Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o...
-
Upload
arthur-montez -
Category
Documents
-
view
214 -
download
0
Transcript of Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o...
![Page 1: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/1.jpg)
Primer DesignPrimer Design
![Page 2: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/2.jpg)
A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA.
•O molde é um DNA dupla fita. •Um par de primers é adicionado, cada um com a sequencia coincidente com o final de uma das extremidades a serem amplificadas. •A Taq termoestavel e os dNTPs são adicionados a reação. •No primeiro ciclo, o aquecimento a 95°C abre a dupla fita de DNA e o subsequencte resfriamento a 60°C permite que os primers hibridizem com a sequencia complementar no DNA alvo. •A polimerase extende cada primer a partir da porção 3’ pela polimeração dos dNTPs, gerando novas fitas sintetizadas.
![Page 3: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/3.jpg)
A reação de PCR produz uma quantidade de DNA que dobra a cada ciclo de sintese.
Modified from: Molecular Biology of the Cell, 3rd edn. 1994 by Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and James D. Watson.
![Page 4: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/4.jpg)
Regras gerais para o desenho dos primersParametros Otimização 1. Sequencia de nucleotídeos única
A sequencia 3’ é crítica para o anelamento
2. G/C na porção 3' 1-2 G/C (S) nucleotideos 3. Não auto-complementaridade
< 3 bases contínuas
4. Não dimerização (complementaridade com outro primer)
< 3 bases contínuas
5. Distribuição de bases randômicas e composição
45-55% G+C
6. Tamanho do primer 18-25 bases 7. Equivalencia de Tm 8. Tamanho e composição do amplificado
100-600 bases
This table is modified from that of A. Sharrocks (1994) in “PCR Technology. Current Innovations” (eds. H.G. Griffin and A. M. Griffin) CRC Press, Boca Raton.
![Page 5: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/5.jpg)
Sequencia única de nucleotídeos do Sequencia única de nucleotídeos do molde de DNAmolde de DNA
• Importante para especificidade de amplificação
…GTATCGTTAAAACAGCTAGGGCTAGGAC…
C
G G A TCAATTTTGTCGATCCCGATC
![Page 6: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/6.jpg)
Grampo de G/C na porção 3'Grampo de G/C na porção 3'
•A porção 3‘ do primer deve ser G ou C para aumentar o correto anelamento do primer
•G-C possui pontes de hidrogenio mais fortes que A-T
Lembre-se que a porção 3’ frequentemente determina o anelamento. Se voce tem um primer em que pelo menos 5-10 nt complementam exatamente com a porção 3’, o anelamento provavelmente funcionará.
![Page 7: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/7.jpg)
Sem auto-complementaridadeSem auto-complementaridade
O auto-pareamento diminui a habilidade do primer se anelar com o molde.
Como regra geral, não use primers com mais de 3 bases no inicio que se complementam com as bases da porção 3’.
![Page 8: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/8.jpg)
Não dimerizaçãoNão dimerizaçãoOs pares de primers podem alinhar entre si. Se este alinhamento inclui pelo menos uma das porções 3’ a polimeras irá extender apenas a porção entre os dois resultando na formação de um dímero:
5’ GTTCAAATGGCATCGTAGGGATGCAT 3‘ | | | | | | | 3’ ACCGTAGTACTGCCG 5’
![Page 9: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/9.jpg)
Distribuição randomica de bases e Distribuição randomica de bases e composiçãocomposição
•Se o conteúdo de G+C% dos dois primers for muito diferente eles terão diferentes Tms e não anelarão a mesma temperatura.•Se todos os nucleotídeos da porção 5’ do primer forem G ou C etodos os da porção 3’ forem A ou T, mesmo que a proporção esteja correta, a porção 3’ não se anelará na temperatura predita.
![Page 10: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/10.jpg)
Tamanho do primerTamanho do primer
•O tamanho do primer deve ser longo o bastante para garantir que uma única sequencia seja amplificada e não tão longo para afetar a Tm e o anelamento.
•Os melhores tamanhos variam de 14 a 30 nucleotídeos.
![Page 11: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/11.jpg)
Equivalencia de TEquivalencia de Tmm
• A Tm aproximada pode ser calculada pela fórmula:
Tm = 4(G + C) + 2(A + T)oC.
A temperatura de alinhamento depende diretamente do tamanho e da composição dos primers. Um primeira tentativa pode ser feita com a reação a 5°C abaixo da Tm estimada para os primers•A principal consequencia de se utilizar uma Tm muito baixa é a possibilidade do primer anela com qualquer sequencia do DNA , perdendo a especificidade
![Page 12: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/12.jpg)
Tamanho do amplificadoTamanho do amplificado
•O máximo rendimento é obtido em uma reaçao de PCR quando o tamanho do produto é entre 100-600 nt.
•Diferentes polimerases possuem diferentes graus de processividade e diferentes tamanhos ótimos.
![Page 13: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/13.jpg)
Ferramentas para desenho:Ferramentas para desenho:
• Primer 3
• GeneRunner
• NCBI
![Page 14: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/14.jpg)
Primer3Primer3
• http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm
• Escolhe normalmente os 3 melhores pares de primers para a seqüência proposta
• É bastante exigente.
![Page 15: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/15.jpg)
GeneRunnerGeneRunner• Excelente para conferir os oligos obtidos com o Primer3
• Pouco exigente quanto aos seus próprios critérios
![Page 16: Primer Design. A reação de polimerização em cadeia é um método para amplificar seletivamente o DNA. O molde é um DNA dupla fita. Um par de primers é adicionado,](https://reader033.fdocumentos.com/reader033/viewer/2022052914/570638461a28abb8238f3421/html5/thumbnails/16.jpg)
NCBINCBI
• Importante para conferir se a seqüência escolhida não amplifica nenhum outro gene do organismo escolhido ou o mesmo gene em possíveis contaminantes.