ProfessoraVera Lúcia dos Santos

Crescimento microbiano

Nutrição microbiana

Nutrição bacteriana

Composição química de uma célula bacteriana (E. coli)

ComponenteságuaproteínaslipídeosLPSpeptidioglicanoglicogênioDNA RNAmetabólitosíons inorgânicos

% Massa úmida7015210,711530,3

Tipos diferentes120004111150035020

Como estudar microrganismos no laboratório?Cultivo “in vitro”conhecer as exigências nutricionais e ambientais dos microrganismos

Lei do Mínimo de Liebig

A biomassa total de um organismo é determinada pelo nutriente presente no meio em menor concentração em relação aos seus requerimentos.

Composição Química Média da Célula (%)Oxigênio...................................... 65

Carbono...................................... 18Hidrogênio................................... 10Nitrogênio..................................... 3Subtotal...................................... 96

Cálcio (Ca).................................... 1,8Fósforo (P).................................... 1,2Potássio (K). ............................. ...0,35Enxofre (S).....................................0,25Sódio (Na)..................................... 0,15Cloro (Cl)...................................... 0,15Magnésio (Mg)............................... 0,05Flúor (F)........................................ 0,007Ferro (Fe)...................................... 0,005Subtotal........................................ 3,962Outros(Zn,Br,Mn,Cu,I,Co)........... 0,038

Em um dado ecossistema sempre haverá algum fator nutricional limitante.

Lei da Tolerância de Shelford

A ocorrência e abundância de um microrganismo em um dado ambiente é determinada não somente pelos nutrientes disponíveis mas pelos fatores físicos e químicos.

O microrganismo apresenta um conjunto complexo de condições, dentro de uma faixa de tolerância.

Se qualquer condição exceder os limites mínimo ou Máximo= organismo falha e morre.

Principais tipos nutricionais dos microrganismos

Cultivo de bactérias no laboratório

Macronutrientes Funções

Carbono

g

Constituintes de carboidratos, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos

Oxigênio

Hidrogênio

Nitrogênio

Enxofre

Fósforo

mg

Potássio (K+) Atividade enzimática

Cálcio Resistência ao calor do endosporo

Magnésio (MG2+) Cofator de enzimas, complexos com ATP, estabiliza ribossomos e membranas

Ferro (Fe2+/Fe3+) Constituição de citocromos, cofator de enzimas, cofator de proteínas transportadores de elétrons

Micronutrientes µg

Co, Cu, Ni, Mo, Mn, Se, Zn, Cr

cofatores de enzimasgeralmente não é preciso adicionar: presentes na água; Água desmineralizada: adicionar solução elementos traço.

Forma de apresentação dos macronutrientes na naturezae em meios de cultura

Fatores de crescimento

Compostos orgânicos específicos, necessários em quantidades muito pequenas devido à incapacidade das células de os sintetizarem.

Fornecidos como componentes dos meios de cultura (peptonas, extrato de levedura) utilizados para o crescimento in vitro dos microrganismos.

1) Aminoácidos - fundamentais para a síntese protéica2) Purinas e pirimidinas - fundamentais na composição

dos ácidos nucléicos3) Vitaminas - fazem parte de co-fatores enzimáticos

Cultivo de microrganismos in vitro

Meio de Cultura: mistura de compostos nutrientes necessários ao crescimento microbiano.

Algumas bactérias crescem em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios especiais e também existem bactérias que não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura já desenvolvido. Uso:Permitem o isolamento, crescimento e manutenção de microrganismos no laboratório.Facilitam a identificação dos microrganismos a partir de diferentes ambientesPermitem verificar susceptibilidades a agentes quimioterápicos e outros compostos químicosUso na indústria: inoculantes, fermentação

Podem ser líquidos (sem agar), semisólidos ou sólidos.

Líquido: obtenção de biomassa e de metabólitos em reatoresSólido: permite a obtenção de cultura pura - caracterizar um agente

infeccioso

Classificação dos meios quanto ao estado físico

Caracterização

Classificação quanto à composição

Meios sintéticos ou definidoscomposição química exata é conhecida

Meios Complexoscomposição química exata não é conhecidaÚteis para cultura de microrganismos com requerimentos nutricionais complexos ou

desconhecidos.Hidrolisados de proteínas preparadas por digestão proteolítica parcial de carne,

caseína, soja ou gelatina), extrato de carne ou extrato de levedura.

