POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA GSTM1 Y LA GSTT1 COMO ...

Noemí Tirado Bustillos

1

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Y BIOMÉDICAS

MENCIÓN GENÉTICA TOXICOLÓGICA

POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA

GSTM1 Y LA GSTT1 COMO

MODIFICADORES DE RIESGO

MUTAGÉNICO EN AGRICULTORES

EXPUESTOS A PLAGUICIDAS

POSTULANTE: NOEMÍ SANDRA TIRADO BUSTILLOS

ASESORAS: MARÍA EUGENIA ASCARRUNZ G. MSc.

XIMENA AGUILAR M. MSc.


2

AGRADECIMIENTOS

Mis más sinceros agradecimientos a:

Institut de recherche pour le développement (IRD) por la beca de estudios otorgada dentro de la maestría. Todas las personas (agricultores, profesores y personal de salud) que participaron voluntariamente para la realización de este trabajo. Mis asesoras María Eugenia Ascarrunz y Ximena Aguilar por la colaboración y dedicación y principalmente por su amistad. Personal del Instituto de Genética, en especial a Ana Rada por colaborarme en la genotipificación de forma desprendida y desinteresada Profesora Catarina Takahashi por enviarme los primers para las pruebas de genotipificación y por su apoyo técnico Rafael Cervantes y Omar Huici del proyecto PLAGBOL por brindarme su colaboración para realizar las tomas de muestra de los participantes en el estudio Tribunal externo del documento escrito, Enrique Zamorano, Lucia Regina Ribeiro y Luz Stella Hoyos por sus valiosas sugerencias y contribuciones a este trabajo.


3

A mis queridos papás Hugo y Noemí

por su ejemplo de fortaleza y dedicación

y a mis amados Ferni, Stephie y Nathalie

por permitirme robarles el tiempo que le

pertenece para lograr realizaciones

profesionales


4

ABSTRACT Pesticides are one of the most frequently toxic chemicals found in the environment. Farmers exposed to pesticides suffer constant chronic exposure constitute a risk group, as was evident in the first study to assess genotoxic damage done these records showed the need for genetic susceptibility studies by determining the genotypes of biotransformation isoenzymes of pesticides and their relationship with the extent of damage to genetic material as modifiers of risk of future diseases such as cancer, In order to contribute to prevention policies in the health sector. In this paper we studied the frequency and the influence of polymorphisms of GSTM1 and GSTT1 on biomarkers of exposure and effect. In this study, 142 farmers and control subjects: 99 exposed and 43 not exposed to pesticides from four rural villages of the Department of La Paz. Cholinesterase levels were determined by a spectrophotometric method. The Micronucleus genotoxicity parameters in binucleated cells (MNBC) and sister chromatid exchanges (SCE) were evaluated from a culture of peripheral blood lymphocytes. Genotyping was performed from a blood sample from which genomic DNA was obtained and used the multiplex PCR method for determining GSTM1 and GSTT1 polymorphisms The frequency of SCE and MNBC and showed no statistically significant data, however to make the study found that people in the community of Palca there are higher values in the frequency of MN with a statistically significant difference in relation to Caranavi (p=0.000), the analysis showed SCE communities more in Caranavi Palca regarding statistically significant differences (p = 0.004). With regard to the cytogenetic parameters analyzed, the effect of GSTM1 null genotype frequency of micronuclei shows lower values than those of GSTM1 genotype positive but not statistically significant p = 0.075Escuchar Leer fonéticamente Regarding GSTT1 null genotype that showed a MN frequency equal to the positive GSTT1 genotype. The combination of polymorphisms GSTM1/GSTT1 showed that the null genotype frequency of MN has both slightly lower in relation to genotype both positive. The influence of GSTM1 null on SCE showed a slight increase in the frequency of this parameter, although no statistical significance, while the influence of GSTT1 null on SCE showed a slight decrease compared to GSTT1 positive individuals. The analysis of the magnitude of association between polymorphisms of GSTs and other factors in addition to exposure to pesticides showed that alcohol consumption is a significant risk factor The analysis for calculating the magnitude of association between polymorphisms of GSTs and genotoxic damage shows that people with absence of GSTM1 increased the risk 0.38 times more than present genotoxic damage in relation to the population having the gene. This analysis for the GSTT1 polymorphism showed no association.


5

RESUMEN

Los plaguicidas son uno de los químicos tóxicos más frecuentemente encontrados en el ambiente. Los agricultores que están expuestos a los plaguicidas, sufren una exposición crónica constante constituyendo un grupo de riesgo, como se pudo evidenciar en un primer estudio de evaluación de daño genotóxico realizado, estos antecedentes mostraron la necesidad de realizar estudios de susceptibilidad genética a través de la determinación de los genotipos de las isoenzimas de biotransformación de plaguicidas y su relación con la magnitud de daño al material genético como modificadores de riesgo de futuras enfermedades, como el cáncer, con el propósito de contribuir a las políticas de prevención del sector salud. En el presente trabajo se estudió la frecuencia y la influencia de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 sobre los biomarcadores de exposición y efecto. En este estudio participaron 142 agricultores y sujetos control: 99 expuestos y 43 no expuestos a plaguicidas de cuatro poblaciones rurales del Departamento de La Paz. Los niveles de colinesterasa se determinaron por un método espectrofotométrico. Los parámetros de genotoxicidad de Micronúcleos en células binucleadas (MNCB) e Intercambios entre cromátides hermanas (ICH) se evaluaron a partir de un cultivo de linfocitos de sangre periférica. La genotipificación se realizó a partir de una muestra de sangre de donde se obtuvo DNA geonómico y se utilizó el método de PCR multiplex para determinar los polimorfismos GSTM1 y GSTT1. La frecuencia de MNCB y de ICH no mostraron datos estadísticamente significativos, sin embargo al realizar el estudio por poblaciones se observó que en la comunidad de Palca existen valores superiores en la frecuencia de MN con una diferencia estadísticamente significativa en relación a Caranavi (p=0,000), el análisis por comunidades de ICH mostró mayor número de en Caranavi en relación a Palca con diferencias estadísticamente significativas (p=0,004). Con relación a los parámetros citogenéticos analizados, el efecto del genotipo GSTM1 nulo en la frecuencia de micronúcleos muestra valores inferiores a los del genotipo GSTM1 positivo aunque estadísticamente no significativos p=0,075. Respecto al genotipo GSTT1 nulo este presentó una frecuencia de MN igual al genotipo GSTT1 positivo. La combinación de los polimorfismos GSTM1/GSTT1 mostró que el genotipo nulo de ambos presenta frecuencia de MN ligeramente inferior en relación al genotipo positivo de ambos. La influencia del GSTM1 nulo sobre los ICH se mostró como un ligero incremento en las frecuencias de este parámetro, aunque sin significancia estadística, mientras que la influencia del GSTT1 nulo sobre los ICH se mostró con una ligera disminución en relación a los individuos GSTT1 positivos. El análisis para el cálculo de la magnitud de asociación entre polimorfismos de las GSTs y daño genotóxico, muestra que la población con ausencia del GSTM1 incrementa el riesgo 0.38 veces más de presentar daño genotóxico en relación a la población que tiene el gen. Este análisis realizado para los polimorfismos de la GSTT1 no mostró ninguna asociación. El análisis realizado sobre la magnitud de asociación entre polimorfismos de las GSTs y otros factores adicionales a la exposición a plaguicidas mostró que, el consumo de alcohol es un factor de riesgo significativo.


6

INDICE

Abreviaturas……………………………………………………………………………………. 9

Indice de Tablas ……………………………………………………………………………… 10

Indice de Figuras………………………………………………………………………………. 11

1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………. 12

2. ANTECEDENTES……………………………………………………………………… 15

2.1. CONCEPTO DE PLAGUICIDA…………………………………………………. 15

2.2. CLASIFICACIÓN DE LOS PLAGUICIDAS…………………………………... 16

2.3. EFECTOS ADVERSOS AL MEDIO AMBIENTE……………………………. 21

2.4. MOVIMIENTO DE LOS PLAGUICIDAS EN EL MEDIO AMBIENTE…. 23

2.5. METABOLISMO DE LOS PLAGUICIDAS EN EL ORGANISMO……… 25

2.6. EFECTOS ADVERSOS A LA SALUD……………………………………….. 26

2.7. LA EXPOSICIÓN A PLAGUICIDAS EN BOLIVIA…………………………. 32

2.8. EFECTOS SOBRE EL MATERIAL GENÉTICO…………………………… 33

2.8.1. ESTUDIOS DE GENOTOXICIDAD………………………………………….. 33

2.9. BIOMONITORIZACIÓN DE POBLACIONES HUMANAS EXPUESTAS

A AGENTES GENOTOXICOS………………………………………………….

35

2.10. SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A LOS PLAGUICIDAS………………… 36

2.11. BIOMARCADORES……………………………………………………………… 38

2.11.1. CLASIFICACION DE BIOMARCADORES……………………………… 38

2.11.2. BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN…………………………………. 39

2.11.3. BIOMARCADORES DE EFECTO……………………………………….. 40

2.11.4. BIOMARCADORES DE SUSCEPTIBILIDAD………………………….. 46

2.11.4.1. LAS GLLUTATION S TRANSFERASAS………………………………….. 49

2.11.5. LA IMPORTANCIA DE LA PREVENCIÓN EN ONCOLOGÍA……….. 52

2.11.6. LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR AL SERVICIO DE LA


7

VALORACIÓN DE RIESGO……………………………………………….

53

2.11.7. LOS SISTEMAS DE DEFENSA QUÍMICA…………………………….. 55

2.11.8. POLIMORFISMOS DE SUSCEPTIBILIDAD EN ONCOLOGÍA……… 56

3. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………. 58

3.1. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN………………………………………….. 3.2. HIPOTESIS……………………………………………………………………...

59

59

4. OBJETIVOS………………………………………………………………………….. 60

5. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………….

5.1.DISEÑO DE ESTUDIO……………………………………………………. 5.2. POBLACIÓN ESTUDIADA……………………………………………….. 5.3. OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS ……………………………………. 5.3.1. ELABORACIÓN DE LA ENCUESTA………………………………… 5.3.2. EVALUACION DE LA INFORMACION DE LA ENCUESTA…….. 5.3.3. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD COLINESTERASA…….. 5.3.4. EVALUACION DE DAÑO GENTOXICO……………………………… 5.3.5. ENSAYO DE MN EN LINFOCITOS DE SANGRE PERIFERICA........................................................................... 5.3.6. INTERCAMBIO ENTRE CROMATIDES HERMANAS……………. 5.3.7. GENOTIPIFICACIÓN DE LAS GLUTATION S- TRANSFERASAS…………………………………………………………. 5.4. ANALISIS ESTADÍSTICO…………………………………………………

61

61

61

62

62

63

63

63

64

66

67

72

6. RESULTADOS………………………………………………………………………….

6.1.ANÁLISIS DEMOGRÁFICO………………………….…………………… 6.2.BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN…………………………………. 6.3. BIOMARCADORES DE EFECTO…………………………….…………

73

73

78

79


8

6.4. BIOMARCADORES DE SUSCEPTIBILIDAD INDIVIDUAL………..

6.4.1. ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS DE LA GSTM1 Y LA

GSTT1 CON NIVELES DE COLINESTERASA…………………….

6.4.2.ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS DE LA GSTM1 Y

GSTT1 CON EL DAÑO GENOTOXICO………………….…………..

6.4.3. REGRESIÓN LOGÍSTICA………………………………………………

7. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………

8. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………..

9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………….

ANEXOS……………………………………………………………………………………

83

87

87

98

99

113

114

132


9

LISTA DE ABREVIATURAS

AC CBN CYP CYP450 CBPI DNA dNTP EDTA EPA GSTs GSTM1 GSTT1 %HFC IARC ICH INSO IDN MN MNBN OMS OPS PCR PLAGBOL PRI RFLP SCE TBE

Aberraciones cromosómicas Células binucleadas Citocromo P Citocromo P 450 Indice de proliferación con bloqueo de la citocinesis Desoxiribonucleid acid Desoxirribonucleotidos Etilen diamino tetracético Agencia de protección ambiental de EUA Glutation transferasas Glutation transferasa M1 Glutation transferasa T1 Porcentaje de células con alta frecuencia de intercambios Agencia Internacional de Investigación del cáncer Intercambios entre cromatides hermanas Instituto Nacional de Salud Ocupacional Indice de duplicación nuclear Micronúcleos Micronucleos en células binucleadas Organización Mundial de la Salud Organización Panamericana de la Salud Polymerase Chain reaction Plaguicidas Bolivia Proliferativ rate index Restriction fragment length polymorfisms Sister Cromatid exchange Buffer de tris-acido bórico EDTA


10

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas según tipo de plaga a Controlar ………………………………………………………………………….

5

Tabla 2. Clasificación toxicológica de los plaguicidas según OPS …………….. 6 Tabla 3. Plaguicidas no recomendados por ser extremadamente tóxicos…….. 8 Tabla 4. Efectos crónicos de algunos plaguicidas………………………………….. 20 Tabla 5. Tipos de biomarcadores y funciones de salud pública………………… 27 Tabla 6. Polimorfismo genéticos de las glutatión S-transferasas …………….. 39 Tabla 7. Frecuencia del polimorfismo de la GSTM1 en diferentes poblaciones.. 41 Tabla 8. Cebadores utilizados en la PCR múltiple para la detección de los genotipos GST estudiados ……………………………………………………

59

Tabla 9. Ciclos de amplificación de la PCR múltiple para GSTs………………. 60 Tabla 10. Análisis demográfico de la población estudiada………………………. 64 Tabla 11. Descripción poblacional expuestos y control………………………….. 65

Tabla 12. Valores de colinesterasa por comunidad………………………………… 67 Tabla 13. Daño citogenético en linfocitos de la población estudiada……………. 68

Tabla 14. Daño citogenético en linfocitos según comunidad……………………. 69 Tabla 15. Frecuencia de los genotipos para GSTM1 y GSTT1 en la población Estudiada……………………………………………………………………….

72

Tabla 16. Frecuencias genotípicas de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 en la población por comunidad ……………………………………………………

73

Tabla 17. Frecuencia de polimorfismos GSTM1/GSTT1 en la población por Comunidad………………………………………………………………………

75

Tabla 18. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su asociación con la frecuencia de MN en linfocitos……………..………

77

Tabla 19. Asociación de los polimorfismos GSTM1/GSTT1 con la frecuencia de MN en linfocitos………………………………………………………………

78

Tabla 20. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su asociación con el IDN…………………………………………………………

79

Tabla 21. Asociación de los genotipos de GSTM1/GSTT1 con el IDN………….. 79 Tabla 22. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su asociación con el número de ICH…………………………………………..

80

Tabla 23. Asociación de los polimorfismos de la GSTM1 / GSTT1 con los valores de ICH………………………………………………………………

81

Tabla 24. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su asociación con el %HFC…………………………………………………….

82

Tabla 25. Asociación de los genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 / GSTT1 y su asociación con el %HFC………………………………………..

83

Tabla 26. Magnitud de asociación entre polimorfismos GSTM1 y GSTT1 y daño genotóxico ……………………………………………………………………….

84

Tabla 27. Magnitud de asociación entre polimorfismos y daño mutagénico… 84 Tabla 28. Magnitud de asociación entre polimorfismos GSTM1 y otros factores de riesgo……………………………………………………………………………

85

Tabla 29. Magnitud de asociación entre polimorfimsos GSTT1 y otros factores de riesgo…………………………………………………………………………

86


11

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Clasificación de los plaguicidas según su peligrosidad………….. 7 Figura 2. Posibles mecanismos de transporte y transformación de plaguicidas………………………………....................................

12

Figura 3. Formación de micronúcleos………………………………………. 34 Figuras 4 a y b. Linfocitos binucleados con un MN………………....... 55 Figuras 5 a y b. Metafases con ICH…………………………………………. 56 Figura 6. Gel representativos de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1… 60 Figura 7. Distribución de la población estudiada…………………………. 63 Figura 8. Porcentaje de plaguicidas utilizados…………………………….. 64 Figura 9. Valores de colinesterasa distribuidos por comunidad………. 67 Figura 10. MNBN en la población agrupada por sexo…………………… 69 Figura 11. MNBN en la población distribuida por comunidad…………. 70 Figura 12. IDN en la población distribuido por comunidad…………….. 70 Figura 13. ICH en la población distribuido por comunidad……………. 71 Figura 14. %HFC en la población distribuido por comunidad…………. 71 Figura 15. PRI en la población distribuido por comunidad……………. 72 Figura 16. Frecuencias de los polimorfismos GSTM1 distribuidos por Comunidad………………………………………………………….

74

Figura 17.Frecuencias de los polimorfismos GSTT1 distribuidos por comunidad…………………………………………………………….

74

Figura 18. Frecuencias de la asociación de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 por comunidad…………………………………………..

75

Figura 19. Micronúcleos según genotipo GSTM1 nulo/positivo……… 77 Figura 20. %HFC según genotipo nulo/positivo…………………………. 82


12

1. INTRODUCCIÓN. Los plaguicidas son productos químicos tóxicos utilizados para prevenir,

destruir o controlar cualquier plaga, incluyendo vectores de enfermedades

humanas y animales, además de especies indeseadas de plantas que causen

daño a la producción, procesado, almacenamiento, transporte o

comercialización de los alimentos. (Jors, 2005)

Los plaguicidas se utilizan principalmente en agricultura, pero también

son de uso doméstico, se utilizan en campañas de salud sobre todo para

controlar o erradicar enfermedades producidas por vectores (fiebre amarilla y

malaria). Los plaguicidas se han utilizado por miles de años como sustancias

naturales, claros ejemplos son el azufre, piretro y nicotina. Desde 1930

empezó la producción industrial de plaguicidas sintéticos, en el Manual de los

plaguicidas del año 1994 se registraron más de 1285 ingredientes activos.

(Jors, 2005)

Los plaguicidas son uno de los químicos tóxicos más frecuentemente

encontrados en el ambiente. Aunque el uso de plaguicidas refuerza la

productividad de la cosecha, los humanos también pagan un precio por los

beneficios, traducidos en efectos sobre la salud. Alrededor del mundo, se ha

informado anualmente 3 millones de envenenamientos agudos y 220 000

muertes, aproximadamente, por la exposición a plaguicidas (Au y col, 1999).

Además, se ha descrito que los granjeros con exposición prolongada a bajas

dosis de plaguicidas eventualmente desarrollan a largo plazo efectos sobre la

salud; similares a aquellos que han recibido exposiciones agudas con altas

dosis, por ejemplo, las anormalidades del comportamiento neuronal, resultados

reproductivos adversos, y aumento de la incidencia de cáncer (leucemia,

linfoma no Hodking, y mieloma múltiple). Por consiguiente la exposición

crónica a plaguicidas puede causar serios efectos a la salud de los agricultores

expuestos que no tengan historia de envenenamiento agudo.


13

Entre los diversos daños que puede sufrir el material genético, como

consecuencia de condiciones ambientales perjudiciales, están las mutaciones

puntuales y cromosómicas, que pueden propiciar la transformación celular. Si

tales alteraciones ocurren en proto-oncogenes o genes supresores de tumores,

involucrados en el crecimiento y diferenciación celulares, pueden propiciar el

desarrollo de cáncer en el órgano comprometido; contribuir al envejecimiento

prematuro, producir enfermedades vasculares, autoinmunes o degenerativas.

Si ocurren en la línea germinal, pueden originar problemas reproductivos

(infertilidad) y en la descendencia aumento de enfermedades genéticas, tanto

monogénicas como complejas. La evidencia toxicológica de la acción

mutagénica y carcinogénica de varios plaguicidas y la exposición ocupacional o

accidental de grandes poblaciones humanas a estos compuestos, han centrado

la atención de muchos estudios citogenéticos. En varios estudios que buscaron

evaluar el riesgo genético de exposición ocupacional se domostró una

asociación entre exposición ocupacional a plaguicidas y la presencia de

aberraciones cromosómicas y/o intercambios entre cromátides hermanas y/o

micronúcleos (Antonucci y De Sillus Colus, 2000; Au y col, 1999; Bolognesi y

col, 2003; Garaj-Vrhovac y Zeljesic, 2002; Paramjit y col, 2003; Pastor y col,

2001; Paz y Mino y col, 2002).

La susceptibilidad a la acción peligrosa de los químicos puede derivar de

las características genéticas o adquiridas del individuo. En el caso de

carcinógenos genotóxicos, puede asociarse susceptibilidad con diferencias

individuales, por ejemplo, ya sea, en la eficacia de metabolismo carcinogénico o

en la habilidad de reparar lesiones de ADN inducidas por el

carcinógeno.Algunos de los genes de susceptibilidad pueden tener ligeras

variaciones en su secuencia codificadora, es decir que son polimórficos. Si el

mismo alelo variante es heredado de ambos padres, el individuo es homocigoto

para este gen polimórfico, mientras que una combinación de alelos conduce a

heterocigocidad. (Marrs 1993; Vogel y col. 1997). En los heterocigotos, la

sensibilidad a los carcinógenos genotóxicos podría asociarse, por ejemplo, con


14

polimorfismo genético sutil que influye en los procesos de reparación del DNA,

aunque no se han encontrado tales rasgos todavía en la población humana.

Por otro lado, los estudios de diferencias individuales en metabolismo de

xenobióticos han revelado un número creciente de enzimas del polimorfismo

que están implicadas en el metabolismo de carcinógenos (Yasmashita, 1997;

Steenland, 1994).

La susceptibilidad genética a los efectos adversos de la exposición a

plaguicidas constituye un concepto nuevo e importante para futuros estudios y

aplicación, y puede representar la línea de corte de la investigación de los

efectos a salud de los plaguicidas. Puede ser un factor mediador para explicar

mecanismos para la salud de los trabajadores, variaciones en los resultados

entre grupos étnicos, y resultados de mezclas en estudios epidemiológicos. En

otras áreas de salud ambiental y evaluación de riesgo, los polimorfismos

genéticos han sido investigados como predictores de cáncer de pulmones en

fumadores (Cajas-Salazar y col., 2003), y la severidad del envenenamiento por

plomo en niños (Long y col., 2002). La búsqueda de metabolizadores lentos

genéticamente susceptibles ciertamente ofrece esperanza para prevenir el

cáncer en el futuro, educando a aquellos quienes son más susceptibles a

efectos a la salud por plaguicidas para limitar su exposición a estos

compuestos.

En Bolivia, la actividad agropecuaria representa uno de los principales

componentes de la economía. Este sector aporta el 21% del Producto Interno

Bruto contribuyendo con alrededor del 20% del total de las exportaciones.

Ocupa un poco más del 39% de la población económicamente activa,

abarcando una superficie cultivada por año agrícola de cerca de dos millones

de hectáreas. Durante los años 1997 y 1998, para una superficie de 1.241.621

has. (65 % de la superficie sembrada es dedicada al cultivo de la soya, arroz,

algodón, maíz, girasol, caña, tomate y papa), se utilizaron 6.762,88 toneladas

métricas, con un costo aproximado de 92.061 millones de dólares americanos.


15

En el año 2003 los registros de importación de insumos agropecuarios

mostraron un total de 17. 128. 402.79 kilogramos de los que alrededor de un

50% correspondieron a plaguicidas, sin tomar en cuenta la cantidad de ellos

que ingresan por la vía del contrabando, estimada en un 30% adicional. Este

importante uso de plaguicidas en Bolivia durante los últimos 40 años, se

traduce en la actualidad en la existencia de alrededor de 300 toneladas de

plaguicidas obsoletos encontrados a los largo del territorio, entre los que

figuran organoclorados, organofosforados, piretroides, ditiocarbamatos e

inorgánicos entre los principales, lo que implica un importante riesgo para la

salud. (Cervantes y col. 2006).

En vista de que en nuestro país los agricultores que están expuestos a

los plaguicidas, sufren una exposición crónica constante y además realizan

un manejo inadecuado de los mismos (sin normas de seguridad) constituyen

un grupo de riesgo, como se pudo evidenciar en un primer estudio de

evaluación de daño genotóxico realizado, estos antecedentes mostraron la

necesidad de realizar estudios de susceptibilidad genética a través de la

determinación de los genotipos de las isoenzimas de biotransformación de

plaguicidas y su relación con la magnitud de daño al material genético como

modificadores de riesgo de futuras enfermedades, como el cáncer, con el

propósito de contribuir a las políticas de prevención del sector salud.

2. ANTECEDENTES Y MARCO TEÓRICO. 2.1 Concepto de plaguicida

Un plaguicida es cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a

prevenir, destruir o neutralizar una plaga, ya sea debida a insectos, roedores,

nemátodos, hongos, algas u otras formas de plantas terrestres o acuáticas,

animales, bacterias o virus.

Los plaguicidas no se restringen exclusivamente a un uso agrícola o

industrial, sino que también son importantes en sanidad, en la lucha contra


16

los vectores de enfermedades transmisibles y para combatir las especies que

interfieren en cualquier forma de producción, elaboración, almacenamiento,

transporte o comercialización de alimentos, productos agrícolas, madera y

derivados, entre otros. Muchos productos cotidianos del hogar son plaguicidas:

aerosoles y polvos para cucarachas y hormigas, repelentes de insectos de uso

personal, rodendicidas, matamoscas, collares antiparasitarios, detergentes

desinfectantes de baño, ropa, cocina, productos para saneamiento de piscinas,

etc.

2.2. Clasificación de los plaguicidas

Existen numerosas clasificaciones de los plaguicidas utilizados en la actualidad

y son complicadas debido a que constituyen un grupo muy heterogéneo.

2.2.1 Según el tipo de plaga que se quiere controlar

Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas según tipo de plaga a controlar

TIPO DE PLAGUICIDA ORGANISMO AL QUE INTERESA

CONTROLAR

Insecticida * Larvas de insectos, hormigas

Acaricida Ácaros

Avicidas Aves

Herbicidas Malezas

Nematicida Nemátodos

Molusquicida Moluscos

Rodenticida/Raticida Roedores

Bactericida / Bacteriostático Bacterias

Fungicida Hongos

*Son los más utilizados en la agricultura y en campañas de salud Pública. Modificado de Diagnóstico, tratamiento y prevención de intoxicaciones agudas por plaguicidas, PLAGBOL.


17

2.2.2. Según el grupo químico:

• Bipiridilos • Carbamatos • Compuestos organofosforados • Compuestos organoclorados • Compuestos organofosforados • Compuestos organomercuriales • Derivados del ácido fenoxiacético • Derivados del cloronitrofenol • Derivados cumarínicos • Piretrinas y piretroides • Tiocarbamatos y ditiocarbamatos • Triazinas • Otros

2.2.3. Clasificación Toxicológica de plaguicidas según la Organización

Mundial de la Salud (OMS, 1991)

La OMS ha recomendado, sujeta a actualizaciones periódicas, una clasificación

según su peligrosidad, entendiendo ésta como su capacidad de producir daño

agudo a la salud cuando se da una o múltiples exposiciones en un tiempo

relativamente corto. Esta clasificación se basa en la dosis letal media (DL50)

aguda, por vía oral o dérmica de las ratas. Sin embargo; un producto con un

baja dosis letal media (DL50) puede causar efectos crónicos por exposición

prolongada.

