Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de ... · envolvidas na sinalização...
Transcript of Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de ... · envolvidas na sinalização...
1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas
LGN 5799 - SEMINÁRIOS EMGENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS DE PROTEÍNAS
Fernanda SalvatoDr. Carlos Alberto Labate
Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
DefiniçõesDefinições
? Proteômica:
- Diz respeito ao estudo em larga escala de proteínas em sistemasbiológicos;
- Pode ser vista como uma metodologia experimental que explica a informação contida na seqüência genômica em termos de estrutura, função e controle de processos biológicos.
? Proteoma:
A totalidade de proteínas existentes em uma célula, tecido ou organismo.
2
P
Transcrição Alternativa
Splicing Alternativo
Tradução
1 Gene ? 1 Transcrito ? 1 Proteína
? O número de genes é muito menor que o número de proteínas em humanos (~33.000 genes vs ~200.000 a 1 milhão proteínas)
? Cada gene codifica XX proteínas diferentes- devido à diversidade alélica, splicing alternativo e às modificações
pós-traducionais de proteínas
? Há muitos casos em que a população de RNAm não está fortemente correlacionada com o perfil protéico;
Por que estudar o Por que estudar o ProteomaProteoma??
Maneira direta para se Maneira direta para se estudar expressãoestudar expressão
Objeto de estudo: Objeto de estudo: PROTEOMAPROTEOMA
3
Determinação direta da Determinação direta da seqüência de aminoácidos seqüência de aminoácidos
Seqüência traduzida Seqüência traduzida a partir do DNAa partir do DNAX
? Freqüentemente, as proteínas são modificadas para formar a proteína madura que difere significativamente da predita pela tradução;
- em muitos casos, a falta da modificação pós-traducional é muito importante e tem conseqüências funcionais;
? Além disso, em alguns casos, o RNAm é editado antes da tradução, criando mudanças na seqüência de aminoácidos que não são inferidas pelos genes.
Por que estudar o Por que estudar o ProteomaProteoma??
Uma proteína inferida a partir da seqüência Uma proteína inferida a partir da seqüência genômicagenômica é um objeto é um objeto hipotético até um experimento verificar sua existência.hipotético até um experimento verificar sua existência.
? Desde o primeiro artigo de revisão “Plant Proteome Analysis” (Canóvas etal, 2004) foram publicados 246 artigos relacionados com proteoma de plantas menos de 1% de publicações na área proteômica!!
? Cerca de 3% são artigos relacionados ao estudo de modificações pós-traducionais de proteínas neste mesmo período (2004-2007).
? Destes, 60% representam artigos de revisão;
? Este período pode ser interpretado como avanço potencial da proteômica, refletindo mais expectativas do que realizações;
? Período de adequações de técnicas e estratégias de análise.
Pesquisa no Pesquisa no WebWeb of of ScienceScience::
4
Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
O que são?
? Definição Geral: qualquer modificação na forma traduzida das proteínas.
? Adições covalentes que regulam a função da proteína, determinando o estado de atividade, a localização celular e a dinâmica de interações com outras proteínas.
Por que alterar as proteínas depois de traduzidas ao invés Por que alterar as proteínas depois de traduzidas ao invés de utilizarde utilizar--se do controle se do controle transcricionaltranscricional??????
É mais fácil:
A partir de um “esqueleto protéico”
•Criar um espectro de proteínas ligeiramente diferentes;
•Mudar totalmente as propriedades dessas proteínas
Ao invés de construir cada proteína correndo o risco de não ser utilizada num dado momento.
Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
5
Características Gerais
? São conhecidas mais de 200 tipos;? Estão presentes em pelo menos 80% das proteínas eucariotas;? Foram encontradas em todas as espécies;? Estão localizadas em seqüências específicas;? Algumas são transientes;? Presentes sob baixa estequiometria;? Geralmente agem em conjunto.
Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
Características Gerais
? Quase todas as proteínas são modificadas durante a síntese ou após a síntese de proteínas;
? Estas modificações podem ser químicas ou por meio de clivagem;
? Toda proteína pode potencialmente ser modificada de diferentes maneiras;
? As modificações não podem ser preditas através da seqüência, somente os possíveis locais de sua ocorrência.
