XVIII Jornada de Iniciação Científica PIBIC CNPqlF APEAMlINPA Manaus - 2009

PRESERVAÇÃO E MANUTENÇÃOMICRORGANISMOS FITOPATOGÊNICOS.

DE CULTURAS DE

Camila de Paiva NOGUEIRA1; Rogério Eiji HANAOA2;Rosalee Albuquerque COELHONETT03.

'Bolsista FAPEAM/ INPA; 2Co-Orientador pesquisador CPPF/ INPA; 30rientadora Pesquisadora CPCA/INPA.

1. IntroduçãoColeções de microrganismos fitopatogênicos podem fornecer isolados para uso em estudos devariabilidade, de patogenicidade, na avaliação de resistência a doenças, no diagnóstico, no controlede doenças, na caracterização de patógenos exóticos introduzidos, entre outros. Representam oproduto dos recursos investidos em coletas de campo e em trabalhos realizados em laboratório eproporcionam validade aos resultados obtidos ficando disponíveis para confirmação de estudos epara novas pesquisas reduzindo, assim, os investimentos em inventário e levantamentos. Váriosmétodos de armazenamento como água, óleo mineral, sílica gel, baixa temperatura e liofilizaçãoodem ser utilizados, dependendo da espécie. Cada método tem suas vantagens e desvantagens. Amanutenção de isolados em meio de cultura com transferências periódicas exige trabalho intensivoe, apesar de ser um método simples, o risco de perda de isolados é muito alto seja porcontaminações, infestação de ácaros ou seleção manual de partes não típicas das culturas (Smith eOnions, 1983). Outros métodos como armazenamento em água destilada, óleo mineral ouutilizando liofilização, podem permitir a manutenção de microrganismos por 20 anos ou mais equase todas as grandes coleções de fungos estão basicamente alicerçadas nesses métodos depreservação (Figueiredo, 2001). Utilizando nitrogênio líquido (-196°C) o tempo de preservação émuito longo e os limites da viabilidade ainda não foram estabelecidos (Smith e Onions, 1983).O presente trabalho teve por objetivo a preservação e a manutenção de isolados demicrorganismos fitopatogênicos da Coleção de microrganismos de interesse Agrossilvicultural -Fitopatógenos do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), mantendo sua viabilidade eproporcionando estabilidade genética aos isolados, pelo período de tempo o mais longo possível.

2. Material e métodosO trabalho foi conduzido no laboratório de Fitopatologia da Coordenação de Pesquisas em Ciências

. Agronômicas do INPA, em Manaus. Os isolados previamente armazenados em tubos de ensaio commeio de cultura foram transferidos para meio BOA em placas de Petri (Ohingra e Sinclair, 1995) eincubados sob luz fluorescente (fotoperíodo de 12 h). Para confirmação da identificação dosisolados foram preparadas microculturas (Tuite, 1969) e lâminas semipermanentes paraobservação, sob microscópio ótico, das características morfológicas dos isolados. A confirmação daidentificação foi baseada em características fenotípicas descritas na literatura especializada (Barnette Hunter, 1987; Hanlin, 1990; Rossman et ai. 1987; Sneh et al.,1991; Sutton, 1980; Toussoun eNelson, 1976). Os isolados, dependendo das exigências de cada gênero e/ou espécie, foramarmazenados utilizando diferentes metodologias. No armazenamento em água, discos de colôniascultivadas em BOA foram transferidos para frascos de vidro com capacidade de 10 mL contendo 5mL de água destilada autoclavada. Os tubos, fechados com tampas de borracha e lacres dealumínio, foram mantidos em temperatura ambiente. Na preservação em óleo mineral, culturasjovens desenvolvidas em tubos de ensaio com meio BOA, foram cobertas com óleo mineralpreviamente esterilizado em autoclave a 121 o( e 1 atm por 30 minutos e desidratado em estufa a72°C, por 48 h. Em outra metodologia utilizando óleo mineral, discos de colônias fúngicas (0,5 cmde diâmetro) foram transferidos para tubos plásticos com capacidade de 2 mL contendo 1 mL deóleo mineral esterilizado. Os tubos foram fechados com tampas rosqueáveis e armazenados emtemperatura ambiente. Na preservação sob baixa temperatura discos de colônias (0,5 cm dediâmetro) cultivadas em BOA foram transferidos para 1 mL de solução de glicerol a 10%,esterilizada, em criotubos com capacidade de 2 mL. Os tubos foram fechados com tampasrosqueáveis de plástico e armazenados em freezer, a -17°C. Na preservação em sílica-gel foramutilizados frascos de vidro, com capacidade de 10 mL, com metade da capacidade preenchida comsílica gel, previamente esterilizada em estufa. Discos de papel de filtro com 4 mm de diâmetroforam imersos em suspensão de esporos ou conídios do fungo preparada com leite desnatado a 5%e transferidos para os frascos com sílica gel. Estes foram fechados com tampas de borracha e

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mantidos em temperatura ambiente. Na preservação por liofilização suspensões de esporos ouconídios dos fungos foram preparadas em leite em pó desnatado 5% e vertidas sobre sílica-gel semindicador, esterilizada, contida em frascos de vidro (10 mL). Cerca de 5 mL de nitrogênio líquido foivertido nos frascos e esses submetidos ao processo de liofilização por 24 horas. Os frascos foramfechados com tampas de borracha e mantidos em temperatura ambiente.

