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Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu Mestrado Profissional em Ciência e Tecnologia de Alimentos

Campus Rio de Janeiro

Angelo Máximo Batista de Amorim

AVALIAÇÃO DA MULTIRRESISTÊNCIA A DROGAS E DA PRODUÇÃO DE OUTROS

FATORES DE VIRULÊNCIA POR ISOLADOS DE ENTEROBACTERIACEAE

PROVENIENTES DE PRODUTOS LÁCTEOS

RIO DE JANEIRO – RJ

2016


AVALIAÇÃO DA MULTIRRESISTÊNCIA A DROGAS E DA PRODUÇÃO DE OUTROS

FATORES DE VIRULÊNCIA POR ISOLADOS DE ENTEROBACTERIACEAE

PROVENIENTES DE PRODUTOS LÁCTEOS

Dissertação apresentada como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos, no Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu Mestrado Profissional em Ciência e Tecnologia de Alimentos, do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia (IFRJ).

Orientadora: Profª. Dr.ª Janaína dos Santos Nascimento

RIO DE JANEIRO – RJ

2016


Avaliação da multirresistência a drogas e da produção de outros fatores de virulência

por isolados de Enterobacteriaceae provenientes de produtos lácteos

Dissertação apresentada como parte dos

requisitos necessários para a obtenção do

título de Mestre em Ciência e Tecnologia de

Alimentos, no Programa de Pós-Graduação

Stricto Sensu Mestrado Profissional em

Ciência e Tecnologia de Alimentos, do

Instituto Federal de Educação, Ciência e

Tecnologia (IFRJ).

Data de aprovação: _____/_____/_____

________________________________________________________________

Prof. Dra. Janaína dos Santos Nascimento

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro

________________________________________________________________

Prof. Dr. Bárbara Cristina Euzébio Pereira Dias de Oliveira

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro

________________________________________________________________

Prof. Dra. Jéssica Manya Bittencourt Dias Vieira

Fundação Centro Universitário Estadual da Zona Oeste

Rio de Janeiro – RJ

2016

Dedico esta dissertação à minha esposa Luciane Carvalho dos Santos de Amorim, às minhas filhas Mylena dos Santos de Amorim e Alice dos Santos de Amorim, e, à minha mãe, Jandira Batista da Nóbrega, como um pedido de desculpas pelos momentos ausentes.

AGRADECIMENTOS

Agradeço, primeiramente, a Deus pela oportunidade de transformar este sonho em

realidade.

Agradeço a todos os meus guias espirituais.

Agradeço à Gláucia Motta da Silva Passos Ferreira, pessoa que me apresentou ao

curso e me incentivou a participar do processo seletivo, diante de uma barreira encontrada.

Agradeço à Luciane Martins Medeiros, primeira pessoa a me dar as diretrizes do

projeto de pesquisa e de compartilhar comigo a sua experiência na área de alimentos e

microbiologia.

Agradeço ao pessoal da SEPIN, especialmente à Adriana Marques Frazão, Luciana

Veloso da Costa, Josiane Machado Vieira Mattoso e Vania Maria da Silva Fernandes.

Agradeço ao pessoal da SEMEC, minha antiga seção de trabalho, pela parceria de

sempre.

Agradeço à minha gerente de divisão Claudia Maria Dias.

Agradeço à Érica Louro da Fonseca pelas aulas de biologia molecular.

Agradeço ao meu colega do INCQS Rafael Lawson Ferreira.

Agradeço aos meus colegas de seção (SEPRM).

Agradeço ao meu grupo de trabalho do laboratório de microbiologia do IFRJ:

Brendon Chaves Araújo, Douglas Henrique de Melo, Bárbara Victor Souza, Érica Yang,

assim como as professoras Thaís Souza Silveira Majerowicz, Zilma das Graças Nunes e

Aline dos Santos Garcia Gomes, e, especialmente a professora Bárbara Cristina Euzébio

Pereira Dias de Oliveira, pelas contribuições ao trabalho após a sua participação na banca

de qualificação.

Agradeço aos colegas da turma do mestrado 2015.

Agradeço à coordenadora do mestrado, Márcia Cristina da Silva e a todos os demais

professores do curso.

Um agradecimento especial à Maria Teresa Dias Ferreira, colega de trabalho, amiga

pessoal, conselheira espiritual e pessoa que faz parte da minha vida desde 2004, que

sempre me incentivou e continua incentivando, sem medir esforços.

E, por último, não tenho como deixar de agradecer a esta pessoa tão especial.

Aquela que, até quando os resultados saíram diferentes do esperado, sorriu, confortou-me

dizendo que foi a melhor que podia acontecer, e, sugeriu-me um novo rumo ao trabalho:

Janaína dos Santos Nascimento. Agora entendi porque seus alunos não te deixam em paz!

A todos vocês, meu muito obrigado.

“A verdadeira medida de um homem não se vê na forma como se comporta em momentos de conforto e conveniência, mas em como se mantém em tempos de controvérsia e desafio”.

Martin Luther King

i

AMORIM, A. M. B. Avaliação da multirresistência a drogas e da produção de outros fatores

de virulência por isolados de Enterobacteriaceae provenientes de produtos lácteos.

Dissertação apresentada como parte dos requisitos necessários para a obtenção do

título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Programa de Pós-Graduação

Profissional em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Instituto Federal de Educação,

Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Campus Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,

RJ, 2016.

RESUMO

Os produtos lácteos são consumidos mundialmente por indivíduos de todas as classes

sociais. Diante das condições de fabricação, armazenamento, comercialização e consumo,

estes produtos podem carrear diversas bactérias, como alguns membros da família

Enterobacteriaceae que, apesar de possuir representantes com elevado potencial

patogênico, não costumam causar complicações em um indivíduo imunocompetente.

Todavia o número de indivíduos com debilidade no sistema imunológico sobe

continuamente. Representantes da família Enterobacteriaceae podem expressar fenótipos

de multirresistência a drogas (MDR) e, eventualmente, estão associados a infecções e

surtos. Na área de Alimentos, e, mais especificamente em produtos lácteos, os poucos

trabalhos envolvendo bactérias patogênicas da família Enterobacteriaceae estão

relacionados à Escherichia coli e à Salmonella spp. Logo, o objetivo deste trabalho foi

investigar a prevalência de bactérias da família Enterobacteriaceae, diferentes de

Escherichia coli e Salmonella spp., provenientes de amostras de produtos lácteos

comercializados no Rio de Janeiro e caracterizar os isolados quanto à expressão de

multirresistência a drogas e de outros fatores de virulência. A partir de 10 amostras de

conveniência de produtos lácteos, foram obtidos 58 isolados, que foram identificados pelo

sistema VITEK 2. Os resultados do antibiograma revelaram que vinte e quatro isolados

expressaram multirresistência, uma vez que foram resistentes a pelo menos um antibiótico

de três classes distintas. Os isolados MDR foram avaliados quanto à expressão dos

fenótipos de susceptibilidade reduzida aos carbapenens (KPC) e de produção de β-

lactamase de espectro estendido (ESBL) em meios de cultura cromogênicos (CHROMagar®

KPC e CHROMagar® ESBL). Seis deles expressaram fenótipo KPC e 14 expressaram

fenótipos ESBL. A produção qualitativa de biofilme foi avaliada em ágar vermelho Congo e

cinquenta e quatro isolados mostraram ser produtores. Quanto aos demais fatores de

virulência, dezesseis isolados expressaram atividade proteolítica e vinte isolados mostraram

ser lipolíticos. Quarenta e dois isolados apresentaram algum tipo de atividade hemolítica. A

produção de substâncias antimicrobianas (SAM) também foi investigada, porém nenhum

dos isolados produziu SAM contra as estirpes utilizadas como indicadoras. O perfil

ii

plasmideal dos isolados MDR e não MDR do complexo Enterobacter cloacae revelou que

não foi possível identificar um padrão que distinguisse os dois grupos, baseado apenas em

número e tamanho das formas plasmidiais. Este trabalho sugere que alguns produtos

lácteos podem ser veículos de bactérias MDR da família Enterobacteriaceae, algumas

carreadoras de vários fatores de virulência, constituindo uma grave ameaça para a indústria

de laticínios e para os seus consumidores, especialmente aqueles pertencentes a grupos de

risco, como os imunodeprimidos.

Palavras-chave: Enterobacteriaceae. Produtos lácteos. Multirresistência. Fatores de virulência

iii

AMORIM, A. M. B. Avaliação da multirresistência a drogas e da produção de outros

fatores de virulência por isolados de Enterobacteriaceae provenientes de produtos

lácteos. Dissertação apresentada como parte dos requisitos necessários para a obtenção

do título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Programa de Pós-Graduação

Profissional em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Instituto Federal de Educação, Ciência e

Tecnologia do Rio de Janeiro (IFRJ), Campus Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, 2016.

ABSTRACT

Dairy products are consumed worldwide by individual belonging to all social classes. Under

different manufacturing conditions, storage, commercialization and consumption, these

products may carry various bacteria, as some members of the Enterobacteriaceae family

that, despite having representatives with high pathogenic potential, they do not usually cause

complications in an immunocompetent individual. However, the number of individuals with a

weak immune system rises continuously. Representatives of the family Enterobacteriaceae

can express multidrug resistance phenotypes (MDR) and, possibly, are associated with

outbreaks and infections. In the Food area, and more specifically, in dairy products, the few

studies involving pathogenic bacteria of the Enterobacteriaceae family are related to

Escherichia coli and Salmonella spp. Therefore, the aim of this study was to investigate the

prevalence of bacteria of the Enterobacteriaceae family, non-Escherichia coli and non-

Salmonella spp., from dairy products commercialized in Rio de Janeiro and characterize

isolates with respect to multidrug resistance and other virulence factors. From 10

convenience samples of dairy products were obtained 58 isolates which were identified by

the VITEK 2 system. Results of antibiogram revealed that twenty-four isolates expressed a

MDR phenotype, since they were resistant to antibiotics belonging to at least 3 different

classes. MDR isolates were evaluated for expression of reduced susceptibility to

carbapenems (KPC) and extended spectrum β-lactamase (ESBL) in CHROMogenic culture

media (CHROMagar® KPC and CHROMagar® ESBL). Six of them expressed KPC+

phenotype and 14 expressed ESBL+ phenotypes. Qualitative biofilm production was

evaluated in Congo red agar and fifty-four isolates proved to be producers. Regarding the

other virulence factors, sixteen isolates expressed proteolytic activity and twenty isolates

were lipolytic. Forty-two isolates showed some kind of hemolytic activity. The production of

antimicrobial substances (AMS) has also been investigated, but none of the isolates

produced AMS against the strains used as indicators. The plasmid profile of isolated MDR

and non-MDR from Enterobacter cloacae complex revealed that was not possible to identify

a pattern that distinguished the two groups, based only on number and size of plasmids. This

study suggests that some dairy products can be vehicles of MDR bacteria from

iv

Enterobacteriaceae family, some of them carriers of several virulence factors, constituting a

serious threat to dairy industry and its consumers, especially those belonging to risk groups,

such as immunocompromised.