6
ModificaçõesModificações
Adição de grupos funcionais Adição de grupos funcionais
- sulfato, acetato, metil, fosfato
Cadeias de carboidratos e/ou lipídiosCadeias de carboidratos e/ou lipídios
Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
? Estas mudanças químicas podem alterar a hidrofobicidade de umaproteína e assim determinar a localização celular;
? Outras modificações, como a fosforilação, são parte de um sistema de controle do comportamento protéico (por exemplo, ativando ou inativandouma enzima).
Cacatas de fosforilaçãoenvolvidas na sinalização
celular
Várias modificações regulam a função de microtúbulos
Proteínas de membrana podem se ligar à membrana
através de âncoras GPI
Poliubiquitinaçãoinduz à degradação
protéica
Proteínas carregam O-glicanos
Histonas controlam muitos processos
nucleares
Proteínas de Membrana com
N-glicanos
(Jensen, 2006)
Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais CelularesCelulares
7
A B C
MecanismoMecanismo FunçãoFunção
Processamento proteolítico e mudança
comformacional
Ativação
Proteólise dependente-MPT
Degradação
Reconhecimento dependente-MPT
Ativação, interação,
localização e secreção
Múltipla-MPTsRegulação dinâmica
ou modulação de atividade protéica,
interação prot-prot e interação DNA-prot
Função protéica Função protéica dependentedependente--MPTMPT
MPTMPT
Mecanismo de Ação das Mecanismo de Ação das MPTsMPTs
(Jensen, 2006)
Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
Estabilidade protéica, estrutura tridimensional
Pontes de dissulfeto
Atividade protéicaSulfatação
Sinal de degradaçãoUbiquitinação
Estabilidade protéicaHidroxiprolina
Reversível, interações célula-célula, proteínas secretadas, funções regulatórias
Glicosilação
Regulação da expressão gênica, estabilidade protéica
Metilação
Reversível, estabilidade, regulação das interações DNA-proteína (histonas)
Acetilação
Reversível, regulação da atividade protéica, sinalização
Fosforilação
FunçãoTipo
(Adaptado de Mann & Jensen, 2003)
8
Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
Funções Biológicas
? Regulação da atividade de proteínas e de suas funções;
? Aumenta significativamente a diversidade e a complexidade do proteoma;
? Essenciais na transdução de sinais desde a membrana plasmática até o núcleo em resposta a estímulos externos;
? Ativação e inativação de enzimas;
? Modulação de interações moleculares proteína-proteína;
? Reconhecimento de DNA;
? Estabilidade protéica;
? Controle da transcrição gênica (fatores de transcrição);
? Desbalanços de modificações estão associadas a doenças;
Modificações Pós-Traducionais mais estudadas
? Fosforilação- adição e remoção de grupos fosfatos
? Glicosilação- adição de uma cadeia curta de carboidratos
(oligossacarídeos ou glucanos)
? Ubiquitinação- adição de ubiquitina(tag para localização e degradação)
Modificações Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
9
ANÁLISE DE MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS
•Enriquecimento de amostras complexas
•Identificação de MPTs
Análise de Modificações Análise de Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
? É recente o início do estudo de MPTs em uma escala proteômica;
? Muitas das modificações estudadas hoje foram descobertas ao acasoestudando-se somente uma proteína em particular;
Combinações de diferentes
modificações
Amostra complexa!
Heterogênea!
Difícil caracterização e quantificação das
modificações
? Premissa básica: as modificações resultam em perda ou incremento de massa relativa no peptídeo.
? Logo, a detecção deste incremento/perda de massa pode ser feita por espectrometria de massasespectrometria de massas.
10
Os métodos se baseiam:
? Em separação de proteínas;
? Análise comparativa de amostras antes e depois da remoção de modificações;
? Técnicas específicas de coloração para modificações pós-traducionaisparticulares.
Métodos:
Análise de Modificações Análise de Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
? Método ideal: Espectrometria de Massas
- Modificações pós-traducionais causam mudança na massa predita;
- Ideal para adições e substituições, mas a proteína deve ser isolada.
? Anticorpos específicos para tipos de modificações
? Coloração de Gel específica
Análise de Modificações Análise de Modificações PósPós--TraducionaisTraducionais
? A complexidade das amostras com MPTs
? Características físico-químicas (MPTs lábeis)
? Tamanho de peptídeos com MPTs
? Baixa concentração de MPTs
Diminuem a eficiência/acurácia
de detecção por MS
? Para análise em “escala proteômica” é necessário :
- enriquecimento de amostras com MPTs
- utilização de MS em combinação com outras técnicas (géis 2D)
Só é possível detectar MPTs quando em abundância
Grande quantidade de amostra é necessáriaAumenta
Sensibilidade !!!
