Técnicas de Preservação de Microrganismos

Lara Durães Sette

CBMAI-CPQBA/UNICAMP

lara@cpqba.unicamp.br

Importância da preservação

armazenamento de culturas por longos períodos e utilização periódica para pesquisa e/ou produção

– contaminação– perda de viabilidade– mutação (perda das características fisiológicas)

solução → metodologia de preservação de longa duração– diminuição do crescimento e das atividades metabólicas

crescimento em meio mínimo resíduos metabólicos podem comprometer a viabilidade da cultura

Importância da preservação

preservação a longo prazo – evita problemas com o novo isolamento de microrganismos– economia de tempo, mão de obra e custos com material de consumo

importante função da coleção de culturas– pesquisadores: falta de experiência e/ou equipamentos para preservação

por períodos prolongados– garantia de sobrevivência, estabilidade e pureza

Escolha do método de preservação

pontos a serem considerados

– manutenção da viabilidade: perda de células no processo de preservação e durante o armazenamento

– manutenção das propriedades originais: perda de características de interesse científico ou industrial

– pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo

– custos de preservação e manutenção

Escolha do método de preservação

– tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento

– importância do acervo: conseqüência de sua eventual perda; culturas com potencial biotecnológico → preservação por mais de um método

– necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada para embalagem de envio e condições de transporte

– disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e financeiros

Métodos de preservação

curto prazo– repique contínuo

médio prazo– preservação em óleo mineral– preservação em água– congelamento a -20°C– secagem em sílica, solo e papel de filtro

longo-termo– liofilização– congelamento a -80°C– criopreservação em nitrogênio líquido

princípio– diminuição do metabolismo (meios mínimos; baixa temperatura)

fatores a serem considerados– meio adequado para manter a cultura– temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 2-3 meses; geladeira

(4 a 7 ºC) de 4-6 meses– freqüência entre as transferências: determinação empírica

minimizar o n° de repiques → evitar a seleção de mutantes examinar a pureza em cada transferência conservar em duplicata

Repique contínuo

Repique contínuo

vantagens– baixo custo– não requer equipamentos especializados– o manuseio é simples

desvantagens– riscos de contaminação e possível perda da linhagem– perda de características morfológicas, fisiológicas ou patogenicidade– seleção de células atípicas (variantes ou mutantes)– supervisão especializada– mão-de-obra– espaço relativamente grande para a armazenamento

Repique contínuo

princípio– diminuição da atividade metabólica

fatores a serem considerado (Castellani)– espessura do ágar– número de blocos na água

Preservação em óleo mineral e em água

Preservação em óleo mineral

Preservação em óleo

armazenamento em geladeira

vantagens- ↓ custo de equipamento

- evita contaminação por ácaros

desvantagens- necessidade de mais transferências

até que a cultura revigore- requer espaço para amazenamento

Preservação em água (Castellani)

Geladeira

Blocos de ágar de 4-6 mm3 10-15 mL água destilada esterilizada

Preservação em água

vantagens- boa taxa de viabilidade

- evita contaminação por ácaros

desvantagens- limitado a organismos que

aderem ao ágar (Castellani)- dificuldade da retirada dos cubos

na reativação (Castellani)- crescimento durante a estocagem- requer espaço p/ amazenamento- riscos de contaminação

Preservação em água

armazenamento em geladeira

Secagem

princípio– diminuição do metabolismo por desidratação e conservação em geladeira

fatores a serem considerados– tipo de célula– idade da cultura– concentração celular– condições de estocagem

Secagem em sílica e em solo

Secagem em papel de filtro

Secagem

vantagens– simples e de baixo custo– não requer equipamento especial– estabilidade elevada– ácaros não sobrevivem

desavantagens– métodos limitados a bactérias e fungos filamentosos esporulados– risco de contaminação devido ao manuseio sucessivo– papel: poucos dados sobre o sucesso do método

Liofilização

princípio– remoção da água por sublimação

fatores a serem considerados– tipo de células– idade da cultura– concentração celular– agentes crioprotetor– condições de estocagem– método de reidratação

Liofilização

agentes crioprotetores– reduzem danos durante o congelamento e descongelamento– estabilidade ao microrganismo contra os efeitos adversos da estocagem

leite desnatado (skim milk) 10% leite desnatado 10% + inositol 5% sacarose 7% + peptona 7% inositol 5% em soro de sangue de cavalo

Liofilização

3 mL

Skim Milk

Cultura pura 0,2 mL

na ampola

Maçarico Liofilizador

Maçarico

Liofilização - reativação

Liofilização

vantagens– vedação total da amostra– longa viabilidade– estabilidade elevada em muitas espécies– produção em larga escala– não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz)– fácil distribuição e transporte

desvantagens– muitas espécies não sobrevivem ao processo– viabilidade ocasionalmente insatisfatória– mão-de-obra especializada– requer equipamentos sofisticado

Congelamento em ultrafreezer

princípio– indução da dormência do microrganismo– armazenamento a - 80˚C

fatores a serem considerados– tipo de microrganismo– idade da cultura– concentração celular– agente crioprotetor (dimetilsufoxido 10%; glicerol 10% ou concentração

maior)– condições de estocagem– método de descongelamento

Congelamento

10 mL

Fungos filamentosos não esporulados

Bactérias, arqueas e leveduras

Fungos filamentosos esporulados

7 mL

1 mL

1 mL1 mL

Congelamento em ultrafreezer

Congelamento em nitrogênio líquido

princípio – indução da dormência do microrganismo– armazenamento a - 196˚C

fatores a serem considerados– tipo de microrganismo– idade da cultura– concentração celular– agente crioprotetor– condições de estocagem– método de descongelamento

Congelamento em nitrogênio líquido

Congelamento em nitrogênio líquido

vantagens– condições estáveis por longos períodos– vedação completa, evitando contaminação– utilização para esporulados e não esporulados

desvantagens– viabilidade ocasionalmente insatisfatória– requer equipamento sofisticado– suprimento contínuo de N2

– boa infra-estrutura – caso de acidentes de vazamento

Controle de qualidade de preservação

contagem de população viável antes e após preservação– determinar a taxa de mortalidade do microrganismo específico no

protocolo utilizado– aplicável a métodos de médio e longo-termo– imprescindível para garantia de preservação de longo-termo

pureza– logo após o processamento do lote

viabilidade– primeira pós: até um mês após o processamento– segunda pós em diante: anualmente

Controle de qualidade de preservação

Suspensão de células em crioprotetor

0,1 mL 0,1 mL0,1 mL0,1 mL

(10-8)(10-6) (10-4)(10-2)9,9 mL água + 0,1% ágar

10-2 10-4

10-8 10-6

no de células mL-1 inoculados na ampola = (no de colônias em 0,1 mL = 3 gotas) x 10 x (fator de diluição) UFC/mL