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PRODUÇÃO DE VACINAS

A FERMENTAÇÃO NA PRODUÇÃO DE VACINAS A tecnologia de produção de vacinas é realizada com métodos de escala de laboratório desde o início até hoje; devido á vários motivos:

A. apoio governamental – desenvolvimento sem fins lucrativos; eficiência e produtividade são secundários. As operações são realizadas em bancadas, por profissionais como biólogos, químicos e médicos bacteriologistas não pertencentes a área de engenharia e portanto sem os conhecimentos necessários para a ampliação de escala do processo;

B. vacinas virais, preparadas com matérias-primas como: peles de bezerro e ovos de galinha, tornam-se problemáticas quando preparadas em larga escala;

C. condições complexas de cultivo de bactérias patogênicas e vírus, conduziram ao falso conceito, de que cultivos em “tanques” seriam de difícil realização;

D. necessita-se de um profissional com visão integrada das várias linhas e que submeta a processos periódicos de reciclagem de conhecimento; contribuindo para reduzir tais obstáculos.

PRODUÇÃO DE VACINAS COMO PROCESSO UNITÁRIO As operações para produção de vacinas bacterianas e virais, compreendem:

a. temperaturas de cultivo: para bactérias ao redor de 37 0 C; b. os volumes de meio de cultivo empregados na produção industrial de

vacinas (25 a 3500 litros)são pequenos, quando comparados com outros processos industriais de cultivo;

c. a natureza complexa dos meios utilizados, o pH ótimo das fermentações (~ 7,5), a temperatura: favorável a proliferação de m.os.. Exige-se assepsia na condução dos processos e proteção especial do operador contra infecções acidentais;

d. efeitos colaterais, decorrentes da aplicação de vacinas, devem ser minimizados, considerando que as vacinas pertencem ao grupo de medicamentos preventivos;

e. a obtenção imediata de valores de potencia da vacina é praticamente impossível, pois se baseiam em efeitos demorados observados em animais de laboratório.

São importantes informações sobre: - pH do meio; - oxigênio dissolvido, porém não são considerados referenciais seguros pois nem sempre se relacionam de maneira definida com a potência da vacina.

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VACINAS BACTERIANAS – CLASSIFICAÇÃO E PROCESSOS DE PRODUÇÃO As vacinas bacterianas podem ser classificadas em particuladas e não particuladas. A tabela 1 apresenta a classificação segundo VAN HERMERT PERTUSSIS Microrganismo causador da coqueluche – Bordetella pertussis – bacilo gram-negativo Isolado e identificado por BORDET e GENGOU – 1906 – formulação do meio semi-sólido, contendo sangue de carneiro, empregado até hoje durante os estágios iniciais de preparo do inoculo. O processo de produção da vacina pertussis celular, compreende as etapas: - preparação do inoculo; - fermentação; - filtração e destoxificação

1. o preparo do inóculo: Inicialmente – preparado pela ressuspensão do m.o. liofilizado em soro fisiológico, seguido de um espalhamento da suspensão resultante sobre o meio de BORDET. Incubação: 350 C/ 96 h Posteriormente – cultivo da bactéria em erlenmeyeres agitados, cada uma com o meio de STAINER- SCHOLTE (sem sangue); 350 C/ 24h.

2. A fermentação As dimensões dos erlenmeyeres dependerão da capacidade do fermentador, a relação entre volume de inoculo e o volume do meio, é da ordem de 5%.

3. Filtração e destoxificação A etapa de filtração tangencial, no processo de produção, visa separar as bactérias do meio de cultura. Estas são ressuspensas em soro fisiológico e destoxificadas com formaldeido. Por se tratar de uma bactéria – o pH de cultivo entre 7,5 e 8,5 , existe alta probabilidade de contaminação. É feito o exame microscópico com a técnica de GRAM (a Bordotella é gram-negativa), e também com dois tipos de meio: tioglicolato ou BREWER (detecta contaminantes anaeróbios) e caseína de soja (indica presença de fungos).