Tabla 2. Clasificación toxicológica de los plaguicidas según OPS

CLASE ORAL DERMICA SÓLIDOS* LIQUIDOS* SÓLIDOS* LIQUIDOS*

I a Extremadamente peligroso

Ib Altamente peligroso

II Moderadamente peligroso

III Ligeramente peligroso

5 o menos

5 a 50

50 – 500

Más de 500

20 o menos

20 – 200

200 – 2000

Más de 2000

10 o menos

10 – 100

100 – 1000

Más de 1000

40 o menos

40 – 400

400 – 4000

Más de 4000 *Estado físico del ingrediente o formulación que se clasifica. Fuente: International Programme of Chemical Safety. The WHO recommended classification of pesticides by hazard and guidelines to classification 1990-1991. Geneva: IPCS. 1990 WHO/IPOCS/90


18

Ia Extremadamentetóxico

Ib Altamente tóxico

II Moderadamentetóxico

III Ligeramentetóxico

IV Menos tóxico

SU PELIGROSIDADES

EL COLORDE LA

ETIQUETA

Además de estas categorías existen otros tres grupos de plaguicidas:

a. Grupo V: incluye a aquellos productos que no implican un riesgo agudo

cuando se usan normalmente. Tienen un DL50 oral mayor o igual que

2000 mg/Kg en el caso de los sólidos y mayor o igual a 3000 mg/Kg en el

caso de líquidos.

b. Grupo VI: incluye a aquellos productos a los que no se les asigna

ninguna categoría por considerarlos obsoletos o discontinuados.

c. Grupo VII: incluye a los fumigantes gaseosos o volátiles. La clasificación

de la OMS no establece criterios para las concentraciones áereas en las

cuales pueda basarse la clasificación. La mayoría de estos compuestos

son de muy alta toxicidad y existen recomendaciones sobre límites de

exposición ocupacional en muchos países.

2.2.4. De acuerdo al grado de toxicidad

Esta clasificación es recomendada por la OMS y se refiere al riesgo o

peligrosidad del producto para la salud humana, una herramienta muy útil

para darse cuenta del peligro que representa el producto es el color de la

etiqueta (Huici, 2007).

Figura 1. Clasificación de los plaguicidas según su peligrosidad Fuente: Proyecto PLAGBOL


19

Tabla 3. Plaguicidas no recomendados por ser extremada o altamente tóxicos, según la clasificación de toxicidad aguda de la OMS

CLASE 1 A DE LA OMS (EXTREMADAMENTE

TÓXICO)

CLASE 1 B DE LA OMS (ALTAMENTE TÓXICO)

Aldicarb Óxido de arsénico Brodifacum Bromadialone Bromethalin Cianuro de calcio Captafol Clorfenvinfos Clormefos Clorfacinone Clortiofós Coumafós Crimidine CVP Cicloheximide DBCP Demefión O y S Demetón O y S Difenacum Difetialone Difolatan Dimefox Difacinone Disulfoton EPN Etoprop Etoprofós Etiltiometón Fanamifós Fensulfotión Flocoumafén Fonofós Fosthietán Hexaclorobenceno Leptrofós M74 Mbcp Mefosfolán

Aldoxicarb Aldrin Allyl alcohol Aminocarb Antu Azinphos ethyl Azinphos methyl Benfuracarb Bis (tributyltin) oxide Blasticidin S Bromophos ethyl Butocarboxim Cadusafos Calcium arsenate Carbofuran Carbophenotion 3-chloro-1,2´propanediol chloetocarb coumachlor coumatetralyl crotoxiphos DDVF DDVP Delnav Demeton-S-methyl Demeton-S-methylsulphón Dichlorvos Dicrotophos Dieldrin Dimetilan Dinoseb Dinoseb acetate Dinoterb Dioxathion DMTP DNBP DNBPA

Methiltriazothion Monocrotophos MPP Nicotine Nitrilacarb Omethoate Oxamyl Oxidometom-methyl Oxideporfós Paris green Pentachlorphenol Penylmercury Nitrate Pirimiphos ethyl Propaphos Propetaphos Sodium arsenite Sodium cyanite Strycnine TBYO Tefluthrin Thallium sulfate Thiofanox Thiomethon Thioxamil Triamiphos Triazophos Triazothion Vamidothion Warfarin Zinc phospide Efectos crónicos y ambientales Butachlor Campheclor Toxaphene Captán


20

Cloruro de mercurio Merkaptofós Metafós Mevinfós Paratión Metilparatión Fenilmercurio acetato Phorate Phosfolán Phosfamidón Prothoate Red squill Schradan Scilliroside Sodium fluoroacetate Sulfotep TEPP Terbufós Tiophós Thionazin Timet Tricloronat

DNOC EDDP Edifenphos Endrin ESP Famphur Fenthion Flucytrynate Fluoracetamide Formetanate Fosmethilan Furathiocarb Heptenophos Isazophos Isophenfos Isothioate Isoxathion Arsenato de plomo Mecarbam Oxido de mercurio Metamidophos Methidathion Methomyl Methyl-merkapto-phosteolovy Methyl-merkapto-phosoksid

Chordane y heptachlor Chlordimeform DDT Dimethoate Dinoseb EDB Ethylene bis dithiocarbamates (mancozeb, maneb, zineb, etc) haloxifop-ethoxyethil HCH BHC Lindane Mirex Nuarimol Prothiophos

2.2.5 La clasificación de oncogenicidad de la EPA (Environmental

Protection Agency de Estados Unidos) divide los plaguicidas en cinco

grandes categorías:

a) Conocido carcinógeno humano

b) Probable carcinógeno humano

c) Posible carcinógeno humano

d) No clasificado

e) Evidencia de no carcinógeno

La clasificación de IARC (International Agency for Research on Cancer)

es similar:


21

a) Grupo 1: carcinogénico en humanos

b) Grupo 2 a: probable carcinógeno en humanos

c) Grupo 2 B: posible carcinógeno en humanos

d) Grupo 3: no clasificable

e) Grupo 4: probablemente no carcinogénico en humanos

2.3. Efectos adversos al medio ambiente

Los plaguicidas producen graves daños al medio ambiente debido a las

propiedades de toxicidad, estabilidad y persistencia. Estas propiedades son las

que facilitan la contaminación de agua, suelo y aire unida a otros factores

como los propiciados por el hombre en su afán de dominio de la naturaleza e

industrialización; tal como ocurre en las siguientes formas de contaminación

(Cervantes, 2007):

1) Contaminación del agua

Puede producirse por la aplicación directa de plaguicidas a fin de utilizarlas

como cebo de peces, descarga de líquidos remanentes de la aplicación, desecho

de envases vacíos, inundación o desborde de ríos que alcanzan los lugares de

almacenamiento, desplazamiento de plaguicidas arrastrados por las lluvias

hacia los cauces, aplicaciones aéreas cercanas a los ríos y lagos y descarga de

residuos industriales. Esta contaminación ocasiona la pérdida de la flora y

fauna acuática, del recurso como fuente de agua y alimento y es causa de

intoxicaciones humanas y de animales (Castillo, 1995).

2) Contaminación del suelo

Por aplicación directa de plaguicidas en el suelo, goteo desde el vegetal, caída

desde el equipo aplicador, desecho de envases vacíos, arrastre por las gotas de

lluvia, derrame por accidente, contaminación de fuentes de agua, fototoxicidad

y por cadenas alimentarias. La evaluación del grado de contaminación del

suelo por plaguicidas es de particular importancia, debido a la transferencia de

estos contaminantes a los alimentos (Escriche, 1996). Muchos plaguicidas son


22

persistentes y poco degradables lo que les permite permanecer por muchos

años en el suelo. Esta contaminación afecta los microorganismos del suelo,

disminuye la descomposición de la materia orgánica, modifica la estructura de

los suelos, disminuye la fertilidad y finalmente favorece la erosión (García,

1997).

3) Contaminación del aire

Se produce por la aplicación aérea no controlada, pérdida durante el transporte

y durante la aplicación y por la evaporación de aguas contaminadas (ríos,

lagos, etc.). El movimiento del aire puede desplazar los contaminantes

atmosféricos desde sus sitios de origen a largas distancias, como las altas

concentraciones de insecticidas organoclorados y de PBC encontradas en

animales árticos y antárticos, procedentes de Centroamérica. Los plaguicidas

se volatilizan con facilidad durante la operación o inmediatamente después de

ella. (García, 1997).

4) Contaminación de los alimentos

La comunidad en general se expone continuamente a los plaguicidas debido a

la contaminación de los alimentos con estos productos. Pueden encontrarse

residuos de plaguicidas en los alimentos debido al uso excesivo de plaguicidas

en el sector agropecuario, la recolección de los productos agrícolas sin esperar

el intervalo de seguridad (o tiempo de carencia) entre la última aplicación de

plaguicida y la cosecha y por contaminación durante el almacenamiento,

transporte, expendio o la preparación de los alimentos (Castillo, 1995).

5) Resistencia de las plagas

Uno de los problemas más importantes que supone el uso continuo de

plaguicidas es la aparición de resistencias genéticas en los organismos que se

quieren combatir. Se estima que desde 1950, al menos 520 especies de

insectos y ácaros, 273 especies de malas hierbas, 150 enfermedades de

plantas, y 10 especies de roedores, han desarrollado resistencia genética a uno


23

o más plaguicidas (Miller, 1999). Probablemente los productos transgénicos

introducidos en el mercado hace pocos años, también creen resistencia.

2.4. Movimiento de los plaguicidas en el medio ambiente La manera en que se produzca la liberación de los plaguicidas al medio

ambiente, determinará su movimiento. La distribución inicial viene

condicionada por el método de aplicación, la cantidad del producto, la duración

y la frecuencia de aplicación. La topografía del terreno, el tipo y densidad de

vegetación, las condiciones del suelo y la proximidad de agua también son

factores importantes. Este conjunto de factores determinan la cantidad de

plaguicida que se distribuirá en aire, suelo, agua, plantas y animales. El

destino de los plaguicidas aplicados en recintos cerrados como los

invernaderos y edificios, será diferente de los aplicados en lugares abiertos.

Figura 2. Posibles mecanismos de transporte y transformación de plaguicidas en el ambiente Fuente: http://www.ine.gob.mx/dgicurg/plaguicidas/download/pytransporte.pdf.


24

Con el tiempo los plaguicidas pueden distribuirse en el lugar de aplicación,

moverse del lugar (aguas subterráneas, atmósfera, etc.), degradarse o persistir.

En la figura 2 se resumen esquemáticamente los movimientos de los

plaguicidas en el medio ambiente y sus posibles destinos. Es la forma en que

se mueven los plaguicidas en el medio ambiente, desde la fuente emisora del

plaguicida hasta los puntos donde existe exposición para el ser humano o

biota. Las características físicas y las condiciones climáticas del sitio de estudio

contribuyen al transporte de los contaminantes. Por consiguiente, es necesaria

la información acerca de la topografía, tipos de suelo y ubicación, tipo de

cubierta del suelo, precipitación anual, condiciones de temperatura, entre

otros, para poder estimar hacia donde pudiera desplazarse el plaguicida

aplicado.

Los plaguicidas pulverizados se pueden mover a través del aire y pueden

acabar en lugares muy lejanos, tanto en el suelo como en el agua. Los que se

aplican directamente sobre el suelo, pueden filtrarse a capas basales,

reabsorberse posteriormente por otras plantas o bien pasar a las aguas

subterráneas. Los plaguicidas que llegan a los acuíferos, ya sea porque se han

aplicado directamente o indirectamente (por las aguas subterráneas

contaminadas, por las pinturas de los barcos, o por la degradación del suelo,

etc.), aumentarán la concentración de los productos en el agua y en la

atmósfera a través de la evaporación. Esta lista incompleta de posibilidades

sugiere que el movimiento de los plaguicidas es muy complejo. Así, por

ejemplo, se encuentra DDT en lugares en donde nunca ha sido utilizado.

2.5. Metabolismo de los plaguicidas en el organismo El estado del conocimiento de la relación entre los plaguicidas y los organismos

vivos a nivel bioquímico y molecular es relativamente alto. Los plaguicidas son

metabolizados por varias enzimas, incluyendo el sistema de la monooxidasa

dependiente del citocromo P450. La flavin monooxidasa (FMO), prostaglandin


25

sintetasa, molibden hidrolasa, deshidrogenasa alcohólica y aldehídica,

esterasas y variedad de transferasas, especialmente la S- glutation esterasa.

Las enzimas involucradas en el metabolismo inicial de los plaguicidas parecen

ser en primer lugar la P450, seguida de la FMO.

Dependiendo del plaguicida (substrato) tanto la activación como la

detoxificación pueden darse con cualquiera de estas enzimas, no obstante la

P450 tiene una importancia adicional como un activador nucleofílico

sustituyente en moléculas como proteínas y ácidos nucleicos. Los plaguicidas

sirven también en el caso particular de P450 como inhibidores o inductores. Se

han caracterizado y secuenciado los nucleótidos y aminoácidos de unos 400

genes de P450. Debido a eso se conoce que el sistema P450 ha evolucionado en

tres direcciones, una para producir P450s para substratos específicos, otros

involucrados especialmente con el metabolismo xenobiótico tendientes a

metabolismo relativamente no específico, el último caso se refiere a

preferencias evidentes de substrato pero con posibilidades de trabajar sobre

algunos sustratos afines. Existen además isoenzimas específicas inductoras e

inhibidoras de P450.

Las FMOs y P450s, están localizadas en el retículo endoplásmico de las

células de vertebrados y están involucradas en la oxigenación de plaguicidas.

Las FMOs, originalmente descritas como una oxidasa de aminas, se conocen

actualmente como catalizadoras de la oxidación de muchos químicos orgánicos

y algunos inorgánicos. Estas son particularmente importantes en la oxidación

de heteroátomos, particularmente nitrógeno, sulfuro, fósforo y selenio en

moléculas orgánicas. (Bastiedas y col., 1999; Gómez y col., 2000).

2.6. Efectos adversos a la salud: toxicidad aguda y efectos a largo plazo La salud humana es afectada de diversas formas. La mayoría de la información

disponible sin embargo, se basa en estudios generalmente realizados con

animales.


26

2.6.1. Exposición y efectos:

La exposición de seres humanos a plaguicidas puede clasificarse de varias formas: ♦ aguda o crónica ♦ profesional o no profesional ♦ intencional o no intencional ♦ accidental o incidental ♦ potencial o real En cada una de estas clasificaciones, la exposición puede ser: ♦ oral ♦ respiratoria ♦ dérmica 2.6.1.1. Exposición aguda: Estas a su vez pueden ser clasificadas en:

♦ accidentales, profesionales o intencionales

♦ sistémicas o locales (dérmicos, oculares, etc)

En casos agudos, principalmente profesionales, la vía de exposición generalmente

es dérmica, a través de ropa contaminada. La vía respiratoria sigue en orden de

importancia. En los casos accidentales e incidentales, la vía más frecuente es la

oral.

- Exposición aguda accidental: La literatura reporta esta exposición en 5% de casos aproximadamente, aunque

refiere, tal como ocurre en Centroamérica, que esta proporción es mayor en

países en desarrollo. Los niños menores son los principales expuestos. Las

principales causas relacionadas con esta exposición son:

♦ plaguicidas almacenados en la vivienda sin restricción


27

♦ plaguicidas reenvasados en botellas sin señalización ♦ plaguicidas almacenados junto a alimentos ♦ plaguicidas usados con fines de control doméstico de vectores ♦ plaguicidas usados con fines de automedicación para control de

ectoparásitos ♦ uso de envases vacíos de plaguicidas para almacén o transporte de agua ♦ tratamiento de granos para semillas o conservación post-cosecha ♦ transporte de plaguicidas junto a alimentos.

- Exposición aguda profesional.

Se estima para el 60-70% de todas las exposiciones y puede afectar no sólo a

adultos en edad económicamente activa, sino también a menores de edad y a

ancianos, principalmente en el sector productivo agrícola.

Diferentes procesos profesionales están involucrados:

♦ Fabricantes ♦ Formuladores ♦ Vendedores ♦ Transportistas ♦ Mezcladores ♦ Cargadores ♦ Aplicadores ♦ Agricultores ♦ Obreros agrícolas ♦ Personal de limpieza

2.6.2. Toxicidad aguda. La toxicidad aguda se refiere a los efectos tóxicos observados con una exposición

única de corta duración (menos de 24 horas en animales de laboratorio). Los

efectos más estudiados son la capacidad letal y la sintomatología que aparece en

casos no letales.

La OMS recomienda la siguiente Clasificación de Plaguicidas conforme a su

toxicidad aguda. Observaciones a esta clasificación:

la peligrosidad se refiere al efecto agudo


28

no puede considerarse como definitiva son puntos de orientación complementaria distingue formas más y menos peligrosas del mismo plaguicida se basa principalmente en la toxicidad aguda oral y dérmica para las ratas

(DL 50)

La Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (EPA) tiene una

clasificación basada en el ingrediente activo y la DL 50 para ratas (oral, dérmica e

inhalada), así como la clasificación según la ocurrencia de efectos oculares

(opacidad corneal reversible, irreversible o sin irritación) y dérmicos (corrosivos,

irritantes severos, moderados o leves).

Otras clasificaciones también permiten medir la capacidad irritativa (negativa o

positiva) en piel y ojos y la capacidad de desencadenar reacciones alérgicas

(negativa, leve, moderada o severa).

2.6.3. Toxicidad crónica.

La toxicidad crónica se refiere a los efectos tóxicos observados (generalmente en

animales de experimentación) luego de administrarles el plaguicida por período

entre seis y veinticuatro meses, y al menos en tres dosis distintas. La toxicidad

crónica puede ser positiva o negativa.

Los principales efectos crónicos son:

a) Neurotoxicidad

b) Mutagenicidad

c) Oncogenicidad

d) Teratogenicidad

e) Efectos reproductivos

f) Otros efectos crónicos

La neurotoxicidad se refiere a los efectos tóxicos sobre el sistema nervioso central

o periférico, tales como neuropatías sensoriales, motoras, trastornos de la

conducta, etc. La literatura sobre las neuropatías retardadas ha aumentado


29

considerablemente, con aparición posterior a la exposición a organofosforados

(Hsieh y col., 2001; Wesseling y col., 2002). Las neuropatías y otros trastornos

neurológicos pueden encontrarse en personas expuestas a dosis bajas y

repetidas de organofosforados (exposiciones crónicas). Los síntomas incluyen

nerviosismo, fatiga, pérdida de memoria y depresión, además de otros. Muchos

de éstos aparecen aun sin que exista una disminución manifiesta de la

colinesterasa, aunque la exposición a organofosforados la gran mayoría de veces

va ligada a un descenso significativo en los niveles de colinesterasa sérica (Dyler

y col. 2001).

Últimos estudios reportan la relación de la exposición a plaguicidas con

enfermedades neurodegenerativas tales como el parkinson (Engel y col., 2001;

Woodward, 2001) y la enfermedad de Alzheimer (Gauthier y col., 2001).

La mutagenicidad se refiere a los cambios producidos en los genes capaces de

trasmitirse a través de la división celular. Si el daño es a nivel de las células

somáticas se puede ocasionar cáncer y si es en las células reproductoras puede

ocasionar malformaciones congénitas. Ej. dibromuro de etileno.

La oncogenicidad es la capacidad de una sustancia para producir cáncer. Existen

dos grandes clasificaciones: la de la EPA (Environmental Protection Agency de

Estados Unidos) y la de la IARC (International Agency for Research on Cancer)

La teratogenicidad es el efecto tóxico que conduce a malformaciones inducidas

durante el desarrollo del embrión (antes de las 20 semanas de gestación). Ej:

paraquat, zineb, benomyl.

Los efectos reproductivos son aquellos efectos tóxicos relacionados con las

alteraciones de la capacidad de reproducción de las especies e incluyen una

amplia gama: salud durante la gestación, fertilidad masculina y femenina,

gametogénesis, funciones genéticas, implantación, teratogénesis, toxicidad


30

perinatal y postnatal, problemas en el alumbramiento, efectos sobre la lactancia,

crecimiento, desarrollo y maduración sexual de los jóvenes, patología de la

descendencia, etc. Uno de los más conocidos en el país es el Nemagón (DBCP)

cuyo uso ya está prohibido y aún genera demanda de los trabajadores por las

secuelas de la exposición.

Tabla 4. Efectos crónicos de algunos

plaguicidas


31

2.7. La exposición a plaguicidas en Bolivia.

El uso de plaguicidas en Bolivia se remonta a la década de los años 50. Luego

de la revolución del año 1952 en que la propiedad de la tierra pasó a manos del

campesino, junto con la implementación de la denominada “marcha hacia el

oriente”, se produjo como consecuencia una importante migración a la

amazonía boliviana y el “comienzo” del uso de plaguicidas. Posteriormente

entre los años 1966 a 1975 la importación de plaguicidas creció de 188.000

kgs a 1.342.800 Kgs. En la década de los noventa se registró 160 productos de

los cuales 40% eran insecticidas, 25% fungicidas, 20 % herbicidas y 5%

nematicidas y rodenticidas.

La importación de plaguicidas fue incrementándose de manera importante

desde el año 1994 cuando el registro de ese año alcanzó las 2000 toneladas de

las que el 65% eran herbicidas, 23% insecticidas, 7% fungicidas y un 5%

destinado para otros usos, con un crecimiento anual del 12%. Para marzo de

1997 ingresaron legalmente a Bolivia 426 insumos agrícolas comerciales y en el

año 1999 se importó alrededor de 10.000 toneladas de plaguicidas. El registro

de agroquímicos para el 31 de diciembre de 2000 mostró 1084 productos de los

que 857 eran plaguicidas. En el año 2003 los registros de importación de

insumos agropecuarios mostraron un total de 17. 128. 402.79 kilogramos de

los que alrededor de un 50% correspondieron a plaguicidas, sin tomar en

cuenta la cantidad de ellos que ingresan por la vía del contrabando, estimada

en un 30% adicional.

Algunos otros datos ilustran mejor la situación en torno al uso de plaguicidas

en el país: En Bolivia, la actividad agropecuaria representa uno de los

principales componentes de la economía. Este sector aporta el 21% del

Producto Interno Bruto contribuyendo con alrededor del 20% del total de las

exportaciones. Ocupa un poco más del 39% de la población económicamente

activa, abarcando una superficie cultivada por año agrícola de cerca de dos


32

millones de hectáreas. Durante los años 1997 y 1998, para una superficie de

1.241.621 has. (65 % de la superficie sembrada es dedicada al cultivo de la

soya, arroz, algodón, maíz, girasol, caña, tomate y papa), se utilizó 6.762,88

toneladas métricas, con un costo aproximado de 92.061 millones de dólares

americanos. En la soya, por ejemplo, se utilizaron 3.820 toneladas de

plaguicidas. En Bolivia no se producen plaguicidas químicos, son importados

bajo ciertos reglamentos.

En síntesis, este importante uso de plaguicidas en Bolivia durante los

últimos 40 años, se traduce en la actualidad en la existencia de alrededor de

300 toneladas de plaguicidas obsoletos encontrados a lo largo del territorio,

entre los que figuran organoclorados, organofosforados, piretroides,

ditiocarbamatos e inorgánicos entre los principales, lo que implica un

importante riesgo para la salud. (Cervantes, 2007)

2.8 Efectos sobre el material genético.

El daño producido por los plaguicidas no solamente es evidente como

intoxicaciones, sino que también los productos pueden llegar a interactuar con el

material genético, dañándolo, y de no repararse este daño puede originar una

serie de efectos (cáncer, enfermedades degenerativas, abortos, descendencia con

alteraciones genéticas). Numerosos estudios han puesto de manifiesto

alteraciones cromosómicas en los individuos que están en contacto con

plaguicidas. En los estudios de los efectos genotóxicos de los plaguicidas, los

tests más frecuentemente utilizados para daño genético son las aberraciones

cromosómicas (AC) análisis realizado en linfocitos de sangre periférica.

2.8.1. Estudios de genotóxicidad. El estudio del potencial mutagénico (genotóxico) de los plaguicidas y de las

mezclas actualmente usados, en diferentes tipos de vida animal y vegetal y en


33

estudios en animales de laboratorio (in vivo), así como estudios en cultivos

celulares bacterianos y de mamíferos (in vitro) nos aproximan a manera de

cernidor a una medida del riesgo de cáncer en humanos. Así que en la última

década se han logrado nuevos conocimientos en el entendimiento del riesgo

carcinogénico de los plaguicidas, por ejemplo se sabe que derivados de bromo

causan sarcoma en el hombre. Diversos estudios epidemiológicos implican a

los plaguicidas como agentes causantes de cáncer en humanos (Blair, 1990),

(Blair y col., 1991), (Blair y col. 1985), (Brown y col., 1990).

En el artículo de revisión realizado por Bolognesi (2003), se describe una

asociación positiva entre la exposición a plaguicidas y aberraciones

cromosómicas en la mayoría de los estudios, de 22 estudios 11 encontraron

incremento estadísticamente significativo en la frecuencia de aberraciones

cromosómicas en grupos de expuestos a plaguicidas. Un estudio encontró una

significativa relación dosis-respuesta entre la frecuencia de MN y años de

exposición (Bolognesi y col., 1993) y otros tres estudios mostraron efectos

significativos de los plaguicidas en la frecuencia de MN. Cinco estudios

mostraron asociación significativa entre exposición a plaguicidas y cola

anormal en el ensayo del cometa, uno fue positivo para daño al DNA en sujetos

expuestos (Ramirez y col., 2002) y otro fue positivo para efectos sobre la

reparación del DNA de las células y presencia de dicéntricos. Dos estudios

mostraron que no existe efecto de los plaguicidas en aberraciones

cromosómicas y uno no mostró ningún efecto en micronúcleos considerando el

problema de toma de muestra que no fue al mismo tiempo que la exposición a

plaguicidas. (Gregio y col, 2000), (Hoyos y col., 1996), (Scarpato y col., 1996)

Se ha propuesto que el rango normal de ACs en la población es de 1%. Las

aberraciones cromosómicas han sido probadas como un biomarcador de riesgo

de cáncer para estudios prospectivos a largo plazo, por tanto queda establecido

que por lo menos algunos plaguicidas serían cancerígenos.

Estudios disponibles en la literatura científica que han evaluado el

potencial genotóxico en personas expuestas ocupacionalmente a mezclas de


34

plaguicidas, se han realizado esencialmente en rodeadores, floriculturistas,

trabajadores agrícolas y trabajadores productores de plaguicidas. Los

resultados fueron controversiales. Mientras que, estudios llevados a cabo en

trabajadores de fábricas de plaguicidas han demostrado genotoxicidad. (Sailaja

y col., 2006)

2.9. Biomonitorización de poblaciones humanas expuestas a agentes

genotóxicos.

Los efectos negativos sobre la salud humana producidos como consecuencia de

una exposición a un factor ambiental, pueden expresarse inmediatamente o

tardar años en manifestarse. Es en estos últimos en los que hay que prestar

atención para poder identificar el problema antes de la aparición de los

síntomas, ya que los individuos estarán expuestos a los agentes nocivos

durante mucho tiempo antes de que se manifiesten los efectos adversos. Aquí

intervienen los estudios de biomonitorización, que intentan establecer la

relación entre factores ambientales y enfermedad, detectando alteraciones

iniciales en fases todavía no malignas. Algunos estudios de biomonitorización

se basan en el análisis de los compuestos químicos o de sus metabolitos en

muestras de sangre, orina, pelo, etc. En el caso de los compuestos

genotóxicos, la biomonitorización se amplía al uso de ensayos de genotoxicidad

y mutagenicidad, para poder realizar una evaluación del daño al material

genético.

La biomonitorización, como parte del proceso de evaluación del riesgo genético,

presenta los siguientes objetivos: detectar la exposición a genotoxinas

ambientales y determinar sus efectos genotóxicos in vivo (Albertini, 1994).

