PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DE TRANSGLUTAMINASE … · Tampão citrato 0,05M, pH 6,0 foi a solução...
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PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DE TRA Santos, E. G. 1 ; Bagag UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, FACU UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, FACU DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA DE ALIMENTOS (DCA [email protected] 1 , [email protected] [email protected] 1 , [email protected] Agência Financiadora: CNPq – Conselho Nacional d Palavras - chave: Transglutaminase Microbiana - F A transglutaminase (TGase, EC. 2.3.2.13) é uma enzima que catalisa reações de acil transf incluindo os grupos amina da lisina. A formação de ligações cruzadas entre as cadeias peptídica incluindo os grupos amina da lisina. A formação de ligações cruzadas entre as cadeias peptídica resistência física e da estabilidade térmica. Na indústria de alimentos, a TGase pode ser utiliz textura de macarrões, formar géis e filmes protéicos. Assim, há interesse em aumentar a dispon textura de macarrões, formar géis e filmes protéicos. Assim, há interesse em aumentar a dispon estudar a produção e aplicação da TGase por fermentação da linhagem Streptomyces sp. P20. Incubação: Pré - Inóculo Amostras para análise de Atividade de TGase Incubação: Estufa a 30°C por 168h Moagem Atividade Enzimática 10 mL de Erlenmeyer de Incubação: 72h, 150rpm e 30°C 200mL de pré-inóculo 168h Atividade Enzimática Centrifugação: 9630 g, 5 C, 10 min. 10 mL de inóculo líquido Erlenmeyer de 20g: farinha/f solução de sais Erlenmeyers de 250mL com Meio de Cultivo 1800mL Incubação: 72 h 0h - 24h: 32°C e 350rpm Erlenmeyer de 250mL: 19g: farinha/farelo + solução de sais 2:1 (m:v) 250mL com 50mL de meio de cultivo Inóculo 350rpm 24h-72h: 26°C e 250rpm 50mL de água destilada Extração: 20°C, 150rpm, 2horas Inóculo Líquido Substratos Protéicos Avaliados •nº1 – Farinha de Soja Meios de Cultivo Avaliados • n°3 - Feijão Branco • n°4 – Feijão Preto S •T •nº1 – Farinha de Soja •nº2 – Farinha de Feijão Branco • n°4 – Feijão Preto •n°5- Amendoim •T •Ta Tabela 1 . Estudo da produção de Streptomyces sp P20 em Meios de cultivo semi-sólido nº3 (farinha de feijão branco e sais) nº4 (farinha de feijão preto e sais) nº 5 (farinha de amendoim e sais) Atividade máxima de TGase foi obtida após 48h de fermentação Maior Prod Figura 1. Cinética de produção de TGase na fermentação da linhagem de Streptomyces sp P20 em reator de bancada Atividade máxima de TGase foi obtida após 48h de fermentação submersa: Meio de cultivo nº1 contendo soja = 1,16 U/mL Meio de cultivo nº2 contendo feijão branco = 1,28 U/mL Maior Prod Meio de cultivo nº3 con 0,8816 U/g d Meio de cultivo nº2 contendo feijão branco = 1,28 U/mL Tabela 2. Avaliação de água destilada, Tampão cCtratoe Tampão Tris-HClcomo soluções extratoras de TGase Tampão citrato 0,05M, pH 6,0 foi a solução Solução extratora Atividade de TGase (U/g substrato seco) Desvio padrão Tampão citrato 0,05M, pH 6,0 foi a solução eficiência de extr Maior extração de TGase com água desti Velocidade de agitação Água destilada 0,2624 a 0,0009 Tampão Tris-HCl 0,05M pH 9,0 0,2576 a 0,0084 Velocidade de agitação Tempo de agitação - 0,05M pH 9,0 Tampão Citrato 0,05M pH 6,0 0,3032 b 0,0198 Na fermentação submersa da linhagem de Streptomyces sp. P20 em reator de bancada utilizando-se meio de cu Na fermentação submersa da linhagem de Streptomyces sp. P20 em reator de bancada utilizando-se meio de cu horas de fermentação, respectivamente. Entre os três meios semi-sólidos testados, foi obtido maior produção de TG cultivo nº3 composto de farinha de feijão branco e sais. Na extração da TGase utilizando água destilada como solu influenciaram a extração de TGase, sendo obtido maior extração utilizando-se menor tempo de agitação (25,8 min. da TGase utilizando-se solução Tampão Citrato 0,05M pH 6,0. A preparação de TGase de Streptomyces sp. P20 fo semelhante à enzima comercial. ANSGLUTAMINASE MICROBIANA gli, M. P. 2 ; Sato, H. H. 3 ULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS (FEA) ULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS (FEA) A), LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS unicamp.br 2 , [email