Preparação de Amostras Biológicas para análise por MEV

Maria Teresa S.Craveiro Martins de AlmeidaDepartamento de Biologia

Preparação de Amostras Biológicaspara análise por MEV

Centro de Biologia Molecular e Ambiental Centre of Molecular and Environmental Biology

WORKSHOP - Caracterização Avançada de MateriaisPreparação de amostras para análise por MEV - 12 de Julho, 2011

• 1. Utilidade em Biologia

• 2. Aplicações - tipos de material

• 3. Um exemplo concreto

• 4. Fases de preparação para MEV

• 5. Secagem pelo ponto crítico do CO2

• 6. Alguns resultados

WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV

Sumário

• Estudo da superfície externa(análise mais pormenorizada da topografia; demonstação de situações ou fenómenos fisiológicos)

WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV

1. Utilidade em Biologia

Caracterização(não apenas para fins taxonómicos)

• Organismos (unicelulares; pluricelulares)

• Células isoladas (ex. macrófagos)

• Estruturas de organismos


2. Aplicações em Biologia


Importante:

- Conhecimento da amostra (tipo, natureza, dimensão)

- Definição dos objectivos da observação/análise

- Conhecimento dos métodos de preparação disponíveis e da sua adequação ao material em estudo


50 µm

• Algumas estruturas de organismos, secas (desidratadas) ou queratinizadas, não necessitam de tratamento prévio particular

Porção de olho composto de díptero Extremidade da pata de um insecto

Cabelo liso Cabelo frisado - encaracola

www.ppws.vt.edu/~sforza/ nema/wire_rkn1.jpg

Estiletewww.invasive.org/ images/192x128/1356037.jpg


Estiletes extraídos manualmente de nemátodes, sob o microscópio invertido,: Meloidogyne spp. e Trichodorus spp.


Estrutura superficial da levedura Saccharomyces cerevisiae

Levedura patogénica - Candida albicans

Alguns exemplos de aplicação da MEV na observação de materiaisbiológicos

WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV WORKSHOP - Preparação de amostras biológicas para análise por MEV

Biofilme de Candida albicans - estirpe BPW17

Ferreira, C., Silva, S., Ferreira-Oliveira, F., Pinho, E., Henriques M. & Lucas, C. 2010. Candida albicans virulence and drug-resistance requires the O-acyltransferase Gup1p. BMC Microbiol. 10: 238.


Wt

gup1!

20 µm

Ferreira, C., Silva, S., Ferreira-Oliveira, F., Pinho, E., Henriques M. & Lucas, C. 2010. Candida albicans virulence and drug-resistance requires the O-acyltransferase Gup1p. BMC Microbiol. 10: 238.

Diferenciação do crescimento da levedura Candida albicans - estirpe selvagem e mutante


Fig. 3. Wall morphology of the Scgup1 mutant. Scanning electron micrographs showing the morphology of the cell surface of the W303-1a (columns 1 and 2) and the gup1 mutant (columns 3 and 4). Cells were grown to exponential phase in YPD at 30°C and 37°C, YPD supplemented with 1M NaCl, and YPD subsequently treated with lyticase for 30min or with Zymolyase for 5 min at 37°C. Bar = 2 mm.

Ferreira, C., Silva, S, van Voorst F., Aguiar, C., Kielland-Brandt, M.C., Brandt, A. & Lucas, C, 2006. Absence of Gup1p in Saccharomyces cerevisiae results in defective cell wall composition, assembly, stability and morphology. FEMS Yeast Res. 6: 1027–1038.

• Caracterização de nemátodes


3. Outra aplicação particular

Nemátodes

http://soils.usda.gov/education/facts/hands.jpg

Espécies conhecidas (descritas): ± 30 000

100 000 - 1 milhão de espécies

milhares de nemátodes

Os animais mais abundantes do planeta

Estimativa: (De Ley & Blaxter, 2002; Blumenthal & Davis, 2004)

Nemátodes Fitoparasitas (parasitas das plantas)

Nemátodes

- Responsáveis por 13% das perdas agrícolas e florestais,

ao nível mundial (US$ 100 mil milhões, anualmente)

- Grupo de animais muito numeroso e abundante

- Distribuição mundial: ampla - Diversidade de habitats: marinho, água doce e terrestre

naturlink.sapo.pt/ ResourcesUser/Agricultura%2...

Nemátode-da-madeira do pinheiro - Bursaphelenchus xilophilus

Alguns exemplos de prejuízos causados em culturas, devidos a nemátodes fitoparasitas

Danos provocados por Trichodorus primitivus num campo cultivado com beterraba sacarina, à esquerda (A. Steele)

(Fotografia: Society of Nematologists)

Efeitos nas plantas/culturas: danos/ prejuízos

- directos - nas raízes (durante o processo de alimentação)

- indirectos - transmissão de tobravírus (geralmente muito mais prejudiciais)

- ectoparasitas

- vectores de vírus

NemátodesTrichodoridae

100 nm vírus

Controlo

Identificação correctadas espécies(Caracterização)

Caracterização morfológica das espéciesM.O.M.E.V.

Almeida, M.T.M. de, Santos, M.S.N. de A, Abrantes, I.M. de O. & Decraemer, W. (2005). Paratrichodorus divergens sp. n., a new potential virus vector of tobacco rattle virus and additional observations on P. hispanus Roca & Arias, 1986 from Portugal (Nematoda: Trichodoridae). Nematology. 7 (3): 343-361.

Almeida, M.T.M., 1993

Maximum Likelihood treeshowing relationships amongTrichodorus and Paratrichodorusspecies inferred from rDNA 18S

region.