Keywords: Enterobacteriaceae. Dairy products. Multidrug resistance. Virulence Factors

v

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Etapas da formação do biofilme bacteriano 8

Figura 2 Número de isolados da família Enterobacteriaceae obtidos no presente

estudo 23

Figura 3 Número de isolados produtores de biofilme 30

Figura 4 Exemplo de isolado produtor em biofilme em ágar vermelho congo 30

Figura 5 Exemplos de isolados que apresentaram atividade lipolítica 34

Figura 6 Exemplos de isolados que apresentaram atividade hemolítica 36

Figura 7 Eletroforese em gel de agarose com alguns isolados MDR e não MDR do

complexo Enterobacter cloacae 37

vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Antibióticos utilizados no presente estudo 17

Tabela 2 Interpretação dos resultados nos meios cromogênicos CHROMagar® KPC e CHROMagar® ESBL para os representantes da família Enterobacteriaceae 18

Tabela 3 Bactérias utilizadas como indicadoras da produção de substâncias antimicrobianas 20

Tabela 4 Isolados da família Enterobacteriaceae obtidos no presente estudo 21

Tabela 5 Perfil de resistência aos antimicrobianos 25

Tabela 6 Resultado dos testes com os meios cromogênicos CHROMagar® KPC e CHROMagar® ESBL 28

Tabela 7 Isolados que expressaram atividade proteolítica 31

Tabela 8 Isolados que expressaram atividade lipolítica 33

Tabela 9 Isolados que expressaram atividade hemolítica 35

vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMC Amoxicilina + ácido clavulânico

AMI Amicacina

AMP Ampicilina

ATCC American Type Culture Collection (Coleção norte-americana de micro-

organismos)

ATM Aztreonam

CAZ Ceftazidima

CEP Cefalotina

CHL Cloranfenicol

CIP Ciprofloxacina

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute (Instituto de Padrões Clínicos e

Laboratoriais)

CTX Cefotaxima

DNA Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucleico)

DTA Doença Transmitida por Alimento

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético

EMB Eosina Azul de Metileno

ESBL β-lactamase de espectro estendido

GEN Gentamicina

IDSA Infectious Diseases Society of America (Sociedade de Doenças Infecciosas da

América)

IFRJ Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro

IPM Imipenem

HIV Human Immunodeficiency Virus (vírus da imunodeficiência humana)

KPC Sensibilidade reduzida aos carbapenens

LMIFRJ Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal de Educação, Ciência e

Tecnologia do Rio de Janeiro.

LPS Lipopolissacarídeo

MDR Multidrug resistant (multirresistente a drogas)

viii

MER Meropenem

MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus resistente

à meticilina)

NOR Norfloxacina

pH Potencial de Hidrogênio

RDC Resolução da Diretoria Colegiada

SAM Substância(s) antimicrobiana(s)

STR Estreptomicina

TBE Tris/Borato/EDTA

TOB Tobramicina

TRI Trimetoprim

TET Tetraciclina

UFC Unidade(s) formadora(s) de colônia

UHT Ultra High Temperature (Temperatura ultraelevada)

ix

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 1

2 REFERENCIAL TEÓRICO 3

2.1 PRODUTOS LÁCTEOS 3

2.1.1 Contaminação microbiológica de produtos lácteos 4

2.2 A FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE 5

2.3 RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS 6

2.4 PRODUÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA 8

2.4.1 Produção de biofilme 8

2.4.2 Atividade proteolítica 10

2.4.3 Atividade lipolítica 10

2.4.4 Atividade hemolítica 11

2.5 PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS (SAM) 12

3 JUSTIFICATIVA 13

4 OBJETIVOS 14

4.1 OBJETIVO GERAL 14

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 14

5 MATERIAIS E MÉTODOS 15

5.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE PRODUTOS LÁCTEOS 15

5.2 ISOLAMENTO DOS MICRO-ORGANISMOS 15

5.3 MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS 15

5.4 IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS 16

5.5 PERFIL DE RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS 16

5.5.1 Detecção dos fenótipos de ESBL e KPC 17

5.6 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA 18

5.6.1 Detecção qualitativa da produção de biofilme 18

5.6.2 Detecção de atividade proteolítica 18

5.6.3 Detecção de atividade lipolítica 19

5.6.4 Detecção de atividade hemolítica 19

x

5.7 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS (SAM) 19

5.8 DETERMINAÇÃO E COMPARAÇÃO DO PERFIL PLASMIDEAL DOS ISOLADOS DO COMPLEXO ENTEROBACTER CLOACAE 20

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 21

6.1 PERFIL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS 24

6.1.1 Detecção dos fenótipos de ESBL e KPC 27

6.2 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA 29

6.2.1 Detecção qualitativa da produção de biofilme 29

6.2.2 Detecção de atividade proteolítica 31

6.2.3 Detecção de atividade lipolítica 33

6.2.4 Detecção de atividade hemolítica 34

6.3 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS (SAM) 36

6.4 DETERMINAÇÃO DO PERFIL PLASMIDEAL DOS ISOLADOS DO COMPLEXO ENTEROBACTER CLOACAE 36

7 CONCLUSÕES 39

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS 41

9 PRODUÇÃO CIENTÍFICA 42

9.1 ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÂO (ANEXO 1) 42

9.2 SUBMISSÃO DE ARTIGO: INTERNATIONAL FOOD RESEARCH JOURNAL

(ANEXO 2) 42

9.3 MANUSCRITO EM PREPARAÇÂO 42

9.4 COMUNICAÇÔES EM EVENTOS (ANEXOS 3 E 4) 42

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44

11 ANEXOS 59

1

1 INTRODUÇÃO

Os produtos lácteos são consumidos mundialmente por indivíduos de todas as

classes sociais, e geralmente, in natura, ou seja, sem qualquer processamento prévio até a

sua ingestão (DAMACENO et al., 2015; CASALINUOVO et al., 2014), o que exige destes

produtos uma qualidade microbiológica satisfatória. Apesar deste consumo abrangente, em

muitos locais, a produção, o armazenamento e a comercialização destes produtos ainda são

carentes de Boas Práticas de Fabricação e Higiene, podendo torná-los potenciais veículos

de transmissão de micro-organismos, muitos deles com elevado potencial patogênico, como

alguns representantes da família Enterobacteriaceae (LAGRANGE et al., 2015; CAINE et al.,

2014).

Os micro-organismos da família Enterobacteriaceae não costumam gerar grandes

transtornos a indivíduos imunocompetentes, tanto que alguns micro-organismos desta

família fazem parte da flora intestinal humana (FAKRUDDIN et al., 2014). Todavia, o número

de indivíduos com debilidade no sistema imunológico sobe continuamente, como nos casos

de imunodepressão (HIV, câncer, tuberculose entre outras) e imunossupressão (indivíduos

transplantados, submetidos à quimioterapia e portadores de doenças autoimunes)

(REZENDE, 2011). As doenças autoimunes são muito comuns na sociedade atual,

principalmente às ligadas a fatores reumatológicos. Estas doenças predispõem ainda mais

os indivíduos acometidos a doenças infecciosas (LUZ et al., 2007). Com isso, o contato

destes indivíduos com enterobactérias multirresistentes pode ser de suma criticidade.

Representantes da família Enterobacteriaceae podem expressar multirresistência

(MDR; do inglês multidrug resistant), e também fenótipos de susceptibilidade reduzida ao

carbapenens (KPC) e de β-lactamase de espectro estendido (ESBL), uma enzima que

hidrolisa o anel β-lactâmico dos antibióticos lactâmicos. Ambas as classes de antibióticos

são amplamente utilizadas no tratamento de infecções com bactérias gram-negativas

(PFEIFER et al., 2010; KONG et al., 2010).

Artigos evidenciando e/ou investigando o relacionamento de bactérias

multirresistentes com surtos hospitalares estão cada vez mais disponíveis nos bancos de

dados científicos (FERNÁNDEZ et al., 2015; CORNEJO-JUÁREZ et al., 2015; STOESSER

et al., 2015; GEFFERS e GASTMEIER, 2011). Entretanto, há poucos trabalhos relacionando

bactérias patogênicas da família Enterobacteriaceae a produtos lácteos. Os poucos

trabalhos disponíveis, são referentes à espécie Escherichia coli e ao gênero Salmonella.

(KOBAYASHI et al., 2016; LIU et al., 2016b; NUESCH-INDERBINEN et al., 2015; DEVAUX

et al., 2015; LAUNDERS et al., 2013; FARROKH et al., 2013).

Além da multirresistência aos antimicrobianos, outros fatores relacionados a

2

membros da família Enterobacteriaceae destacam-se na literatura, tais como:

O número de bactérias capazes de sobreviverem a ambientes totalmente

desfavoráveis, como em superfícies e equipamentos da indústria de alimentos, devido à

capacidade de produção de biofilme (OLIVEIRA et al., 2013c; OTTER et al., 2011);

A produção de enzimas proteolíticas (proteinases ou proteases), responsáveis pela

deterioração do leite e seus derivados (ZAJÁC et al., 2015), e pela desestabilização das

micelas de caseína, impedindo a coagulação do leite, logo a formação do queijo (CALDERA

et al., 2015; PINTO et al., 2007). Além disso, ainda afetam consideravelmente as

propriedades sensoriais dos produtos lácteos (CALDERA et al., 2015; HANTSIS-

ZACHAROV e HALPERN, 2007);

A produção de enzimas lipolíticas que influenciam diretamente nas propriedades

sensoriais e desenvolvendo no produto um sabor acre e um odor desagradável (CARPINÉ

et al., 2010; SANTOS et al., 2007);

A produção de hemolisina, enzima capaz de causar doença nas glândulas mamárias

dos animais produtores de leite, podendo, assim, afetar o leite delas extraído (BURGOS e

BEUTIN, 2010). No ser humano, afetam os mecanismos de modulação da morte celular

induzida e as vias de sinalização inflamatória (MILHAS et al., 2010);

A produção de substâncias antimicrobianas, que em um nicho de competição,

proporcionam vantagens às bactérias que as produzem, pois servem de ferramenta contra

as suas concorrentes.

A presença de plasmídeos relacionados aos mecanismos de resistência aos

antimicrobianos e a outros fatores de virulência

Diante de todos estes fatores, ressaltou-se a importância de se investigar a

prevalência de bactérias da família Enterobacteriaceae, diferentes de Escherichia coli e

Salmonella spp., em produtos lácteos comercializados no Rio de Janeiro, caracterizando-os

quanto à expressão de multirresistência a drogas e de outros fatores de virulência.

3

2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 PRODUTOS LÁCTEOS

O leite e seus derivados são a base da alimentação de muitas famílias no Brasil e no

mundo em todas as classes sociais (LAGRANGE et al., 2015). Assim sendo, o leite, uma

das fontes mais acessíveis de energia e nutriente, principalmente para recém-nascidos,

voltou a ocupar posição de destaque no cenário mundial devido aos seus lipídios, proteínas

e polipeptídios com funções fisiológicas. Estes fatores estão presentes na membrana do

glóbulo de gordura do leite, que dentre muitas funções destacam-se no auxílio à inibição do

câncer do colo do útero; na supressão à esclerose múltipla; na ação bactericida e na

inibição do crescimento celular de micro-organismos (ZHOU et al., 2014), assim como há

relatos de sua atuação anti-hipertensiva, antioxidante, anti-inflamatória e

hipocolesterolêmica (HSIEH et al., 2015).

Um dos principais produtos derivados do leite é o queijo, estando o Brasil entre as

principais elites mundiais na sua produção, destacando-se a produção de queijo mussarela,

queijo prato e queijo minas frescal (queijo de alta umidade), os mais consumidos no país,

principalmente após as campanhas de redução de sódio que envolve estes produtos. Para

alguns autores, a redução do sódio nestes produtos acaba deixando-os mais vulneráveis,

pois este é eficaz no controle de alguns micro-organismos patogênicos e/ou deteriorantes,

afetando diretamente a vida de prateleira, além da possibilidade de alterações reológicas e

sensoriais (DAMACENO et al., 2015; CRUZ et al., 2011; DOYLE e GLASS, 2010). Outros

pontos importantes incluem o fato de que os queijos podem não ser fabricados através de

leite pasteurizado e esta produção, muitas vezes, é realizada de forma artesanal em

fazendas, o que pode ser uma fonte em potencial para micro-organismos como os da família

Enterobacteriaceae (ZHANG et al., 2015b). Até mesmo nos produtos que sofrem processo

de pasteurização, Silva e colaboradores (2010) destacaram que não é garantida a ausência

de contaminantes, devido a possíveis falhas no processo ou na pós-pasteurização.

Jeyakumar e Lawrence (2014), por exemplo, conseguiram isolar bactérias entéricas

patogênicas, como E. coli, Salmonella sp., Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris e

Shigella, em 64% das amostras de leite pasteurizado do seu estudo. Até em fórmulas

infantis e leite em pó, que sofrem processo de retirada de toda umidade, há relatos da

presença de representantes desta família (ARAÚJO et al., 2015; FAKRUDDIN et al., 2014;

OLADIPO e OMO-ADUA, 2011a).