11
TÉCNICAS DE ENRIQUECIMENTO DA AMOSTRA
•IMAC
•Imunoprecipitação
•Tags
Enriquecimento da amostra
? Objetivo é aumentar a abundância relativa de uma classe de modificação pós-traducional de polipeptídeos de uma amostra;
? É aplicada ao nível protéico ou peptídico.
Técnicas:
? Colunas de afinidade (IMAC, colunas de lectina)
? Anticorpos imunoprecipitação
? Tags (biotina)
Enriquecimento de AmostrasEnriquecimento de Amostras
12
Técnicas de EnriquecimentoTécnicas de Enriquecimento
IMAC (Immobilized Metal-Affinity Chromatography)
? Técnica de CromatografiaCromatografia de de AfinidadeAfinidade utlizando metal imobilizado (faseestacionária);
? Muito utilizado para isolar fosfopeptídeos a partir de uma amostra protéica digerida antes da análise por espectrometria de massas;
? Íons metálicos imobilizados carregados positivamente (FeIII) atraem grupos fosfato negativos;
? Surgiu com o estudo de fosfoproteínas de células de leveduras (Ficaro et al, 2002);
? Outros exemplos: •purificação de fosfotirosinas de proteínas humanas (Salomon et al,2003)• isolamento de proteínas de membranas em plantas(Nühse et al, 2003)
Digestão
Adesão à coluna
Eluição
Peptídeos fosforilados
Peptídeos não fosforilados
Fração não aderida
Amostra complexa de
proteínas
AnáliseMS
13
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tempo (min)
Abu
ndân
cia
Rel
ativ
a
29.16
61.9750.6039.27 74.5936.6527.90
Antes do enriquecimento
Depois do enriquecimento
K.FQS*EEQQQTEDELQDK.I
K.FQS*EEQQQTEDELQDK.I50.50
28.83
22.35 33.7062.87
42.56 57.1320.17
41.08
Cromatrografia de Afinidade por lectina
? Utilizada para enriquecimento de amostras com glicoproteínas e glicopeptídeos;
? Lectinas são carboidratos que se ligam às proteínas;
? Reconhecem estruturas específicas de carboidratos;
? Este método revelou 400 locais de N-glicosilação em 250 proteínas de Caenorhabditis elegans.
Introdução de Tags de Afinidade
? Através de reações químicas incorpora-se uma tag molecular na proteína que pode subseqüentemente ser purificada;
? Converte MPTs de aminoácidos em espécies facilmente detectáveis por MS, ou seja, aumenta a habilidade de detecção de MPTs;
Técnicas de EnriquecimentoTécnicas de Enriquecimento
14
? Biotina: é uma glicoproteína muito utilizada como tag molecular;
? Moléculas biotiniladas podem ser imobilizadas através da interação com proteínas (avidin) que se ligam à biotina.
? Avidin: proteína que possui forte interação com a biotina
+
Avidin beads Biotina-proteína
Afinidade Avidin-Biotinaoutras proteínas
Purificação
biotina
Proteína com MPT
TagsTags de Biotinade Biotina
Proteína eluída/purificada
Digestão
Mistura de Peptídeos
AnáliseMS/MS
TagsTags de Biotinade Biotina
15
Imunoprecipitação
Anticorpo contra proteína de interesse
Anticorpo se liga às proteínas de
interesse
Adiciona-se proteína A tornando o complexo
insolúvelCentrifugação
? Extensivamente utilizado na purificação de fosfoproteínas intactas;
? Desvantagem: ligação fraca proteína-anticorpo.
Técnicas de EnriquecimentoTécnicas de Enriquecimento
Descarte !
Outras proteínas
Proteínas com a modificação de interesse
IDENTIFICAÇÃO E MAPEAMENTO DE MPTs
•Espectrometria de Massas (ESI-Q-TOF)
•Gel 2D
•Coloração específica
16
Espectrometria de MassasEspectrometria de Massas
? É o método ideal para análise de modificações pós-traducionais;
? O espectrômetro de massa determina a razão massa/carga do peptídeo ou proteína ionizadas;
? O erro de massa é freqüentemente inferior a 10 ppm (depende da máquina)
- Exemplo: 0,02 Da por peptídeo de 2000 Da
? A presença ou ausência de modificações pós-traducionais causam diferenças na massa do peptídeo.
