Poder analtico de LLE-HPLC-PDA-MS / MS em estudos do metabolismo de drogas: Identificao de um novo metabolito nabumetona.Nabumetone um pr-frmaco anti-inflamatrio no esteride no-cido. Aps a administrao oral, opr-frmaco convertido no fgado em 2-metoxi-6-cido naftilactico (6-MNA), que se verificou sero metabolito principal responsvel pelo efeito AINE. A via de transformao nabumetonepara 6-MNA no foi clarificada, sem intermedirios entre nabumetona e 6-MNA tendo sidoidentificados at o momento.Neste estudo, uma nova, fase ainda no declarada como metabolito que foi descoberto no mbito da avaliao denabumetone metabolismo, fraes microssomais de fgado humano e de rato. Excertos dos Biomatrizesforam sujeitas a HPLC quiral LLE-PDA-aquiral e LLE-UHPLC-MS / MS para anlise elucidar oestrutura qumica deste metabolito. Experimentos UHPLC-MS / MS detectou a presena de uma estruturacorrespondente a composio elementar C15H16O3, que foi tentativamente identificado como um hidroxiladonabumetone. Nabumetona idnticos e espectros de UV HO-nabumetona obtida a partir do detector de PDAexcluda a presena do grupo hidroxi no radical aromtico de nabumetona. Assim, omais provvel estrutura do novo metabolito era 4- (6-metoxi-2-naftil) -3-hidroxibutan-2-ona (3-nabumetona hidroxi). Para confirmar essa estrutura, o padro deste metabolito nabumetone foisintetizados, a sua espectrais (UV, CD, RMN, MS / MS) e propriedades de reteno sobre cromatogrfica quiral e aquiralcolunas foram avaliadas e comparadas com as do metabolito nabumetona autntica.Para elucidar a biotransformao subsequente de nabumetona 3-hidroxilo, o composto foi usadocomo um substrato em incubao com fraco microssmica de fgado humano e de rato. Um nmero de 3-hidroximetablitos nabumetona (produtos de conjugao com cido glucurnico, O-desmetilao, carboniloreduo e sua combinao) foram descobertos nos extratos dos microssomas incubados usandoExperimentos LLE-HPLC-PDA-MS / MS. Por outro lado, quando o 3-hidroxi nabumetona foi incubadacom hepatcitos de rato isolados, 6-MNA foi detectado como o metabolito principal de 3-hidroxi nabumetona.Assim, 3-hidroxi nabumetone poderia ser o elo perdido na nabumetone biotransformao a 6-MNA(Isto , nabumetona 3-hidroxi nabumetona6-MNA).

IntroduoO nabumetone pr-frmaco anti-inflamatrio no esteride possuiapenas uma fraco da ciclo-oxigenase 2 (COX-2) actividade inibidora[1]. A originalidade da estrutura nabumetona neutro surgea partir de uma relativamente baixa incidncia de irritao gstrica, hemorragia,ulceraes e perfuraes at gastrointestinais, que eramfreqentemente observado na sequncia de um uso a longo prazo de vrios AINE ativacidos arylalkane. Faltando os efeitos adversos mencionados, neutronabumetona bem absorvido a partir do GIT, e transportada nofgado, onde se submete a uma extensa biotransformao de primeira passagem.Clivagem oxidativa de nabumetone cadeia lateral conduz ao principal farmacodinamicamente metablito ativo, a COX muito forte2 inibidor,-2-naftilactico 6-metoxi cido (6-MNA). Semelhantepara outros cidos arylalkane, 6-MNA exibe anti-inflamatriae efeitos analgsicos. -desmetilao e reduo carbonilTambm tm sido relatados como converses metablicas adicionais denabumetona [2,3]. Hidroflicos fase II metablitos nabumetona,nomeadamente acil-glucuronido de 6-MNA, glucuronides ter deO-desmetil e fase I nabumetone metabolitos com reduzidacarbonil foram encontrados na urina, na blis e de mucosa duodenalminiporcos, bem como em urina humana [4].Uma viso geral das abordagens analticas para a determinao denabumetone em aplicaes farmacuticas e nabumetone biotransformaoprodutos em estudos bioanalticas foi fornecidana nossa comunicao anterior [3]. Mtodos analticos recentespara a determinao de nabumetona com base em tcnicas voltamtricas[5], pesado fosforescncia induzida por tomo de [6], espectrofotomtricamtodos [7], TLC ou HP TLC densitometria [8,9] ou HPLC [10-13]Tambm tm sido relatados na ltima dcada. Caracterizao doenzimas envolvidas na biotransformao de nabumetona de 6-MNA [14] e em O-desmetilao de 6-MNA a 6-HNA [15] temj sido realizada. muito surpreendente que nenhum biotransformao intermedirio (s)entre nabumetona e 6-MNA foram descobertos desde1984, quando Haddock et al. publicou uma viso geral de nabumetonemetablitos para o primeiro tempo [2]. A perda de dois tomos de carbono indicauma converso inicial de nabumetona de produto oxidante (s),a identificao de que poderia ajudar a elucidar a detalhadacurso de converso nabumetona para 6-MNA.A nossa tentativa de encontrar o elo perdido (s) em nabumetone6-Converso MNA iniciada por avaliao in vitro da nabumetonebiotransformao utilizando fraes subcelulares de fgado humano e de rato(microssomas e citosol) e de ratos isolados hepatcitos. Estexenobiochemical abordagem combinada com LLE-HPLC-PDA-MS / MSpermitiu a deteco e identificao de novos nabumetonametabolito (s).