4

2.1.1 Contaminação microbiológica de produtos lácteos

O consumo in natura de alimentos contaminados está entre as principais causas de

doenças transmitidas por alimentos (DTA) nos países em desenvolvimento, e até mesmo

em países desenvolvidos, configurando-se, assim, um grave problema de saúde pública.

Nesse âmbito, o leite e seus derivados merecem destaque (DAMACENO et al., 2015;

CASALINUOVO et al., 2014). Segundo o Committee on Infectious Diseases e o Committee

on Nutrition (2014), nos Estados Unidos, por exemplo, as doenças transmitidas pela

ingestão de produtos lácteos deveriam ter menor impacto, pois em grande parte do país a

legislação não permite a comercialização de produtos lácteos sem processamento térmico,

porém, segundo este comitê, as informações equivocadas de que o consumo in natura

destes produtos traz benefícios à saúde dos consumidores, influenciam negativamente

nesta estatística.

Durante a sua produção, processamento, armazenamento, distribuição e

comercialização, os produtos lácteos podem estar sujeitos a condições de higiene

inadequadas, que podem promover a contaminação por micro-organismos patogênicos e/ou

deteriorantes (CUSATO et al., 2013; FREITAS et al., 2013). Galinari e colaboradores (2014),

por exemplo, avaliaram bancadas e utensílios de madeiras utilizados na produção artesanal

de queijos. Estes utensílios de madeira haviam sido substituídos pela legislação local por

suspeitas de contaminarem os produtos. Todavia, apenas alguns utensílios de madeira

apresentaram contaminação. Em contrapartida, com a nova metodologia de produção ainda

foi possível encontrar contagem de micro-organismos contaminantes, inclusive acima da

contagem permitida pela legislação, sugerindo que o problema possa estar relacionado com

más práticas na produção.

O queijo de alta umidade é um dos exemplos mais clássicos de alimentos

consumidos crus. Em muitos países, este tipo de queijo é obtido através do processo

fermentativo de leite de vaca, soro de leite e adição de água. Esta água, muitas vezes é

utilizada sem tratamento prévio, o que pode aumentar consideravelmente a carga

microbiana durante o tempo de estocagem (BARUZZI et al., 2012). Mesmo em produtos

com ausência ou baixa umidade, os representantes da família Enterobacteriaceae podem

ser encontrados, como relataram Yang e colaborares (2015) em fórmulas lácteas infantis.

O alto teor de nutrientes do leite, e, consequentemente, dos seus derivados, além do

pH próximo ao neutro e elevada atividade de água, fornecem um ambiente ideal para o

desenvolvimento de diversos micro-organismos (OLADIPO e OMO-ADUA, 2011a).

Populações de micro-organismos psicrotróficos que se estabelecem durante o

armazenamento em baixas temperaturas são os principais componentes da microbiota

desses produtos (QUIGLEY et al., 2013). Ao longo dos últimos 50 anos, inúmeros estudos

5

sobre a contaminação de produtos lácteos têm sido realizados, embora muitas questões

relacionadas com as populações de micro-organismos psicrotróficos no leite e seus

derivados ainda permaneçam sem resposta (HANTSIS-ZACHAROV e HALPERN, 2007).

Esses grupos de micro-organismos constituem um problema econômico significativo para a

indústria de produtos lácteos, uma vez que são os principais agentes causadores de

deterioração microbiana nesses produtos, e várias espécies consideradas patogênicas e

muitas vezes resistentes a antibióticos já foram relatadas (ZHANG et al., 2015b;

SAMARŽIJA et al., 2012). A deterioração destes produtos é facilmente percebida, pois os

micro-organismos deteriorantes geram compostos voláteis como, por exemplo, os

compostos voláteis de enxofre, que alteram o odor, a cor e o sabor destes alimentos

(BÖHME et al., 2010).

Já Zhang e colaboradores (2015b) destacaram como ponto importante a alimentação

de animais voltados para a produção de leite, que pode causar distúrbios metabólicos,

levando a acidose ruminal, podendo resultar na translocação de LPS e outros fatores de

virulência para as glândulas mamárias e, consequentemente, para o leite delas extraído.

2.2 A FAMÍLIA ENTEROBACTERIACEAE

As bactérias da família Enterobacteriaceae possuem as seguintes características:

são bastonetes retos gram-negativos, oxidase-negativos, catalase-positivos, não formam

esporos, são anaeróbios facultativos, movimentam-se por flagelos peritríquios, exceto

alguns representantes imóveis (como, por exemplo, Klebsiella spp. e Shigella spp.),

temperatura ideal de crescimento 37ºC, com algumas exceções, a maioria produz ácidos e

gases durante a fermentação de carboidratos (PUBLIC HEALTH ENGLAND, 2015;

TORTORA et al., 2012; MADIGAN et al., 2010; OWEN et al., 2010).

Esta família de micro-organismos compreende um grupo de bactérias entéricas que

possui entre suas representantes, bactérias de baixo potencial patogênico, mas também

bactérias de grande relevância clínica; como as espécies Klebsiella pneumoniae e

Escherichia coli e os gêneros Salmonella e Enterobacter, capazes de gerar, desde leves

desconfortos intestinais a graves infecções em seres humanos e demais animais de sangue

quente. Atualmente, cinquenta e três gêneros estão descritos, sendo que aproximadamente

vinte e seis destes possuem relatos de infecções em humanos (PUBLIC HEALTH

ENGLAND, 2015). Além de infecções intestinais, também estão relacionadas com outros

tipos de infecções como as do trato respiratório, urogenital, cerebral (meningite neonatal

bacteriana) e, ainda, infecção generalizada e pós-cirúrgicas (HAWKEY e CHOY, 2015;

PHILIPPE et al., 2015; COSKUN et al.; 2014; FAKRUDDIN et al., 2014). Dos 26 gêneros

supracitados, algumas bactérias merecem destaque, principalmente as dos gêneros

6

Salmonella e Enterobacter; e as espécies Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae.

Na literatura, estão disponíveis diversos trabalhos tanto para a Salmonella spp.

quanto para a Escherichia coli (KOBAYASHI et al., 2016; LIU et al., 2016b; NUESCH-

INDERBINEN et al., 2015; DEVAUX et al., 2015; LAUNDERS et al., 2013; FARROKH et al.,

2013), porém há um número bem limitado de trabalhos evidenciando os gêneros

Enterobacter, Klebsiella e Serratia, principalmente no que se refere a presença destes

gêneros em alimentos, e mais especificamente, em produtos lácteos. Além de poucos, os

trabalhos disponíveis na literatura relacionando estas bactérias a produtos lácteos e/ou

ambientes de produção, armazenamento e comercialização, limitam-se à quantificação, à

identificação e ao perfil de resistência a alguns antimicrobianos. Mas este quadro vem

mudando e já há alguns trabalhos explorando e evidenciando outros fatores de virulência

como, a produção de biofilme (CHERIF-ANTAR et al., 2016), a produção de enzimas

proteolíticas (CHOVE et al.; 2013), a produção de enzimas lipolíticas (MASIELLO et al.,

2016) e a produção de substâncias antimicrobianas (DAMACENO et al., 2015).

2.3 RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS

Algumas classes de antibióticos são mais eficientes no combate às infecções por

micro-organismos patogênicos da família Enterobacteriaceae. Dentre estas classes,

destacam-se as ciclosporinas de 1ª a 4ª gerações (ceftazidima, cefepima, cefotaxima,

ceftriaxona) e os carbapenens (doripenem, ertapenem, imipenem, meropenem), logo a

utilização destes antibióticos em animais voltados para a obtenção de leite pode levar à

geração de bactérias resistentes. Isto porque, muitas vezes, os antibióticos são utilizados

em demasia e indiscriminadamente nestes animais, objetivando a prevenção e o tratamento

de infecções e o desenvolvimento destes animais (MURPHY et al., 2016; GUIMARÃES et

al., 2012; BOSCO et al., 2012; FLEMING et al., 2010) e esta rotina pode estar causando

grande impacto para a indústria alimentícia (ROLAIN, 2013). O leite é considerado um

excelente meio de cultura para a transferência gênica por conjugação, tendo relato na

literatura de uma eficiência 10 vezes maior do que meios de cultura laboratoriais (VERRAES

et al., 2013). O uso de antibióticos visando o desenvolvimento do animal ainda é muito

discutido, pois alguns autores defendem que o consumo de produtos oriundos destes

animais não traz riscos à saúde humana (PHILLIPS et al., 2004), mas outros questionam a

possibilidade de bactérias com genes de resistência serem transmitidas pelos alimentos

advindos destes animais (GUIMARÃES et al., 2012). Outro ponto importante foi relatado por

Zhang e colaboradores (2009a): em uma fazenda aonde na agricultura era utilizado o

antibiótico Apramicina. Tanto os trabalhadores do local, quanto os animais, possuíam genes

de resistência a este antibiótico, muito semelhantes em suas floras intestinais, que foi

7

evidenciado através de estudos de conjugação gênica.

As diferentes estratégias que as bactérias têm desenvolvido para alcançarem

resistência aos antibióticos, seja por transdução, transformação e/ou conjugação, carece

cada vez mais de estudos, no intuito de se descobrir o papel dos antibióticos na evolução

dos ecossistemas (ROLAIN, 2013). Alterações na permeabilidade das membranas e

paredes celulares, o papel das porinas e, principalmente, a participação das bombas de

efluxo, constam na literatura como alguns dos principais responsáveis por este processo de

resistência (PHILIPPE et al., 2015; BECEIRO et al., 2013). As bombas de efluxo são

mecanismos de bombeamento de solutos para fora do citoplasma celular, como substâncias

tóxicas à célula, dentre elas os antimicrobianos (SOTO, 2013). Por estarem relacionadas à

resistência aos antibióticos e à produção de biofilme, as bombas de efluxo estão entre os

mecanismos mais visados pelos pesquisadores na busca de elucidar a sua contribuição nos

processos biológicos e avaliação da eficácia de agentes terapêuticos (BLAIR e PIDDOCK,

2016).

Porém, dos fatores relacionados à aquisição de resistência aos antimicrobianos

pelos representantes da família Enterobacteriaceae, o que parece estar preocupando mais a

comunidade científica é a capacidade dessas bactérias produzirem β-lactamases de

espectro estendido (ESBL), que são enzimas mediadas por plasmídeos, assim chamadas

porque lisam a estrutura do anel β-lactâmico presente nos antibióticos lactâmicos: as

penicilinas, as cefalosporinas, os carbapenêmicos e os monobactâmicos (TEKINER e

ÖZPINAR, 2016; THENMOZHI et al., 2014). Estes antibióticos são amplamente utilizados

para o tratamento de diversas infecções bacterianas, em especial as relacionadas a

bactérias Gram-negativas, logo conferindo resistência a uma quantidade considerável de

antibióticos destas classes. Outro ponto preocupante é que estas bactérias têm também se

mostrado resistentes aos antibióticos inibidores de β-lactamases (THAM et al., 2012).

Vale ressaltar que estes fenômenos podem ocorrer, inclusive, no lúmen dos

intestinos humano e/ou animal, através de processos lisogênicos, influenciando na evolução

de novas cepas patogênicas (GROTIUZ et al., 2006).

As opções de antimicrobianos estão cada vez mais escassas devido à aquisição de

resistência bacteriana, atingindo um ponto preocupante. A indústria farmacêutica não

encontra incentivos para buscar novos princípios ativos, visto que, de certo ponto, este

tipo de produto não se torna rentável, pois o desenvolvimento de novos medicamentos

envolve anos de pesquisa por um produto de uso relativamente curto quando comparado

a medicamentos que os indivíduos utilizam por longos períodos (BROGAN e

MOSSIALOS, 2013). O que se tem visto é a tentativa de a indústria farmacêutica produzir

compostos eficazes através da modificação de antibióticos já existentes (ZIPPERER et al.,

2016).