? Em princípio, qualquer MPT pode ser detectada pela espectrometria de massa.
? O espectrômetro funciona como uma balança analítica;
? Mede a massa dos resíduos de aminoácidos;
? Cada aminoácido tem sua massa previamente definida;
Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas
Massa (Da)Aminoácido
113.1594Isoleucina (I)
137.1411Histidina (H)
57.0519Glicina (G)
128.1307Glutamina (Q)
129.1155Ácido Glutâmico (E)
103.1388Cisteina (C)
115.0886Ácido Aspártico (D)
114.1038Asparagina (N)
156.1875Arginina (R)
71.0788Alanina (A)
Massa (Da)Aminoácido
99.1326Valina (V)
163.1760Tirosina (Y)
186.2132Triptofano (W)
101.1051Treonina (T)
87.0782Serina (S)
97.1167Prolina (P)
147.1766Phenylalanina (F)
131.1926Metionina (M)
128.1741Lisina (K)
113.1594Leucina (L)
17
-2Ligações Disulfíticas
238Acilação
14Metilação
16Hidroxilação
1Deaminação
42Acetilação
> 1.000Ubiquitinação
> 800Glicosilação
80Fosforilação
? Massa, DaMPT
Espectrometria de MassasEspectrometria de Massas
? Exemplos de mudanças de massas devido às modificações
Espectrometria de MassasEspectrometria de Massas
Como funciona?
? Existem diversos modelos que diferem quanto à fonte de ionização, quanto ao analisador de massas diferentes propósitos.
? Componentes:
Ionizador•MALDI•Electrospray (ESI)
Amostra
+_
Analisador de Massa•Tempo de vôo (TOF)•Quadrupolo•Ion-Trap
Detector
18
Gás nebulizador N2
Temp 20-350ºC
Espectrometria de Massas
Como funciona ?? Modelo: ESI-Quadrupolo-TOF
•Fonte de ionização: Electrospray (ESI)
Análise massa
+ 6.000 V
Eletrodo
Espectrometria de MassasEspectrometria de Massas
Detector
Quadrupolo
AmostraVoltagens
Íon ressonante
Íon não ressonante
? Analisador de Massa ou Filtro de Massa ou Separador de Massa
• O Analisador Quadrupolar é o mais comum atualmente.
•Mudando-se o potencial elétrico aplicado,
seleciona-se diferentes massas.
19
Espectrometria de MassasEspectrometria de Massas
? Tempo de Vôo (TOF): é um analisador de massa.
+
++
++
+
++ +
Íons - amostra Detector
Distância fixa
Mais leveMais pesado
Espectrometria de MassasEspectrometria de Massas
? Espectrometria em Tandem – MS/MS
-São filtros de massa concetados em série.
- Ideal para moléculas grandes e amostras complexas (mais sensíveis).
DetecçãoAmostra Ionização Separação m/z
Fragmentos Separação m/z
ESI
MALDI
Célula de Colisão
-
+
++ +
+
+
MS 1
Íon precursor
MS 2
produto do íon
Detector
Gás Ar
20
Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas
Análise de MPTs
Levar em consideração o
déficit de massa!
•?m= 80 Da
Protease
Protease
Proteína Modificada
Proteína não modificada
Peptídeos
Peptídeos
Corresponde à adição de um
HPO3
21
Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas
? Nos fornece picos m/z característicos durante a MS/MS;
? Espectrômetros MS/MS podem ser programados para detectar somente os peptídeos que geram sinais específicos de MPTs;
? Exemplo: peptídeos contendo resíduos Lisina acetilada geram um sinal de íon fragmentado com m/z de 126,1.