protected] 3 unicamp.br 2 , [email protected] 3 de Desenvolvimento Científico e Tecnológico/PIBIC Fermentação Semi-Sólida - Fermentação Submersa ferência entre resíduos de glutamina e uma variedade de aminas primárias (receptores acil), as resulta em modificação das propriedades físico-químicas das proteínas, como o aumento da as resulta em modificação das propriedades físico-químicas das proteínas, como o aumento da zada para promover a união de retalhos de carne, aumentar o volume de pães, melhorar a nibilidade e reduzir o custo da produção da TGase microbiana. Este trabalho teve como objetivo nibilidade e reduzir o custo da produção da TGase microbiana. Este trabalho teve como objetivo e 250mL: Extração: Ensaios Delineamento Fatorial 2 2 (Velocidade de Agitação e Tempo de Agitação) Hidroxilamina (25µL) CBZ-glutaminil- glicina (75μL) 20g de carne bovina moída e 250mL: farelo + 2:1 (m:m) Tempo de Agitação) Centrifugação 7100 g, 5 C, TGase (200µL) Tampão Citrato (200µL) TGase de Streptomyces sp. P20 Moldados em cilindros (5 x 3 cm), colocados em sacos plásticos e 50mL de solução Extratora Incubação: 7100 g, 5 C, 15 min. Atividade Banho: 37°C, 60min colocados em sacos plásticos e retirado o ar Incubação: Estufa a 30°C, 168h Atividade Enzimática TCA + FeCl 3 (500 μL) Banho: 37°C, 120 min Armazenado a 7°C por 15h Soluções Extratoras Avaliadas •Água Destilada Tampão Citrato 0,05M pH 6,00 (500 μL) Absorbância a a 7°C por 15h Avaliação visual da união dos pedaços Cozimento: Tampão Citrato 0,05M pH 6,00 Tampão Tris-HCl 0,05M pH 9,00 525nm união dos pedaços de carne Cozimento: a 70°C, 1h TGase pela fermentação da linhagem de m meios de cultivo semi-sólidos Atividade de TGase (U/g de substrato seco) Desvio Padrão 0,8816 a 0,0833 0,0418 b 0,0016 0,7732 a 0,1008 Figura 2. Aplicação da TGase na reestruturação de carne bovina moída (a) Activa® TG-BP (1 U/g de carne); (b) TGase de Streptomyces sp. P20 (1 U/g de dução de TGase: (a) Activa® TG-BP (1 U/g de carne); (b) TGase de Streptomyces sp. P20 (1 U/g de carne); (c) controle; (d) Activa® TG-BP (0,1 U/g de carne); (e) TGase de Streptomyces sp. P20 (0,1 U/g de carne) dução de TGase: ntendo feijão branco e sais = de substrato seco. A TGase de Streptomyces sp. P20 foi capaz de unir e reestruturar proteínas da carne bovina moída extratora que apresentou maior extratora que apresentou maior ração. ilada como solução extratora: o -185,5 rpm Figura 3. Superfície de resposta do efeito do tempo de agitação e da velocidade de agitação na extração de TGase com água destilada. o -185,5 rpm - 25,8 min ultivo nº1 e nº2 foram obtidos 1,16 U/mL e 1,28U/mL de TGase após 48 ultivo nº1 e nº2 foram obtidos 1,16 U/mL e 1,28U/mL de TGase após 48 Gase na fermentação da linhagem de Streptomyces sp. P20 em meio de ução extratora, os fatores tempo de agitação e a velocidade de agitação .) e maior velocidade de extração (185,5 rpm). Foi obtido maior extração oi capaz de unir e reestruturar proteínas da carne bovina moída de forma
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PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DE TRANSGLUTAMINASE MICROBIANA
Santos, E. G.1; Bagagli
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS (FEA)UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS (FEA)
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA DE ALIMENTOS (DCA), LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS
[email protected], [email protected]@fea.unicamp.br1, [email protected]
Agência Financiadora: CNPq – Conselho Nacional de
Palavras - chave: Transglutaminase Microbiana - Fermentação Semi
A transglutaminase (TGase, EC. 2.3.2.13) é uma enzima que catalisa reações de acil transferênciaincluindo os grupos amina da lisina. A formação de ligações cruzadas entre as cadeias peptídicasincluindo os grupos amina da lisina. A formação de ligações cruzadas entre as cadeias peptídicasresistência física e da estabilidade térmica. Na indústria de alimentos, a TGase pode ser utilizadatextura de macarrões, formar géis e filmes protéicos. Assim, há interesse em aumentar a disponibilidadetextura de macarrões, formar géis e filmes protéicos. Assim, há interesse em aumentar a disponibilidadeestudar a produção e aplicação da TGase por fermentação da linhagem Streptomyces sp. P20.