2.10 Susceptibilidad genética a los plaguicidas, efectos a la salud

mediados por polimorfismos genéticos.

El proyecto Genoma Humano ha creado un nuevo y potencialmente un

poderoso método para estudiar mecanismos de susceptibilidad individual de


35

los efectos producidos por los plaguicidas a la salud. El mapeo de los genes ha

permitido la identificación de polimorfismos en individuos que están asociados

con metabolismo impar de xenobióticos, incluyendo drogas y plaguicidas. Sin

embargo, todas las rutas de detoxificación no están plenamente entendidas, el

proceso involucra tres sistemas principales: las enzimas citocromo P450,

glutatión S transferasas, y el sistema paroxone que metabolizan insecticidas

organofosforados. La herencia de un gen desfavorable “pobre metabolizador” y

versiones de estos genes han mostrado ser la causa de un incremento en la

activación o reducción de la detoxificación y eliminación de mutágenos

ambientales tales como los pesticidas. (Au y cols. 1999).

Se hipotetiza que, sujetos expuestos a plaguicidas, pobres metabolizadores

desarrollarían altos rangos de cáncer y otros efectos que los metabolizadores

normales. En un estudio de Bolognesi (2003) contiene una excelente revisión y

discusión de estudios de polimorfismos genéticos. Tres ejemplos de los

artículos que investigan la relación entre polimorfismos genéticos y

susceptibilidad genética son los siguientes:

- Infante-Rivard y col. (1999) estudiaron niños con leucemia linfocítica aguda

(ALL) quienes habían sido genotipados al nacimiento. Los niños con

polimorfismos de pobres metabolizadores que representaban justo sobre el

40% del grupo de estudio Montreal, tuvieron en general interacción odds

ratio (ORs) de 1.05 a 5.55 para ALL al ver expuestos a plaguicidas durante

el embarazo o la infancia. El más alto ORs (4.33 – 5.55) fue para los

expuestos a repelentes y roceadores para insectos fuera de la casa durante

el embarazo. Herbicidas empleados (principalmente 2,4 D) durante el

embarazo y la infancia, mostraron una interacción consistente con genes

pobres metabolizadores y fue asociada a un incremento al doble en el valor

de incidencia de leucemia en esta cohorte.


36

- Hubble y col. (1998) compararon pacientes que habían tenido el subtipo de

demencia de la enfermedad de Parkinson con un grupo control de pacientes

con la enfermedad de Parkinson sin demencia. Los marcadores genéticos

para metabolizadores pobres fueron medidos en ambos grupos y se

encontró que estaban en igual frecuencia. Sin embargo, la ocurrencia del

gen de pobre metabolizador combinado con la exposición a plaguicidas fue

más común en el grupo de demencia (12%) que en los pacientes con

Parkinson sin demencia (2%). Este estudio sugiere un posible mecanismo

para los consecuentes hallazgos de estudios epidemiológicos de que la

exposición a plaguicidas es un factor de riesgo para el desarrollo de la

enfermedad de Parkinson (Hagmar y cols. 1998).

Au y colaboradores (1999) estudiaron granjeros de bananas en Costa

Rica, quienes habían estado previamente expuestos a dibromocloropropano

(DB CP), un plaguicida para banano conocido de causar reducción en el

recuento de esperma, y quienes fueron fuertemente expuestos a plaguicidas

para la agricultura en sus trabajos. Los trabajadores con polimorfismos de

pobres metabolizadores tenían un problema en la respuesta de reparación del

DNA, comparados con los trabajadores quienes fueron metabolizadores

normales. El estudio también encontró que los metabolizadores pobres fueron

significativamente no representados en el grupo de granjeros comparados con

los controles. Los autores especulan que los pobre metabolizadores pueden

elegir por ellos mismos no trabajar en agricultura debido a su susceptibilidad

incrementada a los efectos adversos a la salud por alta exposición a

plaguicidas.

2.11. Biomarcadores.

Los biomarcadores o indicadores biológicos se definen como una alteración del

organismo ya sea a nivel celular, bioquímico o funcional; producen cambios


37

biológicos, bioquímicos, fisiológicos o morfológicos importantes, los cuales son

causados por la exposición a xenobióticos presentes en el ambiente donde nos

desenvolvemos diariamente. Estos cambios pueden ser medidos y

proporcionan información sobre la cantidad de xenobiótico a la que está

expuesto y de la intensidad de la respuesta, así como la presencia de ciertas

enfermedades producidas por dichos xenobióticos. Los biomarcadores pueden

ser de exposición, de efecto y de susceptibilidad (Kendall y cols., 2001).

2.11.1 Clasificación de biomarcadores.

Tabla 5. Tipos de biomarcadores y funciones de salud pública

2.11.2. Biomarcadores de exposición.

Determinan la presencia de un agente o los metabolitos que se forman y que

interaccionan con las células blanco o moléculas del organismo. Se utilizan

para predecir la cantidad de xenobiótico a la que un individuo está expuesto,

Tipo de

Biomarcadores

De Vigilancia Screening medico Intervención

Exposición • Monitoreo Biológico

• Monitoreo ambiental

No aplicable • Variables Independientes

• Evaluación de riesgo

Efecto • Monitoreo de

efectos a la

salud

• Prevención

secundaria

• Variables dependientes

• Aproximación al riesgo

• Tratamiento

Susceptibilidad • Validación de

riesgo

• Evaluación

diagnóstico

• Aproximación al riesgo


38

también pueden indicar si la exposición es temprana o pasada, dependiendo de

la temporalidad del biomarcador.

Si el compuesto ha penetrado y ha interaccionado con el material genético

(mutágenos/ carcinógenos electrofílicos), se puede detectar por aductos en

proteínas (albúmina y hemoglobina) y en DNA (células de la línea blanca, orina

y tejidos), así como la formación de IC, reflejando una exposición primaria. Un

resultado positivo a este nivel no indica necesariamente consecuencias

adversas, ya que parte del daño genotóxico primario puede ser reversible. Para

detectar la exposición a plaguicidas se han utilizado diversos biomarcadores

tales como: la determinación directa del DDE (derivado del DDT) en tejidos de

peces (Mora y col., 2001); de hexaclorobenceno (HCB) y bifenilos policlorados

(PCB) en suero (Sala y col., 2001); disminución de los niveles de colinesterasa

(Anwar 1997). Maroni y col. 2000 revisa las distintas técnicas utilizadas para

detectar la exposición a los diferentes plaguicidas, ya sea midiendo

directamente el compuesto en cuestión (como los herbicidas fenoxiacéticos, que

casi no se metabolizan en mamíferos), o los metabolitos que se forman, tanto

en sangre como en orina.

2.11.2.1. Colinesterasa. La deficiencia congénita de colinesterasa sérica es una causa potencial

conocida de reacción prolongada a agentes bloqueantes neuromusculares tales

como la succinilcolina (Jensen y col., 1995). Pensamos que puede ser útil

incorporar este biomarcador a los trabajadores agricultores con el propósito de

monitorizar a aquellos que aplican insecticidas anticolinesterásicos

(organofosforados y carbamatos), especialmente para detectar a los que son

más susceptibles por presentar una baja actividad enzimática o una deficiencia

congénita de la colinesterasa sérica.

La actividad de colinesterasa en suero es medida por un método

espectrofotométrico, la colinesterasa se utiliza en el primer paso de la


39

reducción del potasio hexacianoferrato produciéndose un cambio en el color

que se puede medir con una variación debajo de 2,3% dentro del mismo

sistema de análisis. Las medidas se dan en KU/L (kilounidades por litro). La

variación individual normal es demasiado amplia, los resultados pueden ser

utilizados solamente de manera individual en el análisis de sangre de la

persona cuando no ha estado en contacto con los organofosforados por meses.

Pero para un nivel grupal la actividad de colinesterasa en suero se puede

comparar entre los diversos grupos, si se asume que los individuos se

distribuyen uniformemente dentro de los mismos. Sabemos que la actividad de

colinesterasa puede ser influenciada por el peso, sexo, edad, enfermedades

hepáticas, alcoholismo y uso de píldoras anticonceptivas. (Hernández y col.,

1998).

2.11.3. Biomarcadores de efecto.

Evalúa los efectos resultantes de la exposición a un xenobiótico sobre un

proceso bioquímico o fisiológico. Estos biomarcadores miden el daño que se ha

producido cuando el organismo ya lo ha procesado, pudiendo llegar a ser

permanentes en la célula, órgano u organismo. Los efectos ya fijados, reflejan

daños producidos por exposiciones pasadas, lo que los hace útiles para el

estudio de daño acumulativo. Si se quiere detectar un daño cromosómico, los

biomarcadores de efecto que se pueden utilizar incluyen las aberraciones

cromosómicas (AC), los micronúcleos (MN), y las roturas de DNA y, si se quiere

detectar un daño génico, se pueden analizar las mutaciones puntuales.

Los biomarcadores de efecto también pueden determinar cambios

cromosómicos o génicos en lugares específicos relacionados con el desarrollo de

alguna enfermedad. En tal caso, nos referimos a los biomarcadores de

enfermedades que constituyen manifestaciones tempranas o preclínicas, que se

presentan antes de que se establezca la enfermedad producida por la

exposición. Si hay daño cromosómico, se pueden buscar alteraciones


40

estructurales o numéricas específicas de la enfermedad en estudio, y si hay

daño génico, se pueden evaluar mutaciones en protooncogenes, en genes

supresores de tumores o en genes de reparación. Los biomarcadores de efecto

que entregan información específica de una enfermedad, se denominan

biomarcadores de riesgo. Los biomarcadores de riesgo y de enfermedad no

pueden identificar el tóxico que produjo el daño, pero si indican al investigador

que el daño ha ocurrido.

En los estudios de biomonitorización de poblaciones humanas expuestas

a plaguicidas se ha usado diferentes biomarcadores de efecto, entre los que

podemos señalar los MN, CA, ICH, SCGE (Saleha y col, 2001, Pastor y col.,

2001 a y b), entre otros. Entre los diversos estudios de biomonitorización de

genotoxicidad por exposición a plaguicidas, se puede observar que hay estudios

que no encuentran incremento de daño, mientras que otros sí, y que la tarea

de vigilancia a poblaciones humanas expuestas a plaguicidas es una tarea

difícil por la diversidad de factores que entran en juego, especialmente en el

campo de la exposición ocupacional, en donde generalmente no se emplea un

único producto sino mezclas de varios de ellos.

2.11.3.1. Los micronúcleos.

El DNA puede ser alterado de manera espontánea o por acción de diversos

agentes. Muchas de estas alteraciones se traducen en roturas del DNA y en

pérdida de material genético. Estas anomalías pueden detectarse mediante

distintas técnicas moleculares y/o citogenéticas. Entre las técnicas

citogenéticas más utilizadas están las que permiten detectar los cambios

cromosómicos, tanto estructurales como numéricos. Así, para evaluar el riesgo

genético de poblaciones humanas expuestas a mutágenos, las técnicas más

frecuentemente usadas son las de AC y MN. El ensayo del MN es uno de los

ensayos de genotoxicidad más utilizado en la biomonitorización de poblaciones

humanas expuestas a agentes genotóxicos como es el caso de los plaguicidas


41

(Bolognesi y col., 2003; Garaj-Vrhovac, 2002; Ghita y col., 1999; Joksic y col.,

1997).

El ensayo de MN ha sido muy usado en la evaluación genotóxica in vitro de una

gran diversidad de mutágenos químicos, en diversos tipos celulares. El uso de

cultivos de linfocitos humanos que iniciaron Heddle y col. en 1976, permitió

por su parte, biomonitorizar una población in vivo y llevar a cabo el estudio

citogenético de cada individuo, pudiendo correlacionar las alteraciones

citogenéticas sufridas con la exposición a las substancias o agentes cuyos

efectos adversos se pretende evaluar.

Los micronúcleos pueden corresponder tanto a cromosomas enteros como a

fragmentos acéntricos que, al no orientarse correctamente durante la división

celular, quedan fuera de ambos núcleos hijos. Los MN tienen un aspecto

similar al del núcleo principal y se ven como pequeños núcleos en el

citoplasma de las células interfásicas. Entonces los MN pueden ser indicativos

de daño clastogénico o aneugénico.

La clastogenicidad ha sido relacionada con procesos de envejecimiento

prematuro, alteraciones vasculares e inducción de diversos tipos de cáncer

(Ames y Gold, 2000). Un aumento significativo de la frecuencia de MN que

contengan cromosomas enteros puede tener consecuencias negativas para la

salud humana dado que las aneuploidías, ya sean somáticas o germinales, se

han correlacionado con abortos espontáneos, retraso mental y carcinogénesis,

entre otras alteraciones (Hassold y col., 1996; Hagmar y col., 1998). El ensayo

de MN es uno de los pocos ensayos disponibles para analizar alteraciones

citogenéticas tempranas en tejidos epiteliales, antes de que ocurran cambios

malignos.

La frecuencia basal de MN depende del tipo celular. La frecuencia espontánea

de MN en linfocitos humanos, oscila entre 0 y 2.5% (Surrallés y Natarajan,


42

1997). También se sabe que esta frecuencia basal varía en diferentes etnias, y

según el sexo; en mujeres la frecuencia de MN es aproximadamente 1,4 veces

mayor a la de los hombres (Fenech, 1993) y que, a medida que aumenta la

edad, e independientemente del sexo, la frecuencia de MN también aumenta

(Fenech y Morley, 1986). Dependiendo de las características de cada estudio,

se pueden usar diferentes tipos celulares para aplicar el ensayo de MN.

Entre las ventajas del ensayo de MN se puede mencionar: el ser una técnica

simple, de fácil recuento y de tener un costo reducido. Tiene la habilidad de

valorar exposiciones prolongadas y se puede analizar un gran número de

células en poco tiempo. Posibilita el menor uso de animales de

experimentación. Entre las desventajas se puede mencionar: la existencia de

factores de confusión que modulan la frecuencia de MN como son la edad, el

sexo, etnia, técnicas de tinción, etc. (Fenech y Morley, 1986; Fenech, 1993;

Surrallés y col., 1995) los cuales deben ser considerados en el momento del

análisis. En los estudios de biomonitorización a veces es difícil interpretar los

datos debido a la gran variabilidad intra e interindividual que puede llegar a

ser de hasta un 67%, atribuible a un error experimental (Fenech y Neville,

1992), y otras veces debido a la tinción (Surrallés y col., 1995b). Otra

limitación del ensayo es que no permite determinar la exposición que causa

aberraciones inestables, ya que estas se pierden (Surrallés y col., 1997).

En el ensayo de micronúcleos llevado a cabo en linfocitos de sangre periférica

se pueden realizar dos tipos de cultivos diferentes. Por un lado, pueden

utilizarse linfocitos aislados, que representan un sistema de evaluación muy

sensible para el análisis del potencial genotóxico (Elhajouji y col., 1994;

Surrallés y col., 1995a), con la desventaja de que se necesitan mayores

volúmenes de muestra. Por otra parte, los cultivos de sangre completa tienen la

ventaja de que, al conservar los componentes del plasma, reflejan más

fielmente la situación in vivo. Esto se debe a que los eritrocitos y demás

componentes del plasma tienen un papel muy importante en la activación


43

metabólica de los promutágenos (Elhajouji y col. 1994, Surrallés y cols., 1995

a) y también en la degradación de potenciales agentes genotóxicos (Stocker y

Ames, 1987).

El uso de linfocitos humanos de sangre periférica permite hacer una evaluación

citogenética empleando células de larga duración que están circulando

constantemente por todo el cuerpo y que, en consecuencia, están en contacto

con los diversos xenobióticos y sus metabolitos. Por otro lado, los linfocitos son

fáciles de obtener y sólo se requiere una pequeña cantidad de sangre para

poder realizar el ensayo. Como la mayoría de los linfocitos están en estado no

proliferativo (G0), deben ser estimulados para que, al dividirse puedan formar

los MN. Durante el cultivo en presencia de fitohemaglutinina (PHA), un extracto

de porotos Phaseolus vulgaris, estimula eficazmente los linfocitos, logrando que

las células reingresen en el ciclo celular (G1, S, G2 y Mitosis) y se dividan. Por

otro lado, la cinética del crecimiento de los linfocitos humanos en cultivo está

bien conocida, lo que es importante tanto para la aplicación de la técnica como

para el análisis de los resultados.

Es conveniente que el ensayo de micronúcleos se aplique a células que han

experimentado sólo una división celular después de la exposición al agente

genotóxico ya que, los MN se pueden perder en divisiones sucesivas, lo que

conducirá a subestimar el daño genético inducido (Evans, 1988). Para facilitar

la evaluación, se utiliza un bloqueador de la citocinesis para obtener células

binucleadas (con una división) y detectar también células mononucleadas y

polinucleadas, las cuales no se incluyen en la evaluación debido a que, si no se

han dividido y son células dañadas no han tenido la oportunidad de expresar

daño, y si se han dividido más de una vez, pueden haber perdido material

genético sin que lo podamos detectar. En ambos casos se puede subestimar la

evaluación del daño.


44

El uso de la citocalasina B (cyt-B) fue propuesto por Fenech y Morley (1985)

ensamblaje de los microfilamentos de actina e impide la citocinesis sin afectar

la mitosis. Como resultado de la división celular en presencia de cyt-B, se

obtiene una célula binucleada, la cual será evaluada para detectar la presencia

de MN. En la figura 3 se presenta un esquema gráfico del ensayo de MN

usando cyt-B.

El ensayo de MN usando cyt-B detecta tanto la acción de los agentes

clastógenos como aneugénicos. Sin embargo, parece que puede existir cierta

interacción entre los agentes aneugénicos y la cyt- B, debido a que los MN

inducidos por agentes aneugénicos podrían verse alterados por la acción que la

cyt-B ejerce sobre los microfilamentos de actina (Antoccia y col., 1993). En tal

caso, la distancia entre los polos de la célula se acorta (Norppa y col. ,1993);

Falck y col.1997), favoreciendo que los cromosomas aislados queden dentro de

alguno de los núcleos hijos. Se debe tener en cuenta, pues, que al evaluar

agentes aneugénicos en presencia de cyt-B, se podría subestimar la frecuencia

de MN, dar resultados contradictorios o poco reproducibles.

Figura 3. Formación de micronúcleos debido a la pérdida de un cromosoma entero y fragmentos cromosómicos de tipo acéntrico en anafase mitótica. El esquema muestra el bloqueo de la Cyt-B y la consecuente obtención de células binucleadas.


45

En el presente trabajo se estudió la exposición a plaguicidas utilizando el

ensayo de micronúcleos en células binucleadas como biomarcador de efecto; a

continuación se detalla cómo se originan, su significado biológico y el uso de

linfocitos de sangre periférica donde se analizó su frecuencia.

2.11.3.2. Intercambios entre cromátides hermanas (ICH).

Cuando las células son cultivadas en presencia de bromodeoxiuridina (análogo

de la timina), que se incorpora de forma semiconservativa, se forman hebras

mixtas de DNA en el primer ciclo. Tras el segundo ciclo en presencia de BrdU

las dos cromátides estarán formadas: una por Timina-BrdU y la otra por BrdU-

BrdU. La visualización mediante colorantes fluorescentes como Hoechst 33258

más Giemsa, permite revelar las cromátides mono y bisustituidas con BrdU en

el segundo ciclo.

Esta prueba mide indirectamente los daños primarios (Sandverg y col., 1982),

Se considera que los intercambios entre cromátides hermanas (Sister

Chromatid Exchange, SCE) se forman como subproducto de la actividad

reparadora o sobre todo por errores en la replicación debido a alteraciones de

algunos nucleótidos del DNA. El aumento del daño primario se reporta como el

incremento en el número de ICH; la magnitud de respuesta es proporcional al

daño (Wolf y col., 1974)

El análisis de la frecuencia de ICH es una metodología citogenética bastante

sensible en estudios genotóxicos. La proporción entre la inducción de ICH y de

mutación o aberración cromosómica es diferente para los agentes químicos

probados. Los agentes probados muestran diferentes eficiencias de inducción y

cada tipo de lesión formada parece ser procesada diferentemente por la célula,

resultando en un tipo específico de daño.


46

2.11.4. Biomarcadores de susceptibilidad.

Se sabe que la respuesta tóxica puede variar de un organismo a otro, aunque

los individuos sean de la misma especie, etnia o sexo. Aunque las respuestas

de organismos de diferentes especies pueden ser similares a dosis similares,

esto no ocurre necesariamente. La toxicidad de una sustancia en el organismo

receptor está influenciada por factores genéticos (especie, cepa, sexo, individuo,

etc.) y fisiológicos (embarazo, edad, dieta, estado nutricional, estado hormonal,

estado de salud, etc.).

Los biomarcadores de susceptibilidad identifican aquellas diferencias

interindividuales que hacen que un individuo sea más susceptible o responda

de manera diferente, con un mayor riesgo para la salud, frente a diferentes

exposiciones ambientales. La capacidad de reparación del daño genético

también está determinada genéticamente y aquellos individuos deficientes en

los mecanismos de reparación sufrirán mayores niveles de daño genético

irreversible, incluso frente a exposiciones de baja intensidad. Otros

indicadores de susceptibilidad que deber ser considerados son las diferencias

inmunológicas (Richeldi y col., 1993) y factores nutricionales, tales como las

deficiencias en folato (Branda y col., 1991) o vitamina C (Aidoo y col., 1994),

que pueden incidir en la existencia de mayor daño genético.

Se ha demostrado que distintos genes polimórficos como los que codifican para

el citocromo P450, las glutatión S transferasas (GST) y los genes PON son

algunos de los responsables del metabolismo de los plaguicidas (Sultatos,

1992, 1994; Furlong y col., 2000). De los loci que codifican estas enzimas

metabolizadoras existen múltiples alelos, lo que supone una susceptibilidad

individual delante de una exposición a un compuesto. El estudio de Au y col.,

(1999), sugiere que los agricultores que presentan el alelo favorable (menor

metabolización) o nulo, presentan más efectos biológicos adversos.


47

Las enzimas conocidas como citocromo P450 son una familia multigénica,

formada por diversas monooxigenasas monoméricas que catalizan el

metabolismo oxidativo de la mayoría de los compuestos químicos endógenos

(esteroides, ácidos grasos, etc.) y xenobióticos (tóxicos, fármacos, etc.).

Participan en la fase I del metabolismo, normalmente haciendo más hidrofílicos

a los sustratos y facilitando su excreción. Así, por ejemplo, éstas se han

relacionado con la decodificación de organofosforados (Eaton, 2000; Tang y

col., 2001); aunque algunas veces, dependiendo de su isoforma, pueden actuar

de activadores de procarcinógenos, transformando los compuestos en

electrofónicos y altamente reactivos con el DNA (Tang y col., 2001).

Las glutatión S transferasas, son otro grupo de enzimas polimórficas, que

intervienen en la detoxificación de los metabolitos electrofílicos originados en la

fase I del metabolismo, glutatión reducido (GSH) a la molécula, minimizando su

potencial tóxico (Smith y col., 1995). Las enzimas más estudiadas de esta

familia son la GSTM1 y la GSTT1. Ambas presentan variantes genotípicas

nulas que determinan la ausencia total de la enzima. Por otra parte Hayes y

Pulford (1995) sugirieron que la deficiencia en una isoenzima GST se podrían

compensar con otras isoformas y rutas metabólicas alternativas. Esto podría

ser la respuesta a numerosos resultados conflictivos sobre la asociación de los

polimorfismos de las GST s y la predisposición al cáncer (Hirvonen, 1997).

Los genotipos nulos GSTM1 y GSTT1 se han asociado con incrementos en la

frecuencia de algunos cánceres (Rebbeck, 1997; Toruner y col., 2001; Kerb y

col., 2002; Zheng y col., 2001), con un mayor incremento de daño citogenético

(Šram, 1998; Au y col., 1999) y con una acción genotóxica in vitro de algunos

compuestos (Norppa y col.,1995; Ollikainen y col., 1998) y, aunque existe

mucha controversia al respecto, es útil utilizarlos como biomarcadores de

predisposición, de ser posible junto con otros biomarcadores de susceptibilidad

metabólica, ya que las posibles interacciones pueden aportar mayor

información y reflejar mejor la realidad.


48

La susceptibilidad individual frente a los compuestos xenobióticos, en este caso

los plaguicidas, está determinada por la existencia de los polimorfismos

genéticos involucrados en su metabolismo. Esto supone diferentes capacidades

enzimáticas en diversas rutas metabólicas y, por lo tanto, explica que las

personas reaccionen de manera diferente, en iguales condiciones, frente a una

misma exposición. En este estudio se analizaron dos genes polimórficos que

codifican las GSTs, que se han postulado que participan en el metabolismo de

los plaguicidas (Scarpato y col., 1996; Coles, 1990; Eaton, 2000; Canalle y col.,

2004).

2.11.4.1. Las glutatión S- transferasas (GST).

Las glutatión S tansferasas (GST) constituyen una familia de proteínas

diméricas multifuncionales que catalizan la conjugación entre los glutationes

reducidos (GSH) electrofónicos y neutrofílicos. Su función primaria es la de

detoxificar los compuestos electrofílicos capaces de unirse al DNA, típica

reacción metabólica de fase II (Pickett y Lu, 1989). Las GSTs también catalizan

una serie de reacciones que implican al GSH, incluyendo la reducción del

hidroperóxido orgánico (Mannervik, 1985), las cuales juegan un papel

importante en la protección de los tejidos frente al estrés oxidativo.

Las enzimas GST se dividen en proteínas solubles y proteínas de membrana;

entre ellas, no hay ninguna relación estructural. La mayoría de estudios se

centran en las GST solubles ya que se sabe que presentan variantes alélicas

con consecuencias funcionales. Para su estudio, se han clasificado en nueve

clases agrupadas en cinco familias, α (GSTA), µ (GSTM), π (GSTP), θ (GSTT) y Ω

(GSTO) (Rushmore y Pickett, 1993; Mannervick, 2003). En la tabla 1 se

presentan de forma ordenada los diferentes polimorfismos genéticos conocidos

de las GSTs, entre los que se detalla la información de los polimorfismos

estudiados en esta tesis.


49

Todas las GSTs solubles están formadas por dos subunidades de la misma

clase, que pueden ser iguales o diferentes. Todas las GSTs tienen diferentes

perfiles de afinidad por los substratos y, aunque existe un pequeño

solapamiento entre ellos, cada una de estas subunidades es importante al

definir la capacidad de detoxificar en el tejido diana, es por ello que la

presencia o ausencia de una GST en particular o la modificación de su

eficiencia catalítica es significativa (Mannevick, 2003). A continuación se

analizan en mayor detalle los polimorfismos que se han estudiado en este

trabajo, correspondiente a las clases GSTM1 y GSTT1.

