Produção de Proteínas Recombinantes Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto...
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Produção de Proteínas
Recombinantes
Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do PortoFaculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto
Regente:Prof. Dra. Deolinda LimaRegente:Prof. Dra. Deolinda Lima
Orientadora: Dra. Alexandra GouveiaOrientadora: Dra. Alexandra Gouveia
Discentes: Andreia PiresDiscentes: Andreia Pires
Benedita AguiarBenedita Aguiar
Bruna GonçalvesBruna Gonçalves
Catarina OliveiraCatarina Oliveira
O que são proteínas recombinantes?São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes
clonados. Isto é, advêm da técnica de DNA recombinante.
Para que servem? A produção de proteínas recombinantes permite obter benefícios
em várias áreas: - saúde; - biologia; - bioquímica; - microbiologia; - genética; - biotecnologia; - agricultura; - etc.
Terapia génicaPossibilidade de introdução de um gene num organismo e
consequente correcção de doenças genéticas.
Melhoramento animal e vegetalPlantas resistentes a pragas e a
diferentes meios nutritivos.Animais de maiores dimensões,
mais férteis e carne com maior qualidade.
Criação de modelos animaisIdeais para o estudo da estrutura, função e regulação de um gene,
além de facilitar a compreensão da fisiopatologia da doença.
Algumas aplicações
www.dqb.fc.ul.pt
Técnica de produção de proteínas recombinantes
• Isolar e preparar o DNA;• Escolher o vector apropriado;• O fragmento de DNA a clonar é introduzido em vectores de clonagem, formando-se o DNA recombinante.• O DNA recombinante é inserido na célula hospedeira – transformação, que possui mecanismos enzimáticos para a replicação do DNA e para a síntese proteica;• Selecção e identificação de células que incorporam o DNA recombinante;• Verificar se a proteína foi expressa;• Remoção e purificação das proteínas.
The Cell- A Molecular Approach;Cooper, Geoffrey M..
Algumas enzimas envolvidas no processo
Enzimas Função
Tipo II (endonuclease de restrição) Cortam os DNAs em sequências de bases específicas.
DNA ligase Juntam duas moléculas de DNA ou fragmentos.
Taq DNA polimerase Adiciona os nucleotídeos na extremidade 3´ da cadeia de DNA.
Transcriptase reversa Produz uma molécula de DNA através de uma molécula de RNA.
● Enzimas de restrição- EndonucleasesEnzimas de restrição- Endonucleases Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas recombinantes são normalmente gerados por digestão através de recombinantes são normalmente gerados por digestão através de endonucleases de restrição. endonucleases de restrição.
. Conhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6 . Conhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6 pares de bases.pares de bases.
. São designadas por três letras: EcoRI, HindIII.. São designadas por três letras: EcoRI, HindIII.
Vectores de clonagem Capaz de transportar uma sequência de DNA estranha dando
origem a um DNA híbrido ou recombinante. Capacidade de se auto-replicar. Conter pelo menos um gene que confira resistência a antibióticos. Possuir locais de restrição únicos, polylinker. Fácil de purificar.
Tipos de vectores de clonagem• Plasmídeos (pBR322)• Fasmídeos ou fagemídeos • Cosmídeos• Bacteriófagos λ• YACs, BACs e PACs
www.biologianaweb.com/ Livro2/C11/pbr322.html
Vectores de expressão
Promotor Codão de iniciação seguido de polylinker Local de ligação ao ribossoma
www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html
Promotor
Local de ligação ao ribossoma
Sítio de clonagem e sequência codificante de 6 histidinas
www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html
Transformação
Ocorre quando uma célula incorpora e exprime um fragmento de material genético.
Para a introdução do DNA recombinante podem ser utilizados vários métodos:
• Células competentes;• Electroporação;• Bombardeamento de DNA
revestido de Tungsténio;• Microinjecção;• Transfecção.
Modern Genetic Analysis.