Incubação:
Pré - Inóculo
Amostras para análise de
Atividade de TGase
Incubação:
Estufa a 30°C por
168h
Moagem
Atividade Enzimática 10 mL de Erlenmeyer de 250mLIncubação:
72h, 150rpm e 30°C
200mL de pré-inóculo
168h Atividade Enzimática
Centrifugação:
9630 g, 5 C, 10 min.
10 mL de inóculolíquido
Erlenmeyer de 250mL
20g: farinha/farelo + solução de sais 2:1 (m:m)
Erlenmeyers de 250mL com
Meio de Cultivo 1800mL
Incubação: 72 h0h - 24h: 32°C e
350rpm
Erlenmeyer de 250mL:19g: farinha/farelo + solução de sais 2:1
(m:v)
10 min.
250mL com 50mL de meio
de cultivo
Inóculo350rpm
24h-72h: 26°C e 250rpm
(m:v)
50mL de água destilada Extração:
20°C, 150rpm, 2horas Inóculo Líquido
Substratos Protéicos Avaliados
•nº1 – Farinha de Soja
Meios de Cultivo Avaliados
• n°3 - Feijão Branco• n°4 – Feijão Preto
Soluções Extratoras Avaliadas
•Tampão •nº1 – Farinha de Soja
•nº2 – Farinha de Feijão Branco• n°4 – Feijão Preto•n° 5 - Amendoim
•Tampão •Tampão
Tabela 1 . Estudo da produção de Streptomyces sp P20 em meios de cultivo semi
Meios de cultivo semi-sólido
nº3 (farinha de feijão branco e sais)nº3 (farinha de feijão branco e sais)
nº4 (farinha de feijão preto e sais)
nº 5 (farinha de amendoim e sais)
Atividade máxima de TGase foi obtida após 48h de fermentação Maior Produção de
Figura 1. Cinética de produção de TGase na fermentação da linhagem de Streptomyces sp P20 em reator de bancada
Atividade máxima de TGase foi obtida após 48h de fermentação
submersa:
Meio de cultivo nº1 contendo soja = 1,16 U/mL
Meio de cultivo nº2 contendo feijão branco = 1,28 U/mL
Maior Produção de
Meio de cultivo nº3 contendo feijão branco e sais =
0,8816 U/g de substrato seco.Meio de cultivo nº2 contendo feijão branco = 1,28 U/mL
0,8816 U/g de substrato seco.
Tabela 2. Avaliação de água destilada, Tampão cCtrato e Tampão Tris-HCl como soluções extratoras de TGase
Tampão citrato 0,05M, pH 6,0 foi a solução extratora que apresentou maior
Solução extratoraAtividade de TGase
(U/g substrato seco)
Desvio
padrão
Tampão citrato 0,05M, pH 6,0 foi a solução extratora que apresentou maior
eficiência de extração.
Maior extração de TGase com água destilada como solução extratora:
Velocidade de agitação
Água destilada 0,2624a 0,0009
Tampão Tris-HCl 0,05M pH 9,0
0,2576a 0,0084Velocidade de agitação
Tempo de agitação -
0,05M pH 9,00,2576 0,0084
Tampão Citrato0,05M pH 6,0
0,3032b 0,0198
Na fermentação submersa da linhagem de Streptomyces sp. P20 em reator de bancada utilizando-se meio de cultivoNa fermentação submersa da linhagem de Streptomyces sp. P20 em reator de bancada utilizando-se meio de cultivohoras de fermentação, respectivamente. Entre os três meios semi-sólidos testados, foi obtido maior produção de TGasecultivo nº3 composto de farinha de feijão branco e sais. Na extração da TGase utilizando água destilada como soluçãoinfluenciaram a extração de TGase, sendo obtido maior extração utilizando-se menor tempo de agitação (25,8 min.influenciaram a extração de TGase, sendo obtido maior extração utilizando-se menor tempo de agitação (25,8 min.da TGase utilizando-se solução Tampão Citrato 0,05M pH 6,0. A preparação de TGase de Streptomyces sp. P20 foisemelhante à enzima comercial.
PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DE TRANSGLUTAMINASE MICROBIANA
Bagagli, M. P.2; Sato, H. H.3
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS (FEA)UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS (FEA)
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIA DE ALIMENTOS (DCA), LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS
, [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico/PIBIC
Fermentação Semi-Sólida - Fermentação Submersa
transferência entre resíduos de glutamina e uma variedade de aminas primárias (receptores acil),peptídicas resulta em modificação das propriedades físico-químicas das proteínas, como o aumento dapeptídicas resulta em modificação das propriedades físico-químicas das proteínas, como o aumento da
utilizada para promover a união de retalhos de carne, aumentar o volume de pães, melhorar adisponibilidade e reduzir o custo da produção da TGase microbiana. Este trabalho teve como objetivodisponibilidade e reduzir o custo da produção da TGase microbiana. Este trabalho teve como objetivo
de 250mL:
Extração:
Ensaios Delineamento Fatorial 22 (Velocidade de Agitação e
Tempo de Agitação)
Hidroxilamina(25µL)
CBZ-glutaminil-glicina (75µL)
20g de carne bovina moída
de 250mL:20g: farinha/farelo +
solução de sais 2:1 (m:m)
Tempo de Agitação)
Centrifugação
7100 g, 5 C,
TGase(200µL)
Tampão Citrato(200µL)
TGase de
Streptomyces sp. P20
Moldados em cilindros (5 x 3 cm), colocados em sacos plásticos e
50mL de solução Extratora
Incubação:
7100 g, 5 C, 15 min.
Atividade
Banho: 37°C, 60min
colocados em sacos plásticos e retirado o ar
Incubação:Estufa a 30°C,
168h
Atividade Enzimática
TCA + FeCl3
(500 µL)
Banho: 37°C, 120 min
Armazenado a 7°C por 15h
Soluções Extratoras Avaliadas
•Água DestiladaTampão Citrato 0,05M pH 6,00
(500 µL)
Absorbância a
a 7°C por 15h
Avaliação visual da união dos pedaços Cozimento: Tampão Citrato 0,05M pH 6,00
Tampão Tris-HCl 0,05M pH 9,00
Absorbância a 525nm união dos pedaços
de carneCozimento: a 70°C, 1h
Estudo da produção de TGase pela fermentação da linhagem de P20 em meios de cultivo semi-sólidos
Atividade de TGase(U/g de substrato seco)
Desvio Padrão
0,8816a 0,08330,8816 0,0833
0,0418b 0,0016
0,7732a 0,1008Figura 2. Aplicação da TGase na reestruturação de carne bovina moída
(a) Activa® TG-BP (1 U/g de carne); (b) TGase de Streptomyces sp. P20 (1 U/g de
Maior Produção de TGase:
(a) Activa® TG-BP (1 U/g de carne); (b) TGase de Streptomyces sp. P20 (1 U/g decarne); (c) controle; (d) Activa® TG-BP (0,1 U/g de carne); (e) TGase deStreptomyces sp. P20 (0,1 U/g de carne)
Maior Produção de TGase:
Meio de cultivo nº3 contendo feijão branco e sais =
0,8816 U/g de substrato seco.
A TGase de Streptomyces sp. P20 foi capaz de unir
e reestruturar proteínas da carne bovina moída0,8816 U/g de substrato seco.
0,05M, pH 6,0 foi a solução extratora que apresentou maior 0,05M, pH 6,0 foi a solução extratora que apresentou maior
eficiência de extração.
com água destilada como solução extratora:
Velocidade de agitação -185,5 rpmFigura 3. Superfície de resposta do efeito do tempo de agitação e da velocidade de agitação na extração de TGase com água destilada.
Velocidade de agitação -185,5 rpm
- 25,8 min
cultivo nº1 e nº2 foram obtidos 1,16 U/mL e 1,28U/mL de TGase após 48
velocidade de agitação na extração de TGase com água destilada.
cultivo nº1 e nº2 foram obtidos 1,16 U/mL e 1,28U/mL de TGase após 48TGase na fermentação da linhagem de Streptomyces sp. P20 em meio de
solução extratora, os fatores tempo de agitação e a velocidade de agitação.) e maior velocidade de extração (185,5 rpm). Foi obtido maior extração.) e maior velocidade de extração (185,5 rpm). Foi obtido maior extração
foi capaz de unir e reestruturar proteínas da carne bovina moída de forma