Tabla 6. Polimorfismos genéticos de las glutatión S- transferasas (GSTs)

Familia Clase Polimorfismos conocidos

Mutación

GSTM1

GSTM2

GSTM3

GSTT1

GSTT2

GSTP1

GSTO1

GSTO2

GSTO3

GSTM1*A

GSTM1*B

GSTM1

GSTT1*0

GSTP1*A

GSTP1*B

Por clasificar

Por clasificar

Por clasificar

Alelo salvaje

Situación de base C534G

Cambio de AA Lis 172 Asp

Deleción del gen

Deleción del gen

Alelo salvaje

Transición A118G en exón 5’

Cambio de aminoácido Ile105/val

(Cambio *B)+

Transición C341T C

Cambio de aminoácido

Ala 114/val


50

En la familia GSTµ se distinguen tres clases, M1,M2 y M3. La más estudiada es

la clase GSTM1, debido a que entre sus polimorfismos existe la completa

deleción del gen, lo que provoca la ausencia total de la enzima. El gen que

codifica para la GSTM1 se encuentra en el cromosoma 1 (1p13.3). Existen tres

variantes del gen GSTM1, la GSTM1* A es el alelo salvaje, la GSTM1*B. difiere

de la *A sólo en una base del exón 7 que codifica monómeros que puedan

generar enzimas homodiméricas y heterodiméricas de efectividad catalítica

muy similar in vitro (Mannervik y col., 1992; Hayes y Pluford, 1995), en este

caso ocurre la sustitución de base C534G, que conlleva un cambio de

aminoácido Lis172Asp. Finalmente la GSTM1*O es la deleción total del gen lo

que provoca una ausencia de la actividad enzimática (Smith y col. 1995;

Tsuchida, 1997; Taningher y col. 1999).

Las deleciones de GSTM1, tanto en homocigosis como en heterocigosis, se han

asociado con un aumento de susceptibilidad al cáncer debido a una

detoxificación deficiente. El genotipo homocigoto para el alelo nulo de GSTM1

(-/-), se denomina genotipo nulo GSTM1. La frecuencia de individuos con

genotipo nulo es de aproximadamente 50% en la población caucásica

(Seidegard y col., 1988) y varía entre 30% y el 90% en diferentes grupos étnicos

(Lin y col., 1994; Rebbeck 1997). El impacto de la deleción de este gen en la

salud humana puede ser muy importante debido a la frecuencia con que se

presenta en las distintas poblaciones.

En la familia GSTθ existen dos clases descritas, la GSTT1 y la GSTT2. Ambas

clases comparten el 55% de la secuencia de aminoácidos y sus estructuras son

similares, aunque presentan diferentes afinidades por los sustratos. La clase

polimórfica es la GSTT1, razón por la cual es más estudiada, se encuentra

localizada en el cromosoma 22 (22q11.23). Los individuos homocigotos para el

alelo nulo presentan la ausencia total de la función de la proteína (Smith y col.,

1995; Tsuchida 1997 y Taningher y col. 1999). En un estudio realizado por

Garte y col. (2001), se analizaron todos los datos publicados sobre enzimas del


51

metabolismo determinándose las frecuencias alélicas de las diferentes

variantes, y en diferentes poblaciones ya que estos valores pueden variar en

función de la etnia (Chen y col., 1996). En él se concluyó que la frecuencia de

los homocigotos para el alelo GSTT1*O (deleción completa del gen) era de 19.7

en la población caucásica y de 47, 0 en la población asiática (Garte y col.,

2001).

La GSTM1 y la GSTT1 detoxifican tanto los productos de muchas reacciones

catalizadas por el citocromo, como los lípidos y peróxidos resultantes del estrés

oxidativo (Mannevik y Danielson 1988; Picket y Lu 1989; Ketterer y col., 1992;

Berhane y col., 1997), lo que sugiere una acción coordinada. Tanto la actividad

GSTM1 como GSTT1 pueden verse completamente suprimidas en algunos

individuos debido a que pueden presentar la deleción completa del gen en

ambos casos ( M1- y T1-) (Seidegard y col., 1988; Pemble y col. 1994).

Los individuos con genotipo nulo para GSTT1 como para GSTM1 son

particularmente sensibles a los cancerígenos químicos. Chen y colaboradores

(1996) estudiaron poblaciones caucásicas y afroamericanas determinando que

la prevalencia del genotipo nulo para GSTM1 era mayor en los caucásicos

(53,5% Vs. 27,6%), mientras que la del genotipo nulo para GSTT1 era mayor en

los afroamericanos (24,1% vs. 15,0%). Sin embargo, no se encontraron

diferencias étnicas para el doble genotipo nulo. Otros estudios realizados en el

mismo año (Abdel-Rahman y col., 1996) encontraron resultados similares en

poblaciones estadounidenses y egipcias, en donde la prevalencia del genotipo

nulo para GSTM1 fue de 51% y 44%, para GSTT1 fue de 15% y 14,7%, y para

el doble genotipo nulo fue de 6,3% y 8,8%, respectivamente.


52

Tabla 7. Frecuencia del polimorfismo de la GSTM1en diferentes Poblaciones. Población n GSTM1 Nulo (%) GSTM1 positivo (%) Referencia

Caucásicos

Chilenos

Japoneses

Chinos

164

58

452

244

55.5

43

53

50

44.5

57

47

50

Bailey y cols., 1998

Quiñones y col.,1999

Kihara y col.,1995

Lan y col., 2000

2.11.5. La importancia de la prevención en oncología Las terapias sólo tienen una modesta efectividad en la reducción de las tasas

de mortalidad debidas al cáncer. Entre los hombres europeos, sólo cuatro tipos

relativamente infrecuentes (testículos, laringe, pene y enfermedad de

Hodgkin´s) presentan unas tasas de supervivencia que exceden el 50%. En

mujeres la situación es mejor, ocho tipos (mama, cervix, cuerpo uterino,

laringe, cavidad oral, vagina, enfermedad de Hodgkin´s y leucemia linfoide

crónica) tienen unas tasas de supervivencia por encima de este nivel (Berrino y

col., 1995).

En Europa, las cifras de incidencia ajustadas a la edad se incrementaron en un

8,7% entre 1970 y 1990 en hombres y decrecieron en este periodo un 1,4 % en

mujeres. La prevención es claramente la mejor estrategia para reducir la

mortalidad. En los países industrializados se ha estimado en un 50% el

número de casos de cáncer que podrían prevenirse (Tomatis 1997).

Existe un amplio consenso en cuanto a que la mayoría de los cánceres son el

resultado de la exposición a agentes producidos por la gente y a exposiciones

ambientales (humo del tabaco, contaminantes químicos en el aire, agua,


53

alimentos, drogas; radiaciones; componentes dietarios, radón y agentes

infecciosos). El riesgo frente a estos carcinógenos está condicionado por

factores: genéticos, edad, sexo, estado inmunitario, enfermedades preexistentes

y nutrición.

2.11.6. La Epidemiología Molecular al servicio de la valoración del riesgo

personal en Medicina Preventiva.

El conocimiento de las interacciones entre los agentes presentes en el medio

ambiente y el hombre se ha ido adquiriendo sobre todo en la última década

gracias a la Epidemiología Molecular mediante el análisis de biomarcadores de

exposición y daño presentes en células, tejido y fluidos corporales. Ejemplos de

estos biomarcadores son: A.-Los aductos, productos que se forman como

consecuencia de la unión covalente al ADN de las moléculas reactivas

(carcinógenos o especies reactivas). B.-Los cambios en genes claves (oncogenes

o genes supresores) que actúan disparando o bloqueando procesos básicos de

la fisiología celular como la división, diferenciación, apoptosis o los que se

heredan en genes que afectan la metabolización de carcinógenos o reparación

del ADN.

La epidemiología molecular tiene la ventaja de ser directamente relevante

para evaluar el riesgo humano, a diferencia de otros modelos experimentales en

animales que requieren la extrapolación a humanos. En contraste con la

epidemiología tradicional que centra su atención en la incidencia y mortalidad

como punto final, la epidemiología molecular tiene el potencial de

constituir una llamada de aviso o advertencia. Señala los efectos preclínicos

de la exposición y de una susceptibilidad aumentada. Proporciona una gran

oportunidad para advertir del peligro a tiempo de poder intervenir en el curso

de la enfermedad.


54

Una clase especial de interacción entre la exposición a agentes externos y

factores del hospedador, está representada por las interacciones entre genes y

ambiente, incluidos los polimorfismos metabólicos. Cuando hablamos de

polimorfismos metabólicos nos referimos a las variaciones en la secuencia de

ADN de los genes que codifican enzimas de metabolización. Estas variaciones

en la secuencia originan proteínas con actividades variables que dan lugar a

diferentes capacidades en la metabolización por parte de subgrupos de

población o por individuos aislados.

Desgraciadamente, los métodos actuales de evaluación de los riesgos

ambientales no tienen en cuenta estos factores. Aunque las agencias estatales

como la EPA suelen utilizar criterios conservadores de valoración del riesgo (en

función de los niveles de exposición), estos criterios subestiman el riesgo frente

a ciertos carcinógenos ambientales al considerar que todos los individuos en

una población tienen la misma respuesta biológica a dosis específicas de

agentes causales.

Actualmente se ha cuestionado y demostrado científicamente la no

homogeneidad de la población. Extrapolando la variación observada en el

hombre en algunos índices de susceptibilidad (metabolismo de carcinógenos y

daño genético) a una exposición dada, una persona puede ser de 10 a varios

cientos de veces más susceptible al cáncer que otra. Esta información tiene

obvias implicaciones para el asesoramiento del riesgo frente al cáncer.

2.11.7. Los sistemas de defensa química.

Son los grandes desconocidos en medicina a diferencia del sistema

inmunitario. Para cumplir esta misión el hombre y la mayoría de los seres vivos

disponemos del sistema del Citocromo P450 cuya misión es actuar sobre

sustancias químicas exógenas, convirtiéndolas en formas solubles, fácilmente

excretables, evitando que se acumulen en los organismos alcanzando


55

concentraciones letales o tóxicas. En el curso de la evolución ha sido necesario

que las especies desarrollaran unos sistemas de defensa química que les

permitiese adaptarse y sobrevivir al hábitat diferente y con disponibilidades

dietarias muy diversas. Por ello en estas familias de genes de metabolización de

xenobióticos hay una gran variabilidad interindividual e interespecies en sus

estructuras y funciones

Dado que muchos carcinógenos son sustratos de enzimas de metabolización

podemos asumir que los humanos tenemos una capacidad variable para

activar o inactivar carcinógenos. Muchos de los genes hoy conocidos son

polimórficos y existen numerosas variantes alélicas relevantes para el fenotipo

en la población. Podemos señalar que los polimorfismos en las enzimas de

metabolización son casi la regla más que la excepción y constituyen un factor

decisivo en la supervivencia de las especies.

Numerosos estudios han demostrado que la variabilidad en el metabolismo de

carcinógenos es un factor de riesgo en la carcinogénesis química. Los

miembros más importantes de estos sistemas son además del citocromo P450,

la familia de las Glutatión S-transferasas y la N-acetil transferasa, entre otros.

A medida que los avances tecnológicos están facilitando su estudio y análisis,

va siendo mayor el número de circunstancias y patologías en los que son

relevantes.

Así por ejemplo se conoce su importancia en mujeres embarazadas fumadoras,

por sus repercusiones sobre el bajo peso al nacer, ciertas malformaciones y

tumores infantiles. También se ha descrito su importancia en patologías

cardiovasculares, colitis ulcerosa, glaucoma, etc.

2.11.8. Polimorfismos de susceptibilidad metabólica en oncología La incorporación del análisis genético de polimorfismos metabólicos en la


56

epidemiología del cáncer es de particular interés porque:

A.-Permite la identificación de subpoblaciónes de sujetos que son más

susceptibles al cáncer inducido por agentes químicos

B.-El análisis de los polimorfismos es importante con relación a bajos niveles

de exposición. Este conocimiento condiciona por una parte el proceso de

evaluación del riesgo, y por otra el establecimiento de unos límites tolerables de

exposición (que tenga en cuenta la sensibilidad individual) y por tanto el

establecimiento de unas pautas de seguimiento y diagnóstico diferenciadas en

función de los genotipos de riesgo.

La susceptibilidad genética podemos considerarla como un espectro que abarca

un rango intermedio de situaciones entre dos extremos. En uno, tenemos las

enfermedades monogénicas de elevada penetrancia (Ej. mutaciones heredadas

en los genes APC o BRCA1, en los cánceres hereditarios de colon o mama y

ovario). En estos casos los riesgos acumulados a lo largo de la vida entre los

portadores de mutaciones es muy alto (50-90%), sin embargo tales mutaciones,

son raras en la población general, por lo que sólo una pequeña fracción de los

cánceres en cuestión puede ser atribuida a caracteres heredados.

El otro extremo está representado por los polimorfismos metabólicos: en este

caso, nos encontramos con mutaciones muy frecuentes (del orden del 40-50%

de la población, como es el caso de los alelos acetiladores lentos de NAT-2 y el

GSTM1nulo en la raza caucásica), con un incremento leve del riesgo. El riesgo

individual se incrementa en una pequeña fracción pero el número de cánceres

atribuibles a estas características genéticas es alto.

Estos conceptos podemos aplicarlos a otras patologías tanto crónicas

(cardiovasculares, neurodegenerativas e inflamatorias) como en agudas

(toxicidad ocupacional o ambiental).


57

Conocemos algunos polimorfismos que están asociados con el cáncer pero no

con el metabolismo de sustancias carcinogénicas endógenas o exógenas por

ejemplo el complejo de múltiple resistencia a drogas (Md complejo), gen del

factor de necrosis tumoral beta (TNF-beta), el receptor de la vitamina D o genes

implicados en los mecanismos de reparación del ADN. (Brüske-Hohfeld, 2000).


58

3. JUSTIFICACIÓN.

Actualmente existen numerosos organismos internacionales dedicados a la

prospección de agentes genotóxicos y estimación de su consiguiente riesgo

poblacional, especialmente la "International Agency for research on Cancer

(IARC)" de la Organización Mundial de la Salud, la "International Commission

for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens (ICPEMC)" y

la "U.S. Environmental Protection Agency (EPA). La base de datos de estos

organismos, y la literatura mundial sobre el tema son extraordinariamente

densas.

La adecuación de la problemática genotóxica de nuestro país al estado actual

de la ciencia a nivel mundial debe ser una dimensión urgente en las políticas

científicas bolivianas, a la vez que se puedan comenzar a realizar aportes desde

nuestro país, que se centren en aquellos problemas que más nos atañan. En

este sentido, existen una serie de sustancias en nuestro medio ambiente de

especial incidencia poblacional.

Los plaguicidas son uno de los químicos tóxicos más frecuentemente

encontrados en el ambiente. Aunque el uso de pesticidas refuerza la

productividad de la cosecha, los humanos también pagan un precio por los

beneficios. Alrededor del mundo, aproximadamente 3 millones de

envenenamientos agudos y 220.000 muertes por la exposición a pesticidas se

ha informado anualmente. Además, granjeros con exposición prolongada a

bajas dosis de pesticidas eventualmente desarrollarán en el futuro efectos a la

salud similares a aquellos que han recibido exposiciones agudas con altas

dosis, por ejemplo, las anormalidades del comportamiento neuronal, resultados

reproductivos adversos, y aumento de la incidencia de cáncer (por ejemplo

leucemia, linfoma no Hodking, y mieloma múltiple. Por consiguiente la

exposición crónica a plaguicidas puede causar serios efectos a la salud de los

agricultores expuestos que no tengan historia de envenenamiento agudo.


59

En vista de que en nuestro país los agricultores que están expuestos a los

plaguicidas, sufren una exposición crónica constante y además realizan un

manejo inadecuado de los mismos (sin normas de seguridad) constituyen un

grupo de riesgo, por tanto se ve la necesidad de realizar estudios para

determinar los genotipos de las isoenzimas de biotransformación de

plaguicidas y su relación con la magnitud de daño al material genético como

modificadores de riesgo de futuras enfermedades como el cáncer con el

propósito de contribuir a las políticas de prevención del sector salud.

3.1. Pregunta de investigación. ¿Serán modificadores de riesgo los polimorfismos de las isoenzimas GST en

relación a la frecuencia de los biomarcadores de efecto en agricultores

expuestos a plaguicidas?

3.2. Hipótesis.

Los genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y de la GSTT1 afectan a las

frecuencias de parámetros de genotoxicidad (MN e ICH) en individuos

expuestos a mezclas de estos contaminantes, junto a la magnitud de

exposición a plaguicidas.


60

4. OBJETIVOS.

4.1. OBJETIVO GENERAL.

Evaluar la influencia de los polimorfismos genéticos del gen de la glutatión S-

transferasa, GSTM1 y GSTT1 como modificadores de riesgo mutagénico en

trabajadores agrícolas expuestos a plaguicidas.

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

1. Establecer el posible efecto genotóxico de los plaguicidas mediante las

técnicas de micronúcleos (MN) y de intercambios entre cromátides

hermanas (ICH) en linfocitos de sangre periférica.

2. Identificar el efecto citotóxico de los plaguicidas mediante la determinación

del Indice de duplicación nuclear (IDN).

3. Determinar los valores de colinesterasa sérica como biomarcador de

exposición.

4. Determinar el genotipo a través de las isoformas de las enzimas GSTs

(GSTM1 y GSTT1).

5. Establecer la variabilidad genética de los genotipos GST como modificadores

de riesgo mutagénico por exposición a plaguicidas.

6. Establecer la asociación de los polimorfismos con el riesgo mutagénico y

genotóxico.

7. Determinar la existencia de factores modificadores de efecto, confundentes o

protectores.


61

5. MATERIAL Y MÉTODOS.

5.1. DISEÑO DEL ESTUDIO.

Se realizó un estudio de casos y controles anidado en un estudio de corte

transversal.

5.2 POBLACION ESTUDIADA.

Las muestras y los datos para el estudio se recogieron de 4 municipios del

departamento de La Paz, Bolivia (mapas en anexo 3), en estas regiones es

conocida la importancia del uso de plaguicidas en la agricultura debido a la

producción de cosechas tales como vegetales, flores y tomates para la venta en

la ciudad de La Paz y para la exportación al país vecino, Perú. Los dos

municipios cerca del la ciudad de La Paz, Palca y Mecapaca, tienen un clima

templado debido a su localización de 2,500 a 3,500m sobre nivel del mar. Los

otros dos municipios Caranavi y Guanay tienen un clima subtropical, y se

sitúan en la región de los Yungas a una altitud de 500 a 2,000m sobre nivel del

mar, forman un puente de valles de la meseta central de Bolivia ' el Altiplano '

4,000m sobre el nivel del mar.

La población analizada en este estudio ha sido de 142 personas, divididas en

dos grupos de expuestos y controles, que se diferencian en su exposición a

plaguicidas. Así mismo se clasificó en dos grupos: casos (personas expuestas o

no expuestas con daño genotóxico) y controles (personas expuestas o no

expuestas sin daño genotóxico).

5.2.1. Grupo expuesto.

Los individuos expuestos son agricultores residentes de las comunidades de

Caranavi, Guanay, Mecapaca y Palca. Este grupo está formado por un total de


62

99 personas, de las cuales 76.9 % son hombres y 42.7% mujeres. La edad

media del grupo expuesto es de 37años.

5.2.2. Grupo control.

El grupo control consta de 43 personas no expuestas a plaguicidas, residentes

de las mismas comunidades Caranavi, Guanay, Mecapaca y Palca. Este grupo

está compuesto de 23,1% hombres y 52,8% mujeres, con una edad promedio

de 34 años.

5.2.3. Grupo caso.

El grupo caso consta de aquellas personas expuestas o no a plaguicidas que

presentaron daño genotóxico en por lo menos una prueba de la batería de

ensayos empleados.

5.2.4. Grupo control.

Los controles fueron definidos como aquellas personas expuestas o no a

plaguicidas que no presentaron daño genotóxico con ninguna de las pruebas

empleadas.

5.3. OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS Y APLICACIÓN DE LA

ENCUESTA.

Las personas que aceptaron participar en el estudio fueron informadas

adecuadamente de los objetivos y metodología del mismo y consultadas acerca

de su interés y libre voluntad en colaborar, antes de obtener su consentimiento

por escrito.

5.3.1. Elaboración de la encuesta.

Para obtener la información, tanto individual como general, de las personas

incluidas en el estudio, se realizó una encuesta diseñada con la finalidad de

obtener información detallada acerca de los antecedentes y características

personales de cada participante. En líneas generales la encuesta recoge


63

información que incluye: datos personales, actividades laboral actual y previa,

otras actividades (chaqueo), dieta, estilo de vida (consumo de tabaco, de

alcohol, té, café, mate de coca), exposición a agentes físicos y químicos y

antecedentes familiares y de salud. En el anexo 4 se presenta una copia de la

encuesta.

5.3.2. Evaluación de la información de la encuesta.

Las encuestas fueron codificadas juntamente con las muestras, luego se

introdujo la información en una base de datos y posteriormente se procedió al

análisis.

5.3.3. Determinación de la actividad colinesterasa.

La actividad de colinesterasa en suero fue medida en el laboratorio del INSO

por un método espectrofotométrico, cuyo fundamento se basa en que la

colinesterasa se utiliza en el primer paso de la reducción del potasio

hexacianoferrato produciéndose un cambio en el color que se puede medir con

una variación debajo de 2,3% dentro del mismo sistema de análisis. Las

medidas se dan en KU/L (kilounidades por litro). La variación individual

normal es demasiado amplia, los resultados pueden ser utilizados solamente

de manera individual en el análisis de sangre de la persona cuando no ha

estado en contacto con los organofosforados por meses. Pero para un nivel

grupal la actividad de colinesterasa en suero se puede comparar entre los

diversos grupos, si se asume que los individuos se distribuyen uniformemente

dentro de los mismos. Sabemos que la actividad de colinesterasa puede ser

influenciada por el peso, sexo, edad, enfermedades hepáticas, alcoholismo y

uso de píldoras anticonceptivas.

5.3.4. Evaluación de daño genotóxico.

5.3.4.1. Obtención y preparación de las muestras.

Las muestras de sangre se obtuvieron mediante punción venosa usando tubos

vacutainer con Heparina como anticoagulante (Becton Dickinson Lakes. NJ)


64

previamente identificados con el código de los donantes; los tubos se

transportaron al Instituto de Genética en el transcurso de 24 horas y se realizó

los cultivos y preparaciones de acuerdo a protocolo estandarizado que se

detalla a continuación.

5.3.5. Ensayo de MN en linfocitos de sangre periférica.

5.3.5.1. Protocolo.

Después de homogenizar la muestra, se agregaron 0,5 mL de sangre total a 4,5

mL de medio de cultivo RPMI 1640, suplementado con 10% de suero bovino

fetal, 1% de una solución de antibiótico antimicótico (SIGMA), los linfocitos se

estimularon con 1% de fitohemaglutinina (PHA) Gibco. Los cultivos se

incubaron a 37º C durante 72 h, lo que corresponde a dos ciclos celulares.

Pasadas las 44 h de cultivo se agregó citocalasina B (Sigma) a una

concentración final de 6µg/mL. Se ha demostrado que esta concentración

permite detener la citocinesis de forma óptima, obteniendo mejores valores del

índice de división celular y una mejor estima de la frecuencia de MN, al evitarse

la sobrevaloración ya que se puede diferenciar con mayor precisión las células

correspondientes a la segunda división mitótica (Surrallés y col. 1994). Pasadas

las 72 horas de incubación, los cultivos se centrifugaron a 800 r.p.m durante 8

min. Después de aspirar el sobrenadante, las células fueron sometidas a

choque hipotónico mediante una solución de KCl 0,075 M a 37º C, agitando

enérgicamente en el vórtex; de esta manera se eliminan los hematíes

preservando el citoplasma de los leucocitos, luego se incubó a 37º C durante 5

min. Después de centrifugar nuevamente los tubos en las mismas condiciones

y eliminar el sobrenadante, se procedió a la fijación de células con una

solución de metanol y ácido acético fría en proporción de 5:1 (vol/vol), recién

preparada, agregándola suavemente para evitar precipitados celulares. Se

centrifugó nuevamente para eliminar el sobrenadante, repitiendo el proceso

dos veces o más hasta que el botón celular quedó suficientemente limpio.


65

El botón celular se resuspendió en una pequeña proporción de la solución de

fijación y se goteó sobre portaobjetos limpios y fríos. Las preparaciones se

dejaron secar a temperatura ambiente para luego ser teñidas con una solución

de Giemsa al 6% (Merck) en tampón Sörensen (pH 6.8) durante 12 minutos.

Una vez teñidas, las placas fueron examinadas para determinar la frecuencia

de MN. Los portaobjetos de todos los individuos, tanto expuestos como

controles, se codificaron en ciego por una tercera persona antes de su análisis

para evitar al máximo la subjetividad en el recuento. En la figura 4 se

presentan dos imágenes en las que se puede observar con claridad, linfocitos

binucleados con MN.

De cada individuo se analizaron 1000 células binucleadas con el citoplasma

bien conservado. La observación de los núcleos se realizó con microscopio

óptico (Leitz Laborlux D, Alemania) con el objetivo de 1000 aumentos.

a b

Figuras 4 a y b. Linfocitos binucleados con un MN Fuente: elaboración propia

También se procedió a determinar el parámetro conocido como índice de

división nuclear con bloqueo de la citocinesis (IDN), para detectar efectos de

citotoxicidad. El IDN o CBPI (cytokinesis block proliferation index) se calculó

mediante la siguiente fórmula:


66

IDN = [M1 + 2M2 + 3(M3+M4)]/N

Donde M1 a M4 representan el número de células con uno a cuatro núcleos

respectivamente, y N es el número total de células contadas. Las células con

tres y cuatro núcleos se han considerado equivalentes y correspondientes a la

tercera división mitótica (Surrallés y col., 1995).

5.3.6. Intercambio entre cromátides hermanas (ICH).

5.3.6.1 Protocolo. Los linfocitos fueron incubados en medio RPMI-1640 (Sigma), suplementado

con 1.5% penicilina-estreptomicina (5000 IU/ml–5000 g/ml, respectivamente y

1% l-glutamina (Sigma), 5’-bromo-deoxyuridine (BrdU) (Sigma) (20 uM) y

Phytohaemagglutinine (PHA) 2,5 mg/ml, en la oscuridad por 72 h en estufa a

37ºC y las metafases fueron bloqueadas durante las 2 últimas horas con

colchicina. Los ICH fueron preparados de acuerdo a protocolos convencionales.

Las células fueron colectadas por centrifugación, resuspendidas en una

solución hipotónica precalentada a 37ºC (0.075 M KCl) por 15 min y fijadas en

una solución fría de metanol y ácido acético (3:1 v/v). El botón celular se

resuspendió en una pequeña proporción de la solución de fijación y se goteó

sobre portaobjetos limpios y fríos. Las placas de vidrio fueron secadas al aire

y teñidas con Giemsa al 6% en buffer Sörensen a pH 6.8, de acuerdo al método

propuesto por Perry y Wolf (1974). Las placas de cada cultivo fueron

randomizadas y evaluadas a doble ciego, observándose ICH/célula en 30

metafases en segunda división por cada individuo.

El índice de proliferación celular (PRI) fue calculado con la fórmula

PRI = 1M1 + 2M2 + 3M3

100

Donde M1, M2 y M3 son metafases de primera, segunda y tercera división

respectivamente.


67

El análisis del % HFC fue realizado de acuerdo a Carrano y Moore. Una célula

con alta frecuencia de intercambios (HFC) fue definida como una célula que

presenta un número mayor a 10 ICH/célula.

a b Figuras 5 a y b. Metafases con intercambios entre cromátides hermanas Fuente: Elaboración propia

5.3.7. Genotipificación de las glutatión S-tansferasas

5.3.7.1 Obtención y preparación de las muestras.

Para el análisis de los genotipos de las GSTs se obtuvieron muestras de sangre

de cada uno de los individuos que participaron en el estudio. Las muestras

fueron recogidas mediante punción venosa en tubos vacutainer con EDTA

(etilen diamino – tetra acético), previamente identificados con el código de cada

uno de los donantes. Las muestras fueron transportadas al Instituto de

Genética en un tiempo no mayor a 24 horas donde se realizó la extracción del

DNA y el análisis. La identificación de los genotipos GSTM1 y GSTT1 se hizo

simultáneamente mediante una prueba de PCR múltiple, siguiendo el protocolo

de Abdel – Rahman y col. (1996).