8

2.4 PRODUÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA

2.4.1 Produção de biofilme

A formação do biofilme na indústria de produtos lácteos pode ocorrer em poucas

horas após um processamento (aproximadamente 8 a 12 horas) (MOGHA et al.,2014).

Para que ocorra a formação de biofilme em uma determinada superfície,

primeiramente deve ocorrer adesão à superfície, seguido da formação da matriz polimérica,

replicação celular e, finalmente, a separação celular (BAYOUMI et al., 2012). A Figura 1

demonstra um esquema básico para a formação do biofilme.

Figura 1: etapas da formação do biofilme bacteriano

Fonte: adaptado de Rendueles e Ghigo (2012)

O biofilme é uma estrutura porosa complexa, composta de matriz polimérica

extracelular (polissacarídeos, proteínas, lipídeos), DNA, umidade e nutrientes, aonde

conjuntos de subpopulações heterogêneas de micro-organismos, com comportamentos

diversificados e características fisiológicas específicas, formam um ambiente de cooperação

9

ecológica altamente eficiente e resistente (BRIDIER et al., 2015; MARQUES et al., 2013;

SOTO, 2013). Neste ambiente de cooperação, alguns indivíduos são mais resistentes,

enquanto outros dependem fortemente desta interação, numa diversidade de características

fenotípicas e heterogeneidade fisiológica (OTTER et al., 2011). Mas, apesar de estes

indivíduos viverem em cooperação, não estão livres do estresse oxidativo, que pode levar a

erros e mutações no momento da replicação do DNA bacteriano. Segundo Høiby e

colaboradores (2010), estas mutações estão diretamente relacionadas ao crescimento do

biofilme.

Beceiro e colaboradores (2013) sugeriram uma forte relação entre a produção de

biofilme e a transferência horizontal de genes. Para os autores, numa população que forma

biofilme, estirpes presentes nesta biomassa podem apresentar resistência a antibióticos e

outros fatores de virulência, e este “pool de genes” pode ser transferido entre elas,

principalmente por conjugação.

Assim como ocorre com os fatores de resistência a antibióticos e sanitizantes, a

formação de biofilme também tem forte relação com as bombas de efluxo. O papel das

bombas de efluxo na formação de biofilme carece de mais estudos. Baugh e colaboradores

(2014) relataram que a inativação das bombas de efluxo é capaz de reprimir a transcrição

de componentes da matriz polimérica do biofilme. Por outro lado, Schlisselberg e

colaboradores (2015) avaliaram estirpes de Salmonella enterica tratadas com o antibiótico

cloranfenicol e verificaram que estas bactérias, mesmo com os mecanismos das bombas de

efluxo inativados, foram capazes de produzir biofilme.

Além disso, uma diversidade de enzimas pode ser produzida pelas bactérias dentro

do ambiente formado pelo biofilme, podendo causar a deterioração dos produtos lácteos

(TEH et al., 2014b).

Apesar do controle mais rígido exigido pela indústria de alimentos, os micro-

organismos podem produzir biofilme, nas bancadas, equipamentos, esteiras, tubulações,

entre outros (VERRAES et al., 2013). Bayoumi e colaboradores (2012) relataram a presença

de biofilme constituído por indivíduos do gênero Cronobacter em superfícies de polipropileno

(5,48 logs UFC/cm2) e aço inoxidável (5,44 logs UFC/cm2). Segundo Simões e

colaboradores (2010), as reações químicas e biológicas ocorridas dentro do biofilme geram

corrosões nas superfícies que, podem reduzir a eficácia da transferência de calor nos

processos térmicos. Estas superfícies, se não sofrerem processos eficazes de sanitização,

podem permitir a presença destas bactérias por meses e até anos (ČABARKAPA et al.,

2015). O biofilme pode acumular-se após cada processo de lavagem e sanitização,

sugerindo que, no biofilme, as bactérias estão protegidas contra danos físicos, químicos e

condições de estresse, e que o tempo entre os processos de sanitização deve ser curto,

mas isto pode favorecer a formação de indivíduos mais resistentes (LIPSKI, 2005).

10

2.4.2 Atividade proteolítica

Bactérias capazes de sintetizar enzimas proteolíticas são as grandes responsáveis

pela deterioração do leite e seus derivados, podendo causar diversos transtornos à indústria

de produtos lácteos (ZAJÁC et al., 2015). Estas enzimas podem, ainda, ser responsáveis

pela etapa inicial da produção de biofilme (PONCE et al.; 2012).

A atividade proteolítica é um importante fator de virulência, capaz de propiciar a

sobrevivência de muitos patógenos dentro do organismo hospedeiro e, assim, trazer sérios

riscos à saúde dos consumidores (IQBAL et al., 2013).

Quando relacionadas aos produtos lácteos, na produção de queijos, por exemplo,

estas enzimas desestabilizam as micelas de caseína e podem alterar ou até mesmo impedir

a coagulação do leite, podendo afetar diretamente a formação do produto (CALDERA et al.,

2015; PINTO et al., 2007). Outro grande problema é que estas bactérias levam a um

processo conhecido como off-flavour, ou seja, afetam consideravelmente as propriedades

sensoriais dos alimentos como, a cor, o odor, o sabor, e a textura (CALDERA et al., 2015;

HANTSIS-ZACHAROV e HALPERN, 2007), o que afeta diretamente a aceitação ou a

rejeição do produto pelo consumidor (TEIXEIRA, 2009). Além disso, muitas destas enzimas

são termorresistentes, ou seja, capazes de resistirem às temperaturas baixas de

refrigeração e às temperaturas elevadas dos processos de esterilização (UHT e

pasteurização) (BAUR et al., 2015).

Não são apenas os fatores negativos que colocam a produção de proteinases em

evidência. Algumas proteinases produzidas por bactérias são de grande interesse para os

processos biotecnológicos, podendo ser obtidas em larga escala e em um curto período de

tempo (ABED et al., 2016), e as colônias de bactérias que as produzem são de fácil

manipulação e manutenção (RODARTE et al. 2011). Estas enzimas conseguem hidrolisar a

caseína do leite e, como consequência, liberam peptídeos bioativos, com propriedades

funcionais e farmacêuticas, dentre elas, ação antioxidante, antimicrobiana, anticancerígena

e transportadora de cálcio, melhorando a biodisponibilidade deste micronutriente, logo se

tem buscado produzir alimentos, especialmente os nutracêuticos, que são considerados por

muitos especialistas como alimentos com ação de medicamento (MUHAMMAD et al., 2016;

LI et al., 2013; SALAMI et al., 2011; PHELAN e KERINS, 2011; MAO et al., 2011).

2.4.3 Atividade lipolítica

A síntese bacteriana de enzimas lipolíticas tem se mostrado um processo ao mesmo

tempo preocupante e importante para a indústria alimentícia, porque exercem influência

direta nas propriedades sensoriais destes produtos, principalmente no aroma e na textura

11

(KREWINKEL et al., 2016; CARPINÉ et al., 2010). A lipólise pode levar a um processo

denominado rancidez hidrolítica, desenvolvendo no produto um sabor acre e um odor

desagradável (SANTOS et al., 2007).

A alimentação dos ruminantes é composta por ácidos graxos poliinsaturados.

Todavia, devido à ação de enzimas lipolíticas, produzidas por bactérias, dentro do

organismo animal, o leite obtido destes animais, assim como os produtos lácteos deles

obtidos, são compostos por ácidos graxos saturados, sabidamente mais maléficos à saúde,

podendo causar, principalmente, doenças coronarianas (LOURENÇO et al., 2010), formação

de tumores e outras doenças em humanos (ZECKNER et al., 2012).

O interesse por enzimas catalizadoras sintetizadas por micro-organismos vem

crescendo constantemente, pois apresentam inúmeras vantagens quando comparadas às

enzimas de origem animal e vegetal, dentre elas, o baixo custo e a capacidade de larga

escala de produção; a modificação de gorduras e óleos; o realce no sabor e até mesmo a

utilização no tratamento de resíduos industriais (ROVEDA et al., 2010).

2.4.4 Atividade hemolítica

Algumas bactérias são capazes de expressar atividade hemolítica devido à produção

de hemolisinas, bem como podem, ainda, por transferência gênica horizontal, estar

transferindo plasmídeos responsáveis pela produção destas hemolisinas, como alguns

representantes da família Enterobacteriaceae. O principal mecanismo de ação das

hemolisinas é a criação de poros na membrana celular causando, por exemplo, doença nas

glândulas mamárias dos animais utilizados pela indústria alimentícia, podendo assim afetar

o leite delas extraído (BURGOS e BEUTIN, 2010). Dois tipos de hemolisina destacam-se: a

α-hemolisina e a β-hemolisina, sendo que a β-hemolisina é mais preocupante, pois atua na

esfingomielina da membrana celular (MARQUES et al.,2013). Esta ação, neste importante

componente da membrana plasmática, pode afetar a sinalização celular, influenciar nos

mecanismos de modulação da morte celular induzida e nas vias de sinalização inflamatória

(MILHAS et al., 2010).

Além disso, a sobrevivência de muitas bactérias no hospedeiro e a sua

patogenicidade acabam dependendo do sequestro do ferro das proteínas de ligação e de

transporte deste nutriente no hospedeiro, mas pouco se sabe sobre este mecanismo de

sequestro do ferro, por estas bactérias, e as estratégias utilizadas por estas para escapar do

processo denominado imunidade nutricional. O ferro é essencial para o metabolismo

humano, mas também para o processo de replicação bacteriana (ATANASSOVA et al.,

2015; BARBER e ELDE, 2014; CASSAT e SKAAR, 2013).

12

2.5 PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS (SAM)

Algumas bactérias patogênicas, como alguns representantes da família

Enterobacteriaceae, são capazes de produzir compostos biologicamente ativos, conhecidos

como substâncias antimicrobianas, atuando, num nicho de competição, contra suas

concorrentes. Estas substâncias, através de processos de purificação, vêm sendo utilizadas

pela indústria alimentícia como ferramenta contra bactérias que causam deterioração em

seus produtos, logo aumentando a sua vida de prateleira (DAMACENO et al., 2015;

VERRAES et al., 2013). Nesse sentido, atuam na manutenção das características destes

produtos, visto que possuem ação bactericida e/ou bacteriostática sem alterar as

propriedades sensoriais dos alimentos (OLIVEIRA et al., 2012b). Estas substâncias têm se

mostrado essenciais à indústria alimentícia, visto que os antibióticos não podem ser

utilizados em alimentos (OLIVEIRA et al., 2011a).

Uma das principais substâncias antimicrobianas produzidas por bactérias são as

bacteriocinas. Seu mecanismo de ação em uma célula-alvo é a produção de poros na

membrana citoplasmática desta célula, provocando a saída de compostos celulares e

alterando o gradiente eletroquímico (força próton-motora), fundamental para a geração de

energia e a síntese de proteínas, podendo, com isso, levar a célula-alvo à morte (ZHENG et

al., 2015; OLIVEIRA et al., 2012b; BAYOUB et al., 2011).

As bacteriocinas produzidas por bactérias comensais do trato intestinal animal

podem ter um papel importante na eliminação de micro-organismos patogênicos, sem

alterações significativas na flora intestinal (KOMMINENI et al., 2015), pois estas substâncias

são degradas por enzimas do sistema digestivo e ainda possuem propriedades probióticas

(ROSA et al., 2016).

É importante ressaltar que o número de estudos relacionados às substâncias

antimicrobianas ainda é muito reduzido, mas este cenário está começando a mudar, na

busca de se elucidar e/ou aprimorar os seus mecanismos de ação antimicrobiana e utilizá-

los não só em alimentos, mas também no tratamento de doenças em seres humanos e

animais (FLEMING et al., 2010).