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Amostras do fermentador e da vacina final, de ~0,5ml, colhidas após cada etapa de preparo do inoculo; são adicionadas aos meios, acondicionados em tubos de ensaio. Se não apresentarem turvação, após período determinado incubados a 350 C, significa ausência de contaminantes. (testes de esterilidade) A Bordetella pertussis não prolifera nestes meios. Outras duas provas fundamentais para a liberação final da vacina são: toxidez e de potência em camundongos de linhagem estabelecida. A utilização de antiespumante não é recomendada na produção de vacina pertussis, pois acarreta aumento de toxidez do produto final. Um recurso: evitar turbulência do meio com a remoção das chicanas da parede da dorna e a introdução de ar na superfície. Sistema : - baixa eficiência de aeração; - evita flotação de bactérias, dispensando o uso de antiespumante; - apresenta homogeneidade para freqüências de agitações maior ou igual a 300min -1 e volumes de meio superiores a 300litros. O pH do meio tem um aumento constante, valores iniciais entre 7,0 e 7,5 até 8,0 a 8,6. A VACINA ACELULAR Devido a vacina desenvolvida apresentar efeitos colaterais como: dores e febre, houve um estimulo a pesquisa de novas vacinas que minimizavam os efeitos colaterais. Muitos componentes celulares (polissacarídeos, lipídeos, proteínas) tem sido identificados. Alguns deles foram considerados importantes por sua antigenicidade. A estratégia para a obtenção de uma vacina acelular, consiste no isolamento daquele grupo de substâncias antigênicas das demais. Sato, no Japão, 1981, obteve a primeira vacina acelular. VACINAS CONTRA CÓLERA E FEBRE TIFÓIDE A cólera e a febre tifóide possuem uma epidemiologia comparável. Causam doenças no trato gastro-intestinal, sendo as bactérias correspondentes gram negativas. Reproduzem-se em meios simples, com métodos de cultivo e processamento semelhantes. Por isso, descritos juntos. M. O. causador da cólera – Vibrio cholerae – descoberto por Koch; Origem da doença – Índia e Paquistão.

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Até o momento – melhor imunidade obtida contra a cólera é a conferida por uma vacina contendo cepas atenuadas (Inaba e Ogawa, empregadas em conjunto) de Vibrio cholerae. Febre tifóide descrita por Budd – 1856;pela primeira vez ; 1880 - por Eberth; 1884 – Gaffky – dicispulo de Koch – responsável pelo isolamento. A Salmonella typhi penetra no organismo pela via digestiva, atingindo a corrente sanguínea, o que não ocorre com o Vibrio cholerae que permanece no trato digestivo e portanto presente nas fezes. A vacina contra febre tifóide consiste em bactérias de Salmonella typhi (cepa Ty 2) inativadas pelo calor a 53 0 C, durante 1h e preservadas em fenol a 0,5%. Os cultivos submersos de Vibrio cholerae , bem como o da Salmonella typhi , podem ser realizados em fermentador, com um meio líquido simples, de composição em (g/L): - hidrolisado ácido de caseína (pó); - extrato de levedura em pasta; - pH = 7,6. A glicose é adicionada parceladamente durante a fermentação. O hidrolisado de ácido de caseína é conhecido comercialmente como “ácido casamínico”. Se toda glicose necessária estiver presente no início da fermentação, há uma tendência de que ambas as bactérias formem colônias rugosas durante um cultivo posterior em meio semi-sólido. Desse modo, elas não apresentarão patogenicidade (denominadas de “averulentas”) , o que não é interessante do ponto de vista da produção de vacinas, por causa do baixo teor de certos antígenos. Com a adição parcelada de glicose, durante a fermentação submersa, as colônias apresentarão aspecto posterior liso, portadoras de “virulência”. O pH é controlado na faixa de 7,3 a 7,6, com adição de solução de hidróxido de sódio. VACINA B C G Koch – 1882 – relacionou a tuberculose á micobactéria Mycobacterium tuberculosis. A infecção com o Mycobacterium tuberculosis, afeta os pulmões, os ossos e o trato gênito – urinário. Koch – tentativa sem sucesso – obter a vacina do Mycobacterium tuberculosis inativado pelo calor, formaldeído e outros agentes químicos.