68

5.3.7.2 Protocolo.

Extracción de DNA:

A partir de la muestra de sangre periférica de cada individuo con

anticoagulante EDTA, se realizó la extracción con el Kit de Promega Wizard

Genomic DNA purification de acuerdo al siguiente protocolo:

- A un volumen de 300 µl de sangre se adicionó 900 µl de solución

de lisis en un tubo de microcentrífuga de 1,5ml.

- Previamente se agitó el tubo suavemente hasta mezclar la sangre,

luego se transfirió la sangre a un tubo conteniendo la solución de

lisis de células. Se invirtió el tubo 5-6 veces para mezclar.

- Se incubó la mezcla por 10 min. a temperatura ambiente

(invirtiendo 2-3 veces durante la incubación) para lisar las células

rojas. Se centrifugó a 14,000 x g durante 20 seg. a temperatura

ambiente.

- Se removió y descartó lo más que se pudo de sobrenadante sin

mezclar el precipitado blanco. Aproximadamente 50-100 µl del

líquido residual quedó en el tubo de 1,5 ml.

- Se agitó en vórtex el tubo vigorosamente hasta que las células

blancas estuvieran resuspendidas ( 10-15 segundos)

- Se añadió la solución de lisis de núcleos 300 µl al tubo

conteniendo las células resuspendidas, pipeteando la solución 5-6

veces para lisar las células blancas, la solución se tornó muy

viscosa.

- Se añadió opcionalmente la solución de RNasa 1,5 µl para lisar el

núcleo o mezclar la muestra invirtiendo el tubo 2-5 veces. Incubar

la mezcla a 37ºC por 15 min, luego enfriar a temperatura

ambiente.

- Se adicionó la solución de precipitación de proteínas 100 µl para

lisar el núcleo y se mezcló vigorosamente por 10–20 segundos. Se

hicieron visibles pequeños cúmulos de proteínas después de agitar.


69

- Se centrifugó a 14,000 x g por 3 min. A temperatura ambiente.

Para obtener un pellet café oscuro de proteínas.

- Se transfirió el sobrenadante limpio a un tubo de 1,5 ml

conteniendo 300µl de isopropanol a temperatura ambiente.

- Suavemente se mezcló la solución por inversión hasta que las

hebras blancas de DNA se hicieron visibles.

- Nuevamente se centrifugó a 14,000 x g por 1 min. A temperatura

ambiente. Hasta que el DNA se hiciera visible como una masa

blanca.

- Se decantó el sobrenadante y se añadió un volumen igual de etanol

al 70% al DNA precipitado. Suavemente se invirtió el tubo varias

veces para lavar el pellet de DNA. Se centrifugó como en el paso

anterior.

- Cuidadosamente se aspiró el etanol utilizando una pipeta pasteur

teniendo el cuidado de no remover o aspirar el pellet de DNA. Se

invirtió el tubo y se colocó sobre un papel absorbente para secar el

pellet durante 10–15 min.

- Finalmente se adicionó la solución de rehidratación 100µl al tubo

para rehidratar incubando a 65ºC por 1 hora.

- Posteriormente se almacenó los tubos conteniendo el DNA a 2-8ºC

hasta su procesamiento.

PCR Multiplex:

El PCR multiplex se realizó en un volumen final de 25 µl conteniendo 100 ng

de DNA genómico, 100 ng de cada primer, 2 mM de dNPTPs, 2.5 µl de buffer

para PCR 10X (1X: 200 mM Tris HCl, 500 mM KCl, pH 8,4), 2,0 mM de MgCl 2,

y 1.25 U de DNA taq polimerasa (Gibco - invitrogen). Los primers que se

utilizaron (GSTM1 y GSTT1) en la PCR, la secuencia de los mismos, la longitud

de los productos amplificados en pares de bases (pb) y la secuencia del control

interno (exón 7 del gen CYP1A1), se detallan en la tabla 8.


70

Tabla 8. Cebadores utilizados en la PCR múltiple para la detección de

los genotipos GST estudiados

Gen Cebador Secuencia Pb

GSTM1

GSTM1

GSTT1

GSTT1

CYP1A1

CYP1A1

Directo

Reverso

Directo

Reverso

Directo

Reverso

5’ GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3’

5’ GTTGGGCTCAAATATACGGTGG 3’

5’ TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC 3’

5’ TCACCGGATCATGGCCAGCA 3’

5’ GAACTGCCACTTCAGCTGTCT 3’

5’ CAGCTGCATTTGGAAGTGCTC 3’

480

215

312

Condiciones de la reacción: la desnaturalización inicial 95º por 5 min.

seguidos de 30 ciclos del desnaturalización seguidos de 30 ciclos de

desnaturalización a 94º por 2 min, templado del cebador a 59ºC por 1 min, y

polimerización a 72º por 1 min. Esto seguido de un paso de extensión final a

72º C por 4 min.

Los productos del PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al

2% 3:1 teñidos con bromuro de etidio (0.5µg/ml). La presencia o ausencia de

los genes de GSTM1 y GSTT1 se detectó por la presencia o ausencia de una

banda en 480 pb y una banda en 215 pb respectivamente. Una banda a 312 pb

(CYP1A1) documentó una amplificación existosa.


71

Tabla 9. Ciclos de amplificación de la PCR multiplex para GSTs

Ciclos Temperatura Tiempo

Desnaturalización inicial

Desnaturalización

Hibridación x 30

Extensión

Extensión final

95ºC

94ºC

59ºC

72ºC

72ºC

5min

2 min.

1 min.

1 min.

4 min.

M 1 2 3 4

480 bp

Figura 6. Gel representativo de los polimorfismos GSTM1 Y GSTT1 M: Marcador de peso molecular de 50 bp.; 1 muestra GSTM1 + GSTT1-; 2 muestra GSTM1 +/ GSTT1 +; 3 muestra GSTM1 - /GSTT1 + y 4: muestra.GSTM1 - /GSTT1 – Fuente: Elaboración propia

Control Interno: siempre el exón 7

del gen CYP1A1 312 bp

GSTM1: 480 bp sólo el normal

GSTT1: 215 bp sólo el normal

215 bp

312 bp


72

5.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Se realizó un análisis descriptivo e inferencial a través de un diseño de casos y

controles anidado en estudio de corte transversal. Para realizar el análisis

estadístico de los datos obtenidos en el estudio, primero se confeccionó una

base de datos completa incluyendo tanto los datos obtenidos a través de la

encuesta, como los resultados de los análisis de las muestras procesadas en el

laboratorio. La base de datos se confeccionó utilizando el paquete estadístico

SPSS versión 11.5. Para determinar la normalidad de los datos, se aplicó la

prueba no paramétrica de Kolmogórov- Smirnóv.

Para determinar la significancia estadística de los resultados, en el caso de que

la variable tuviera una distribución normal de los datos, se ha aplicado la

prueba de t de Student para la comparación de medias de dos grupos

independientes y, en caso de que los datos no presentaron una distribución

normal, se utilizó la prueba de Mann Whitney para la comparación de medias

de dos grupos independientes y Kruskal Wallis para la comparación de medias

de más de dos grupos independientes. En ambos casos el nivel de confianza

empleado fue el 95%. Para la determinación del factor de riesgo (OR) de la

presencia o ausencia de los polimorfismos en relación al daño genotóxico se

clasificó la población en dos grupos, casos y controles.


73

6. RESULTADOS.

6.1 ANALISIS DEMOGRÁFICO.

Los datos poblacionales que se presentan han sido obtenidos a partir del

análisis de las encuestas efectuadas a cada una de las personas incluidas en

el estudio. El modelo de encuesta aplicada se adjunta en Anexo 1.

Del análisis se obtuvo la descriptiva poblacional de cada uno de los grupos de

estudio, y luego se efectuó el análisis con los resultados obtenidos de los

procedimientos de parámetros de genotoxicidad y genotipificación.

La base de datos para este análisis se realizó con el programa SPSS versión

11.5.

Después de hacer el análisis de las distintas variables, se ha considerado que

los posibles factores de confusión a tener en cuenta en este estudio son los

siguientes: la edad, el sexo, consumo de mate de coca. Dado que la incidencia

de cáncer entre familiares podría se un indicador de cierta sensibilidad frente a

la exposición a agentes genotóxicos, la variable “familiar con cáncer” indica los

casos de parientes directos que hayan sufrido la enfermedad. También se han

tomado en cuenta en el estudio el hábito de fumar, el consumo de alcohol, el

consumo de hojas de coca (acullico) y el chaqueo.

6.1.2. Descripción poblacional.

En la figura 7 se representa la distribución general de la población de estudio

por localidad: Caranavi (33,8%), Guanay (12,7 %), Mecapaca (8,5%) y Palca

(41,5%).


74

34%

13%

42%

9% 2%

CARANAVI GUANAY PALCA M ECAPACA OTROS

Figura 7. Distribución de la población estudiada

De las 142 personas que participaron en el estudio, 99 (70%) fueron de

ocupación agricultores, el 30% restante fue personal de salud y educación. El

25,4% fue del sexo femenino y el 74,6% del sexo masculino; el 27% tienen

hábito tabáquico; el 41,8% consume bebidas alcohólicas. Sólo el 23% ha sido

sometido alguna vez a rayos X. El 42,1% chaquean. El 57,1 % mastica hojas de

coca y el 42,1% consume mate de coca. Un porcentaje muy bajo 4,3% tiene

antecedentes familiares de cáncer (Tabla 10)


75

Tabla 10. Análisis demográfico de la población estudiada

Variable %

Ocupación Agricultor 70

No agricultor 30

Sexo Femenino 25,4

Masculino 74,6

Hábito tabáquico

Si 27

No 73

Consumo de

alcohol

Si 41,8

No 58,2

Masticadores de

coca

Si 57,1

No 42,8

Nº Chaqueos/Año 1 vez al año 72,9

2 veces al año 18,8

Familiares con

cáncer

Si 4,3

No 94,3

Del total de trabajadores agrícolas, el 49,2% utilizaron organofosforados, el

9,8% y 8,8 % fungicidas y piretrinas o piretroides respectivamente (Fig. 8).

Figura 8. Porcentaje de plaguicidas utilizados

1 9 , 0 0 1 7 , 0 0

9 5 , 0 0

1 2 , 0 0

5 0 , 0 0

9,8 8,8

49,2

6,225,9

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

%

Nº

personas


76

6.1.3. Análisis demográfico en los grupos expuesto y control.

Tabla 11. Descripción poblacional expuestos y control

Población Control Expuesto

Nº de personas

Edad:

años

Sexo:

Hombres

Mujeres

Habito de fumar:

Fumador

No fumador

Consumo de alcohol

Si

No

Masticación de coca

Si

No

Familiar con cáncer

Si

No

43

34 ± 1,83

24 (55,8%)

19 (44,2%)

15 (35,7%)

27 (64,3%)

25 (59,5%)

17 (40,5%)

21 (50%)

21 (50%)

2 (4,8%)

40 (95,2%)

99

37± 1,24

82 (82,8%)

17 (17,2%)

39 (40,6%)

57 (59,4%)

56 (57,7%)

41 (42,3%)

58 (60,4%)

38 (39,6%)

4 (4,2%)

92 (95,8%)

Se analizaron 142 muestras de sangre de trabajadores agrícolas y controles

(grupo expuestos 99 personas y el grupo control 43 personas). Los datos

descritos a continuación han sido extraídos de las encuestas aplicadas.

Edad: No existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos

analizados en función a la variable edad.


77

Sexo: En ambos grupos existen hombres y mujeres. En la población control

hay un 44,2 % de mujeres y un 55,8% de hombres, mientras que en el grupo

de expuestos un 17,2% son mujeres y un 82,8% son hombres. A pesar de que

en el grupo de expuestos existen mayor porcentaje de hombres existe un

porcentaje apreciable de mujeres que utilizan plaguicidas.

Consumo de alcohol: En la población estudiada de controles el 59,5%

consumen alcohol, similar porcentaje al del grupo de expuestos 57,7%.

Consumo de mate de coca: en cuanto al consumo de mate de coca no existe

diferencias entre los individuos de los dos grupos. En el grupo de expuestos

42,7% consumen mate de coca mientras que el grupo control 40,5%.

Masticación de hojas de coca (Acullico): La población en general que matica

hojas de coca está en un 57.1%. No encontrándose diferencias significativas

entre los grupos de expuestos con un 60,4% y los controles en un 50%.

Hábito de fumar: para el análisis de esta variable, la población se ha dividido

en fumadores y no fumadores. El grupo de expuestos presenta un 35,7% de

fumadores, mientras que el grupo control un mayor porcentaje 40,6%.

Cáncer entre familiares: En cuando a la incidencia de cáncer entre familiares

más cercanos tenemos que en el grupo de expuestos 4,8% tienen un familiar

con cáncer y en el grupo control un porcentaje similar 4,2%.

6.2 BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN.

6.2.1 Determinación de Colinesterasa.

La toma de muestras de sangre y la determinación de la actividad de

colinestera fueron realizadas por el personal del laboratorio del Instuto

Nacional de Salud Ocupacional (INSO). Los resultados no mostraron

diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de expuestos y

controles en los niveles de colinesterasa determinados. Con valores de

0,388±0,078 en el grupo de controles y 0,403±0,077 en el grupo de expuestos.

En la tabla 12 y en la figura 9 se muestran los valores de colinesterasa

distribuidos por comunidad, observándose diferencias estadísticamente

significativas.


78

Tabla 12. Valores de Colinesterasa por comunidad

12561848N =

Comunidad

MecapacaPalcaGuanayCaranavi

Co

lin

est

era

sa s

eri

ca

.6

.5

.4

.3

.2

Figura 9. Valores de colinesterasa distribuidos por comunidad. Kruskal Wallis, Caranavi vs. Guanay p = 0.000, Caranavi Vs. Palca p=0,04, Caranavi vs. Mecapaca. p= 0,05, Guanay vs. Mecapaca p = 0.000, Palca Vs. Mecapaca p= 0,01

Comunidad X ± ES

Caranavi

Guanay

Palca

Mecapaca

0,397 ± 0,004

0,364 ± 0,006

0,375 ± 0,007

0,417 ± 0,011


79

6.3. BIOMARCADORES DE EFECTO BIOLÓGICO

6.3.1 MNs e ICHs en linfocitos

Se utilizaron los ensayos de micronúcleos (MN) y de intercambios entre

cromátides hermanas (ICH) de sangre periférica para evaluar el daño

citogenético en la población, el primero con el objeto de determinar un posible

efecto de rotura o mala segregación cromosómica durante la división celular y

el segundo para determinar daño primario al DNA.

En la tabla 13 se pueden observar las medidas de las variables citogenéticas

evaluadas.

Tabla 13. Daño citogenético en linfocitos de la población estudiada

Total Controles ( 30) Expuestos (60)

MN / 1000 BN

IDN

Nº ICH/metafase

%HFC

PRI

3,33 ± 0,51

1,94 ± 0,04

11,20 ± 0,91

50,45 ± 9,16

2,37 ± 0,11

2,86 ± 0,34

1,87 ± 0,04

10,74 ± 0,45

43,86 ± 3,57

2,30 ± 0,03

Al analizar la varible MNBN en la población total separada por sexo se pudo ver

que la población de mujeres presenta mayor frecuencia de daño citogenético

con un valor estadísticamente significativo (p=0,026), datos que se observan en

la figura 10.


80

6623N =

masculinofemenino

MN

BN

14

12

10

8

6

4

2

0

-2

117

Figura 10. MNBN en la población agrupada por sexo p= 0,026

En la tabla 14 se observan los datos de los biomarcadores citogenéticos

analizados por comunidad donde se observan diferencias estadísticamente

significativas entre las comunidades.

Tabla 14. Daño citogenético en linfocitos según Comunidad

Biomarcador de efecto

Caranavi Guanay Mecapaca Palca

MNBN

IDN

ICH

%HFC

PRI

2,38±0,472*

1,85±0,081‡

11,98±0,68¶

55,07±4,84♣

2,35±0,04

3,63±0,366

1,86 ±0,096

2,23±0,21†

59,11±14,62♠

2,23±0,21

1,50±0,327

1,78±0,055

8,64±1,05

25,11±13,3

1,87±0,5

3,70±1,367*

1,97±0,029‡

2,30±0,21¶†

33,61±4,37♣♠

2,309±0,05

*p= 0,001; ‡ p = 0,01; ¶ p = 0,004; † p = 0,042; ♣ p = 0,001; ♠p= 0,032; p= 0,035; p=0,03; U de Mann Whitney diferencias estadísticamente significativas entre poblaciones


81

Al analizar la variable MNBN en la población separada por comunidades

(Figura 11) se puede ver que la comunidad de Palca presenta mayor frecuencia

de MN (p=0,035) en relación a Caranavi.

8401032N =

Comunidad


MN

/10

00

BN

14

12

10

8

6

4

2

0

-2

Figura 11. MNBN en la población distribuida por comunidad. Kruskal Wallis, p =0,001 En la figura 12 se puede apreciar los valores de IDN observándose una

diferencia estadísticamente significativa entre Palca y Caranavi.

8401032N =

Comunidad


IDN

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

.5

Figura 12. IDN en la población distribuida por comunidad. Kruskall Wallis, p= 0,01

*

*

* *


82

Los valores de ICH, %HFC y PRI se muestran en la siguientes gráficas (Figuras

13, 14 y 15) agrupados por comunidad.

236436N =

Comunidad


INT

ER

CA

MB

IOS

EN

TR

E C

RO

MĮT

IDE

S H

ER

MA

NA

S

30

20

10

0

Figura 13. ICH en la población distribuida por comunidad. Kruskal Wallis, * p= 0,004, ‡ p=0,042

236436N =

Comunidad


% H

FC

120

100

80

60

40

20

0

-20

Figura 14. %HFC en la población distribuida por comunidad. Kruskal Wallis, * p=0,001, ‡ p= 0,032

* * ‡

‡

*

*

‡

‡


83

236435N =

Comunidad


PR

I

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

Figura 15. PRI en la población distribuida por Comunidad Kruskal Wallis * p=0,035, ‡ p=0,03

6.4 BIOMARCADORES DE SUSCEPTIBILIDAD INDIVIDUAL.

El análisis de los polimorfismos genéticos se llevó a cabo sobre un total de 142

personas utilizando la técnica de PCR multiplex. En la tabla 15 se muestran

las frecuencias de los distintos genotipos para los genes GSTM1 y GSTT1

observados en la población total estudiada.

* ‡

*

‡


84

Tabla 15. Frecuencia de los genotipos para GSTM1 y GSTT1 en la

población estudiada

Genotipo Alelo Frecuencia %

GSTM1

M+

M-

87

55

61,4%

38,6%

GSTT1 T+

T-

58

84

40,8%

59,2%

La población estudiada en este trabajo cuenta con 55 personas que presentan

deleción del gen GSTM1, lo que representa un 38,6% del total de la población.

Estos datos concuerdan con frecuencias encontradas en estudios realizados en

poblaciones caucásicas (Gapar y col., 2002), donde reportan que un 38 – 62%

de las poblaciones presentan la deleción del gen GSTM1.

Para el genotipo GSTT1 un 40.8% de la población presenta el genotipo salvaje y

un 59,2% presenta la deleción del gen.

La frecuencia de los diferentes genotipos para el polimorfismo GSTT1, que se

observan en la tabla 16 fueron los siguientes: de la GSTT1 presente 61,3% y de

la GSTT1 nula 38,7.


85

Tabla 16. Frecuencias genotípicas de los polimorfismos de la GSTM1 Y

GSTT1 en la población por comunidad

Caranavi Guanay Mecapaca Palca (%) (n) (%) (n) (%) (n) (%) (n) Genotipo

GSTM1 nulo 35,7 (17) 38,9 (7) 25 (3) 43,8 (28)

GSTM1 positivo 64,6 (31) 61,1 (11) 75 (9) 56,3 (36)

GSTT1 nulo 60,4 (29) 72,2 (13) 58,3 (7) 54,7 (35)

GSTT1 positivo 39,6 (19) 27,8 (5) 41,7 (5) 45,3 (29)

En las figuras 16 y 17 se muestran gráficamente las frecuencias genotípicas de

los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 respectivamente distribuidos por

comunidad.

GSTM1

positivonulo

Fre

cu

en

cia

(%

)

80

60

40

20

0

Comunidad

Caranavi

Guanay

Palca

Mecapaca

75

25

57

43

61

39

64

36

Figura 16. Frecuencias de los polimorfismos GSTM1 distribuidos por Comunidad.


86

GSTT1

positivonulo

FR

EC

UE

NC

IA (

%)

80

60

40

20

0

Población

Caranavi

Guanay

Palca

Mecapaca

42

58

45

55

28

72

40

60

Figura 17. Frecuencias de los polimorfismos GSTT1 distribuidos por Comunidad.

En la tabla 17 se puede observar la asociación de las frecuencias de los

genotipos heterocigoto y homocigoto de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 en

la población por comunidad. Destacandose que en las comunidades de

Caranavi y Palca existen frecuencias similares de los genes nulos de GSTM1 y

GSTT1.

Tabla 17. Frecuencia de polimorfismos GSTM1/GSTT1 en la población

por Comunidad

GSTM1/GSTT1 Caranavi Guanay Palca Mecapaca

N % N % N % N %

+/+ 15 31.3 3 16.7 16 25.0 3 25.0

+/- 17 35.4 8 44.4 20 31.3 6 50.0

-/- 12 25.0 6 33.3 15 23.4 1 8.3

-/+ 4 8.3 1 5.6 13 20.3 2 16.7

Total 48 100 18 100 64 100 12 100


87

31.3

35.4

25.0

8.3

16.7

44.4

33.3

5.6

25.0

31.3

23.4

20.325.0

50.0

8.3

16.7

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

CARANAVI GUANAY PALCA MECAPACA

+/+

+/-

-/-

-/+

Figura 18. Frecuencias de la asociación de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 por comunidad

6.4.1. Asociación de la presencia de los polimorfismos de la GSTM1 y

la GSTT1 con los niveles de colinesteresa en sangre

Para conocer si la presencia de los polimorfismos de la GSTM1 y de la GSTT1

en individuos expuestos a plaguicidas podían modificar los niveles de

colinesterasa en sangre se aplicó la prueba t de Student la misma que reveló

que no existen diferencias estadísticamente significativas para GSTM1 (p=0,44)

ni para GSTT1 (p=0,13), donde los individuos con genotipos GSTM1 y GSTT1

nulos tenían niveles similares del biomarcador de exposición en relación a los

individuos que presentaron el genotipo positivo.


88

6.4.2. Asociación de la presencia de los polimorfismos de la GSTM1 y

la GSTT1 con el daño genotóxico

Para determinar si la presencia de los polimorfismos de la GSTM1 y la GSTT1

podían modificar de alguna forma el daño genotóxico en individuos expuestos a

plaguicidas se trabajoó con las poblaciones de expuestos y controles.

6.4.2.1 Micronúcleos

Al evaluar la asociación de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 con el daño

genotóxico en sujetos expuestos se observó que la presencia del genotipo

GSTM1 (positivo) presentó una frecuencia de MN superior en relación al

genotipo GSTM1 nulo, aunque estadísticamente no significativo (p=0,075). Por

otro lado el genotipo GSTT1 nulo presentó una frecuencia de MN igual al

genotipo GSTT1 positivo. Los resultados se muestran en la tabla 18 y se

representan en figura 19.

Tabla 18. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su

asociación con la frecuencia de MN en linfocitos

Polimorfismo n Media E.T p

GSTM1a

Nulo

Positivo

GSTT1a

Nulo

Positivo

33

56

53

36

2,48

3,34

3,04

3,00

0,44

0,37

0,37

0,45

0,075

0,9

aMann-Whitney; nivel de significancia p = 0,075

ET:Error Típico


89

5633N =

GSTM1

positivonulo

MN

BN

14

12

10

8

6

4

2

0

-2

161

179

221

22213712195

117

Figura 19. Micronúcleos según genotipo GSTM1 nulo/ positivo U de Mann Whitney p = 0.075

Tabla 19. Asociación de los genotipos de los polimorfismos de la

GSTM1 y GSTT1 con la frecuencia de MN en linfocitos


GSTM1/GSTT1a

Nulo/nulo

Positivo/Positivo

GSTM1/GSTT1a

Positivo/positivo

Nulo/Positivo

21

24

24

11

2,38

3,17

3,17

2,91

0,58

0,59

0,59

0,68

0,240

0,84

a Prueba de Kruskal-Wallis. NS. ET.: Error Tipico


90

Se consideró la combinación de los polimorfismos GSTM1/GSTT1 (Tabla 19).

El resultado de la combinación nulo/nulo muestra que la media es ligeramente

inferior en relación al positivo/positivo aunque estadísticamente no

significativa. Mientras que los individuos que presentan positivo/positivo

presentan una frecuencia ligeramente superior comparada con los individuos

que presentan el genotipo nulo/positivo no significativa estadísticamente.

6.4.2.2. Índice de duplicación nuclear (IDN). Tabla 20. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su

asociación con el índice de duplicación nuclear


GSTM1a

Nulo

Positivo

GSTT1a

Nulo

Positivo

33

56

53

36

1,96

1,86

1,90

1,89

0,77

0,28

0,50

0,38

0,310

0,27

aMann-Whitney; Ns.

ET:Error Tipico

En el caso del IDN se observó que en los individuos con el genotipo GSTM1

nulo los valores estaban ligeramente incrementados en relación a los

individuos GSTM1 positivo pero sin diferencia estadística. Lo mismo se puede

observar al analizar los individuos con el genotipo GSTT1 nulo en relación a los

que presentan el genotipo GSTT1 positivo (Tabla 21).


91

Tabla 21. Asociación de los genotipos de los polimorfismos de la

GSTM1 y GSTT1 con el IDN


GSTM1/GSTT1a

Nulo/nulo

Positivo/Positivo

GSTM1/GSTT1a

Positivo/positivo

Nulo/Positivo

21

24

24

11

1,95

1,85

1,85

1,95

0,11

0,04

0,04

0,07

0,88

0,09

a Prueba de Kruskal-Wallis ET.: Error Tipico

Al evaluar la combinación de los polimorfismos GSTM1/GSTT1 (nulo/nulo) se

observó que la media es ligeramente inferior en relación al GSTM1/GSTT1

(positivo/positivo), valores estadísticamente no significativos. Mientras que los

individuos que presentan GSTM1/ GSTT1 (positivo/positivo) presentan una

frecuencia ligeramente superior comparado con los individuos que presentan el

genotipo GSTM1/GSTT1 (nulo/positivo) no significativo estadísticamente.

6.4.2.3 Intercambios entre cromátides hermanas (ICH). Los individuos con genotipo GSTM1 nulo mostraron un incremento en el

número de intercambios comparado con los individuos GSTM1 positivo. Al

evaluar el polimorfismo de la GSTT1 se observó que los individuos con genotipo

GSTT1 nulo presentan un número de intercambios menor en relación a los

individuos GSTT1 positivo pero estadísticamente no significativa. (Tabla 22)


92

Tabla 22. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su asociación con el número de ICH


GSTM1a

Nulo

Positivo

GSTT1a

Nulo

Positivo

31

45

42

34

11,38

10,44

10,58

11,13

0,65

0,52

0,56

0,60

0,11

0,18

aMann-Whitney; NS. ET:Error Tipico

El resultado obtenido al evaluar el efecto de los polimorfismos GSTM1 nulo con

los del GSTT1 nulo muestra que no existen diferencias en el número de

intercambios en relación a los genotipos GSTM1 positivo con el GSTT1 positivo.