13

3 JUSTIFICATIVA

Alguns representantes da família Enterobacteriaceae, eventualmente, estão

relacionados a surtos hospitalares, especialmente em unidades de terapia intensiva, aonde

na maioria dos casos os indivíduos encontram-se imunocomprometidos, estando, assim,

mais vulneráveis a estes micro-organismos. Entretanto, o número de indivíduos com

debilidade no sistema imunológico fora do ambiente hospitalar sobe continuamente em todo

o mundo (BERG et al., 2014).

Diante do exposto, é necessário que se evidencie potenciais fontes extra-

hospitalares veiculadoras destes micro-organismos e neste contexto, os alimentos possuem

grande probabilidade. É consenso que os produtos lácteos são muito consumidos

mundialmente e por todas as classes sociais, mas que pelas condições de fabricação,

comercialização e consumo, podem ser considerados potenciais reservatórios extra-

hospitalares de representantes da família Enterobacteriaceae.

Há um número extremamente reduzido de trabalhos associando os produtos lácteos

a patógenos desta família e, geralmente, a pesquisa é mais direcionada para a presença da

espécie Escherichia coli e do gênero Salmonella. Dessa forma, fazem-se necessários mais

estudos evidenciando e caracterizando os demais micro-organismos desta família, nestes

alimentos, principalmente a espécie Klebsiella pneumoniae e o gênero Enterobacter,

eventualmente relacionados a surtos hospitalares (LIU et al.; 2016a; THOMAS et al., 2013;

MSHANAA et al., 2011; KONTOPOULOU et al., 2010).

14

4 OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi investigar a presença de bactérias da família

Enterobacteriaceae, diferentes de Escherichia coli e Salmonella spp., provenientes de

amostras de produtos lácteos comercializados na cidade do Rio de Janeiro e caracterizar os

isolados quanto à expressão de multirresistência aos antimicrobianos e de outros fatores de

virulência, além de investigar o possível papel desses alimentos como potenciais

veiculadores destas bactérias fora do ambiente hospitalar.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Isolar, identificar e caracterizar estirpes da família Enterobacteriaceae, diferentes de

Escherichia coli e Salmonella spp., a partir de produtos lácteos comercializados na

cidade do Rio de Janeiro;

Determinar o perfil de resistência a antimicrobianos dos isolados;

Avaliar a expressão de fenótipos de susceptibilidade reduzida aos carbapenens

(KPC) e de produção de β-lactamase de espectro estendido (ESBL) dos isolados;

Caracterizar os isolados obtidos quanto à produção qualitativa de biofilme e quanto à

expressão de atividade proteolítica; atividade lipolítica e atividade hemolítica;

Investigar a produção de substâncias antimicrobianas (SAM) pelos isolados;

Determinar e comparar o perfil plasmideal dos isolados MDR e não MDR do

complexo Enterobacter cloacae.

15

5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE PRODUTOS LÁCTEOS

As amostras de produtos lácteos (queijo, leite e bebida láctea fermentada) utilizadas

neste trabalho foram obtidas em diferentes estabelecimentos comerciais da cidade do Rio

de Janeiro como supermercados, padarias e queijarias. Cada amostra foi acondicionada

numa caixa térmica, contendo gelo reutilizável, dentro da embalagem original de cada

produto e conduzida ao Laboratório de Microbiologia do IFRJ no máximo duas horas após a

sua aquisição. No presente estudo utilizou-se amostragem de conveniência.

5.2 ISOLAMENTO DOS MICRO-ORGANISMOS

Após assepsia da embalagem, foram pesados 25g (ou 25 ml) de cada amostra e

colocados em 225 ml de água peptonada estéril 0,1% (BIOCEN do Brasil, São Paulo).

Foram preparadas diluições seriadas, até 10-2, em tubos de ensaio com rosca contendo o

mesmo diluente, sem considerar o processo de colocação dos 25g/25 ml em 225 ml de água

peptonada como primeira diluição.

Alíquotas das diluições foram inoculadas, pelo método spread plate, em placas

contendo os meios indicadores seletivos ágar EMB (Eosina Azul de Metileno; Himedia,

Índia) e ágar MacConkey (Merck, Alemanha). As placas foram incubadas a 37°C por 18-24h.

Após o prazo estipulado, as placas foram avaliadas e cerca de 50% do número de colônias

obtidas em cada placa foram selecionadas e passadas individualmente para placas

contendo ágar Casoy (BIOCEN do Brasil, São Paulo). Colônias sugestivas de Escherichia

coli, com brilho verde metálico no ágar EMB, não foram selecionadas.

Para confirmação da seleção de bactérias Gram-negativas, realizou-se a coloração

de Gram dos isolados pré-selecionados e, em seguida, foi realizado o teste da oxidase.

Todos os representantes da família Enterobacteriaceae apresentam-se negativos para o

teste da oxidase. Realizou-se o estriamento em placas contendo ágar Casoy. Com uma alça

descartável, coletou-se uma colônia e colocou-se na fita do teste da oxidase (Laborclin,

Paraná). Os isolados que, em até 20 segundos, apresentaram coloração púrpura, indicando

positividade para o teste de oxidase, foram descartados.

5.3 MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS

Após a purificação da cultura, o crescimento em massa de cada isolado foi

16

coletado e transferido para criotubos contendo 1,5 mL de caldo Casoy (p v-1; Merck,

Alemanha), acrescidos de glicerol 40% (v v-1; Merck, Alemanha), devidamente identificados

e armazenados em criotubos a -20°C ± 2°C até o momento do uso.

5.4 IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS

A identificação dos isolados foi realizada através da tecnologia de espectrometria de

massas, utilizando-se o equipamento VITEK 2, modelo Compact (BioMèrieux, França).

5.5 PERFIL DE RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS

A determinação do perfil de resistência a antimicrobianos das estirpes produtoras e

indicadoras foi realizada utilizando-se a técnica de difusão em disco, conforme

recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2015) para bactérias

da família Enterobacteriaceae.

A partir do isolamento em ágar Casoy, algumas colônias foram transferidas para

tubos de ensaio contendo 5 mL de água peptonada 0,1% até a obtenção da turvação

correspondente a 0,5 da escala de McFarland (aproximadamente 1,5 x 108 UFC/mL).

Após obter a turvação ideal, mergulhou-se um swab estéril no tubo, pressionou-se

levemente contra a parede do mesmo, para que o excesso fosse retirado. O material foi

semeado sobre a superfície de uma placa contendo ágar Müeller Hinton (Himedia, Índia),

em pelo menos três direções diferentes, para a obtenção de um crescimento homogêneo e

confluente. Com o auxílio de uma pinça estéril, os discos de antibióticos foram dispostos de

forma equidistante na placa, perfazendo um total de, no máximo, cinco discos por placa. As

placas foram incubadas a 37°C por 18-24h. Após este período, o diâmetro (em mm) dos

halos de inibição formados foi medido e a interpretação dos resultados foi realizada segundo

as recomendações da CLSI (2015). Foram consideradas multirresistentes as bactérias que

apresentaram resistência a, no mínimo, um antibiótico em, pelo menos, três classes

diferentes. Foram utilizados dezessete antibióticos (Laborclin, Paraná), distribuídos em onze

classes que estão apresentados na Tabela 1.

17

Tabela 1: Antibióticos utilizados no presente estudo

Classe Antibiótico

Penicilinas AMP 10 µg

Inibidores de β-Lactamases AMC 20/10 µg

Cefalosporinas (3ª geração) CTX 30µg

CAZ 30 µg

Cefalosporinas (1ª geração) CEP 30µg

Quinolonas CIP 5µg

NOR 10µg

Aminoglicosídeos

AMI 30µg

GEN 10µg

STR 10µg

TOB 10µg

Fenicóis CHL 30 µg

Carbapenêmicos IPM 10µg

MER 10µg

Monobactâmicos ATM 30µg

Análogos do Ácido Fólico TRI 5µg

Tetraciclinas TET 30µg

Legenda: AMP, ampicilina; AMC, amoxicilina + ácido clavulânico; CTX, cefotaxima; CAZ, ceftazidima;

CEP, cefalotina; CIP, ciprofloxacina; NOR, norfloxacina; AMI, amicacina; GEN, gentamicina; STR,

estreptomicina; TOB, tobramicina; CHL, cloranfenicol; IPM, imipenem; MER, meropenem; ATM,

aztreonam; TRI, trimetoprim; TET, tetraciclina; µg, micrograma.

5.5.1 Detecção dos fenótipos de ESBL e KPC

Para fins de detecção dos fenótipos KPC e ESBL dos isolados multirresistentes,

através de um método prático e rápido, foram utilizados dois meios de cultura cromogênicos:

CHROMagar®KPC e CHROMagar®ESBL.

Para cada isolado multirresistente, obtido após isolamento em placa contendo ágar

Casoy, foi estriada uma colônia em cada um dos meios cromogênicos. As placas foram

incubadas a 37°C por 18-24h.

A Tabela 2 apresenta o modo de interpretação dos resultados dos testes com os

meios cromogênicos utilizados, mas apenas para os gêneros da família Enterobacteriaceae,

alvos do presente estudo.

18

Tabela 2: Interpretação dos resultados nos meios cromogênicos CHROMagar® KPC e

CHROMagar® ESBL para os representantes da família Enterobacteriaceae.

Resultado positivo

Gênero CHROMagar® KPC

Estirpes resistentes aos carbapenens

CHROMagar® ESBL Estirpes produtoras de β-lactamase

de espectro estendido

Citrobacter sp - Colônias azuis metálicas

Enterobacter sp Colônias azuis metálicas Colônias azuis metálicas

Klebsiella sp Colônias azuis metálicas Colônias azuis metálicas

Serratia sp N/A Colônias azuis metálicas

Legenda: N/A - Não aplicável; KPC - Susceptibilidade reduzida aos carbapenens; ESBL - β-lactamases de espectro estendido (Fonte: http://www.CHROMagar.com).

5.6 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA

5.6.1 Detecção qualitativa da produção de biofilme

Os isolados foram inoculados sobre a superfície de placas de ágar Vermelho Congo

[(15 g/l de ágar nutriente; p v-1; Merck, Alemanha); (37 g/l de sacarose; p v-1; Pro Analysi,

São Paulo), e, após autoclavação, adicionado solução de vermelho congo (0,8 g/l; p v-1;

Vetec, Rio de Janeiro)], conforme descrito por Freeman e colaboradores (1989), com

algumas modificações. As placas foram incubadas a 37°C por 24h. Foi utilizada como

controle positivo a cepa padrão Salmonella enterica ATCC14028.

Nesta técnica, os isolados produtores de biofilme apresentam-se como colônias de

coloração preta, enquanto que os isolados não produtores se apresentam despigmentados

ou avermelhados.

5.6.2 Detecção de atividade proteolítica

Para esta análise, foi utilizado ágar leite [(leite em pó integral a 10%; p v-1; Nestlé,

São Paulo), ágar-ágar a 2% (p v-1; Merck, Alemanha)], conforme descrito por Minotto e

colaboradores (2014).

O ágar leite foi autoclavado por 5 minutos e vertido em placas. Os isolados foram

inoculados e incubados por 18-24h a 37ºC. Após a incubação, a hidrólise da caseína no

ágar leite foi observada pela presença de halo transparente ao redor das colônias.

19

5.6.3 Detecção de atividade lipolítica

Para esta metodologia foi utilizado o meio de cultura ágar Spirit Blue [1% de digerido

de caseína (p v-1; Himedia, Índia), 0,05% de extrato de levedura (p v-1; Becton, Dickinson

and Company, Estados Unidos da América), 2% de ágar-ágar (p v-1; Merck, Alemanha),

0,0002% de Spirit Blue (v v-1; Mago, São Paulo), 970 ml de água destilada] com adição de

3% de reagente lipase [0,12 ml de Tween 80 (v v-1; Proquimico, Brasil)], 12 ml de azeite de

oliva (v v-1; Natural Alimentos, São Paulo), 17,9 ml de água destilada], conforme descrito em

Becton, Dickinson and Company (2009), com algumas modificações.