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Calmette – 1921 – suspeitando que a imunidade poderia ser adquirida pela presença de m os vivos no organismo do hospedeiro, desenvolveu uma cepa atenuada de Mycobacterium bovis , causadora da tuberculose bovina. A bactéria se tornou avirulenta como conseqüência de 250 subcultivos, durante vários anos em meio que continha: batata, glicerina e bile bovina. Com essas características, a cepa ficou conhecida pelo nome de Calmette – Guérin (BCG). MÉTODO DE CULTIVO As micobactérias se desenvolvem na forma de uma película na superfície de determinados meios líquidos sem agitação. O método industrial de produção de BCG se baseia nesse cultivo estático, aplicando número elevado de frascos. Como exemplo, produção no Instituto Butantã, são utilizados 6000 erlenmeyeres por semana (cada um com capacidade total de meio litro e contendo 180ml de meio de Sauton). Esta quantidade de material conduz a produção de 18000 doses de BCG por semana. Essa grande quantidade visa a compensação do crescimento lento da bactéria (8 dias) para cobrir o meio e também a morte de 40 a 60% da população bacteriana devido a um processo posterior de dispersão bacilar, esta desagregação é requisito para a BCG oral; porém com diminuição de qualidade. Para solucionar o problema, a mais de 30 anos pesquisadores vem desenvolvendo a técnica de cultivo submerso deste m o. Como resultado, a vacina BCG – Glaxo é produzida por esta técnica. Foram desenvolvidos alguns meios para o cultivo submerso, como o de Dubos, Ungar e Proskauer – Beck, fora o meio de Sauton, tradicionalmente empregado para o cultivo estático. O mais tradicional, Sauton, apresenta a seguinte composição: - L – asparagina; - citrato de ferro amoniacal; - ácido cítrico anidro; - sulfato de magnésio; - fosfato de potássio; - glicerina; - água; - pH 7,2 ( corrigido com solução de hidróxido de amônio). O cultivo submerso parece ser mais promissor frente ao cultivo estático, conduzindo a um produto final mais viável. As bactérias cultivadas em profundidade são mais resistentes a uma posterior liofilização, do que os m os que sofreram a dispersão bacilar.

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Porém ainda temos problemas como: perda de viabilidade durante cultivos prolongados, manter a assepsia durante o período (~8 dias), pois o pH do meio permanece ao redor de 7,5, favorável a proliferação de contaminantes e menor imunogenicidade frente a BCG obtida pelo método estático. Organização Mundial de Saúde - estabeleceu normas para controle e liberação do produto final BCG. Essas compreendem: - medidas físicas ( massa semi-seca e seca); - testes de viabilidade (consumo de oxigênio, unidades formadoras de colônia); - métodos estatísticos para a interpretação de erros associados aos resultados experimentais. TOXÓIDES Serão descritas as vacinas, cujos preparos se baseiam em cultivos de bactérias que excretam toxinas. Estas, são posteriormente submetidas a uma destoxificação, que consiste na destruição de suas propriedades tóxicas (através do formaldeido ou do calor, por exemplo), sem alterar as propriedades imunogênicas. A molécula de toxina, assim modificada é conhecida como toxóide ou anatoxina. Um método rápido, para detectar a presença de toxina no meio, consiste em colocá-la na presença de um soro que contenha os anticorpos contra esta toxina, também conhecido como soro padrão ou antitoxina. Ao ocorrer a combinação entre esses anticorpos e as moléculas da toxina, apareceráuma floculação visível a olho nu. Esse método foi instituído por Ramon e permite exprimir a quantidade da toxina em termos de unidade de floculação (Lf/ml). Por ser rápido, é aplicado nos controles finais de qualidade e durante os cultivos em fermentador, sem a necessidade de grande número de animais de laboratório. Nas provas de liberação das vacinas, o método “in vitro”, deverá também estar obrigatoriamente acompanhado do teste “in vivo” . TOXÓIDE DIFTÉRICO Bactéria gram positiva Corynebacterium diphtheriae, é a causadora da difteria – doença provoca infecção no trato respiratório superior, bem como na parte cutânea. A toxina diftérica é um polipeptídio, com PM ~ 62000. Há dois fragmentos na molécula, denominados A e B. O fragmento B é necessário para a penetração na célula que será afetada.