(Tabla 23)

Tabla 23. Asociación de los genotipos de los polimorfismos

de la GSTM1/ GSTT1 con los valores de ICH


GSTM1/GSTT1a

Nulo/nulo

Positivo/Positivo

GSTM1/GSTT1a

Positivo/positivo

Nulo/Positivo

19

23

23

11

11,01

11,20

11,20

10,98

0,71

0,80

0,81

0,90

0,94

0,92

a Prueba de Kruskal-Wallis. NS ET.: Error Tipico


93

6.4.2.4 Porcentaje de células con alta frecuencia de intercambios. En el caso del porcentaje de células con alta frecuencia de intercambios se

observó que en los individuos con el genotipo GSTM1 nulo los valores estaban

incrementados en relación a los individuos GSTM1 positivo con una asociación

significativa (p=0.05). Mientras que al analizar los individuos con el genotipo

GSTT1 nulo en relación a los que presentan el genotipo GSTT1 positivo se

observó un efecto contrario, sin embargo no fue estadísticamente significativo

(Tabla 24, figura 20).

Tabla 24. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su

asociación con el %HFC


GSTM1a

Nulo

Positivo

GSTT1a

Nulo

Positivo

31

45

42

34

52,34

40,06

42,56

48,18

5,39

4,15

4,46

5,08

0,05

0,334

aMann-Whitney; p=0.05 ET:Error Tipico,


94

Figura 20. Porcentaje de células con alta frecuencia de intercambios según genotipo GSTM1 nulo/ positivo. P=0,05

Al analizar la combinación de los polimorfismos, se pudo constatar que en

individuos que presentan los genes GSTM1/GSTT1 (nulo/nulo) los valores del

%HFC están aumentados en relación a los individuos GSTM1/GSTT1

(positivo/positivo), aunque el efecto no fue estadísticamente significativo.

Mientras que los individuos GSTM1/GSTT1 (positivo/positivo) presentaron un

%HFC menor en relación a los individuos GSTM1/GSTT1 (nulo/positivos). Los

resultados se muestran en la tabla 25.

4531N =

GSTM1

positivonulo

% C

élu

las

co

n a

lta f

recu

en

cia

de i

nte

rcam

bio

s

120

100

80

60

40

20

0

-20


95

Tabla 25. Asociación de los genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 / GSTT1 con los valores de %HFC


GSTM1/GSTT1a

Nulo/nulo

Positivo/Positivo

GSTM1/GSTT1a

Positivo/positivo

Nulo/Positivo

19

23

23

11

50,13

46,43

46,43

51,84

6,24

5,87

5,87

10,15

0,64

0,64

a Prueba de Kruskal-Wallis. NS. ET.: Error Tipico

Tabla 26. Magnitud de asociación entre polimorfismos GSTM1 GSTT1 y daño genotóxico Caso Control Total

GSTM1

Nulo

Positivo

Total

25 (46,3%)

33 (38,4%)

58

29 (53,7%)

53 (61,6%)

82

54

86

140 (100%)

GSTT1

Nulo

Positivo

Total

34 (40,5%)

24 (41,4%)

58

50 (59,5%)

34 (58,6%)

82

84

58

142 (100%)

GSTM1 Odds ratio (OR): 1,385 (IC: 0,695 – 2,758); GSTT1 Odds ratio (OR): 0,963 (IC: 0,488 – 1,902)


96

Tabla 27. Magnitud de asociación entre polimorfismos y daño Mutagénico Factor GSTM1 OR IC 95%

Nulo Positivo

ICH

Menor a 10

Mayor a 10

9

49

36

48 0,245 0.107 – 0,563

MN

Menor a 2

Mayor a 2

21

12

25

31 2,17 0,897 – 5,250

IDN

Menor a 1

Mayor a 1

16

42

20

64 1,219 0,568 – 2,617


97

Tabla 28. Magnitud de asociación entre polimorfismos GSTM1 y otros factores de riesgo FACTOR GSTM1 OR IC 95%

Nulo Positivo

EXPOSICIÓN A PLAGUICIDAS

Expuesto

No expuesto

38

16

59

27 1,920 0,439 – 1,930

EDAD

Menor a 40

Mayor a 40

32

16

52

24 0,923 0,427 – 1,995

OCUPACIÓN

Agricultor

No agricultor

39

15

59

27 0,190 0,562 – 2,518

HÁBITO DE FUMAR

Fumador

No fumador

26

27

28

57 1,960 0,970 – 3,961

CONSUMO DE ALCOHOL

NO

SI

24

29

34

52 1,266 0,633 – 2,529

SEXO

Femenino

Masculino

12

42

24

62 0,738 0,333– 1,636

COMUNIDAD

Altiplano

Yungas

30

24

45

41 1,139 0,575 – 2,256

CHAQUEO

NO

SI

29

25

38

48 1,465 0,740– 2,903

RADIOGRAFÍA POR RAYOS X

NO

SI

40

11

65

21 1,175 0,513– 2,692


98

Tabla 29. Magnitud de asociación entre polimorfismos GSTT1 y otros factores de riesgo Factor GSTT1 OR IC 95%

Nulo Positivo

EXPOSICIÓN A PLAGUICIDAS

Expuesto

No expuesto

24

60

19

39 0, 821 0,398 – 1,694

EDAD

Menor a 40

Mayor a 40

49

25

35

17

0,952 0,448 – 2,022

OCUPACIÓN

Agricultor

No agricultor

60

24

40

18

1,125

0,542 – 2,335

HÁBITO DE FUMAR

Fumador

No fumador

30

53

25

32 0,725 0,364 – 1,443

CONSUMO DE ALCOHOL

NO

SI

42

41

17

41 2,471 1,214 – 5,028

SEXO

Femenino

Masculino

21

63

15

43 0,956 0,443– 2,059

COMUNIDAD

Altiplano

Yungas

42

42

34

24 0,706 0,359 – 1,387

CHAQUEO

NO

SI

38

46

30

28 0,771 0,394– 1,508

RADIOGRAFÍA POR RAYOS X

NO

SI

67

15

40

17 1,898 0,855– 4,213


99

6.4.3 Regresión logística.

Para determinar la existencia de factores que se asocian con los polimorfismos

GSTM1 y la exposición a plaguicidas se realizó el análisis de regresión logística,

los resultados obtenidos se resumen en la tabla 30. Estos resultados nos

muestran que de los factores analizados, el chaqueo muestra asociación

estadísticamente significativa (p = 0,03), el IDN muestra una asociación

estadísticamente marginal (p = 0,07), el número de intercambios entre

cromátides hermanas y el porcentaje de células con alta frecuencia de

intercambios dieron valores con significación estadística p=0,043 y p=0,044

respectivamente.


100

Tabla 30. Regresión logística de polimorfismos GSTM1 y GSTT1

con co-variables.

GSTM1 Error

Standard

z p Nivel de

significancia

GSTT1

MN1000BN

Colinesterasa

Ant. Familiar

Edad

Sexo

Chaqueo

Mast. Coca

Alcohol

IDN

ICH

%HFC

PRI

Exp. N.Exp.

Fumar

2.8354

0.4473

6.45e-10

1.77e+09

0.0561

11.8124

0.0697

0.0802

10.0352

0.0498

0.0623

0.1602

16.3964

9.2940

0.6978

0.358

0.486

- 0.940

0.014

- 0.148

0.630

- 2.156

-1.575

1.048

- 1.798

- 2.027

2.013

0.792

0.578

- 0.523

0.720

0.627

0.347

0.989

0.882

0.529

0.031

0.115

0.295

0.072

0.043

0.044

0.429

0.563

0.601

NO

NO

NO

NO

NO

NO

P < 0.05

NO

NO

Casi p <0.1

P < 0.05

P < 0.05

NO

NO

NO


101

7. DISCUSION.

La población de este estudio fue seleccionada por sus características

particulares de trabajo, que se destacan por una intensa actividad agrícola y

por tanto un uso indiscriminado y manejo inadecuado de los plaguicidas

especialmente en las poblaciones rurales, que supone un alto nivel de

exposición, debido a que comienzan sus labores agrícolas a temprana edad,

además por los resultados del primer estudio de riesgo genotóxico (Ascarrunz y

col, 2006; Jors y col. 2007) en sujetos expuestos a plaguicidas, donde se

observó una elevada frecuencia de ICH, MN, AC y parámetros del cometa, por

lo tanto, aumento de la probabilidad de que los trabajadores agrícolas

expuestos a estos agentes tengan daño genotóxico.

Las poblaciones de Caranavi, Guanay, Palca y Mecapaca, por sus

características netamente agrícolas, han merecido la implementación de un

programa de salud educativo para los trabajadores agrícolas y personal médico

y paramédico, con el propósito de concienciar en el uso adecuado y en el

reconocimiento y tratamiento de intoxicaciones por plaguicidas, trabajo

coordinado y ejecutado por PLAGBOL.

De las 4 poblaciones estudiadas, la de Palca fue la que participó en mayor

porcentaje (42%), luego Caranavi provincia de nor Yungas (34%), Guanay

(13%) y Mecapaca (9%), el 2% restante corresponde a individuos que trabajan

en esas localidades pero que viven en la ciudad de La Paz.

Los estudios de biomonitorización de poblaciones humanas laboralmente

expuestas a diferentes agentes, constituye en la actualidad el objetivo de

numerosos estudios. Cualquier exposición a productos peligrosos debe ser

evitada en la medida de lo posible. Los individuos que, debido a su trabajo,

están en contacto directo con productos tóxicos o genotóxicos ven

incrementada la probabilidad de sufrir efectos adversos sobre la salud y, es por


102

ello, que han sido y son el objeto de estudio de numerosas investigaciones,

principalmente epidemiológicas y toxicológicas.

No todas las investigaciones sobre exposiciones a agentes potencialmente

peligrosos se traducen en un incremento de daño o en alteraciones

inmunológicas o bioquímicas. Así, por ejemplo en el estudio de Surrallés y col.,

1997, no se observa un aumento de las anomalías cromosómicas. A pesar de

que la exposición de los individuos sea a benceno, un reconocido agente

clastogénico y carcinogénico en humanos.

Los estudios de biomonitorización de poblaciones agrícolas, de los que se tiene

constancia por su publicación en revistas científicas especializadas, se vienen

realizando desde principios de los años 70. Como era de esperar, existe una

elevada diversidad de resultados dependiendo del biomarcador analizado y de

la población estudiada.

Los agricultores que participaron en este estudio utilizaron 27 plaguicidas

diferentes, de los cuales, 5 son altamente tóxicos (AT), 6 moderadamente

tóxicos (MT), 10 ligeramente tóxicos (LT) y 6 no clasificados. Asimismo, se

observó que los agricultores utilizaron generalmente mezclas complejas de

plaguicidas cuyos componentes no fueron identificados (Ver Anexo 1).

Comparando con otros estudios, podemos observar que en el trabajo de

Bolognesi (2003), los agricultores utilizaron alrededor de 23 productos,

mientras que en el trabajo de Scarpato y col. (1996), utilizaron más de 100

productos y en las poblaciones estudiadas por Carbonell y col. (1993), fueron

64. Los hallazgos de estos estudios demostraron que el número de plaguicidas

empleados no influye en los resultados encontrados entre las poblaciones

agrícolas expuestas a plaguicidas en relación a los controles, ya que,

independientemente del número de plaguicidas, estas poblaciones presentaron

daño genotóxico.


103

Aunque se ha comprobado que el nivel de exposición y el uso de varios

plaguicidas por separado producen genotoxicidad de forma significativa, en

poblaciones ocupacionalmente expuestas (Balagi y col, 1993; Bolognesi, 2003),

la información científica sobre el efecto genotóxico de mezclas complejas es

reducida.

Según datos de la encuesta aplicada, las poblaciones participantes en este

estudio, utilizaron mezclas de plaguicidas (68%) de los tres grupos (herbicidas,

insecticidas y fungicidas). Entre los más frecuentemente empleados están los

organofosforados (49,2%): Altamente tóxicos (AT): Tamaron (Metamidophos),

Clorados, Monodrin (Monocotrophos); extremadamente tóxicos (ET): Perfection

(Dimetoato), Folidol (Parathión etílico), Nuvacron (Monocotrophos);

moderadamente tóxicos: Baytex (fenthion), Curacron (profenophos), Mapex (Ver

Anexo 1). Este tipo de plaguicidas actúan en el organismo inhibiendo la

actividad enzimática de la acetilcolinestarasa por fosforilación, enzima que

tiene la función de hidrolizar la neurotransmisión de la acetilcolina, lo que

provoca un aumento de la acetilcolina y por lo tanto una actividad eléctrica y

estimulación continua y aumentada en las neuronas, produciendo efectos

tóxicos agudos en el organismo. El Parathion es inhibidor irreversible de la

colinestarasa, en la mayoría de los países es el plaguicida que causa el mayor

número de intoxicaciones agudas notificadas (Obiols, 1998)

Los agricultores estudiados, también utilizaron Piretroides (8,8%) como: Karate

(Lambdacyhalotrina), Biltz (Alphacypermetrina) que son altamente tóxicos,

Ambusch (Permetrina) clasificado como levemente tóxico; carbamatos como el

Baygon y clorados entre otros, como el Mirex. La Permetrina, como piretroide

sintético es considerada estrógeno ambiental, ya que teóricamente los

plaguicidas son disruptores de la función hormonal normal y que pueden

interferir en cualquier etapa de regulación del sistema endocrino tales como los


104

mecanismos que involucran la producción hormonal y los niveles de los

receptores en tejido blanco (Carpenter y col., 2002).

El programa PLAGBOL, en las mismas poblaciones del presente estudio,

a través de la encuesta, mostró que la mayoría de los agricultores no utilizan

protección personal ni hábitos higiénicos para el manejo de los plaguicidas, ya

que el 73 % de los productores manejan estos plaguicidas de forma empírica,

realizando mezclas indebidas, sin respetar las dosis adecuadas o

recomendadas (86 %), sin equipos de protección personal (80%) y lo más

preocupante es que el 94 % de los agricultores utilizan plaguicidas muy tóxicos

o prohibidos como el metamidofos y el metil parathion, productos que han sido

catalogados por la OMS como plaguicidas Clase I que son extremadamente

peligrosos para los seres humanos, a este problema se adiciona el factor

ambiental por la eliminación de los envases de forma incorrecta (67%)

ocasionando la contaminación de fuentes de agua de consumo humano

(Cervantes y Huici, 2005). Por otro lado, el agricultor boliviano tiene como

costumbre ancestral el chaqueo o quema de malezas y pastizales, cuya

actividad produce entre otros compuestos, hidrocarburos aromáticos

policíclicos (HAP) que son también tóxicos. En este estudio el 73 % de los

agricultores de Caranavi y Guanay, chaquean 1 vez al año y el 19 % 2 veces al

año, en cuanto a la frecuencia de fumigación, el 51,7% fumigó 1 vez, el 25%

dos veces y el 22% más de 3 veces en el último mes, condiciones que suponen

un uso permanente de plaguicidas durante todo el año y por varios años,

adicionalmente están expuestos a otros factores de riesgo, hábito de masticar

coca, consumo de tabaco, alcohol entre otros. Estas condiciones cumplen las

características de la evaluación genotóxica, cuyo requisito particular es la

exposición a largo plazo y a dosis subtóxicas.


105

7.1 Biomarcador de exposición.

Como se mencionó en el acápite de resultados como biomarcador de exposición

se determinó los niveles de colinesterasa en suero. La colinesterasa se

considera como un buen biomarcador de exposición a carbamatos y

organofosforados ya que causan una notable depresión de los niveles del

mismo (Yeary y col., 1993). En la población estudiada los datos de estos

análisis nos muestran que no existen diferencias estadísticamente

significativas entre los controles y los expuestos. Sin embargo se encontró

diferencias estadísticamente significativas en relación a las comunidades,

siendo Guanay la población que presentó el mayor grado de toxicidad medido

por la colinesterasa en relación a Caranavi (p=0,000), seguida por la

comunidad de Palca que presentó un valor de colinesterasa inferior con

significancia estadística en relación a Caranavi (p=0,04).

7.2. Biomarcadores de efecto.

Los ensayos empleando biomarcadores son particularmente valiosos para la

detección y cuantificación de la toxicidad cuando los organismos están

expuestos a mezclas de sustancias (Walker, 1998). Entre los plaguicidas que

han sido estudiados existen 28 que producen efecto genotóxico demostrable a

nivel experimental y 19 considerados probables cancerígenos categoría B2 por

la Environmental Protection Agency (EPA). Sin embargo, es de destacar que

estos datos son producto del análisis del efecto producido por cada uno de los

plaguicidas en forma aislada pero no de sus mezclas. Frolichsthal y Piatti

(1996) evaluaron el efecto tóxico de tres insecticidas organofosforados en forma

aislada o combinada en hepatocitos de rata por medio del test de micronúcleos,

en cuyos resultados observaron que ninguno de los compuestos utilizados

evidenciaba un efecto genotóxico aplicado en forma aislada, pero detectaron un

significativo aumento en la frecuencia de micronúcleos al utilizarlos en forma

combinada.


106

En la presente investigación se utilizaron dos biomarcadores de efecto el

ensayo de MN y los intercambios entre cromátides hermanas.

En relación con los diferentes biomarcadores de daño citogenético, la

evaluación de la frecuencia de MN se ha propuesto como una herramienta útil

para estimar la magnitud del daño genotóxico. Dada la sensibilidad del ensayo

de MN y su relativa simplicidad y objetividad en el análisis de los resultados,

en este trabajo se utilizó para medir efecto genotóxico asociado a la exposición

a mezclas de plaguicidas. Por otro lado, se debe enfatizar que otra de las

ventajas importantes del ensayo de MN es que, además de permitir evaluar con

relativa facilidad, el efecto clastogénico de una exposición, también permite

determinar el efecto aneugénico. El ensayo de MN ha sido uno de los más

utilizados en los estudios de biomonitorización de poblaciones humanas

expuestas a plaguicidas (Bolognesi y col., 1998, Au y col., 1999).

En los resultados obtenidos tal como puede observarse, la exposición a

los plaguicidas no ha supuesto un aumento significativo de las frecuencias de

MNBN, es decir, el hecho de ser agricultor laboralmente expuesto a tales

compuestos químicos no se refleja en un incremento de daño genético en

forma de MNBN, datos comparables con los resultados de estudios de

biomonitorización de poblaciones expuestas a plaguicidas publicados por

Joksic y col., 1997, Titenko-Holland y col., 1997, Calvert y col., 1998, Davies y

col., 1998, Venegas y col., 1998, Windham y col, 1998, Figgs y col., 2000 y

Pastor y col., 2001.

El hecho de no haber encontrado un incremento significativo de MN en

los agricultores expuestos a plaguicidas nos indica simplemente que no se han

producido roturas ni pérdidas cromosómicas a niveles estadísticamente

significativos. Esta falta de daño genético no se puede atribuir a una baja

exposición, ya que todas las comunidades analizadas desarrollan una actividad

agrícola intensa. Tal vez el punto más importante esté en los plaguicidas

utilizados. En las poblaciones de nuestro estudio, una amplia variedad de


107

productos son utilizados en mayor o menor proporción (Figura 8). La gran

mayoría están clasificados como seguros, aunque realmente muchos están

probados únicamente en animales de laboratorio y de manera individual (no

mezclas).

Al realizar el estudio por poblaciones se observó que en la comunidad de

Mecapaca existen valores inferiores en la frecuencia de MNBN en relación a

Caranavi, Guanay y Palca, notándose valores superiores en la frecuencia de

MN en Palca con una diferencia estadísticamente significativa en relación a

Caranavi (p=0,000).

Al evaluar los MN en linfocitos también se calculó el índice de duplicación

nuclear (IDN) con bloqueo de la citocinesis. El IDN da cuenta de la velocidad de

división celular y se usa como indicativo del grado de toxicidad al que se

encuentran expuestas las células ya que a mayor toxicidad disminuye la

velocidad de división celular. Un hecho interesante es que los plaguicidas

parecen influir en la cinética de proliferación celular induciendo alteraciones,

tales como retraso en el ciclo celular y reducción de la proliferación de

linfocitos (Rupa y col. 1991; Pasquini y col. 1996). En referencia al IDN, del

total de los 142 individuos, el grupo de expuestos a plaguicidas mostró un

descenso pero no significativo respecto a los no expuestos (Tabla 12). Los

resultados del IDN analizados por comunidad mostraron que los pobladores de

Caranavi presentaban mayor grado de toxicidad celular con un descenso

estadísticamente significativo en relación a los pobladores de Palca (p=0,01).

La reducción de los valores del IDN en los agricultores expuestos a

plaguicidas demuestra que estos productos tienen actividad citotóxica, que

podría manifestarse como genotoxicidad o enmascarar la posible actividad

genotóxica, ya que, según Kirsh-Volders y Fenech (2001), las exposiciones

continuas a toxinas, como podrían ser los plaguicidas, y a niveles bajos, se

puede traducir en una respuesta adaptativa relacionada con un incremento en


108

la sensibilidad a la apoptosis y/o un retraso más extendido del ciclo celular, lo

que daría tiempo a una reparación del daño inducido inicialmente.

Existen numerosos artículos publicados utilizando la técnica de

intercambios entre cromátides hermanas como biomarcador en biomonitoreo

de poblaciones expuestas a plaguicidas desde los años setentas tales como

Crossen y col., 1978, Carbonell y col., 1993.

Los resultados obtenidos del número de intercambios en las poblaciones de

este estudio (expuesto y control) resumidos en la tabla 13, nos muestran que

no existen diferencias estadísticamente significativas comparando ambos

grupos, datos que se corroboran con los publicados por Carbonell y col., 1995,

Hoyos y col., 1996, Joksic y col., 1997, Yu- Chen Lei y col. 2002, Jarno

Tuimala y col. 2004.

Sin embargo al realizar el análisis por comunidades se observó mayor número

de ICH en Caranavi en relación a Palca con diferencias estadísticamente

significativas (p=0,004).

Al realizar el análisis del %HFC se evidenció que no existían diferencias

estadísticamente significativas entre el grupo de expuestos y controles, sin

embargo el análisis de %HFC por comunidad mostró diferencias

estadísticamente significativas entre Caranavi y Palca (p=0,001) y entre

Guanay y Palca (p=0,032). En un estudio realizado por Shaham y col. 2001 en

un grupo de floricultores de Sharon (Israel) se reportó un incremento

significativo de SCE tanto en número como en HFC en el grupo agrícola

comparado con el control.

7.3. Biomarcadores de susceptibilidad

La caracterización genotípica está adquiriendo un peso importante en los

estudios epidemiológicos ambientales, así como en la interpretación de los

procesos cancerígenos. Se intenta comprender por qué los individuos

reaccionan de manera diferente frente a la exposición de un agente. Y es


109

entonces donde se pone en juego, entre otros aspectos, la determinación de los

perfiles metabólicos individuales.

Muchos de los cancerígenos requieren activación metabólica antes de poder ser

activos y otros sufren inactivación después de ser metabolizados. Por lo tanto,

las variaciones individuales en la capacidad metabólica son importantes en la

inducción de una mutación o en el desarrollo de un cáncer y, por consiguiente,

en los estudios de biomonitorización. Según las variantes génicas

(polimorfismos) que un individuo posea, le conferirá mayor o menor

susceptibilidad frente a sustancias con potencial genotóxico, como lo son

muchos de los plaguicidas.

La superfamilia de las glutatión transferasas (GSTs) representa uno de los

polimorfismos más analizados en los estudios de biomonitorización. Estas

enzimas de conjugación, detoxifican compuestos electrofílicos, especialmente

de estructura policíclica aromática, como los que están en el humo del tabaco

y en algunos plaguicidas.

Las dos clases más conocidas y estudiadas son la GSTM1 y la GSTT1.

Investigaciones de Brockmoller y col., 1998 y Yuille y col., 2002. Entre otras

indican que los individuos GSTM1 nulos, es decir los que no tienen ninguna

copia del gen GSTM1, tendrían un mayor riesgo de desarrollar cáncer y otras

enfermedades.

Debido a la elevada variabilidad de exposiciones y a que el fenotipo viene

determinado por un conjunto de enzimas, la evaluación de un único

polimorfismo resulta a menudo insuficiente (Bartsch y col., 1996) para poder

sacar conclusiones válidas.

Se consideró oportuno el realizar el estudio de los genes GSTM1 y GSTT1,

como fuente de variabilidad individual, que podía afectar a los resultados


110

citogenéticos. La metodología utilizada no permite determinar el número de

copias para el gen, simplemente la presencia o ausencia del mismo. Este

análisis se realizó en todas las poblaciones involucradas en el estudio, los

resultados obtenidos mostraron que 55 personas presentan deleción del gen

GSTM1, lo que representa un 38,6% del total de la población. Estos datos

concuerdan con frecuencias encontradas en otros estudios en el ámbito

mundial en individuos sanos donde reportan entre 23% y 41% en la población

afroamericana y africana, 33% y 69% en asiáticos, 39% y 62% en europeos,

38% – 62% en poblaciones caucásicas (Raunio y col. 1995; Gaspar y col. 2002).

Para el genotipo GSTT1 un 40.8% de la población presenta el genotipo salvaje y

un 59,2% presenta la deleción del gen, estos valores son similares a los

obtenidos en estudios realizados en poblaciones chinas (Gaspar ycol. 2002)

donde reportan de 58 – 62% de frecuencias de deleción del gen de GSTT1.

Los resultados obtenidos no muestran ninguna diferencia estadísticamente

significativa de frecuencias entre los grupos control y expuesto a plaguicidas

para GSTT1, aunque para GSTM1 se encuentra una mayor proporción de

genotipos nulos en los individuos del grupo control.

Como el cáncer es un proceso multifactorial, la presencia de los polimorfismos

de la GSTM1 y GSTT1 en una población general no siempre pueden ser los

factores determinantes para que se dé esta enfermedad, ya que puede existir la

presencia de otras enzimas metabólicas (CYP2E1 y paroxone PON) cuyas

actividades están alteradas por la presencia de polimorfismos que modifican el

metabolismo de los plaguicidas. (Sultatos 1992, Sultatos 1994, Humbert y col.

1993).

Los polimorfismos de GSTM1 y GSTT1 modifican la actividad de estas enzimas,

por lo que estas actividades podrían afectar los niveles de colinesterasa en

sangre. En este estudio la presencia de polimorfimos GSTM1 y GSTT1 no


111

afectaron significativamente los niveles de colinesterasa sérica estos resultados

son comparables a los obtenidos por Pastor y col. 2002.

Con relación a los parámetros citogenéticos analizados, el efecto del genotipo

GSTM1 nulo en la frecuencia de micronúcleos muestra valores inferiores a los

del genotipo GSTM1 positivo aunque estadísticamente no significativos

p=0,075, este hallazgo es comparable con los resultados del estudio realizado

por Kirsch-Volders y col. (2006) donde reportan que el efecto del genotipo

GSTM1 nulo en la frecuencia de Mn fue mínimo y sólo significativo al limite y

con los resultados de Ghita y Col. (1999).