Extracção e purificação de proteínas• Extracção lise celular
• Purificação
Cromatografia de afinidade
Lehningher Principles of Biochemistry
Tags moleculares de fusão
Fusion Tag Immobilized Ligand
Binding Conditions Elution Conditions Available Formats
Glutathione (S-transferase(GST)
Reduced glutathione
Neutral (physiologic) pH, and non-denaturing; glutathione must be reduced and GST must be active
Free reduced glutathione at neutral pH (competitor)
Prepacked column kits, spin cup column kits, SwellGel Discs, coated microplates
Histidine-tagged Chelated Nickel or Cobalt
Neutral (physiologic) pH without reducing or oxidizing agents; small tag must be accessible in fusion protein structure; high ionic strength and denaturants (chaotropes such as 8 M urea) compatible.
>200 mM Imidazole, low pH, or strong chelators
Prepacked column kits, spin cup column kits, SwellGel Discs, Swell- Gel Discs in 96-well filter plates, coated microplates
Maltose Binding Protein (MBP)
Dextrin Neutral (physiologic) pH and non-denaturing; NaCl added to reduce nonspecific binding
Maltose at neutral pH (competitor)
Gel slurry, coated microplates
Green Fluorescent Protein (GFP)
Anti-GFP antibody Neutral (physiologic) pH and non-denaturing
Usual antibody/antigen elution buffers (e.g., low pH or chaotropic salts)
Coated microplates
Proteínas Recombinantes
Exemplos de Proteínas Recombinantes
Hormona de crescimento humano – a administração desta hormona durante a infância permite a correcção dos casos de nanismo.
Anticoagulantes – activadores de tecido plasminogénio que por sua vez activam a plasmina, enzima que dissolve os trombos (evita ataques cardíacos).
Dismútase do superóxido – previne danificação de tecidos quando este é exposto à falta de oxigénio.
Anticorpos monoclonais – são usados em testes diagnósticos; transporte direccionado (drogas, toxinas, componentes radioactivos utilizados na terapia cancerígena), assim como outras aplicações.
ioh.medstudents.com.br/ humoral.htm
Referência cronológica
1922 - Frederick Grant Banting descobre a insulina.
1978 - É produzida insulina humana recombinante.
1982 - Esta insulina é disponibilizada no mercado.
Insulina
Insulina- Duas cadeias peptídicas- cadeia A e cadeia B.
- Duas pontes dissulfureto entre as cadeias A e B e outra na própria cadeia A.
Insulina recombinante
Insulina lispro
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm
Monómeros- Insulina é activa na forma de monómeros.
Dímeros – pontes de hidrogénio entre as extremidades C da cadeia B.
Hexameros – na presença de Zn 2+
Produção de insulina Insulina proveniente de suínos e bovinos
Insulina humana biossintética
Introduction to Genetic Analysis.
Β-gal
Β-gal peptide
Purify β-gal- insulin fusion proteins
X-PROT
Unidade de investigação e desenvolvimento na área da
biotecnologia molecular.
Produção de proteínas recombinantes de interesse para
a saúde humana.
Desde 2003, 5 novas proteínas.
Descoberta de proteína com enorme potencial para
terapia do cancro.
Prémio da Comissão Europeia em 2004.
Bibliografia "The Cell. A Molecular approach."- 3nd ed. G.M. Cooper, AMS Press, U.S.A.
2004. "Molecular Biology of the Cell." - 4 nd ed., Alberts, Bray, Lewis, Raff,
Roberts and Watson, Garland Publishing, Inc. New York, 2002. Nelson D.L., Cox M.M.: Lehningher Principles of Biochemistry (4th Ed.).
W.H. Freeman and Company, New York. 2005. http://www.fortunecity.com/campus/biology/752/dnarec.htm http://www.novodordisk.pt/documents/article_page/document/insulina.asp www.biotecnologia_na_escola.up.pt www.terravista.pt/FerNoronha/5802/genetica.htm www.institutovirtual.pt www.dqb.fc.ul.pt www.mces.pt www.aidscongress.net http://acl.com.sapo.pt/naodoping.htm http://www.saudenainternet.pt/guia/?file=guia-artigo&cod=76 www.piercenet.com