O ágar Spirit Blue e o reagente lipase foram autoclavados por 15 minutos, em um

mesmo ciclo, porém em recipientes separados. Após a autoclavação, ambos os recipientes

foram resfriados até que se atingisse a temperatura de 55°C. No ambiente estéril de uma

cabine de segurança biológica, o reagente lipase foi adicionado cuidadosamente ao

recipiente contendo o ágar Spirit Blue; homogeneizado sob forte agitação; em seguida, o

material obtido foi vertido em placas de petri estéreis. Os isolados foram inoculados na

superfície do ágar e incubados por 18-24h a 37ºC. As culturas foram avaliadas quanto à

formação de halo opaco ao redor das colônias, diferenciando-se da coloração azulada do

meio de cultura utilizado.

5.6.4 Detecção de atividade hemolítica

A atividade hemolítica dos isolados foi verificada através do crescimento em placas

contendo ágar sangue base com 5% de sangue de carneiro desfibrinado (p v-1; BIOCEN do

Brasil, São Paulo). As placas foram incubadas a 37°C por 48 h e as culturas foram avaliadas

quanto à formação de zona de hemólise.

5.7 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS (SAM)

Este método foi realizado conforme descrito por Giambiagi-Marval e colaboradores

(1990), com algumas modificações.

A partir do estoque, as bactérias foram crescidas em caldo Casoy por 18h a 37 ºC.

Cinco (5) µl deste material foi inoculado sob a forma de ponto na superfície de uma placa

contendo ágar Casoy (p v-1; Merck, Alemanha). As placas foram incubadas a 37ºC por 18 h

e, em seguida, as bactérias foram mortas por exposição a vapores de clorofórmio por 30

min. Após a evaporação do clorofórmio, verteu-se 3 mL de Casoy semissólido acrescido de

uma alíquota de 0,3 mL da estirpe indicadora (previamente crescida em 3 mL de caldo

20

Casoy a 37°C por 18h). As placas foram incubadas a 37ºC por 18 h.

Neste teste, a produção de SAM é avaliada pela formação de zonas de inibição ao

redor dos pontos de crescimento das estirpes produtoras. As bactérias utilizadas como

indicadoras nos testes estão descritas na Tabela 3.

Tabela 3: Bactérias utilizadas como indicadoras da produção de substâncias antimicrobianas

Identificação Referência

Escherichia coli Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Proteus vulgaris

Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens

Salmonella enterica sorotipo Typhi Salmonella spp. I

Salmonella spp. VI Yersinia enterocolitica

ATCC 25922 LMIFRJ

ATCC 4352 LMIFRJ LMIFRJ

ATCC 27853 ATCC 13525 ATCC 19214

LMIFRJ LMIFRJ

ATCC 9610

Legenda: ATCC - American Type Culture Collection; LMIFRJ – Laboratório de Microbiologia do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro.

5.8 DETERMINAÇÃO E COMPARAÇÃO DO PERFIL PLASMIDEAL DOS ISOLADOS DO

COMPLEXO ENTEROBACTER CLOACAE

Para fins de detecção do perfil plasmideal, todos os isolados do complexo

Enterobacter cloacae foram submetidos à extração de DNA.

A extração de DNA plasmideal foi realizada por lise alcalina conforme descrito por

Birnboim e Doly (1979), com algumas modificações. O perfil plasmideal foi analisado através

de géis de agarose a 0,8 % (p v-1) preparados em tampão TBE (Tris 89 mM, ácido bórico 89

mM, EDTA 2,5 mM; pH 8,2) e contendo o corante GelRed (Biotium, USA). As preparações

de DNA foram submetidas à eletroforese horizontal em tampão TBE a 80 V por 5 h. Após a

eletroforese, os géis foram visualizados e fotografados através do sistema de captura de

imagens L-PIX (Loccus Biotecnologia, São Paulo).

.

21

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para este estudo, foram analisadas 5 amostras de queijo de alta umidade (queijo

minas frescal), 3 amostras de bebida láctea fermentada e 2 amostras de leite pasteurizado

(comercializados em sacos plásticos), totalizando 10 amostras de conveniência, e

representando os produtos lácteos mais consumidos.

Foram encontrados, no total, 89 isolados, entretanto, 31 deles foram descartados

após a identificação no sistema VITEK 2, sendo 10 isolados da família Moraxellaceae

(Acinetobacter spp.), 6 da família Pseudomonaceae (Pseudomonas spp.), 4 da família

Neisseriaceae (Chromobacterium spp.), 3 da família Burkseudomonaceae (Burkholderia

spp) e 6 da família Enterobacteriaceae com baixa relevância na área clínica e de alimentos

[Kluyvera spp. (3), Tatumella spp. (1), Rahnella spp. (1), Escherichia hermannii (1)].

Dessa forma, deu-se prosseguimento ao trabalho com 58 isolados da família

Enterobacteriaceae (Tabela 4) sendo, 21 (36%) do complexo Enterobacter cloacae, 20

(35%) da espécie Serratia marcescens; 8 (14%) da espécie Raoutella planticola; 3 (5%) da

espécie Citrobacter freundii; 2 (3%) da espécie Klebsiella pneumoniae; 2 (3%) da espécie

Citrobacter braakii; 1 (2%) da espécie Klebsiella oxytoca; 1 (2%) do gênero Raoutella (2%).

Recentemente, Masiello e colaboradores (2016), a partir de 21 amostras de leite

pasteurizado, também isolaram uma porcentagem considerável de bactérias da família

Enterobacteriaceae, e assim como no presente trabalho, o maior número de isolados foi do

gênero Enterobacter (42%), seguidos dos gêneros Citrobacter (12%), Serratia (10%) e

Raoutella (9%).

Tabela 4: Isolados da família Enterobacteriaceae obtidos no presente estudo.

Identificação Isolados Origem

Q1C2

Q1C3

Q1L2

Q1R1

Q1R2

Q1R4

Q2E1

Complexo Enterobacter cloacae Q2L1 Queijo

Q2M1

Q2R2

Q2R3

Q11

Q12

Q15

Q16

Continua

22

Continuação da Tabela 4

R4

E1

E2 Leite

E3

L3

BLL1 Bebida Láctea Fermentada

Q1E2

R7 Queijo

R9

R19

E4

E5

E6

E7

E8

Serratia marcescens E9

E10

E12 Leite

E13

E14

E15

E16

E17

E19

E20

L6

Q1L1

Q1R3

Q2E2

Raoutella planticola Q2E3 Queijo

Q2R4

QJ3

QJ5

E11 Leite

Raoutella sp Q1M1 Queijo

Q1M3

Citrobacter freundii Q1R5 Queijo

Q2R1

Citrobacter braakii Q1C1 Queijo

Q1E1

Klebsiella pneumoniae Q2C3 Queijo

R2

Klebsiella oxytoca Q1E3 Queijo

O complexo Enterobacter cloacae, que constituiu o maior número de isolados

obtidos, como apresentado na Figura 2 é composto por 6 espécies (Enterobacter cloacae,

Enterobacter asburiae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter kobei, Enterobacter ludwigii

e Enterobacter nimipressuralis). A diferenciação dessas espécies por meio de identificação

fenotípica é muito difícil, necessitando, assim, do uso de métodos moleculares

23

(MEZZATESTA et al., 2012). Desde 1997 vem surgindo relatos da associação de alguns

representantes deste grupo com infecções hospitalares (DAVIN-REGLI e PAGÈS, 2015;

MEZZATESTA et al., 2012), especialmente a espécies Enterobacter cloacae e Enterobacter

hormaechei, porém em produtos lácteos os trabalhos são mais escassos.

21

20

8

3

2

2

1

1

0 5 10 15 20 25

Complexo Enterobacter cloacae

Serratia marcescens

Raoutella planticola

Citrobacte freundii

Citrobacter braakii

Klebsiella pneumoniae

Klebsiella oxytoca

Raoutella sp

Número de isolados

Ide

ntifica

çã

o

Figura 2: Número de isolados da família Enterobacteriaceae obtidos no presente estudo.

Masiello e colaboradores (2016), em um estudo com 29 amostras de leite

pasteurizado obtidas nos Estados Unidos, em suas embalagens originais, conseguiram

isolar 100 representantes do gênero Enterobacter, 28 do gênero Cronobacter, 24 do gênero

Serratia e 22 do gênero Raoutella. A diversidade de gêneros encontrada foi muito próxima

da obtida no presente estudo.

Fakruddin e colaboradores (2014), num estudo semelhante ao presente trabalho,

porém com amostras mais heterogêneas, entre elas, leite em pó, conseguiram 3 isolados do

gênero Enterobacter, 3 do gênero Citrobacter e 2 do gênero Klebsiella. Já Jeyakumar e

Lawrence (2014), num estudo com 50 amostras de leite cru, isolaram 5 representantes da

espécie Klebsiella pneumoniae. Em nosso estudo, entretanto, nas duas amostras de leite

utilizadas, não foram encontrados isolados da espécie Klebsiella pneumoniae, mas esta

espécie foi identificada a partir das amostras de queijo utilizadas.

No nosso trabalho, foram encontrados 20 isolados da espécie Serratia marcescens,

o que não é muito relatado na literatura. Um dos poucos trabalhos que descreve a detecção

24

dessas bactérias em produtos lácteos foi o publicado por Teh e colaboradores (2011a), que

citam o isolamento de 17 representantes desse gênero a partir de amostras obtidas de 2

tanques de leite cru.

Yao e colaboradores (2012) em amostras de 185 embalagens de fórmulas infantis

conseguiram isolar 8 representantes da espécie Klebsiella pneumoniae, 1 da espécie

Citrobacter freundii, 1 da espécie Enterobacter cloacae, comuns ao presente estudo. Sani e

Yi (2011), também em amostras de fórmulas infantis, isolaram 2 representantes da espécie

Klebsiella pneumoniae, semelhante ao presente estudo e, 4 representantes do complexo

Enterobacter cloacae. Já Oonaka e colaboradores (2010), isolaram 2 representantes da

espécie Klebsiella pneumoniae, além de 6 representantes da espécie Enterobacter cloacae

em fórmulas infantis. Em um trabalho anterior do nosso grupo de pesquisa, com amostras

de fórmulas infantis, foram isolados 12 representantes do complexo Enterobacter cloacae

(ARAÚJO et al., 2015). Esses estudos citados demonstram que as bactérias da espécie

Enterobacter cloacae são frequentemente isoladas de produtos lácteos, mas estudos de

fatores de virulência e de seu potencial MDR são escassos.

6.1 PERFIL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS

Os cinquenta e oito isolados expressaram resistência a, pelo menos, um antibiótico

dos 17 testados. Os isolados expressaram maior resistência (78%) ao antibiótico cefalotina.

Todos os isolados da espécie Serratia marcescens expressaram resistência a este

antibiótico. Já no complexo Enterobacter cloacae, apenas o isolado Q2R2 foi sensível a este

antibiótico, assim como o isolado E11 (Raoutella planticola).

Todos os isolados do gênero Raoutella planticola e do gênero Klebsiella

expressaram resistência à ampicilina. A maior parte dos isolados (85%) da espécie Serratia

marcescens também expressaram resistência a este antibiótico, assim como 48% dos

isolados do complexo Enterobacter cloacae.

Todos os 58 isolados foram sensíveis aos antibióticos tetraciclina, meropenem e

cloranfenicol.

No presente trabalho, 24 isolados foram considerados multirresistentes a drogas: 12

(50%) do complexo Enterobacter cloacae; 11 (46%) da espécie Serratia marcescens; 1 (4%)

da espécie Raoutella planticola. Para ser considerada multirresistente (MDR, de multidrug

resistant), uma bactéria deve ser resistente a um antibiótico de, pelo menos, três classes

diferentes (HEIZMANN et al., 2013). Das bactérias MDR encontradas no trabalho, a

quantidade de antibióticos ao qual as mesmas apresentaram resistência oscilou entre 3 e 4

em, pelo menos, 3 classes diferentes, porém a bactéria E8 (Serratia marcescens)

apresentou resistência a 6 antibióticos distribuídos em 5 classes diferentes. Os resultados

25

estão dispostos na Tabela 5.