En relación al genotipo GSTT1 nulo este presentó una frecuencia de MN igual

al genotipo GSTT1 postivo. La combinación de los polimorfismos

GSTM1/GSTT1 mostró que el genotipo nulo de ambos presenta frecuencia de

MN ligeramente inferior en relación al genotipo positivo de ambos aunque sin

diferencias estadísticamente significativas. Estos datos se asemejan a los

resultados del estudio realizado por Kirsch-Volders y col. (2006) donde los

sujetos que tenían genotipos GSTM1 y GSTT1 nulos mostraron frecuencias de

micronucleos más bajas en relación a sus contrapartes positivas cuando eran

expuestos a genotoxinas ocupacionales (p=0,039).

En relación al IDN se encontró una relación inversa entre este parámetro y la

presencia de GSTM1 y GSTT1, en los individuos expuestos. Se puede especular

sobre la formación de compuestos activos derivados del metabolismo de los

plaguicidas, que serían los responsables de una menor proliferación celular. Se

necesitan más estudios y aumentar el tamaño muestral para poder

correlacionar adecuadamente los polimorfimos con los parámetros

citogenéticos.

Los hallazgos encontrados concuerdan con Au y col. 1999 quienes analizaron

el efecto de los polimorfismos de CYP2E1, GSTM1, GSTT1 y PON en la


112

inducción de AC por mezclas de plaguicidas y no observaron ningún efecto de

estos genotipos en las ACs.

La influencia del GSTM1 nulo sobre los ICH se mostró como un ligero

incremento en las frecuencias de este parámetro, aunque sin significancia

estadística, mientras que la influencia del GSTT1 nulo sobre los ICH se mostró

con una ligera disminución en relación a los individuos GSTT1 positivos pero

estadísticamente no significativa, como se puede observar en los resultados.

En relación a la influencia del genotipo GSTM1 nulo sobre el porcentaje de

células con alta frecuencia de intercambios se observó con un incremento con

significancia estadística (p=0.05), para corroborar esta asociación significativa

se necesita aumentar el tamaño muestral. Al analizar los individuos con el

genotipo GSTT1 nulo en relación a los individuos GSTT1 postivos se observó

una disminución, pero con datos estadísticamente no significativos.

En cuanto al análisis realizado por comunidad, las poblaciones de Caranavi y

Palca presentaron frecuencias de polimorfismos nulos similares (25 y 23,4%)

respectivamente, en relación al daño genotóxico la comunidad de Palca

presentó mayor daño cromosómico mientras que la población de Caranavi

mostró mayor daño primario por lo que deducimos que la población de Palca

tiene daño crónico por fijación de las mutaciones que podría atribuirse a la

ausencia de los genes de detoxificación GSTM1 y GSTT1 o a la deficiencia de

los sistemas de reparación, no se debe dejar de lado la incidencia de los

factores ambientales puesto que la frecuencia de los alelos nulos de estas

enzimas es similar en ambas comunidades pero el tipo de daño es diferente.

Los trabajos publicados sobre biomarcadores de susceptibilidad y su relación

con plaguicidas son escasos (IARC, 1991) y generalmente se relacionan con

enfermedades y problemas en la salud. Solamente se conocen otros estudios

que han relacionado las GSTs con los MN e ICH en poblaciones expuestas a


113

plaguicidas: Scarpato y col., (1996) y Falck y col., (1999), y en ningún caso se

relaciona la frecuencia de MN en linfocitos con los alelos nulos GSTM1 y

GSTT1, lo que concuerda con nuestros resultados. Quizá los MN constituyan

un biomarcador difícil de relacionar con las GSTs. No obstante, dado el

conocimiento que tenemos de estos polimorfismos y la función que realizan,

junto con los resultados que relacionan incrementos de ICH y AC en fenotipos

nulos a determinadas exposiciones (Kelsey y col., 1995; Scarpato y col., 1997)

estos marcadores de susceptibilidad son útiles en estudios citogenéticos en

humanos aportando una información de indudable interés.

El análisis para el cálculo de la magnitud de asociación entre polimorfismos

de las GSTs y daño genotóxico, muestra que la población con ausencia del

GSTM1 incrementa el riesgo 0.38 veces más de presentar daño genotóxico en

relación a la población que tiene el gen. Este análisis realizado para los

polimorfismos de la GSTT1 no mostró ninguna asociación.

En relación a la magnitud de asociación entre polimorfismos GSTM1 y daño

genotóxico medido por la prueba de MN el valor de odds ratio con un intervalo

de confianza del 95% (0,897 – 5,250) nos indica que la ausencia del gen

incrementa 1.17 veces más la probabilidad de presentar daño cromosómico. En

referencia al daño citotóxico (IDN) el valor de odds ratio con un IC al 95%

(0,568 – 2,617) nos indica que la ausencia del gen GSTM1 incrementa 0.21

veces más el riesgo de presentar daño citotóxico. Sin embargo los valores de

odds ratio encontrados al incluir el uno en el IC no pueden ser extrapolados a

la población en general.

El análisis realizado sobre la magnitud de asociación entre polimorfismos de

las GSTs y otros factores adicionales a la exposición a plaguicidas como la

edad, la ocupación, el hábito de fumar, el consumo de alcohol, el sexo, el

chaqueo y la exposición a rayos x, mostraron que, el consumo de alcohol es un


114

factor de riesgo significativo (IC: 1,214 – 5,028), aumentando 1,47 veces la

probabilidad de presentar daño genotóxico en personas con el gen GSTT1 nulo.

Existen trabajos reportados en la literatura que hacen referencia a que el

genotipo GSTT1 nulo esta involucrado en la modulación del riesgo de cáncer

(Inoue y col. 1994, Oude 2006). Este riesgo esta fuertemente asociado al

consumo de alcohol y al hábito de fumar que incrementan la carga de toxinas

carcinogénicas. La detoxificación de tales compuestos dañinos ocurre

generalmente por la vía II de detoxificación donde están involucreadas enzimas

como las GSTs.

Finalmente, se realizó un modelo de regresión logística ajustado por las

variables GSTM1 y GSTT1 haciendo correr el modelo con covariables MN y

colinesterasa como predictoras y el resto de co-variables de estudio; mostrando

como modificadores de efecto el chaqueo, los intercambios entre cromatidas

hermanas y el porcentaje de células con alta frecuencia de intercambios, las

demás co-variables no dieron significancia y tampoco interacción.


115

8. CONCLUSIONES.

Tras la discusión de los resultados obtenidos, se puede llegar a las siguientes

conclusiones.

• La exposición a plaguicidas no ha inducido niveles de daño genético

detectables mediante el ensayo de MN, ni de intercambios entre

cromátides hermanas, en linfocitos de sangre periférica.

• Se determinó que la frecuencia de los alelos GSTM1 nulo 38,6% y de

GSTM1 positivo 61,4%. Para el GSTT1 nulo de 59,2% y para el GSTT1

positivo la frecuencia fue de 40.8%.

• Factores como la edad, sexo, el origen de las poblaciones, el tabaco, el

chaqueo y la irradiación diagnóstica entre otros pueden modificar la

frecuencia de BN MN y número de ICH por lo que estos factores deben

ser tomados en cuenta a la hora de realizar una evaluación citogenética.

• Existe una asociación estadísticamente significativa entre el chaqueo, los

intercambios entre cromátides hermanas y el porcentaje de células con

alta frecuencia de intercambios con los polimorfismos de la GSTM1 y la

exposición a plaguicidas.

• El consumo de alcohol como factor adicional incrementa el riesgo de

presentar daño genotóxico en poblaciones GSTT1 nulas expuestas a

plaguicidas.

• Se ha demostrado que la ausencia de los genes que codifican enzimas de

biotransformacion de xenobioticos constituye un factor importante para

determinar la magnitud del riesgo de tener enfermedades crónicas

degenerativas.


116

9. REFENCIAS BIBLIOGRAFICAS

• Abdel Rahman SZ, el – Zein RA., Anwar, Au WW. 1996. A multiplex PCR

procedure for polymorphyc analysis of GSTM1 and GSTT1 gens in

population studies- Cancer Letter, 107: 229-233.

• Aidoo A., Lyn – Cook, LE, Lensing S., Wamer W. 1994. Ascorbic acid

(vitamin C) modulates the mutagenic effects produced by an alkylating

agent in vivo. Environ. Mol. Mutagen., 24: 220 – 228.

• Albertini RJ. 1994. Why use somatic mutations for human biomonitoring?

Environ. Mol. Mutagen.; 23 (Suppl. 24): 18-22.

• Ames B N., Gold. L.S. 2000. Paracelsus to parascience: the environmental

cancer distraction. Mutat. Res. 447: 3-13. Antoccia A., Tanzarella C,

Modesti D., Degrassi F.1993. Citokinesis Block micronucleus assay with

kinetochore detection in colchicine treated human fibroblasts. Mutat. Res.

287: 93 – 99.

• Antoccia G.A., I.M. De Syllos Colus IM. 2000. Chromosomal aberrations

analysis in a Brazilian population exposed to pesticides. Teratogenesis,

Carcinogenesis, Mutagenesis. 20: 265-272.

• Antonucci G.A., Tanzarolla C., Modesti D, Degrassi F. 1993. Citokinesis

block micronucleus assay with kinetochore detection in colchicine treated

human fibroblasts. Mutation Res. 287: 93 -99.

• Anwar W. 1997. Biomarkers of human exposure to pesticides. Environ.

Health Perspect. 105 Suppl 4:801-6.

• Ascarrunz ME, Tirado N, Gonzáles AR, Cuti M, Cervantes R, Huici O, Jors

E. 2006. Evaluación de riesgo Genotóxico: Biomonitorización de

trabajadores agrícolas expuestos a plaguicidas de Caranavi, Guanay, Palca

y Mecapaca. Revista Cuadernos; 51:7-18.

• Au WW, Sierra-Torres CH, Cajas-Salazar N, Shipp BK, Legator MS.

Cytogenetic effects from exposure to mixed pesticides and the influence

from genetic susceptibility. Environ Health Perspec 1999; 107: 501–505.


117

• Bailey L, Roodi N, Verrier C, Yee C, Dupony W, Parl F. 1998. Breast cancer

and CYP1A1, GSTM1 and GSTT1 polymorphisms: evidence of a lack of

association in Caucasians and African-Americans. Cancer Res. 58 (1): 65-

70.

• Balagi M. and K. Sasikala. 1993. Cytogenetic effect of Malathion in vitro

culture of human peripheral blood. Mutat. Res.; 301:13-17.

• Bartsh H, Hietanen E. 1996. The role of individual susceptibility in cancer

burden related to environmental exposure. Environ. Health Perspect; 104

(Suppl. 3): 569 – 577.

• Bastiedas D., Mora M. 1999. Evaluación del potencial mutagénico de

mezclas de plaguicidas usadas en el Huila Suárez informe final

cofinanciación USCO – Pronatta.

• Berhame K, Widersten M, Engstrom A, Kozarich J.W, Mannervik B. 1997.

Detoxication of base propenals and other alpha, beta unsaturated aldehyd

products of radical reactions and lipid peroxidation by human glutation

transferases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 1480-1484.

• Berrino 1995, Survival of Cancer Patients in Europe. The Eurocare Study,

International Agency for Research on Cancer, Lyon.

• Blair A, Zahm SH. 1991. Cancer among farmers. Occup Med; 6:335–54.

• Blair A. 1990. A review of epidemiológical studies of agriculture

exposures In: Proocedings of Agricultural Occupational and

Environmental Health: Policy Strategies for the Future (Donham KJ,

Merchant JA, Kross B, eds). Am J Indust Med; 18:91-113.

• Blair A. and Zahm, S.H. 1995. Agricultural exposures and cancer.

Environ. Health Perspect., 103, 205–208

• Bolognesi C. 2003. Genotoxicity of pesticides: A review of human

biomonitoring studies. Mutat. Res. 543: 251-272.

• Bolognesi C, Parrini M, Reggiardo F, Bonassi S. 1993. Biomonitoring of

workers exposed to pesticides. Int. Arch. Occup. Env. Health; 65(S):185–

187.


118

• Branda RF, O’ Neill JP, Sullivan LM, Albertini RJ. 1991. Factors

influencing mutation at the hprt lócus in T-Lymphocytes women treated

for breast cancer. Cancer Res., 51: 6603 -6607.

• Brockmoller J, Cascorbi I, Kerb R, Sachse C, Roots I. 1998. Plymorphisms

in xenobiotic conjugation and disease predisposition. Toxicol. Letter; 102 –

103: 173 -183.

• Brown LM, Blair A, Gibson R, Everett GD, Cantor KP, Schuman LM,

Burmeister LF, Van Lier SF, Dick F. 1990. Pesticide exposures and other

agricultural risk factors for leukemia among men in Lowa and Minnesota.

Cancer Res., 50:6585-6591.

• Brüske-Hohfeld I. 2000. Occupational lung cancer risk for men in

Germany: Results from a pooled case-control study. Am J. Epidemiol;

151:384-395

• Cajas-Salazar N, Au WW, Sierra-Torres CH, Slama SA, Alpard SK, Tyring

SK. 2003. Effects of epoxide hydrolase polymorphisms on chromosome

aberrations and risk for lung cancer. Cancer Genet. Cytogenet; 145(2):97–

102.

• Calavert G M, Talaska G, Mueller C.A, Ammenheuser M.M, Au W.W, Fajen

J.M, Fleming L.E, Briggle T, Ward E. 1998. Genotoxicity in workers

exposed to methylbromide. Mutat. Res., 417: 115- 128.

• Canalle R, Burin R, Tone L, Takahashi C, 2004. Genetic polimorphisms

and susceptibility to childhood acute lymphoblastic leukemia.

Environmental and Molecular Murgenesis. 43:100-109.

• Carbonell E, Xamena N, Creus A, Marcos R. 1993. Cytogenetic

biomonitoring in a Spanish group of agricultural workers exposed to

pesticides. Mutagenesis; 8:511–517

• Carbonell E, Valbuena A, Xamena N, Creus A, Marcos R. 1995.

Temporary variations in chromosomal aberrations in a group of

agricultural workers exposed to pesticides. Mutat. Res; 344:127–134.


119

• Carbonell E, Xamena N, Creus A, Marcos R, 1995. Chromosomal

aberrations and sister chromatid exchanges as biomarkers of exposure to

pesticides. Clinical Chem. 41: 1917 – 1919.

• Carbonell E, Puig F, Xamena N, Creus A, Marcos R.1990. Sister chromatid

exchange in lymphocytes of agricultural workers exposed to pesticides.

Mutagenesis. 5:403-405.

• Carpenter D, Arcaro K, Spink D. 2002. Understanding the human Health

effects of chemical mixtures. Enviromental Health perspectives. 110(1). 25-

42.

• Castillo L, Chaverry F. Manual de plaguicidas, guía para América Central.

Costa Rica. 1995: 7 – 9.

• Cervantes R. y col. 2003. Diagnostico, Tratamiento y prevención de

intoxicaciones agudas por plaguicidas; Proyecto PLAGBOL, La Paz -

Bolivia, 9 – 14.

• Cervantes R, Huici O. 2005. Documento de sistematización del proyecto

“PLAGBOL” 2001-2005. Impreso Artes gráficas Sagitario. Primera

edición.11-18 p.

• Cervantes R. 2007. Daños a la salud y al medio ambiente por el uso de

plaguicidas. Segunda Edición. Artes gráficas Sagitario. 10-12 p.

• Cervantes R, Henao G, Morales L, Varona M, Condarco G, Huici O. 2006.

Fortalecimiento de la vigilancia en salud pública de los plaguicidas entre

Colombia y Bolivia Organización Panamericana de la Salud. Organización

Mundial de la Salud; Instituto Nacional de Salud de Colombia; Instituto

Nacional de Salud Ocupacional Bolivia. 12-14p.

• Chen C.L, Liu Q. Relli ng M.V., 1996. Simultaneus characterization of

glutathione S transferase M1 and T1 polymorphisms by polimerase chain

reaction in american whites and black. Pharmacogenetics 6: 187 – 191.

• Coles B, Ketterer. 1990. The role of glutathione and glutathione

transferases in chemical carcinogenesis, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25:

47-70.


120

• Crossen P.E, Morgan W.F. 1978. Cytogenetic studies of pesticides and

herbicides sprayers. N.Z. Med. J. 88:192 – 195.

• Davies H.W, Kennedy S.M, Teschke K, Quintana P.J. E, 1998. Cytogenetic

analysis of South Asian berry pickers in British Columbia using the

micronucleus assay in peripheral lymphocytes, Mutat. Res. 416: 101 –

113.

• Dyer Sm, Cattani M, Pisaniello Dl, Williams Fm, Edwards Jw. 2001.

Peripheral cholinesterase inhibition by occupational chlopyritos exposure

in Australian termiticide applicators. Toxicology, 169: 177-185.

• Eaton DL. 2000. Biotransformation enzymes polymorphism and pesticide

susceptibility. Neurotoxicology, 21: 101 -111.

• Elhajouji A., Santos AP., Van Hummelen PY. Kirsch – Volders M., 1994.

Metabolic differences between whole blood and isolated lymphocytes

cultures for micronucleus (MN) induction by cyclophosfamide and

benzoapyrene. Mutagenesis 9: 307- 313.

• Elin H. Kure, Marit Thorsen and Inger-Lise Hansteen. 1999. Gene

exposure interaction in occupational and environmental epidemiology:

Results from an ongoing study. Norsk Epidemiology; 9 (1): 39-46

• Engel LS, Checkoway H, Kiefer MC, Seixas NS, Longstheth WT Jr, Scott

KC, Hudenell K, Anger WK, Camicioli R. 2001. Parkinsonism and

occupational exposure to pesticides. Occup. Environ. Med. 58: 582 – 589.

• Escriche, I. 1996. Toxicología Industrial de Alimentos, Universidad

Politécnica de Valencia, España, 56.

• Evans R.M. 1988. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily.

Science 240, 4854: 889 – 895.

• Falck G., Catalan J., Norppa H., 1997. Influence of culture time on the

frecuency and contens of human lymphocyte micorenuclei with and

without cytochalasin B. Mutat. Res., 392: 71 – 79.

• Falck G.C, Hirvonen A, Scarpato R, Saarikoski S.T, Migliore L, Norppa H.

1999. Micronuclei in blood limphoicytes and genetic polymorphisms for


121

GSTM1, GSTT1 and NAT2 in pesticide – exposed greenhouse workers.

Mutat. Res., 44: 225-237.

• Fenech M, 1993. The cytokinesis - block micronucleus technique: a

detailed description of the method and its application to genotoxicity

studies in human populations. Mut. Res., 285: 35-44.

• Fenech M, Morley AA. 1985. Measurement of micronuclei in lymphocytes.

Mutat. Res. 147 (1-2): 29-36.

• Fenech M, Morley AA. 1986. Cytokinesis – block micronucleus method in

human lymphocytes: effects of in vivo ageing and low dose x – radiation.

Mutat. Res., 161: 193 – 198.

• Fenech M. and Neville S. 1992. The conversion of excision-repairable DNA

lesions to micronuclei within one cell cycle in human lymphocytes.

Environ. and Molecular Mutagenesis 19: 27-36.

• Figgs L.W, Holland N.T, Rothman N, Zahm S.H, Tarone R.E, Hill R, Vogt

R.F, Smith M.T, Boysen C.D, Holmes F.F, Van Dyck K, Blair A. 2000.

Increased lymphocyte replicative index following 2,4 –

dichlorophenoxyacetic acid herbicide exposure. Cancer Causes Control,

11: 373 – 380.

• Frolichsthal P y Piatti E. 1996. Evaluation of micronuclei in primary

hepatocyte culture in rats treated with organophosphoric compounds. Boll

Chim Farm. 135 (9):541-5.

• Furlong CE, Li Brophy VH, Jarvik GP, Richter RJ, Shih DM, Lusis AJ,

Costa LG. 2000.The PON1 gene and detoxification. Neurotoxicology, 21:

581-587.

• Garaj-Vrhovac V, Zeljezic D. 2002. Assessment of genome damage in a

population of Croatian workers employed in pesticide production by

chromosomal aberration analysis, micronucleus assay and Comet assay. J

Appl Toxicol; 22:249–255.

• García, J. E. 1997. Introducción a los plaguicidas. EUNED. San José.

Costa Rica, 450 p.


122

• Garte S, Gaspari L, Alexandrie AK, Ambrosone C, Autrup H, Autrup JL,

Baranova H, Batum L, Benhamou S, Boffetta P, Bouchadry C, Beskvar K,

Brockmoller J, Cascorbi I, Clapper ML, Coutelle C, Daly A, Dell’ Omo M,

Dolsan V, Dresler CM, Fryer A, Haugen A, Hein DW, Hildeshein A,

Hirvonen A, Hsieh LL, Hingelman – Sundberg M, Kalina I, Kang D, Kihara

M, Kyohara C, Kremers P, Lazarus P, Le Marchand L, Lechner MC, Van

Lieshout EM, London S, Manni JJ, Maugard CM, Morita S, Nazar –

Stewart V, Noda K, Oda Y, Parl FF, Pastorelli R, Persson I, Petters WH,

Rannung A, Rebbeck T, Risch A, Roelandt L, Romkes M, Ryberg D,

Salagovic J, Schoket B, Siedegard J, Shields PG, Sim E, Sinnet D, Strange

RC, Stucker I, Sugimura H, To-Figueras J, Vineis P, Yu MC, Taioli E.

2001. Metabolic gene polymorphism frequencyes in control populations

cancer Epidemiol Biomarkers. Prev., 10: 1239 – 1248.

• Gaspar PA, Hutz MH, Salzano FM, Hill K, Hurtado M, Petzl-Erler ML, y col.

2002. Polymorphisms of CYP1A1, CYP2E1, GSTM1, GSTT1, and TP53

genes in Amerindians. Am J Phys Antrophol; 119:249-56.

• Gauthier E, Fortier I, Courchesne F, Pepin P, Mortimer J, Gauvreau D.

2001. Environmental pesticide exposure as a risk factor for Azheimer`s

disease: a case-control study. Environ. Res., 86: 37-45.

• Ghita C.M. Falck, Ari Hirvonen , Roberto Scarpato, Sirkku T. Saarikoski,

Lucia Migliore, Hannu Norppa, 1999. Micronuclei in blood lymphocytes

and genetic polymorphism for GSTM1, GSTT1 and NAT2 in pesticide-

exposed greenhouse workers. Mutat. Res. 441: 225–237.

• Gómez – Arroyo S, Dias – Sánchez Y, Meneses – Perez MA, Villalobos –

Dictrini R, De León – Rodriguez J. 2000. Cytogenetic. Biomonitoring in a

Mexican floriculture worker group exponed to pesticides. Mutat. Res (386):

219 – 228.

• Gregio D’ArceLP, Colus IM. 2000. Cytogenetic and molecular

biomonitoring of agricultural workers exposed to pesticides in Brazil.

Teratogenesis, Carcinogenesis, & Mutagenesis; 20:161–170.


123

• Hagmar L, Bonassi S, Stromberg U, Mikoczy Z, Lando C, Hansteeen Il,

Montagud Ah, Knudsen L, Norppa H, Reuterwall C, Tinnerberg H, Brogger

A, Forni A, Hogstedt B, Lambert B, Mitelman F, Nordenson I, Salomaa S,

Skerfving S. 1998 a. Cancer predictive value of cytogenetic markers used

in occupational health surveillance programs: a report from an ongoing

study by the European Study Group on Cytogenetic Biomarkers and

Health Mutat. Res., 405 171-178.

• Hagmar L. , S. Bonassi, U. Stromberg, A. Brogger, Le Knudsen, H. Norppa

And C. Reuterwall. 1998b. Chromosomal aberrations in lymphocytes

predict human cancer: a report from the European study group on

cytogenetic biomarkers and health (ESCH). Cancer Research. 58:4117-

4121.

• Hassold T., Abruzzo M., Adkins K., Griffin D., Merrill M., Mille E., Saker.

Zaragoza M., 1996. Human aneuploidy incidence, origin and etiology.

Environ. Mol. Mutagen., 28: 167-175.

• Hayes J.D, Pulford D.J. 1995. The glutathione s-transferase supergene

family regulation of GST and constribution of the isoensyme resistence.

Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 30: 445 – 600.

• Hedde J.A, 1976. Measurement of chromosome breakeage in cultured cells

by the micronucleus technique. En: Mutation – induced chromosome

damage in man. Evamns H.J, Lloyd D.S (Ed.) Univeresity press, Edimburg,

pp. 191 – 200.

• Hernández A. F, Pla A, Gómez M. A, Pena G, Gil F, Pino G. y Rodrigo L. 1998. Susceptibilidad a los insecticidas organofosforados en trabajadores

de invernadero: importancia de los marcadores bioquímicos.Dpto.

Medicina Legal y Toxicología. En: actas del III congreso de la sociedad

española de agricultura ecológica SEAE Valencia: 369 -377.

• Hirvonen A. 1997. Combinations of susceptible genotypes and individual

responses to toxicans. Environ. Health. Perspect. 105 (Suppl. 4): 775 –

758.


124

• Holsaple MP. 2002. Autoinmunity by pesticides: a critical review of the

state of the science. Toxicol Lett. 127, 101-109.

• Hoyos LS, Carvajal S, Solano L, Rodriguez J, Orozco L, Lopez Y, Au WW.

1996. Cytogenetic Monitoring of farmers exposed to pesticides in

Colombia. Environ Health Perspec; 104 Suppl 8:535–538.

• Hsieh B H, Deng JF, Ger J, Tsai WJ. 2001. Acetylcholinesterase inhibition

and the extrapyramidal syndrome: a review of neurotoxicity of

organophosphate. Neurotoxicology 22: 423-427.

• http://www.ine.gob.mx/dgicurg/plaguicidas/download/pytransporte.pdf.

• Hubble JP, Kurth JH, Glatt SL, Kurth MC, Schelleneberg GD, Hassanein

R, Lieberman A, Koller WC. 1998. Gene-toxin interaction as a putative risk

factor for Parkinson’s disease with dementia. Neuroepidemiology 17:96–

104.

• Humbert R, Adler DA, Disteche CM, Hassett C, Omiecinski CJ, Furlong

CE. 1993. The molecular basis of the human serum paraoxonase activity

polymnorphims. Nat. Genet. 3: 73-76.

• Huici O. 2007. El mundo de los plaguicidas. Fundamentos técnicos para el

uso y manejo correcto de plaguicidas. 2ª. ed. Bolivia.: 1- 7.

• IARC. 1991. DDT and asociated compounds En: occupational exposure in

insecticide application and some pesticides. Lyon, France: IARC

Monographs on the evaluation of carcongenic risk to humans. Vol. 53, 179

– 250.

• Infante-Rivard C, Labuda D, Krajinovic M, Sinnett D. 1999. Risk of

childhood leukemia associated with exposure to pestcides and with gene

polymorphisms. Epidemiology 10(5):481–487.

• Inoue M, Tajima K, Hirose K, Kuroishi T, Gao CM, Kitoh T. 1994. Life-style

and subsite of gastric cancer - joint effect of smoking and drinking habits.

Int J Cancer; 54:494-9.

• Jarno Tuimala, Gabor Szekely, Harriet Wikman, Hilkka Järventaus, Ari

Hirvonen, Sarolta Gundy, Hannu Norppa. 2004. Genetic polymorphisms of


125

DNA repair and xenobiotic – metabolizing enzymes: effect on levels of sister

chromatid exchanges and chromosomal aberrations. Mutation Research;

554: 319 – 333.

• Jensen, F. S., Skovgaard, L. T. y Viby-Mogensen, J. 1995. Identification of

human plasma cholinesterase variants in 6.688 individuals using

biochemical analysis. Acta Anaesthesiol Scand, 39: 157-162.