3. Resultados e discussãoVinte lâminas de microculturas foram preparadas de gêneros de fitopatógenos como Colletotrichum,Cy/indrocladium, Alternaria, Corynespora, Cercospora, Fusarium e Cordana. Na coleção, 67 culturasforam preservadas em água, óleo mineral, sílica gel, por liofilização ou baixa temperatura. Novosisolados foram incorporados à Coleção como Colletotrichum sp. obtido de folhas de escarola(Cichorium endivia var.) e de cebolinha (Allium fistolosum L.), Cy/indrocladíum sp. de folhas degerânio (Pelargonium sp) e Cercospora sp. Do quiabeiro (Abelmoschus esculentus (L.) Moench).Amostras dos isolados já preservados por liofilização e água, foram transferidas para meio BOA emplacas de Petri para avaliação da sobrevivência do isolado ao armazenamento. Isolados Alternariaspp. Obtidos de tomateiro (Lycopersícon esculentum Mil!.) e couve (Brassica oleracea L.),Cercospora spp. obtidos de chicória (Eryngíum foetidum L.) e alface (Lactuca sativa L.),Colletotrichum spp. obtido de chicória, pau rosa (Aniba rosaeodora Ducke), pupunheira (Bactrisgasipaes Kunth), cebolinha (AI/ium fistolosum L.), aceroleira (Malpíghia glabra L.) e pimenta murupi(Capsicum sp.), Corynespora cassiícola obtidos de tomateiro, mamoeiro (Carica papaya L.), pepino(Cucumis sativus L.), acerola e feijão caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp.), Cylindrocladium spp.obtidos de acácia (Acácia sp.) e gerânio, Fusarium oxysporum obtido de bananeira (Musa sp.),Rizoctonía spp. obtidos de feijão-macuco (Pachyrrhizus tuberosus (Lam.) Spreeng.), cará(Dioscorea Rotundata Poir), melão (Cumis meIo L.), ixora (Ixora sp.), cariru (Ta/inum paniculatum(Jack) Gaertn.) e quiabeiro, Sclerotium rolfsii Sacc obtidos de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) epimentão (Copsium annuum L.) e isolados não identificados obtidos de andiroba (Carapa guianensisAub.), chuchuzeiro (Sechium edule (Jacq) sw.), rambotã (Nephe/ium lappaceum L.), quiabeiro(Abelmoschus esculentus (L.) Moench), mamoeiro (Carica papaya L.) e feijoeiro sobreviveram àpreservação em água. Isolados de Colletotríchum spp. obtidos de cebolinha e aceroleira. Alternariaspp. obtido de tomateiro, Corynespora cassiicola obtidos de aceroleira e tomateiro Cercospore sp.obtido de alface sobreviveram ao armazenamento por liofilização enquanto que Cercospora sp.obtida de chicória e Cylindrocladium sp. obtido de acácia não sobreviveram. De acordo comFigueiredo (2007) a preservação em água é o mais vantajoso para manter em laboratório,diferentes gêneros e espécies de fungos. Além de ser um método aplicável a grande diversidade degêneros, é pratico, simples, de baixo custo e evita alterações morfológicas e/ou fisiológicas quepoderiam vir a ocorrer nas culturas, como resultado da preservação por repicagens periód icas.Como estes métodos reduzem ou paralisam o crescimento dos fungos a serem preservados,tendem a manter melhor as características da cultura e a viabilidade. Métodos que não exigemaparelhos especiais e são menos dispendiosos como a água, óleo mineral e a sílica gel. Já aliofilização exige um equipamento caro e sofisticado o liofilizador. Os métodos de preservaçãoutilizados: água, óleo mineral, sílica gel, liofilização, baixa temperatura tem permitido uma maiorestabilidade na manutenção das culturas. O tempo de viabilidade de cada gênero nos diversosmétodos ainda terá que ser avaliado.

4. ConclusãoOs microrganismos fitopatogênicos respondem de maneira diferente aos métodos de preservação etem diferentes graus de resistência ao processo de armazenamento a que são submetidos. Assim,cada cultura deve ser preservada de vários modos para que a sua sobrevivência seja garantidamantendo a sua viabilidade para estudos posteriores.

S. ReferênciasBarnett, H.L., Hunter, B.B. 1987. IIIustrated Genera of Imperfect Fungi. 4th ed., New York:Macmillan, 218 p.

Dhingra, 0.0., Sinclair, J.B. 1995. Basic Plant Pathology Methods. 2 ed. Boca Raton, CRC/Lewis,434 p.

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Figueiredo, M.B. 2007. Avaliação da viabilidade de culturas fúngicas preservadas pelos métodos deCastellani (Água Destilada) e liofilização. Biológico, São Paulo, v.69, n.1,p.5-8, jan.

Hanlin, R.T. 1990; IIIustrated Genera of Ascomycetes, vol. 1. St. Paul, Minn. APS. 263 p.

Rossman, A.Y., Palm. M.E., Spielman, L.J. 1987. The Genus Alternaria: Biology, Epidemiology, andPathogenicity. St. Paul, Minn. APS,.326 p.Smith, D. e Onions, A.H.S. 1994. Preservation and Maintenance of Living Fungi. 2nd ed.Wailingford, UK: CAB International,. 122 p

Sneh, B., Burpee, L., Ogoshi, A. 1991. Identification of Rhizoctonia species. St. Paul, Minn. APS,.133 p.

Sutton, B.C. 1980. The Coelomycetes: Fungi Imperfecti With Pycnidia Acervuli and Stromata. Kew,England: Commonwealth Mycological Institute, 696 p.

Toussoun, T.A e Nelson, P.E.1976. Fusarium: A pictoral Guide to the Identification of Fusariumspecies According to the Taxonomic System of Snyder and Hansen, 2d ed., University Park:Pennsylvania State University Press. 43 p

Tuite, J.F. 1969. Plant Pathological Methods; Fungi and Bacteria. Minneapolis, Burgess, 239p.

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