3.2. Identificao de um novo metabolito nabumetona atravs quiral eHPLC aquiral-PDA- (MS / MS)Quando nabumetona foi incubada com a fraco microssomalde rato e tecidos de fgado humano, anlises cromatogrficas deOs extractos de microssomas revelou a presena de um novo, comoainda no descrita, metabolito nabumetona com o tempo de retenotR = 27,5 min (ver o pico denotado como "desconhecido 1, 2" na Fig. 2). Como este metabolito nabumetona foi encontrado nos extractos dea fraco microssomal, mas no nos extractos de citoslicafraces, um produto de oxidao nabumetona, provavelmente hidroxinabumetona (HO-nabumetona) foi antecipado.O metabolito recentemente detectado teve tempo de reteno diferentedos de nabumetona e todos os seus metabolitos de fase I.Os espectros UV idnticos e de novo metabolito todos nabumetonaderivados de excluir a presena de um grupo hidroxi fenlicona poro aromtica de nabumetona. Uma hidroxi auxochromicgrupo ligado ao anel de naftaleno de alterar tanto o comprimento de ondamximos e intensidade da absoro do naftalenoporo. No entanto, nenhum deslocamento batocrmico foi observada na regio do UVespectro de novo metabolito, da, a biotransformao oxidativateve lugar na cadeia aliftica do frmaco.Nabumetone oxidao levando a recm-encontrada metabolito mustforam realizados na cadeia aliftica da molcula,com C1, C3 e C4 sendo disponvel. A deteco de dois separvelEnantimeros HO-nabumetona (ver seco 3.4) no quiralOs cromatogramas (Fig. 3) excludos hidroxilao em C1 (1-HOnabumetone aquiral). Porque HO-nabumetona foi encontrado para sofrer converso metablica de cido 6-metoxi-2-naftilactico(6-MNA), cuja estrutura se preserva o grupo metileno C4intacto, C3 era quase certamente o site hidroxilao.O UHPLC / ESI-MS / MS anlises dos extratos das nabumetonea incubao com a fraco microssomal revelou apresena de uma estrutura que corresponde composio elementarC15H16O3 (ver Tabela 1). Fragmentos caractersticos (ver seco3.5) confirmou a oxidao da cadeia aliftica. Alm disso,a formao final de 6-MNA de nabumetona requerque o vnculo C3 C2 ser clivada. Assim, a estrutura de recm-metabolito encontrada foi confirmado como 4- (6-metoxi-2-naftil) -3-hidroxibutan-2-ona (ou seja, 3-HO-nabumetona).Um padro sinttico de nabumetona racmica de 3-hidroxi foipreparado (ver Seco 2.2. para experimentais, ea Seo 3.3 paradiscusso) para corroborar a estrutura proposta e para permitirestudos adicionais xenobiochemical e farmacocintico. 3-Hidroxinabumetona um composto quiral; o comportamento cromatogrficode seus enantimeros aparente a partir da Fig. 3.Separao quiral de todos os derivados nabumetona (ver Fig. 1)sob as condies experimentais mencionadas na Seo 2.7(Coluna Chiralcel OD-R, fase mvel A) est demonstrada noFigo. 3 (cromatograma superior). A identificao de ambos um grupo 3-HOnabumetoneenantimeros descrito na Seo 3.4. Como evidentea partir dos cromatogramas na Fig. 3, o acima mencionado "desconhecido2 "nabumetona metabolito (tr = 27,5 min na Fig. 2) foi identificadocomo (+) - 3-hidroxi nabumetona. O segundo enantimero, (-) - 3-nabumetona hidroxi (TR = 22 min, denotada como "desconhecido 1" emFigo. 2) foi parcialmente co-eluda com 6-MNA. Felizmente, estes doismetabolitos possuem diferentes propriedades acidobasic, que permitesua separao fcil. Enquanto (-) - 3-hidroxi nabumetona neutro,6-MNA cida e, portanto, bem ionizvel em meios bsicos.Duas abordagens foram usadas para separar estes dois co-eluiometablitos nabumetona.Abordagem 1: Quando quiral fase mvel B [metanol - 1 M aquosoNaClO 4, pH = 6,85 (75:25, v / v)] foi utilizado, em vez do rotineiramentefase mvel cido empregada A (ver seco 2.7), 6-MNA foi ionizado,e a sua forma polar tinha um tempo de reteno mais curto do que o de(-) - 3-hidroxi nabumetona, as caractersticas de reteno dos quaisem ambas as fases mveis (A e B) manteve-se praticamente o mesmo.Mtodo 2: extraco dependente do pH e da reextracobiomatriz (ver o ltimo pargrafo do ponto 2.6).Separao aquiral de I metablitos seis fases, o pai nabumetonenaproxeno e dentro de 12 minutos apresentada na Fig. 4. Orecm-descoberto metabolito, nabumetona 3-hidroxi (tR = 3,9 min), foi bem separada dos dois produtos de biotransformao mais prximas(6-MNA e naproxeno). Alm disso metabolismo de 3-hidroxinabumetona (atravs de reduo de carbonilo e O-desmetilao) foitambm antecipou. Como evidente a partir do cromatograma na Fig. 4,a capacidade de pico no tempo de intervalo de 1,4-3,9 min limitado, e(Como ainda descoberto) possveis metabolitos de 3-hidroxi nabumetonaem conjunto com aqueles no cromatograma (Fig. 4) pode tersido insuficientemente separados nas condies cromatogrficasdescrito na Seco 2.7 e no nosso trabalho anterior [3]. Paraesta razo, UHPLC-MS / MS foi empregue na pesquisa para posteriormetablitos derivados de nabumetone 3-hidroxi (ver Seces 2.9e 3.5).