Classificação quanto à composição

Meios de cultura enriquecidos

Meio basal enriquecido com ovo, soro ou sangue, substâncias que permitem o crescimento de bactérias muito exigentes em termos nutricionais e que se encontram em número reduzido.

• Meios caracterizados por ausência de inibidores. Podem ou não ser diferenciais.• Ex: Agar sangue, Brain and Heart Infusion (BHI)

Quanto a finalidade

Meios diferenciais permitem a distinção entre diferentes grupos de m.o.

Produção de enzimasDNAse - adição substrato e verificação halo hidrólise

Agar sangue: Meio complexo, enriquecido, não seletivo

• Meio diferencial porque permite verificar a existência ou não de hemólise – colônias envolvidas por zonas claras devido a lise de células vermelhas.

• Streptococcus pyogenes.

Meios de enriquecimento

São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras, facilitando o isolamento de um microrganismo de interesse.Ex: caldo de selenito de sódio- permite enriquecimento de Salmonella e Shigella, agentes causadores de intoxicações alimentares.

Meios de cultura seletivos

Permitem apenas o crescimento de certas espécies de bactéria.

Ex: Meio de McConkey (peptona, lactose, NaCl, sais biliares e vermelho de metila como indicador de pH).

Meio diferencial para fermentação de lactose - Bactérias que fermentam áçúcares produzem ácidos que reagem com vermelho de metila formando colônias rosas, colônias não fermentadoras permanecem incolores.

Seletivo para bacilos gram – (bactérias de origem intestinal, enterobactérias)- Contém sais biliares e corantes que inibem o crecimento de bactérias gram +.

Meios de transporte

Meios que servem para o transporte e conservação de um material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais microrganismos. O papel principal deste meio é manter os microrganismos vivos, mas impede o crescimento e multiplicação até o subcultivo em meio adequado.

Meio de Stuart

Glicerol fosfato de sódio .......................................10 gTioglicolato de sódio................................................1 gCloreto de cálcio....................................................0,1 gAzul de metileno................................................0,002 gÁgar............................................................................8 gÁgua…………………………………………………… 1 L

Meios de conservação

São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante meses, anos ou décadas.

Ex: Meio GYMP adicionado de glicerol-crioprotetor

Efeitos ambientais no crescimento microbiano

Fatores físicos que afetam o crescimento de bactérias

Procariotos que vivem em pH extremos parecem manter um pH interno próximo do neutro bombeando prótons para fora da célula

Neutrófilos: crescem na faixa de pH entre 5 a 8Acidófilos: crescem melhor em valores <5Alcalófilos: crescem melhor em valores >5

pH

pH

pH

Os microrganismos podem alterar o pH do micro habitat

Liberação de produtos de degradação ácidos ou básicos. • Produção de ácidos orgânicos (lático)- Bactérias do ácido lático• Thiobacillus sp. (quimiolitotrófico) -oxida enxofre reduzido a

ácido sulfúrico• Produção de amônia através da desaminação de aminoácidos

Podem impactar o macroambiente

Temperatura

Temperatura ótima de crescimentopsicrófilas (12 a 17°C) psicrotróficas (20 a 30°C)mesófilas (28 a 37°C) termófilas (50 a 90°C) termófilas extremas (>80°C)

Efeito da temperatura

Afeta a taxa de crescimento por afetar a taxa das reações celularesFator Q10Mudanças na taxa de crescimento são comparáveis dentro de uma certa faixa às respostas das reações químicas a temperatura.

Efeito de altas temperaturas:

desnaturação de enzimas e proteínas em geralalteração do dobramento das proteínas reduzindo a sua atividadedesintegração das membranas por fusão lipídicaperda de água aumentada- evaporação

Adaptações que permitem crescimento a altas temperaturas

Proteínas e enzimas: o acúmulo de solutos (2,3 difosfoglicerato cíclico) que estabilizam proteínas; o presença de proteínas específicas que estabilizam outras proteínas por dobramento a temperaturas próximas do limite de crescimento (chaperonina)

Aumento da percentagem de G / C (não universal).o Presença de proteínas de união ao DNA que impeçam a sua fusão (aumento da estabilidade térmica)o DNA girase reversa: Superenovelamento (+) no DNA

Formação de estruturas de resistência: esporos

Modificação de lipídeos da membrana aumento da percentagem dos ácidos graxos saturados/ insaturados, ramificados e de alto peso molecular.

Fosfolipídios com alto ponto de fusão: CL, PE

Compensar o aumento da fluidez da membrana

Adaptações que permitem crescimento a altas temperaturas

Stress- Baixa temperatura

Desestabilização da bicamada-membranaAumento da concentração de soluto DesidrataçãoCitoplasma se torna altamente viscoso: alteração dos processos de difusão, incluindo osmoseDesnaturação de proteínas.