MPTs – mistura proteínas
Digestão proteolítica
HPLC
Íons peptídeos
spray Espectro MS/MS
Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas
LC-MS total
Anotação da MPT no peptídeo
22
Gel 2 DimensõesGel 2 Dimensões
? Separação dos diferentes estados de modificações das proteínas;
? Em seguida, os spots são excisados e identificados por MS;
? Técnicas se baseiam na utilização de corantes e anticorpos específicos, marcações com P-32;
Incorporação de P-32
(Bikova et al, 2003)
IEF
Mas
sa M
olec
ular
(KD
a)
SD
S-P
AG
E
Comassie Phospho-imagem
Visualização por autorradiografiadas proteínas fosforiladas
Gel 2 DimensõesGel 2 Dimensões
? Análise utilizando anticorpo para fosfotirosina:
(Kim et al., 2002)
Coloração de Prata Coloração imunofosforilação
MAP Kinases
GAPDH
Proteínas totais Proteínas fosforiladas
23
Gel 2 DimensõesGel 2 Dimensões
? Corantes fluorescentes específicos Análise Multiplex
(Invitrogen)
Células Normais de Fígado Células de Tumor de Fígado
Estratégia Geral de Análise de Estratégia Geral de Análise de MPTsMPTs
Célula
Preparação da Amostra
•Extração Proteínas
•Enriquecimento da amostra com proteínas modificadas
•Digestão proteolítica
•Enriquecimento da amostra com peptídeos modificados
Peptídeos modificados
Ionização
Fase gasosa
Peptídeos ionizados
Aquisição MS
Análise computacional
Anotação de MPTs
Validação da anotação
RéplicaFunção da MPT
Continuação experimentos
24
Cuidados Gerais na Análise de Cuidados Gerais na Análise de MPTsMPTs
? A quantidade de amostra deve ser suficiente;
- as MPTs encontram-se sob baixa concentração.
- spots devem ser concentrados.
? Remoção de contaminantes e concentração da amostra através da purificação com microcolunas antes da MS;
? Deve haver uma boa cobertura de seqüência peptídica;
- requer análise do peptídeo específico que contém a modificação.
- a cobertura de seqüência pode ser melhorada pela divisão da amostra em frações antes da análise MS
- outra técnica utilizada para a melhora da cobertura de seqüência é a utilização de duas enzimas diferentes para digestão das proteínas.
Cuidados Gerais na Análise de Cuidados Gerais na Análise de MPTsMPTs
? Um spot pode conter uma proteína com a mesma modificação em locais específicos diferentes;
- Ex: em um mesmo spot tenho proteína fosforilada em Ser e Tyr
Um spot pode conter também proteínas modificadas e não modificadas;
- a utilização de faixas de pI menores (melhor resolução) ajudará a identificar/separar proteínas modificadas das não modificadas.
? Algumas modificações possuem ligações lábeis, ocorrendo perda destas MPTs durante o processo o preparo da amostra e ionização;
- devemos encontrar condições que mantenham estas ligações (muito difícil!!!)
25
SIMPLICIDADE
SELETIVIDADE
SENSIBILIDADE
Experimentos baseados em:Experimentos baseados em:
Bancos de Bancos de MPTsMPTs
? As diferentes MPTs ocorrem em seqüências específicas;
? A presença de uma seqüência específica não significa que a mesma se encontra modificada;
? A presença de modificações em seqüências particulares pode ser útil na predição da função e localização de proteínas;
? O RESID DatabaseRESID Database é um banco público que possui documentado mais de 320 modificações pós-traducionais;
? Possui uma coleção de anotações e estruturas de modificações pós-traducionais incluindo modificações na extremidade amino-terminal, carboxi-terminal e nas cadeias peptídicas;
? Possui informações cruzadas com o SWISS-PROT e TrEMBL (bancos de seqüências de proteínas);
http://www.ebi.ac.uk/RESID/
26
•EXPASYEXPASY (Ferramentas proteômicas)
•Predição de locais onde podem ocorrer modificações pós-traducionais;
•É importante associar a predição com a detecção experimental!
Exemplos de Ferramentas:
•TermiNator – Predição de modificações N-terminais•Sulfinator - Predição de sulfatação de tirosina•NetPhos – Predição de fosforilação de Ser, Thr e Tyr em proteínas eucarióticas•MITOPROT – Predição de seqüências-sinais mitocondriais•NetNGlyc – Predição de N-glicosilação em proteínas humanas
Predição de Predição de MPTsMPTs
http://ca.expasy.org/
ConclusõesConclusões
? As MPTs são extremamente importantes para o funcionamento de sistemas biológicos;
? O grande interesse em entender a diversidade de proteínas e a regulação de processos têm levado ao estudo de MPTs;
? Existem numerosas técnicas que estão sendo desenvolvidas rapidamente e aplicadas ao estudo de MPTs;
? Instrumentos extremamente rápidos e precisos (espectrômetros de massa);
? O estudo de MPTs contribui para o entendimento:
- etiologia de doenças (diagnóstico, novas drogas);
- respostas a estresses;
- redes de sinalização que regulam os processos biológicos da célula
27
Obrigada pela Atenção!