Tabela 5: Perfil de resistência aos antimicrobianos.

Identificação Isolados Resistência


Q1C2* CEP / AMC / AMP

Q1C3 CEP / AMC

Q1L2* CEP / NOR / AMC / AMP / TRI

Q1R1 CEP / AMC

Q1R2 CEP / AMC

Q1R4* CEP / AMC / AMP

Q2E1* CEP / AMC / AMP / TOB

Q2L1* IPM / CEP / AMC / TOB

Q2M1* CEP / CTX / AMP

Q2R2 AMC / AMP

Q2R3* IPM / CEP / AMC

Q11 CEP / AMC

Q12 CEP / AMC

Q15 CEP / AMC

Q16 CEP / AMC

R4 CEP / STR

E1* CEP / AMC / AMP

E2* CEP / AMC / AMP

E3* CEP / AMC / AMP

L3* CEP / AMC / AMP

BLL1* ATM / CEP / CAZ

Q1E2* CEP / AMC / AMP

R7 CEP

R9 CEP / STR

R19 CEP

E4* CEP / AMC / AMP

E5* CEP / AMC / AMP

E6* CEP / AMC / AMP / STR


E8* CEP / CAZ / AMC / AMP / AMI / TOB

E9* CEP / AMC / AMP / GEN

Serratia marcescens E10 CEP / AMP

E12 CEP / AMP

E13 CEP / AMP

E14* CEP / AMP / TOB

E15 CEP / AMP

E16 CEP / AMP


E19 CEP / AMP

E20* CEP / CIP / AMC / AMP

L6* CEP / AMC / AMP

Q1L1* CTX / AMP / GEN

Q1R3 AMP

Raoutella planticola Q2E2 AMP

Q2E3 AMP / GEN / TOB

Continua

26

Continuação da Tabela 5

Q2R4 AMP

QJ3 AMP

QJ5 AMP

Raoutella sp E11 AMP

Q1M1 AMP

Q1M3 CEP

Citrobacter freundii Q1R5 CEP / AMC

Q2R1 CEP / AMP

Citrobacter braakii Q1C1 CEP

Q1E1 TRI

Klebsiella pneumoniae Q2C3 AMP

R2 AMP

Klebsiella oxytoca Q1E3 AMP

Legenda: AMC, amoxicilina + ácido clavulânico; AMI, amicacina; AMP, ampicilina; ATM, aztreonam; CAZ, ceftazidima; CEP, cefalotina; CIP, ciprofloxacina; CTX, cefotaxima; GEN, gentamicina; IPM, imipenem; MER, meropenem; NOR, norfloxacina; STR, estreptomicina; TOB, tobramicina; TRI, trimetoprim; *Isolados multirresistentes (MDR).

Merece destaque, neste trabalho, o complexo Enterobacter cloacae, que apresentou

12 representantes multirresistentes (50%). Segundo Davin-Regli e Pagès (2015), neste

complexo, os principais fatores responsáveis por conferirem maior resistência aos

antibióticos são a permeabilidade seletiva da membrana celular, somados à capacidade de

adquirir componentes móveis, que os permite colonizarem uma diversidade maior de áreas

nos organismos infectados, além da facilidade de alterar seu metabolismo para adaptar-se

às pressões ambientais.

Fakruddin e colaboradores (2014), em amostras de alimentos, dentre elas leite em

pó, encontraram isolados multirresistentes dos gêneros Enterobacter (3); Citrobacter (3) e

Klebsiella (2). Destes oito isolados apenas dois do gênero Citrobacter foram sensíveis ao

antibiótico ampicilina. No nosso estudo, dos cinco isolados do gênero Citrobacter

encontrados, apenas um apresentou resistência à ampicilina. Já os três isolados do gênero

Klebsiella encontrados foram resistentes à ampicilina. A maior parte (52%) dos isolados do

complexo Enterobacter cloacae do nosso estudo expressaram-se sensíveis ao antibiótico

em questão. Além disso, todos os oito isolados do estudo de Fakruddin e colaboradores

(2014) expressaram resistência ao antibiótico imipenem, enquanto que no presente trabalho

apenas dois isolados (complexo Enterobacter cloacae: Q2L1 e Q2R3) foram resistentes a

este antibiótico.

Damaceno e colaboradores (2015), em amostras de queijo minas frescal,

conseguiram isolar onze representantes da família Enterobacteriaceae, sendo dois isolados

do gênero Enterobacter. Estes expressaram resistência a quatro antibióticos de classes

diferentes, assim como os isolados Q2E1 e Q2L1 (complexo Enterobacter cloacae) do

27

presente estudo.

Em outro trabalho, Chauhan e colaboradores (2013) conseguiram isolar 27 bactérias

da espécie Klebsiella pneumoniae, a partir de 100 amostras de leite cru, sendo que 26

destas foram multirresistentes, diferente do presente estudo, onde os dois isolados desta

espécie (Q2C3 e R2) expressaram resistência somente à ampicilina, sendo sensíveis aos

outros dezesseis antibióticos utilizados.

No presente trabalho, obteve-se um índice alto de estirpes MDR, levando em

consideração a amostragem utilizada e o tipo de alimento (pronto para consumo). Assim,

decidiu-se investigar a expressão de outros fenótipos importantes relacionados à

resistência, como o KPC e o ESBL.

6.1.1 Detecção dos fenótipos de ESBL e KPC

Os meios de cultura cromogênicos CHROMagar KPC® e CHROMagar ESBL® são

considerados bons e rápidos indicadores/confirmadores da expressão de fenótipos de

resistência, facilitando a identificação e a triagem de estirpes resistentes (RAMESHKUMAR

et al., 2015; HORNSEY et al., 2013; SAITO et al., 2010).

Os vinte e quatro isolados multirresistentes foram submetidos aos testes com os

meios cromogênicos. Seis isolados, sendo um do complexo Enterobacter cloacae e cinco da

espécie Serratia marcescens, expressaram fenótipo de susceptibilidade reduzida aos

carbapenens (KPC), e quatorze isolados (4 do complexo Enterobacter cloacae e 10 da

espécie Serratia marcescens) expressaram fenótipos de produção de β-lactamase de

espectro estendido (ESBL). Os resultados estão dispostos na Tabela 6.

Apesar de a detecção dos fenótipos KPC e/ou ESBL ter sido evidenciada nos testes

com os meios cromogênicos, apenas o isolado E8 (Serratia marcescens) expressou fenótipo

de produção de ESBL e resistência a um dos antibióticos da classe das cefalosporinas de 3ª

geração (ceftazidima), concomitantemente, podendo sugerir uma relação direta deste

fenótipo com o antibiótico testado, o que não ocorreu com os demais isolados. Isto sugere

que estes isolados possam ser resistentes a outro(s) antibiótico(s) das classes estudadas,

porém não testado(s) neste trabalho. Situação inversa ocorreu com os isolados Q2L1 e

Q2R3 (complexo Enterobacter cloacae), que expressaram, no antibiograma, resistência ao

antibiótico IPM, da classe dos carbapenens, e os isolados Q2M1 e BLL1, que expressaram

resistência aos antibióticos da classe das cefalosporinas de 3ª geração cefotaxima e

ceftazidima, mas não expressaram fenótipos KPC e ESBL, respectivamente. Além disso,

90% dos representantes do complexo Enterobacter cloacae foram resistentes à combinação

de antibióticos inibidores de β-lactamase amoxicilina- ácido clavulânico.

28

Tabela 6: Resultado dos testes com os meios cromogênicos CHROMagar® KPC e CHROMagar® ESBL*

Identificação Isolados CHROMagar® KPC CHROMagar® ESBL


Q1L2

Q2R3

E2

L3

-

-

-

+

+

+

+

+

Serratia marcescens

Q1E2

E4

E6

E7

E8

E9

E14

E17

E20

L6

-

-

+

-

+

+

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Legenda: - Ausência de fenótipo de resistência; + Presença de fenótipo de resistência; KPC - Susceptibilidade reduzida aos carbapenens; ESBL - β-lactamases de espectro estendido. *Estão citados na tabela apenas os isolados MDR que expressaram fenótipo em, pelo menos, um dos meios cromogênicos.

Das bactérias da família Enterobacteriaceae, as que mais se destacam na literatura

como maiores produtoras de ESBL são as do gênero Klebsiella (especialmente a espécie

Klebsiella pneumoniae) e a espécie Escherichia coli, deixando para trás, por exemplo,

gêneros como o Acinetobacter, de alta relevância clínica (SAITO et al., 2010; MUNOZ-

PRICE e WEINSTEIN, 2008).

Um exemplo disso é o trabalho de Calbo e colaboradores (2011), que investigaram

um surto de Klebsiella pneumoniae produtoras de ESBL numa enfermaria de uma unidade

de saúde. Após obter resultados negativos para as superfícies e para os profissionais da

enfermaria, sugeriu-se que a veiculação estava ocorrendo via alimento, visto que 14% dos

funcionários, assim como 35% da superfície da cozinha do hospital, apresentaram

contaminação pela bactéria, o que demonstra que os alimentos podem ser excelentes

veiculadores de bactérias com esta característica.

Entretanto, os trabalhos ainda estão muito escassos na literatura e podem levar a

interpretações precipitadas: Dahmen e colaboradores (2013), por exemplo, investigaram

100 amostras coletadas de tanques de leite cru de 100 fazendas diferentes da Suíça para

investigação da produção de ESBL. Destas amostras, foram isoladas 85 estirpes da espécie

Klebsiella pneumoniae, porém nenhuma demonstrou ser produtora de ESBL, assim como no

nosso estudo. Isto levou os autores a sugerirem que o leite não é um bom veiculador de

29

bactérias produtoras de ESBL. Mas, esta sugestão contrasta com Chauhan e colaboradores

(2013), por exemplo, aonde num estudo, também com 100 amostras de leite cru, coletados

de fazendas em um vale da Índia, os autores conseguiram isolar 27 estirpes de Klebsiella

pneumoniae, e todas se apresentaram como produtoras de ESBL. Também contrasta com o

trabalho de Sudarwanto e colaboradores (2015), em um estudo realizado em 80 tanques de

leite cru de fazendas na Indonésia, quando 7 isolados produtores de ESBL da espécie

Klebsiella pneumoniae foram confirmados fenotipicamente. Vários fatores podem ter

influenciado para esta divergência de resultados entre o primeiro e os dois outros estudos,

como questões socioeconômicas (mão-de-obra, controle de qualidade, questões

infraestruturais), legislativas/normativas e até mesmo culturais. No presente estudo, apesar

dos isolados do gênero Klebsiella não expressarem fenótipos ESBL, e, de se trabalhar com

um número menor de amostras de leite, foram isoladas, nestas amostras, onze bactérias

com esta característica (2 do complexo Enterobacter cloacae e 9 da espécie Serratia

marcescens), demonstrando que o leite pode ser considerado um bom veiculador de

bactérias produtoras de ESBL.

Nesta última década, porém, o gênero Enterobacter vem surgindo como um fator

preocupante, principalmente a espécie Enterobacter cloacae, pertencente ao complexo

Enterobacter cloacae, que começa a se destacar neste grupo e já aparece como a terceira

maior produtora de ESBL da família Enterobacteriaceae, segundo Arnaud e colaboradores

(2014).

6.2 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA

6.2.1 Detecção qualitativa da produção de biofilme

Dos 58 micro-organismos isolados, 54 expressaram a produção de biofilme (93%),

sendo: 20 (37%) do complexo Enterobacter cloacae, 17 (31%) da espécie Serratia

marcescens, 8 (15%) da espécie Raoutella planticola, 3 (5%) da espécie Citrobacter freundii,

2 (4%) da espécie Klebsiella pneumoniae, 2 (4%) da espécie Citrobacter braakii, 1 (2%) da

espécie Klebsiella oxytoca, 1 (2%) do gênero Raoutella. Apenas quatro isolados (R4, R7, R9

e R19) não expressaram produção de biofilme. Esses resultados estão apresentados na

Figura 3. A Figura 4 ilustra um isolado que expressou produção de biofilme.