Baixas temperaturas-nível celular

Cristais de gelo grandes se formam no exterior das células, remove água e concentra o soluto.

Aumento dos cristais extracelulares: promovem a saída da água intracelular por osmose.

Causa lesões nas membranas e provoca intensa desidratação das células

Microrganismos psicrófilos

Modificação da composição das membrana celulares

o Aumento de ácidos graxos insaturados, encurtamento das cadeias e diminuição de ácidos graxos cíclicos

o Estas alterações mantém as membranas em um estado semi-fluido a baixas temperaturas.

Exemplos: Pseudomonas, Listeria e Flavobactérias

Atmosfera gasosa

O2 e CO2, são os gases principais que afetam o crescimentoDe acordo com resposta ao O2, os microrganismos são classificados em:

AERÓBIOSEstritos (obrigatórios): necessitam de O2 (respiração aeróbica)Microaerófilo: necessitam de O2 em níveis menores que atmosfera (respiração aeróbica)

ANAERÓBIOSAerotolerantes: não necessitam de O2 mas podem tolerar sua presença (fermentação)Facultativos: não necessitam de O2 mas crescem melhor na sua presença (fermentação, respiração aeróbica)Estritos (obrigatórios): não toleram O2 (letal) (fermentação, respiração anaeróbica)

Por que o O2 é tóxico para os anaeróbios?

O2 é poderoso agente oxidante e excelente aceptor de elétrons na respiraçãoProcessos celulares geram formas reativas de O2 - são

oxidantes poderosos que destroem constituintes celulares

Formas tóxicas do oxigênio

células devem ser capazes de se proteger contra estas espécies reativas para manter sua integridade

Enzimas que inativam o O2 tóxico

Caracterização de microorganismos quanto ao metabolismo de O2

(a) Aeróbio obrigatório (catalase e superóxido dismutase)

(b) Anaeróbio (catalase e superóxido dismutase ausentes na maioria)

(c) Anaeróbio facultativo (catalase e superóxido dismutase)

(d) Microaerófilo (necessitam de baixos teores de O2) (pequenas quantidades de catalase e superóxido dismutase)

(e) Aerotolerante (suportam a presença de O2, apesar de não o utilizarem) (superóxido dismutase)

uso de agentes redutores nos meios de culturaEx: tioglicolato de sódio, que reage com oxigênio, formando águaremoção mecânica do oxigênio, sendo substituído por nitrogênio e CO2;

Cultivo de anaeróbiosMétodos de produção de ambiente anaeróbio

Uso de sistemas geradores de anaerobiose (GasPak) -Jarra de anaerobiose: adicionadas de bicarbonato de sódio e boroidreto de sódio que reagem com a água liberando hidrogênio e CO2 com um catalisador de paládiousada para anaeróbios aerotolerantes

Cultivo de anaeróbiosMétodos de produção de ambiente anaeróbio

Câmara de anaerobiose

Transporte de anaeróbios

Embalagem formadora de anaerobioseInserção de amostra no interior do meio de cultura pré-reduzido

Pressão osmótica

Pressão Osmótica - força com a qual a água se move através da membrana citoplasmática a partir de uma solução de baixa concentração de soluto para uma contendo alta concentração de soluto (osmose).

As células podem estar em um meio:

Isotônico - Não hámovimento de água para dentro ou para fora da célula

Hipertônico -concentração de solutos fora da célula é maior que no interior. A água flui para fora da célula - plasmólise

Hipotônico - a concentração de soluto no interior da célula é maior que fora dela. A água flui para dentro da célula: pode inchar e se romper

Como os microrganismos conseguem crescer em um meio com baixa atividade de água?

Bombeamento de íons inorgânicos (KCl) para o interior da célula Síntese de solutos orgânicos acumulados no interior da célula para o ajuste da atividade de água citoplasmática (BS)

Prolina (G(+) Staphylococcus aureus);

Glicina betaina (bacterias halófilas)

Ectoina (Ectothiorhodospira)

Glutamato

Sacarose, Trehalose, Glucose, Frutose

(Cianobacterias de aguas continentais, fotossintéticas anoxigênicas)

Solutos compatíveis

Glicerol, Manitol, Sorbitol, Ribitol

(Cianobacterias e algas marinhas, Dunaliella, leveduras osmofílicas, fungos xerófilos)

(Algas marinas)

KCl: Arqueobacterias halófilas extremas

Efeito da concentração do íon sódio no crescimento de microrganismos

1-15% de NaCl 15ª 30% de NaCl

Os efeitos osmóticos são de maior importância em ambientes salinos.Em relação a necessidade de sal (NaCl) m.o. podem serNão Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença no meio.Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meioHalófilos: necessitam de sal em uma concentração moderadaHalófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações.