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Após penetração, o fragmento A é responsável pela toxidez, interferindo enzimaticamente com a síntese protéica da célula afetada. Embora haja uma variedade de antígenos para ambos os fragmentos, os anticorpos dirigidos contra o fragmento B são aqueles que protegem contra a infecção. A presença de proteínas estranhas no toxóide, causa reações colaterais no paciente, como a febre. Com isso, a vacina é aplicada várias vezes em doses moderadas, com o objetivo de minimizar os efeitos indesejáveis. O MÉTODO DE CULTIVO O meio de cultura empregado para o cultivo do Corynebacterium diphtheriae foi desenvolvido por Linggood e Fenton; sua composição para um litro e meio, é a seguinte:

Carne bovina (~) 155g

Extrato de levedura em pasta 0,15g

Lactato de sódio 1,5ml

Maltose 50ml

Sulfato de magnésio 0,62g

β alanina 1,75mg

Ácido nicotínico 1,75mg

Ácido pimélico 0,11mg

Sulfato de cobre 0,75mg

Sulfato de zinco 0,60mg

Cloreto de manganês 0,22mg

pH 7,8

A carne é previamente digerida, por intermédio de uma solução com a seguinte composição:

Papaína 1,5g

Solução de hidróxido de sódio 8,0ml

Ácido clorídrico 2,5ml

Ácido acético 6,0ml

Hidrocloreto de cisteína 0,25g

A formação da toxina não está associada á reprodução bacteriana: sua atividade (medida em unidades floculantes: Lf/ml), se torna mensurável ao redor de 18 horas de fermentação. Atinge seu valor máximo em 200 Lf/ml com 40 horas. O pH diminui nesse mesmo período de 7,8 para 7,5. Se a aeração for insuficiente, a queda será mais pronunciada (de 7,8 para 6,5), com produção mais baixa de toxina (100 Lf/ml). O processo industrial de produção da toxina diftérica é constituído pelas etapas de: - fermentação;

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- filtração tangencial do meio fermentado; - filtração molecular do filtrado; - cromatografia; - destoxificação; - nova cromatografia; - filtração esterilizante da toxina purificada; - mistura com o toxóide tetânico (DT); - ou este e a vacina contra coqueluche (DTP) a filtração tangencial do meio fermentado visa a separação das bactérias do meio, onde se encontra a toxina. A filtração molecular, separa os nutrientes residuais e os metabólitos da toxina. Na cromatografia – separação das moléculas por tamanho e carga, permitindo a obtenção de uma toxina de alta pureza. A destoxificação consiste em desnaturar a toxina pela ação do formaldeido a 37 0 C / 4 a 6 semanas, conduzindo ao toxóide ou anatoxina diftérica. Mais uma etapa de cromatografia purifica e concentra a anatoxina nos padrões estabelecidos. Ela pode ser misturada com o toxóide tetânico, constituindo na vacina combinada DT ou em mistura com a vacina pertussis, para se constituir na vacina tríplice DTP.