concentração das frações protéicas de peso molecular

entre 18,5 e 44,1 kDa (ROVERI JOSÉ, 2003).

Em geral, a germinação das sementes é determinada por serie de efeitos de

hormônios, os quais sugerem a presença de uma interação entre fitohormônios como

giberalinas, ácido abscísico (ABA), citocinina, etileno e auxina (S ALGADO et al.,

2006). O ABA inibe a captação de água, a germinação e o posterior desenvolvimento da

radícula.

Pode se observar no ensaio I, nas sementes de pinhão -manso submetidas a

restrição de -0,8MPa que não houve germinação (Figura 10), o que permite inferir que

tal evento provavelmente ocorreu pelo aumento do ABA, pois estresse hídrico nas

sementes aumenta a produção de ABA , que pode induzir dormência (KHAN, 1992), e,

ainda levam a expressão de heat shock proteínas, que funcionam como protetoras das

estruturas celulares (LEPRINCE et al., 1993). O ABA também está envolvido na

expressão dos genes que codificam as proteínas de reserva e proteínas LEA, que são

proteínas sintetizadas na semente após a dife renciação do embrião (WISE e

TUNNACLIFFE, 2004).

Comparando-se os perfis protéicos de sementes de pinhão-manso submetidos a

estresse combinado de temperatura e restrição hídrica , promovida por soluções de PEG

68

6000, durante o processo de embebição, pode ser observada maior intensidade

de perfis protéicos, em sementes embebidas com soluções de -1,0 e -1,2MPa (Figura

11b)

(a)

(b)FIGURA 11 Perfil eletroforético de proteínas resistentes ao calor em sementes de

pinhão manso (Jatropha curcas L.), submetidas ao estresse combinado detemperatura e restrição hídrica. Marcador de peso protéico (P) de 220 a10 KDa. UFS, São Cristóvão-SE, 2009.

0,0 -0,8

-1,0 -1,2

25ºC

40ºC

25ºC

40ºC

25ºC

40ºC

25ºC

25ºC

40ºC

25ºC

40ºC

25ºC

40ºC

40ºC

25ºC

40ºC

69

Portanto, as sementes submetidas aos potenciais osmóticos de -1,0 e 1,2 MPa

apresentaram uma maior função protetor a diante da elevação da temperat ura. Padrões

sementes têm sido encontrados em sementes de Pisum sativum, para os quais tem-se

sugerido a participação das proteínas LEA e sHSPS, como um mecanismo de proteção

(GALLARDO et al., 2001).

5.2 Expressão gênica induzida por estresse combinado

O principal desafio das pesquisas em expressão gênica está na identificação dos

eventos relacionados à resistência a deterioração das sementes, que precedam a perda da

capacidade germinativa.

A técnica de eletroforese de proteínas é capaz de auxiliar a de tecção dos estádios

iniciais de deterioração através da avaliação da atividade de enzimas associadas à

degradação e oxidação de substâncias de reserva, bem como com a biossíntese de novas

substâncias (SPINOLA et al., 2000). A capacidade de avaliação e a co rreta interpretação

da variação eletroforética nos perfis de proteínas e enzimas pode ser uma eficiente

ferramenta na determinação de mudanças bioquímicas resultantes do processo

deteriorativo (CARRARO,1990). Possíveis indicadores do estádio de deterioraçã o em

sementes de pinhão-manso sob condições de estresse poderão auxiliar no entendimento

da susceptibilidade das sementes ao estresse

Nos resultado obtidos para sementes de pinhão-manso houve expressão para

transcritos responsáveis pelas subunidades 18S, que foi empregada como controle para

validação das PCRs. Como para estas seqüências não foram produzidos transcritos para

os tratamentos 9 e 10, isto indica que os resultados obtidos para estes tratamentos

devem ser desconsiderado, o que sugere um provável erro experimental ocorrido nestes

tratamentos.

Em sementes ortodoxas, a fase final de maturação do desenvolvimento é

caracterizada pela dessecação. Concomitantemente, as sementes de algumas espécies

entram num estado de quiescência, que permite a sobrevivência em condições

desfavoráveis do ambiente e garanti a da dispersão (INGRAM e BARTELS, 1996).

Quando as sementes encontram condições para a sua germinação, se inicia o

desenvolvimento do embrião. Espécies modelos, como Arabidopsis thaliana L. revelam

70

que este desenvolvimento é impulsionado principalmente por três genes, Ácido

Abscíssico Insensível 3, (ABI3), Fusca3 (FUS3), e Leafy Cotyledon1 (LEC1) (PARCY

et al., 1997;WOBUS e WEBER, 1999).