Adaptações aos períodos de dessecação

Formação de esporos: Sobrevivência em estado dormente e crescimento ativo em condições favoráveis

Formação polissacarídeos extracelulares (cápsulas, camada mucosa) com trehalose

Síntese de açúcares (sacarose, trehalose) que se liga a proteínas impedindo a desnaturação

Trehalose forma ligações de H com lipídios (substituindo moléculas de água) mantendo a membrama celular funcional

Mecanismos de reparo de DNA (fragmentação em condições de dessecação)

Para microrganismos que se dividem por fissão ou por gemulação, o termo crescimento refere-se a um aumento do número e não ao tamanho das células.

Os microrganismos em crescimento estão, na verdade, aumentando o seu número e se acumulando em colônias

COLÔNIAS => grupos de células => visualização sem utilização de microscópio.

Taxa de crescimento: é a variação no número ou massa de microrganismos por unidade de tempo.

Crescimento microbiano

Crescimento celular e fissão binária

•As bactérias dividem-se em duas por fissão binária e aumentam o seu número de forma geométrica em que a sua população duplica a cada tempo de geração (Crescimento exponencial)

•Tempo de geração: é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique.

Tempo de geração varia de acordo com sua constituição genética e condições do meio

Escherichia coli se divide a cada 20 minutos em caldo em laboratório e a cada 2-3 dias no colon.

Quando uma bactéria é semeada em um meio apropriado, nas condições apropriadas, o seu crescimento segue uma curva definida e característica:

A – Fase LAG: pouca divisão celular, os microrganismos estão se adaptando ao meio em que estão crescendo. As células aumentam de volume, mas não se dividem.

B – Fase exponencial (log): crescimento exponencial, divisões celulares sucessivas, grande atividade metabólica.

C – Fase estacionária: decréscimo na taxa de divisão celular, onde a velocidade de crescimento = velocidade de morte

D – Fase de declínio ou morte: condições impróprias para o crescimento, meio deficiente em nutrientes e rico em toxinas, onde as células mortas excedem o número de células vivas

Curva de crescimento bacteriano

MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO CRESCIMENTO MICROBIANO

Métodos para medida de crescimento microbiano

Contagem do número de microrganismos

- Direta: ao microscópio ótico

- Indireta: contagem em placa, membrana filtrante e incubação.

Contagem do número de células

Contagem direta das células, usando uma câmara de contagem (câmara de Neubauer ).

- Vantagens: é o processo mais direto, econômico e rápido de contagem de microrganismos. - Dá também informação sobre o tamanho e morfologia dos microrganismos.

- Desvantagem: não permite distinguir as células vivas das células mortas.

CÂMARA DE NEUBAUER

Ao microscópio – aumento de 400X

Contagem em placas

O número original de microrganismos na amostra (UFC/mL) pode ser calculado a partir do número de colônias formado e da diluição feita.

MËTODO DE DILUIÇÕES SUCESSIVAS

CONTAGEM DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DE FILTRAÇÃO

Sistema de filtragemCélulas bacterianas na superfície da membrana (poros)A membrana filtrante foi colocada sobre omeio de cultura e a placa foi incubada.

Determinação da massa celular

Direto: pesagemIndireto: determinação do contéudo de N, P e C e turbidimetria

Determinação do peso seco- Método que inclui centrifugação, lavagem, secagem num forno e pesagem.- Desvantagens: baixa sensibilidade e necessidade de grandes quantidades de massa orgânica.

Medição da massa celularTurbidimetria

- Baseia-se no fato de as células microbianas dispersarem a luz. A quantidade de luz detectada é proporcional àconcentração de células presentes.

- Quando a concentração bacteriana atinge 10 milhões de células por ml o meio aparece ligeiramente turvo. O aumento da concentração celular conduz ao aumento da turvação e menos luz é transmitida através do meio. A luz detectada pode ser medida num espectofotómetro.

- Vantagens: é um método rápido e sensível.- Desvantagem: não permite descriminar entre as células vivas e mortas

Determinação da atividade celular

Atividade enzimática

Concentração de um metabólito

Medida da respiração

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