• Joksic G, Vidakovic A, Spasojevic-Tisma V. 1997. Cytogenetic monitoring

of pesticide sprayers. Environ Research. 75(2):113-118.

• Jors E., 2005. Intoxicacion aguda por plaguicidas en pequeños

agricultores del departamento de La Paz- Bolivia. Tesis doctoral.

• Jors E, Gonzales A.R, Ascarrunz M.E, Tirado N, Takahashi C, Lafuente E,

Dos Santos R, Bailon N, Cervantes R, Huici O, Baelum J, Lander F. 2007.

Genetic alterations in Pesticide exposed Bolivian farmers an evaluation by

analysis of chromosomal aberrations and the comet assay. Biomarker

Insights 2: 439–445.

• Kendall R, Anderson T, Baker R, Bens C, Carr J, Chiodo L, Cobb III G,

Dickerson R, Dixon K, Frame L, Hooper M, Martin C, McMurry S, Patino R,

Smith E, Theodorakis C, 2001. Ecotoxicology. En: Curtis D. Klassen.

Editorial Mc Graw Hill. Casarett and Doull’s Toxicology. Sexta Edición. Mc

Graw Hill: pp. 1018 – 1019.

• Kelsey KT, Wienke JK, Ward J. 1995. Sister Chromatid exchanges,

glutathione S-transferase θ deletion and cytogenetic sensitivity to

diepoxybutane in lymphocytes from butadiene monomer production

workers. Mutat. Res. 335: 267-273.

• Kerb R, Brockmoller J, Schlangerhaufer R, Spreger R, Roots I,

Brinkmmann U. 2002. Influence of GSTT1 and GSTM1 genotypes on

sunburn sensitivity. Am. J. Pharmacogenomics, 2: 147-154.

• Ketterer B, Harris JM, Talaska G, Meyer DJ, Pemble SE, Taylor JB, Lang

NP, Kadlubar FF (1992) The human glutathione S-transferase supergene


126

family, its polymorphism, and its e.ectson susceptibility to lung cancer.

Environ Health Perspect 98:87±94

• Kihara M, Noda K, 1995. Risk of smoking for squamous and small cell

carcinomas of the lung modulated by combinations of CYP1A1 and GSTM1

gene polymorphisms in a Japanese population. Carconogenesis 16 (10):

2331 – 2336.

• Kirsch-Volders M, Fenech M. 2001. Inclusion of micronuclei in non-

divided mononuclear lymphocytes and necrosis/apoptosis may provide a

more comprehensive cytokinesis block micronucleus assay for

biomonitoring purposes. Mutagenesis, 16: 51- 58.

• Kirsch-Volder M., Antonina R., Roelants M., Tremp A., Zeiger E., Stefano

B. , Holland N., Peter W., Vande P., DeBoeck M., Godderis L., Haufroid V.,

Ishikawa H., Laffon B., Marcos R., Migliore L, Norppa H., Teixeira J., Zijno

A., Fenech M. 2006. The Effects of GSTM1 and GSTT1 Polymorphisms on

Micronucleus frequencies in Human Lymphocytes In vivo. Cancer

Epidemiol Biomarkers Prev; 15(5).

• Lan Q, He X, Costa D, Tian L, Torhman N, Hu G, Mumford JL. 2000.

Indoor coal combustion emissions, GSTM1 and GSTT1 genotypes and lung

cancer risk: A case-control study in Xuan Wei, China. Cancer

• Lin H J, Han CY, Bernstein DA, Hsiao W, Lin BK, Hardy S. 1994. Ethnic

distribution of the glutathione transferase Mu 1-1 (GSTM1) null genotype

in 1473 individuals and application to bladder cnacer susceptibility,

Carcinogenesis, 15: 1077 – 1081.

• Long J, Covington F, Delaney-Black V, Nordstrom B. Allelic variation and

environmental lead exposure in urban children. AACN Clinical Issues

2002;13(4):550–556.

• Mannervick, B. (1985). The isoenzymes of glutathione transferase. Adv.

Enzymol. 57: 357-417.

• Mannervik B, Awasthi YC, Board PG, Hayes JD, Di Ilio C, Ketterer B,

Listowsky I, Morgenstern R, Muramatsu M, Pearson WR et al. 1992


127

Nomenclature for human glutathione transferases. Biochem J 282:305–

306.

• Mannervik B, Danielson UH. 1988. Glutathione transferases – structure

and catalytic activity. CRC. Crit Rev. Biochem., 23: 283 – 337.

• Mannervik B. 2003.Novel polymorphisms in the glutathione transferase

superfamily. Pharmacogentics, 13: 127-128.

• Maroni M, Colosio C, Ferioli A, Fait A. 2000 Biological monitoring of

pesticide exposure. A review. Introduction. Toxicology, 143. 1-118.

• Marrs TC. 1993 Organophosphate poisoning. Pharmacol Ther. 58:51-66.

• Miller GT. 1999. Environmental science working Herat. Seven Edition.

Wad Worth. Publishing Company. ITP Canada.

• Mora MA, Papoulias D. Nava I, Buckler DR. 2001. A comparative

assessment of contaminants in fish from resacas of the Texas USA –

Tamaulipas, México border region. Environ. Int. 27: 15 -20.

• Norppa H, Renai L, Lindholm C. 1993. Detection of whole chromosome in

micronuclei of cytokinesis human lymphocytes by antikinetochore staining

and in situ hybridization. Mutageneis, 8: 519-525.

• Norppa H, Hirvonen A, Järventaus H, Uusküla M, Taw G, Ojajärvi A, Sorsa

M. 1995. Role of GSTT1 and GSTM1 genotypes in determining individual

susceptibility to sister chromatid Exchange induction by diepoxibutane in

cultured human lymphocytes. Carcinogenesis, 16: 1261 – 1264.

• Obiols Q. J. 1998. NTP 512: Plaguicidas organofosforados (I): aspectos

generales y toxicocinética.

• Ollikainen T, Hirvonen A, Norppa H. 1998. Influence of GSTT1 genotype on

sister chromatid exchange induction by styrene-7, 8-oxide in cultured

human lymphocytes. Environ. Mol. Mutagen., 31: 311-315.

• Oude Ophui Michel B, Manni Johannes J, Peters Wilbert H. M.

Glutathione S-transferase T1 null polymorphism and the risk for head and

neck cancer 2006. Acta oto-laryngol. vol. 126, No3; 311-317.


128

• OMS, 1991. World Health Organization. Safe use of pesticides.

Recommended classification of pesticides by hazard and guidelines to

classification Geneva. (WHO Technical Report Series).

• Paramjit G., Danadevi K., Mahboob M., Rozati R., Saleha B., Rahman MF.

2003. Evaluation of genetic damage in workers employed in pesticide

production utilizing the Comet assay. Mutagénesis. 18: 201-205.

• Pastor S, Gutierrez S, Creus A, Cebulska-Wasilewska A, Marcos R. 2001.

Micronuclei inperipheral blood lymphocytes and buccal epithelial cells of

Polish farmers exposed to pesticides. Mutat Res 495:147–156.

• Pastor BS. 2002. Biomonitorización citogenética de cuatro poblaciones

agrícolas Europeas, expuestas a los plaguicidas, mediante el ensayo de

micronúcleos. Universidad Autónoma de Barcelona. Facultad de ciencias

departamento de genética y de microbíologia. Grupo Mutagenesis. Tesis

Doctoral.

• Pastor S, Gutierrez S., Creus A., Xamena N., Piperikis S., Marcos R.

2001b. Cytogenetic analysis of Greek farmers using the micronucleus

assay in peripheral lymphocytes and buccal cells. Mutagenesis 16:539-

545.

• Pastor S, S. Gutierrez, A. Creus A. Cebuska-Wasilewska, R. Marcos. 2001

Micronuclei in peripheral blood lymphocytes and bucal epithelial cells of

polish farmers exponed to pesticides. Mutat. Res. 495 147-156.

• Paz- y -Miño C., Dávalos MV., Sánchez ME, Arévalo M., Leone P. 2002.

Should gaps be included in chromosomal aberration analysis? Evidence

based on the comet assay. Mutat. Res. 516:57-61.

• Pemble S, Schroeder KR, Spencer SR, Meyer DJ, Hallier E, Bolt HM,

Ketterer B, Tayler JB. 1994. Human glutathione S – transferase Theta

(GSTT1): cDNA cloning and the characterization of a genetic

polymorphism. Biochem. J, 300:271-276.

• Perry P and Wolf R. 1974. New giemsa method for differential staining of

sister chromatid. Nature 251: 156-158.


129

• Pickett CB, Lu Ay. 1989. Glutathion S-transferases: gene structure,

regulation and biological function. Annu. Rev Biochem; 58:743 – 764.

• Quiñones L, Berthou F, Varela N, Simon B, Gill L, Lucas D. 1999.

CYP2E1, CYP1A1 and GSTM1 genetic polymorfisms between French

Caucasian and Chilean populations. Cancer Lett. 141 (1-2): 167-171.

• Ramírez V, Cuenca P. 2002. DNA damage in female workers exposed to

pesticides in banana plantations at Limon, Costa Rica. Spanish. Rev Biol

Trop; 50:507–518.

• Raunio H, Pursiainen KH, Antilla S, Hietanen E, Hirvonen A, Pelkonen O.

Diagnosis of polymorphisms in carcinogen-activating and inactivating

enzymes and cancer susceptibility - a review. Gene 1995; 159:113-21.

• Rebbeck TR. 1997. Molecular epidemiology of the human glutathione s –

transferase genotype GSTM1 and GSTT1 in cancer susceptibility. Cancer

Epidemiol. Biomarkers Prev., 6: 733-743.

• Richeldi I, Sorrentino R, Saltini C. 1993. HLA-DPB1 glutamate 60: a

genetic marker of beryllium disease. Science. 262: 242-244.

• Rupa DS, Reddy PP, Sreemannarayana K, Reddi OS. 1991. Frequency of

sister chromatid Exchange in peripheral lyjmphocytes of male pesticide

applicators. Environ. Molec. Mutagen. 18: 136-138.

• Rushmore TH, Pickett CB. 1993. Glutathion S-transferase Structure,

regulation and therapeutic implications. J. Biol.Chem., 268: 11475 –

11478.

• Sailaja, N, Chandrasekhar, M, Rekhadevi, P.V. et al. 2006. Genotoxic

evaluation of workers employed in pesticide production. Mutat. Res.,

609:74–80. Sasaki, Y.F, Sekihashi, K, Izumiyama, F. et al. 2000. The

Comet Assay.

• Sala M, Sunyer J, Herrero C, To –Figueras J, Grimalt J. 2001. Association

between serum concentrations of hexaclorobenzene and polyclorobiphenils

with thyroid hormone and liver enzymes in a simple of the general

population. Occup. Environ. Med., 58: 172 – 177.


130

• Saleha Banu B, Danadevi K´rahman MF, Ahuja YR, Kaiser J.

2001.Genotoxic effect of monocrotophos to sentinel species using comet

assay. Food Chem. Toxicol., 39:361-366.

• Sandberg AA (1982) Sister chromatid exchange in human states. En:

Sandberg AA (Ed) Sister Chromatid Exchange. Liss, New York, pp 619-

651.

• Scarpato R, Migliore L, Angotzi G, Fedi A, Miligi L, Loprieno N. 1996a.

Cytogenetic monitoring of a group of Italian floriculturists: no evidence of

DNA damage related to pesticide exposure. Mutation Research. 367: 73-

82.

• Scarpato R, Migliore L, Hirvonen A, Falck G, Norppa H. 1997. Influence of

GSTM1 and GSTT1 polymorphism on the frequency of chromosome

aberrations in lymphocytes of smokers and pesticide – exposed greenhouse

workers. Mutat. Res. 389: 227-275.

• Scarpato R , Miliore L, Hirvonen A, Falck G, Norppa H. 1996b. Cytogenetic

monitoring of occupational exposure to pesticides: characterization of

GSTM1, GSTT1 and NAT2 gentoypes. Environ. Mol. Mutagen., 27: 263 –

269.

• Shaham, J., Kaufman, Z., Gurvich, R. and Levi, Z. 2001. Frequency of

sister-chromatid exchange among greenhouse farmers exposed to

pesticides. Mutat Res 491: 71-80.

• Seidegard J, Vorachek WR, Piero RW, Pearson WR. 1988. Hereditary

differences in the expression of the human Glutathion transferase active

on trans-stilbene oxide are due to gene detection, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 85: 7293 – 7297.

• Smith G, Smith CAD, Wolf CR. 1995. Pharmacogenetic polymorphisms.

En: Environmental Mutagenesis. Philips DH. Venitt S (Eds). BIOS

Scientific Publishers. Ltd., UK.


131

• Šram RJ. 1998. Effect of glutathione S-transferase M1 polymorphisms on

biomarkers of exposure and effects. Environ. Health Perspect, 106 (Suppl.

1): 231-239.

• Steenland K, Jenkins B, Ames RG, O'Malley M, Chrislip D, Russo J. 1994.

Chronic neurological sequelae to organophosphate pesticide poisoning. Am

J Public Health 84:731-736 (Sultatos LG. 1992. Role of glutathione in the

mammalian detoxification of organophosphorus insecticides. In: chambers

JE, Levi P (Eds) Organophosfates Chemistry, Fate and Effects. New York

Academic Press; pp: 155 – 168.

• Stocker R and BN Ames. 1987. Potential role of conjugated billers bin and

cooper in the metabolism of lipid peroxides in bile. Proc. Natl. Acad. Sci.

(USA) 84: 8130 – 8134.

• Sultatos LG.1992. Role of glutathione in the mammalian detoxification of

organophosphorus insecticides. In: Organophosphorus Chemistry, Fate

and Effects. New York: Academic Press; 155 – 168.

• Sultatos LG. 1994. Mammalian Toxicology of organophosphorous

peseticides J. Toxicol. Environ. Health, 43: 271 – 289.

• Surrallés J. Antoccia A, Degrassi F. Tanzarella C. 1994. The effect of

cytochalasyn –B concentration on the frequency of micronucleus induced

by four standard mutagens. Results from two laboratories. Mutagenesis 9:

347-353, 1994.

• Surrallés J, Catalan J, Creus A, Norppa H, Xamena N, Marcos R. 1995.

Micronuclei induced by alachlor mitomycin C and vinblastine in human

lymphocytes presence of centromeres and kinetochores and influence of

staining technique. Mutagenesis, 10: 417 – 423.

• Surrallés J, Natarajan AT. 1997. Human lymphocytes micronucleus assay

in Europe. An international survey. Mutat. Res., 392: 165-174.

• Taningher M. Malacarne D, Izzoti A, Ugolini D, Parodi S. 1999. Drug

metabolism polymorphisms as modulaitors of cancer susceptibility. Mutat.

Res., 436: 227 – 261.


132

• Tang J, Cao Y, Rose RL, Brimfield AA, Dai D, Goldstein JA, Hodgson E.

2001. Metabolism of chlorpyrifos by human cytochrome P450 isoforms

and human mouse and rat liver microsomes. Drug Metab. Dispos. 29:

1201 – 1204.

• Titenko-Holland N., Windham G., Kolachana P, Reinish F, Parvatham S,

Osorio A.M, Smith M.T. 1997. Genotoxicity of Malathion in human

lymphocytes assessed using the micronucleus assay in vitro and in vivo: a

study of malathion-exposed workers, Mutat. Res. 388: 85-95.

• Tomatis, L. 1997. Cancer: Causes, Occurrence and Control. IARC

Scientific Publ. No. 100. Lyon, France: IARC.

• Toruner GA, Akerli C, Ucar A, Aki T, Atsu N, Ozen H, Tez M, Cetinkaya M,

Ozcelik T. 2001. Polymorphisms of glutathione s-tranferase genes (GSTM1,

GSTT1 and GSTT1) and bladder cáncer susceptibility in the Turkish

population. Arch. Toxicol., 75: 459 – 464.

• Tsuchida S. 1997. Glutathione transferases En: Encyclopedia of cáncer.

Vol. 1 Academic Press. Inc., pp. 733-743.

• Venegas W, Zapata I, Carbonell E, Marcos R,. 1998. Micronuclei analysis

in lymphocytes of pesticide sprayers from Concepción, Chile. Teratolog.

Carcing. Mutagen. 18:123-129.

• Vogel F, Motulsky G. 1997. Human genetics. 3rd edn. Berlin: Springer-

Verlag, 1997.

• Walker CH. 1998. The use of biomarkers to measure the interactive effects

of chemicals. Ecotoxicol Environ Saf. 40 (1-2):65-70.

• Windham Gc. Titenko-Holland N, Osorio Am, Gettner S, Reinisch F, Haas

R, Smith M. 1998. Genetic monitoring of malathion-exposed agricultural

workers. Am J Med. 33(2):164-74.

• Wolf S. y Perry P. 1974. Differential giemsa staining of sister chromatids

and the study of sister chromatid exchanges without auto radiography.

Chromosoma. 48 (4): 341 – 345.


133

• Woodward G. 2001. Autism and Parkinson´s disease. Med Hypotheses;

56(2): 246-9.

• Yasmashita M, Tanaka J, Ando Y. 1997. Human mortality in

organophosphate poisonings. Vet Hum Toxicol 39:84-85.

• Yeary, R.A., Eaton, J., Gilmore, E., North,B. and Singell,J. 1993. A

multiyear study of blood cholinesterase activity in urban pesticide

application. J. Toxicol. Environ. Health. 39, 11–25.

• Yu-Chen Lei, Shing-Jen Hwang, Chuen-Chau Chang, Hsen-Wen Kuo, Gin-

Chyuan Luo, Ming J.W. Chang, Tsun-Jen Cheng. 2002. Effects on sister

chromatid exchange frequency of polymorphisms in DNA repair gene

XRRCC1 in somkers.Mutation Research 519: 93-101.

• Zheng T, Zahm SH, Cantor KP, Weisenburger DD, Zhang Y, Blair A. 2001.

Agricultrural exposure to carbamate pesricides and risk of non – Hodking

linphoma. J. Occup. Environ Md. 43: 641 – 649.

• Zheng W, Wen WQ, Gustafson DR, Gross M, Cerhan JR, Folsom AR. 2002.

GSTM1 and GSTT1 polymorphisms and postmenopausal breast cancer

risk. Breast Cancer Res. Treat., 74: 6-16.


134


135


136

ANEXO 2 Tabla 31. Plaguicidas Prohibidos en Bolivia

Nombre del veneno Nombre Comercial DDT DDT Matador Endrin Endrín Aldrin Aldrín Mirex Mirex Dieldrin Dieldrín Lindano Lindano, Gama BHC Heptacloro Heptacloro, Clorahep Metoxicloro Metoxicloro, Marlate Hexacloro o benceno BHC Pentaclorofenol Pentaclorofenol, Dowcide Endosulfan Cyclodon, Thiodan Toxafeno Toxafeno Clordano Clordano Heptacloro Heptacloro

Fuente: Huci. 2004. El mundo de los plaguicidas. Cartilla 2. Proyecto Plaguicidas Bolivia

Tabla 32. Plaguicidas de uso permitido en Bolivia FUNGICIDAS

INGREDIENTE ACTIVO NOMBRE COMERCIAL Nº DE REGISTRO Azoxystrobin Priori 1722

Azufre Kumulus- R DF Sulflox 720

1378 1395

Benomil Benlate Benomil

362 1254

Captan Merpan 48 FW Captan 50 PM Captan 750 Merpan 80 WDG

1495 1253 1342 1487

Captan + Molibdeno Captan 250 Moly 1034

Carbendazin Bavistin FL 910

Carboxin- Thiran Vitavax 200 FF 1285

Cyproconazole Alto 100 SL 1426

Clorotalonil Bravo 720 Bravo 500 Hortyl 50

1647 724 1368

Cymoxanil + Mancozeb Curathane 1434

Difenoconazole Score 250 EC 1389

Edifenphos Hinosan 1201

Epoxiconazol + Carbendazin Duett 1448

Flusilazole Punch 1148

Flutriafol Impact Vincit F

1341 1425

Folpet Folpan 80 PM 728


137

HERBICIDAS

INGREDIENTE ACTIVO NOMBRE COMERCIAL Nº DE REGISTRO

2,4 D Sal amina DMA - 6 3345

Acetoclor Acetoclor 1275

Acifluorfen + Bentazon Galaxi Top 1556

Aclonifen Prodigio 1296

Alachlor Alanex 48 EC 778

Ametrina Ametrex 50 FW 1359

Atrazina Atranex 50 FW 1223

Bentazon Basagran R 600 1376

Bromacil Hyvar X 1514

Butroxydim Falcon 1622

Cicloxydim Focus Ultra 1191

Clethodim Select 24 EC 1414

Clomazone Command LE 1115

Clorimuron Spin 25 PE 1309

Dicamba Banvel 480 SL 1435

Diquat Reglone 1032

Diuron Karmex SF 1141

Fomesafen Flex 250 848

Metribuzin Sencor 480 1295

MSMA Arsonex 96 1301

Paraquat Gramoxone 365

Folpan 80 WDG 1343

Folpet + Prochloraz Mirage - F 1344

Fosetil Aluminio Defense 80 WP 1418

Iprodione Rovral 744

Iprodione + Thiram Rovrin 1002

Kasugamicina Kasumin 1379

Mancozeb Dithane Dithane M - 45 Manzate 200 Tiozeb Manzeb

978 384 661 1654 1552

Mancozeb + Metalaxil Metaman WP Hieloxil Mix 72

1370

1551

Metiran Polyram DF 1501

Ofurace + Mancozeb Patafol 1259

Oxicloruro de Cobre Cupravit Cobox Kupoxil Roxicop Fungicobre

1290 1600 1082 1512 1464

Prochloraz Mirage 45 EC 1264

Propiconazole Bumper 25 EC 1263

Propineb Antracol 1210

Propineb + Cymonaxil Fitoraz 1209

Sulfato de Cobre Pentahidratado Pitón- 27 1711

Tebuconazole Folicur 259 EC Folicur 250 EW

1337 1700

Thiabendazol Tecto 100 1261


138

INSECTICIDAS

INGREDIENTE ACTIVO NOMBRE COMERCIAL Nº DE REGISTRO

Aldicarb Temik 1506 1294

Carbaryl Sevin 480 1074

Ciflutrina Baytroid 50 1286

Cipermetrina Arrivo 25 EC 1672

Clorpirifos Lorsban 48 EC 876

Deltametrina Decis 5 1266

Dianizon Diazol 60 EC 1415

Dimetoato Dimetoxion 1553

Endosulfan

Thiodan 35 Thiosulfan Endozol

1276 1272 1713

Fentoato Elsan 906

Fipronil Regent 20 G 1351

Lufenuron Match 50 EC 1373

Metamifodos Tamaron 600 1280

Methomil Lannate 90 1515

Profenofos Curacron 500 EC 513/1335

Triclorfon Dipterex 1233

Triflumuron Alsystin 25 PM 1205


139

ANEXO 3. Hoja de información a los participantes en el estudio

PROYECTO: POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA GSTM1 Y LA GSTT1 COMO MODIFICADORES DE RIESGO MUTAGÉNICO EN AGRICULTORES EXPUESTOS A PLAGUICIDAS N° de identificación………………….

HOJA DE INFORMACIÓN

Estimado señor (a): El Instituto de Genética y el proyecto Plaguicidas Bolivia se encuentran realizando un proyecto

de investigación para evaluar el riesgo genotóxico y la susceptibilidad genética por exposición a plaguicidas

mediante los métodos de micronúcleos e Intercambios entre cromatides hermanas en linfocitos de sangre periférica

y genotipificación.

Las comunidades de Caranavi, Guanay, Mecapaca y Palca, tienen a la agricultura como la principal actividad

económica. Para la producción de diferentes productos usan diferentes agroquímicos y plaguicidas. Sólo un

pequeño porcentaje de los plaguicidas aplicados, alcanza su objetivo, acabando generalmente en el aire, en el agua

de beber, en los alimentos y en organismos sobre los que no se tenía ninguna intención de hacer llegar el plaguicida,

entre ellos el hombre. La exposición a plaguicidas representa un riesgo potencial para las personas que viven en el

las comunidades de Caranavi, Guanay, Mecapaca y Palca, ocasionando daños en la salud, provocando neuritis,

manifestaciones neurológicas y psiquiátricas, trastornos hepatorrenales, y otras enfermedades. Se ha determinado

que en la comunidad donde Ud. vive se encuentra lo suficientemente cerca de la exposición de plaguicidas y podría

estar siendo contaminado por ellos. En un primer estudio piloto, se ha encontrado que el grupo expuesto a

plaguicidas, presenta daño genotóxico, es decir que tiene riesgo de contraer en el futuro alguna enfermedad crónica

degenerativa; además en este estudio se evaluará la susceptibilidad genética a través de la identificación de las

diferencias interindividuales que hacen que un individuo sea más susceptible o responda de manera diferente, con

mayor riesgo para la salud, frente a la exposición a plaguicidas.

Por estas razones, es que solicitamos su participación en este estudio. Con ello Ud. contribuirá al conocimiento

sobre estos contaminantes y permitirá que se le diagnostique oportunamente cualquier alteración en su salud Si Ud.

acepta participar, le pediremos contestar preguntas sobre sus datos personales y sus hábitos, para determinar su

exposición a plaguicidas encuesta. Además de eso, permitirnos la toma de una muestra de sangre y mucosa bucal.

Las muestras de sangre y mucosa bucal serán obtenidas por una persona profesional, y analizadas en un laboratorio

de alta calidad y sin costo para usted, pero tampoco usted recibirá ningún tipo de retribución por participar en el

estudio.

Su participación es absolutamente voluntaria, y si Ud. decide hacerlo le rogamos firmar su consentimiento en las

líneas siguientes. Esperamos contar con su colaboración, ya que los resultados de este estudio irán en directo

beneficio de Ud. y de la comunidad.

Dra. Noemí Tirado Bustillos

CI: 2369439 L.P. INVESTIGADORA PRINCIPAL.


140

Consentimiento informado

PROYECTO: POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA GSTM1 Y LA GSTT1 COMO MODIFICADORES DE RIESGO MUTAGÉNICO EN AGRICULTORES EXPUESTOS

A PLAGUICIDAS

N° de identificación………………….

CONSENTIMIENTO INFORMADO

Yo _____________________________ con CI: __________________

Dirección: ------------------------------------------- Comunidad: …………………………………

Tengo conocimiento del trabajo de investigación que están realizando el Instituto de Genética y

el proyecto Plaguicidas Bolivia, para evaluar el riesgo genotóxico y la susceptibilidad genética

por exposición a plaguicidas en agricultores de las comunidades de Caranavi, Guanay,

Mecapaca y Palca.

Después de haber leído y haberme informado en detalle del estudio, doy mi consentimiento

para participar en el estudio.

Entiendo que mi participación es voluntaria.

______________________________________________

Nombre, CI y Firma del participante.

__________________________

Dra. Noemí Tirado Bustillos.

CI: 2369439 L.P.

INVESTIGADOR PRINCIPAL.

_____________________________________________

Tec. Sup. Marina Cuti.

RESPONSABLE DE TOMA DE MUESTRA.

______ de ______________ de 200___


141

ANEXO 4. Mapas de las comunidades de estudio

Mapa de Caranavi


142

Mapa de Mecapaca


143

Mapa de Palca

POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA GSTM1 Y LA GSTT1 COMO ...

Documents

Transcript of POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA GSTM1 Y LA GSTT1 COMO ...