O padrão de expressão do ABI3 em sementes de Arabidopsis é caracterizado por

um aumento contínuo ao longo de todo o desenvolvimento e expressão transitória

durante a primeira semana de germinação (P ARCY et al., 1994). Por outro lado, Bassel

et al. (2006) estudando a expressão de ABI3 em tomate (Lycopersicon esculentum) e

Arabidopsis (A. thaliana) encontraram alta expressão desse gene em sementes durante a

embebição e antes de terminar a germinação, não expressando em sementes secas.

Nos resultados obtidos houve um padrão de bandas expressas em sementes de

pinhão-manso submetidas ao estresse combinando de restrição hídrica e temperatura até

as 96h de embebição para os genes ABI3 e LEC1. Os transcritos de ABI3 permanecem

mesmo na semente não hidratada e se expressam em abundância após embebição indo

até 96 horas para todos os tratamentos. Isto sugere a participação de ABI3 em eventos

que ocorrem durante a reidratação , acontecendo em momentos diferentes, de acordo

com o teor de água inicial , mesmo antes da embebição. É importante notar, contudo

que, mesmo com expressão de ABI3 em sementes sob restrição hídrica de -0,8; -1,0 e -

1,2 a 25 e 40ºC, estas não germinaram.

O ABI3, em sementes de Talauma ovata germinadas, expressou altamente em

sementes secas após a embebição, mas mesmo assim a grande maioria das sement es não

germinaram (JOSÉ, 2007), resultado este que esta de acordo com estudos desenvolvidos

por Faria et al. (2005), comparando as alterações na expressão ABI3 durante a perda e

re-estabelecimento de tolerância em sementes germinadas de Medicago truncatula.

O gene ACT2, envolvido no processo de germinação de semente, que neste

estudo apresentou maior intensidade de bandas nas amostras foram embebidas em água

por 48hs a 25ºC e durante 24hs em temperatura de 40ºC, foram submetidas ao potencial

osmótico de -1,0 por 96hs a 25ºC, sob o mesmo potencial por 24hs em temperatura de

40ºC , em -1,2 as 48 e 96hs em temperatura de 25ºC, em -1,2 as 72 e 96hs sob a

temperatura de 40ºC . Houve expressão para todas as sementes embebidas em água no

período de 24,24,48,72 e 96 horas.

71

Em tecidos vegetativos o déficit hídrico provoca uma diminuição na atividade

mitótica, o que é atribuído à regulação dos genes CDC2 e outros ciclos dependentes de

quinases (CDK) (SCHUPPLER et al., 1998).

Autores propõem que o estresse hídrico a ge sobre o CDC2 aumentando a

fosforilação da tirosina, causando uma mudança na forma e intensidade da produção

celular. Em T. ovata, houve uma redução nos níveis de mRNAs de CDC2, quando as

sementes foram secas a baixos teores água. Em pinhão-manso houve a expressão para

este gene durante a embebição por 48h 00 a 25ºC e em sementes tratadas com restrição

de -0,8MPa a 40ºC nos períodos de 48 e 96h de embebição.

A expressão de ABI3, ACT2 e CDC2 isoladamente não explicam o

comportamento de germinação de semente s de pinhão-manso, mas estes resultados

sugerem que sementes dessa espécie pode m apresentar certa plasticidade, o que lhes

confere adaptação as regiões semi-áridas, que dispõe de pouca água e elevadas

temperaturas.

Os genes EM6, PER1, sHSP18.2 e PKABA1 estão relacionados ao estresse. O

PKABA1 está envolvido em uma sinalização pela via ABA que suprime a indução de

genes responsivos a giberelina em camadas de aleurona em cereais (GOMEZ -

CADENAS et al., 2001). Sua expressão é regulada pela elevação do ABA, desidratação,

frio e estresse osmótico em outros tecid os vegetais (HOLAPPA e WALKER -

SIMMONS, 1995).

Em sementes de trigo, durante o desenvolvimento, os níveis de PKABA1

aumentam, mas diminuem durante a embebição das sementes não dormentes,

transitoriamente aumentando durante a embebição de sementes dormentes (JOHNSON

et al., 2002).

Neste trabalho observou-se que transcritos do gene PKABA1 ocorreram em

todos os tratamentos, não sendo induzida sua expressão após a embebição. O PKABA1 e

sHSP17.5 são genes relacionados com tolerância a estresse, e nos resultados observou-

se uma relação entre a restrição hídrica e estresse de temperatura. Desta forma, sugere-

se o envolvimento destes genes no mecanismo de proteção durante a embebição. O gene

ABI3 é induzido a ativar a expressão dos genes que codificam a pequenas proteínas

específicas de choque térmico durante o desenvolvimento das sementes (ROJAS et al.,

1999; WEHMEYER e VIERLING,2000).