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA

P. pachydermus - Sct

Paratrichodorus sp. A - Pt

P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl

Prismatolaimus intermedius

I – AP. minor

I – BT. primitivus

I – CT. beirensisT. lusitanicusT. emarginatusT. spatulatus

II – A

P. porosusP. alliusP. teres

II – B

P. anemonesP. divergensP. hispanusP. pachydermusParatrichodorus sp. A

P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

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83

89

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

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83

89

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

99

100P. minor - Pt

P. minor - Gr

T. primitivus - Sct

T. primitivus - Pt

T. lusitanicus - Pt

T. emarginatus - Pt

T. spatulatus - Pt

T. beirensis - Pt

P. teres - Gr

P. allius - USA



P. hispanus - Pt

P. divergens - Pt

0.1

77

77

100

68

89

83

89

Clusters

P. anemones - Engl


I – AP. minor



II – A


II – B


P. porosus - Pt

Clusters

II

I

Phylogenetic analysis of trichodorids

Duarte, 2006

Caracterização morfológica e molecular de espécies de nemátodes tricodorídeos

• Colheita do material biológico

• Isolamento do material no Laboratório


4. Fases da preparação - MEV

• Morte e fixação

• Desidratação

• Secagem

• Montagem

• Revestimento

• Observação/ análise

Preparação para MEV:

O sucesso do resultado final depende de todas as fases (e pormoneres) da preparação da amostra!


Colheita do material biológico !"#$%&'()"

A colheita de nemátodes fitoparasitas pode ser morosa

Amostras de solo colhido na zona da rizosfera das plantas

Sobreiros - montado no Alentejo (projecto FCT em curso)

O isolamento dos nemátodes fitoparasitas vivos,do grupo taxonómico pretendido, ao microscópio, é um processo moroso; frequentemente a espécie pretendida está representada em números baixos - insuficientes.

Fixação - essencial para a preservação da integridade das estruturas biológicas sujeitas a desidratação posterior e vácuo


• TAF (MO) - 48 h (pode ser conveniente)

• Glutaraldeído - a 2% (4-8 ºC, 48 h)

Lavagens: tampão de cacodilato de sódio 0.1 M

(Pode ser necessária a morte prévia, rápida, pelo calor)

• Tetróxido de ósmio a 2% (8-18 h, no escuro)

(malha de 5 μm)

Atenção: pH, tempos, concentrações, temperatura

Glutaraldeído(fixador potente de MEV)

Tetróxido de ósmio

Estabilizador proteico

Estabilizador lipídico e proteico;

(Pós-fixador)

aumenta o contraste

Fixação


Equipamento para o processo de fixação de nemátodes para a MEV


10 µm

Levedura Saccaromyces cerevisiae sujeita a fixação com glutaraldeído


Efeito bem evidente na levedura Saccaromyces cerevisiae, não sujeita a fixação com glutaraldeído


5 µm 5 µm

Efeito da fixação com glutaraldeído na preparação da bactéria Escherichia coli por MEV: A - não sujeita a fixação; sujeita à acção do fixador

A B


Desidratação - indispensável para sujeitar o material ao vácuo

• série alcoólica* Vácuo

etanol a: 5, 10, 25, 50, 75, 95, 100 %100 % - 3 passagens

(15 minutos cada passagem)

(*ou com acetona)

• Aparelho - Secador


5. Secagem pelo ponto crítico

• Agente: CO2*

Secagem

“Balzers”* ou Freon

• Procedimento


1. Colocação dos espécimes na câmara

2. Arrecimento: 10 ºC

3. Lavagem (s) com CO2 (5-10 ciclos)

4. Aquecimento/ secagem (35-40 ºC)

Alguns materiais poderão oferecer mais dificuldade na questão do suporte para colocação na câmara- ex: células que crescem sobre um substracto

• Procedimento


5. Evaporação

CO2 — 31º C; 73.8 bar Freon — 40º C; 39.8 bar


3 µm

10 µm

Nemátodes tricodorídeos (MEV)

Superfície cuticular com numerosos detritos aderentes


5 µm

Superfície cuticular de nemátode tricodorídeoperfeitamente livre de detritos/ partículas aderentes

Paratrichodorus porosus - fêmea

Acção da secagem pelo ponto crítico do CO2


Montagem

1 mm

6. Manutenção do material para um excicador até ao revestimento - metalização.

exemplares (nemátodes)

fita-cola dupla, carbonadacabelo - suporte

exemplares (nemátodes)

suportemetálico

Fixação: sobre fita-cola dupla carbonada, numa lamela de vidro circular, ou directamente no suporte metálico


Revestimento

Revestimento condutor - com ouro (ou ouro e platina)

Å

(Necessário, uma vez que o material biológico não é condutor)


Análise/ Observação

Análise - observação


Alguns Resultados

Sampaio, P. & Pais, C., 2008

10 µm

Acção de macrófagos sobre a levedura patogénica, Candida albicans - processo de reconhecimento e fagocitose.


1 µm

1 µm

5 µm

(Almeida, M.T.M., 1993) (Almeida et al., 2005)Cauda de macho de Paratrichodorus divergens

Fêmea de Paratrichodorus sp.


Miranda, S. & Almeida, M.T.M., 2011

Fêmea de Trichodorus sp.


10 µm

Silva, L. & Almeida, M.T.M., 2006

!

Pormenores cuticulares de fêmea e de macho deParatrichodorus sp. e Trichodorus sp.



Pormenores cuticulares da cauda de macho de Paratichodorus sp.



10 µm

Pormenores cuticulares da cauda de macho de Paratichodorus sp.



Cutícula de nemátode do género Trichodorus

Importância da análise da estrutura cuticular superficial de géneros de nemátodes da família Trichodoridae

Obrigada pela atenção

Preparação de Amostras Biológicas para análise por MEV

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