72

Nos resultados para o gene EM6 foi observada a presença para o s transcritos do

gene EM6, com maior expressão em sementes submetidas a restrição a -1,0 MPa e

temperatura de 25ºC embebidas por 96h ; e em restrição de -1,2 MPa e temperatura de

40ºC por 24h de embebição.

Para o gene PER1, houve maior expressão em sementes secas e sementes

submetidas a temperatura de 40ºC sob restrição de -0,8; -1,0 e -1,2 embebidas ao longo

de 48h até 96h.

Para o gene sHSP, as sementes sob restrição hídrica e temperatura de 25ºC

apresentaram expressão, com maior intensidade para as sementes a temperatura de 40ºC

por 24h00 e em restrição de -0,8 e -1,0MPa.

Comparando o perfil de expressão da ABI3 e sHSP, houve uma relação direta

entre a expressão dos genes em transcritos, com o aumento da expressão para ABI3

durante a embebição, o que confirma, em pa rte, a proposição de ABA sinalizando o

PKABA1 e controle da expressão do sHSP.

O gene CTS age, no mínimo em parte, por afetar profundamente o metabolismo

de lipídios armazenados. A expressão aumenta rapidamente após a embebição e durante

a germinação, o que não foi observado em sementes de pinhão -manso sob restrição de -

0,8 e -1,0MPa a 25ºC, sendo observada a presença de transcritos para sementes

submetidas a restrição de -1,0 MPa a 40ºC.

73

6. CONCLUSÕES

Uma maior concentração de frações de proteínas res istentes ao calor, de peso

molecular entre 20 e 50 kDa ocorre em sementes de pinhão-manso sob estresse

combinado de restrição hídrica e de temperatura , sendo esta observada em condições de

Observou-se a ocorrência de transcritos para os genes LEC1, sHSP, CDC2a,

18S, PKBA1, AB13, ACT, EM6 e PER1, sendo estes ferramentas potenciais para a

seleção de genótipos resistentes a estresse combinado de restrição hídrica e temperatura.

74

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO

Aceitabilidade da Agricultura Familiar ao Programa Nacional de Produção e usodo Biodiesel.

Orientadora da pesquisa: Profª Renata Silva MannDepartamento de Engenharia Agronômica – UFS

1-Apresentação Data:____/____/_____1.1 Entrevistado:

Chefe de família: __________________________________________Nome da mãe:_____________________________________________Idade: _____ Escolaridade:______________

2-LocalNome:________________Município: ________________________Distancia da cidade: ____________

3-Atividades agrícolas desenvolvida

Culturas permanentes: sim( ) não( ) quais:__________________________________________________________________.Área usada para cultivo permanente:______________________Culturas temporárias: sim( ) não( )quais:_____________________________________________________________Tamanho da área: ___________4- Trabalha com consorcio: sim( ) não( ) quais culturas:__________________________________________________________________5- Quais as vantagens do consorcio?__________________________________________________6- Há diferença entre o plantio consorciado e não consorciado: sim( ) não( ) quais:_____________________________________ _________________________________7-O que o espaçamento pode contribuir ou não em culturas consorciadas?______________________________________________________________________8-O que o espaçamento pode interferir na prática de tratos culturais?______________________________________________________________________9-Antes do plantio, costuma fazer análise de solo: sim( ) não( )Quem orientou:______________________________________ com quanto tempo fez aultima analise de solo:_____________________________ _______________________10- Utiliza adubos nas suas plantações: sim( ) não( )11-Qual tipo: ( ) orgânico ( ) químico: quais?_____________________________________________________________________12-Qual a importância de se utilizar adubos:______________________________________________________________________13-Conhece algumas plantas com potencial para a produção de óleo:( )sim ( )não,quais:__________________________________________________________________

14-Conhecem o Programa Nacional de Prod ução e uso de Biodiesel

80

( )sim ( )não, e como ficou sabendo:15- Participação:( )sim

O que achou desse programa?_________________________________________

( )não:Gostaria de participar: sim( ) ( ) não e porque_________________________________

16-Acredita que esse programa (PNPB) tem um carátersocial?_____________________________________________________________________________________________________________________________________17- Conhecem plantas que serve para produção de biodiesel: ( )sim ( )não,Quais:__________________________________________________________________18- Acha que o pinhão-manso será uma boa alternativa para a produção deóleo?_____________________________________________________________

19-Plantaria em seu lote, pinhão-manso?Sementes ( )Mudas ( )

20-Quais as culturas plantariam em consorcio com o pinhão -manso?_____________________________________________________________________________________________________________________________________

21-Antes do PNPB, já conhecia o pinhão-manso?____________________________________________________________________________________________________________________________________________

Anotações:

_____________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _________

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