30

20

17

8

3

2

2

1

1

0 5 10 15 20 25


Serratia marcescens


Citrobacter freundii

Citrobacter braakii

Klebsiella pneumoniae

Klebsiella oxytoca

Raoutella sp

Número de isolados

Ide

ntifica

çã

o

Figura 3: Número de isolados produtores de biofilme.

Figura 4: Exemplo de isolado produtor de biofilme em ágar vermelho Congo (Q1L2;

complexo Enterobacter cloacae)

Outros trabalhos relataram membros da família Enterobacteriaceae produtores de

biofilme e associados à produtos lácteos. Cherif-Antar e colaboradores (2016) encontraram,

aderidas às superfícies de aço inoxidável das tubulações de uma fábrica de processamento

de leite, 32 bactérias Gram-negativas: 13 pertenciam à espécie Klebsiella pneumoniae, 6 à

espécie Serratia marcescens, 5 ao gênero Enterobacter.

Malek e colaboradores (2012) realizaram coleta de amostras de 5 fazendas

produtoras de leite pasteurizado e de leite em pó desnatado na Argélia. Toda a linha de

produção passava por processos constantes de sanitização com produtos à base de

31

amônia, e, eventualmente, com produtos à base de ácido peracético. Em duas fazendas

foram encontrados representantes do gênero Enterobacter. (5 e 6%, respectivamente).

A avaliação qualitativa de biofilme através da metodologia utilizando placas contendo

ágar Vermelho Congo é um dos protocolos mais práticos e acessíveis utilizados na rotina

laboratorial para bactérias gram-negativas (ČABARKAPA et al., 2015; MORAES et al., 2015;

SAISING et al., 2012).

6.2.2 Detecção de atividade proteolítica

Dos 58 micro-organismos isolados no presente estudo, 16 (28%) expressaram

atividade proteolítica, sendo 15 (26%) isolados da espécie Serratia marcescens e 1 (2%)

isolado da espécie Raoutella planticola. Os resultados estão dispostos na Tabela 7.

Tabela 7: Isolados que expressaram atividade proteolítica

Identificação Isolado

Serratia marcescens

E5 E6 E7 E8 E9 E10 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E19 E20 L6

Raoutella planticola E11

Masiello e colaboradores (2016), em um estudo com amostras de leite pasteurizado,

isolaram 13 representantes do gênero Serratia e 2 representantes do gênero Raoutella que

apresentaram atividades proteolítica. Os números foram muito próximos aos encontrados no

presente trabalho. Os autores ainda isolaram outros representantes da família

Enterobacteriaceae, comuns aos isolados do presente trabalho: 23 do gênero Cronobacter,

13 do gênero Enterobacter, demonstrando que os micro-organismos da família

Enterobacteriaceae estão cada vez mais adquirindo a capacidade de produzir enzimas

proteolíticas.

32

Hantsis-Zacharov e Halpern (2007) conseguiram isolar, em amostras de leite cru de 4

fazendas do norte de Israel, 2 bactérias da espécie Serratia marcescens que expressaram

atividade proteolítica. Em outro trabalho, Teh e colaboradores (2011a), a partir de amostras

retiradas da superfície interna de tanques de leite, isolaram 17 representantes do gênero

Serratia que apresentaram produção de enzimas proteolíticas. No presente estudo, 75% dos

isolados da espécie Serratia marcescens expressaram atividade proteolítica.

No trabalho de Nörnberg e colaboradores (2010), a partir de amostras de leite cru,

foram isolados 2 representantes da espécie Klebsiella oxytoca com alta capacidade

proteolítica. Amostras de leite UHT deste trabalho, quando expostas a estas cepas, em

temperatura ambiente, coagularam após 5 dias de exposição. Oladipo e Omo-Adua (2011a)

conseguiram obter, a partir de 10 amostras de leite em pó enlatado, um isolado da espécie

Klebsiella pneumoniae que expressou considerável atividade proteolítica. No presente

estudo, nenhum dos isolados do gênero Klebsiella expressou atividade proteolítica, porém

merece destaque o isolado E11 (Raoutella planticola), que até a alguns anos pertencia ao

gênero Klebsiella e expressou atividade proteolítica.

Bactérias com a capacidade de produzir enzimas proteolíticas podem ser

responsáveis pela degradação do leite e seus derivados, mesmo em produtos que sofrem

processamento térmico (MASIELLO et al., 2016), visto que muitas destas enzimas são

termorresistentes (ZAJÁC et al., 2015). Chove e colaboradores (2013), por exemplo,

analisaram a atividade proteolítica em amostras de leite cru após processamento térmico

nas temperaturas de 85, 110, 120, 130 e 142° C. Os autores evidenciaram nas amostras

que sofreram processamento térmico até 85° C/ 15 segundos e nas amostras sem

processamento, considerável atividade proteolítica. Nas demais temperaturas as enzimas

foram inativadas.

O exemplo mais prático da ação de proteinases sobre a caseína, influenciando

negativamente os produtos lácteos, está na produção de queijos: as proteases podem

desestabilizar as micelas de caseína, e, quando isto ocorre, o leite não coagula,

consequentemente o produto não adquire a consistência padrão (CALDERA et al., 2015;

PINTO et al., 2007).

Além disso, bactérias que sintetizam proteinases afetam consideravelmente as

propriedades sensoriais dos alimentos como, a cor, o odor, o sabor, e a textura (CALDERA

et al., 2015; HANTSIS-ZACHAROV e HALPERN, 2007), o que pode acarretar na rejeição do

produto pelo consumidor (TEIXEIRA, 2009).

Por outro lado, nesta última década, surgiu um grande interesse nas pesquisas

visando à utilização de proteinases na promoção de hidrólise da caseína para a fabricação

de alimentos com propriedades funcionais e farmacêuticas, como os nutracêuticos (LI et al.,

2013; SALAMI et al., 2011; PHELAN e KERINS, 2011). Mao e colaboradores (2011), por

33

exemplo, demostraram que produtos fabricados através de caseína hidrolisada por

proteases possuem capacidade de liberar peptídeos bioativos que atuam como

antioxidantes, entre outros benefícios à saúde. Um estudo de Muhammad e colaboradores

(2016) sugeriu, ainda, que estes peptídeos podem atuar no transporte de cálcio, melhorando

a sua biodisponibilidade.

6.2.3 Detecção de atividade lipolítica


atividade lipolítica, sendo 18 (31%) da espécie Serratia marcescens, 1 (2%) do complexo

Enterobacter cloacae, 1 (2%) da espécie Raoutella planticola. Os resultados estão dispostos

na Tabela 8.

Tabela 8: Isolados que expressaram atividade lipolítica.

Identificação Isolado

Serratia marcescens

E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E12 E13 E14 E15

E16 E17 E19 E20 R7 R9 R19

Complexo Enterobacter cloacae Q1R4

Raoutella planticola E11

A Figura 5 ilustra uma placa com meio de cultura Spirit Blue apresentando 4 isolados

da espécie Serratia marcescens que expressaram atividade lipolítica.

34

Figura 5: Exemplos de isolados que apresentaram atividade lipolítica

Masiello e colaboradores (2016), em amostras de leite pasteurizado, conseguiram

isolar alguns representantes da família Enterobacteriaceae, comuns ao presente estudo,

que expressaram atividade lipolítica no meio ágar Spirit blue: 17 isolados do gênero Serratia,

14 do gênero Enterobacter e 1 do gênero Raoutella, números muito próximos ao do

presente estudo. Apesar de nenhum dos isolados do gênero Citrobacter do presente estudo

ter expressado atividade lipolítica, vale ressaltar que no estudo de Masiello e colaboradores

(2016) 5 representantes expressaram.

Se por um lado as bactérias que expressam atividade lipolítica podem gerar

prejuízos à indústria de produtos lácteos com a deterioração de seus produtos, por outro, há

a possibilidade da utilização destas lipases como catalisadoras nos processos de

produção de biodiesel (WINAYANUWATTIKUN et al., 2011), lipases estas obtidas através

de fontes como os resíduos sólidos das indústrias, que são ricos em gorduras, promovendo,

assim, destinação a estes resíduos (SALIHU et al., 2012).

6.2.4 Detecção de atividade hemolítica


atividade hemolítica, sendo 20 (35%) do complexo Enterobacter cloacae, 8 (14%) da

espécie Serratia marcescens, 6 (10%) da espécie Raoutella planticola, 3 (5%) da espécie

Citrobacter freundii, 2 (3%) da espécie Citrobacter braakii, 2 (3%) da espécie Klebsiella

pneumoniae e 1 (2%) da espécie Klebsiella oxytoca. Os resultados estão dispostos na

Tabela 9. A Figura 6 ilustra a atividade hemolítica de alguns isolados.

35

Tabela 9: Isolados que expressaram atividade hemolítica.

Identificação Isolado Tipo de hemólise


BLL1 E1 E3 L3

Q11 Q12 Q15 Q16

Q1C2 Q1C3 Q1L2 Q1R1 Q1R2 Q1R4 Q2E1 Q2L1 Q2M1 Q2R2 Q2R3

R4

α α α α α α β α α α α α

α α α α α α β β

Serratia marcescens

E7 E13 E14 E15 E17 E19 L6

R19

α α α α α α α α


QJ3 QJ5

Q1R3

α α α

Q2E2 Q2E3 Q2R4

α α α

Citrobacter freundii

Q1M3 Q1R5 Q2R1

α α α

Citrobacter braakii Q1C1 Q1E1

α α

Klebsiella pneumoniae Q2C3

R2 α α

Klebsiella oxytoca Q1E3 α

Rajani e colaboradores (2016), em amostras de leite cru, conseguiram isolar um

representante da espécie Enterobacter sakazakii que expressou atividade β-hemolítica. No

presente estudo, três isolados do complexo Enterobacter cloacae expressaram atividade β-

hemolítica. Até a publicação do artigo de Rajani e colaboradores (2016) não havia, na

literatura, trabalhos relacionando bactérias hemolíticas a produtos lácteos.

36

Figura 6: Exemplos de isolados que apresentaram atividade hemolítica. À esquerda, α-

hemólise apresentada pelo Q1E3 (Klebsiella oxytoca) e à direita, β-hemólise apresentada

pelo isolado R4 (do complexo Enterobacter cloacae).

6.3 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ANTIMICROBIANAS (SAM)

Nenhum dos micro-organismos isolados neste trabalho produziu algum tipo de SAM

contra as estirpes indicadoras utilizadas. É importante ressaltar que os micro-organismos

produtores de SAM possuem uma grande vantagem na competição em um determinado

nicho ecológico.

Diante disto, a indústria está começando a demonstrar interesse no potencial de

prospecção biotecnológica dos micro-organismos produtores de SAM. Segundo Oliveira e

colaboradores (2011a), como os antibióticos não podem ser utilizados nos alimentos, estas

substâncias podem ser de suma importância na prevenção e controle de contaminantes em

alimentos. Em um trabalho anterior realizado pelo nosso grupo de pesquisa, por exemplo,

dois representantes do gênero Enterobacter e outros nove representantes da família

Enterobacteriaceae foram capazes de produzir substâncias antimicrobianas contra as cepas

E. coli ATCC25922 e S. enterica ATCC19214 utilizadas como indicadoras da produção de

SAM (DAMACENO et al., 2015). Estas duas espécies de bactérias estão entre as maiores

causadoras de doenças transmitidas por alimentos (FLEMING et al., 2010).

6.4 DETERMINAÇÃO DO PERFIL PLASMIDEAL DOS ISOLADOS DO COMPLEXO

ENTEROBACTER CLOACAE

Por constituírem a maior parte das bactérias detectadas neste trabalho, todos os

isolados do complexo Enterobacter cloacae foram submetidos à extração de DNA e

eletroforese em gel de agarose para a determinação dos seus perfis

37

plasmideais. A maioria dos isolados possuía mais de uma forma plasmideal. Alguns isolados

não MDR expressaram o mesmo perfil plasmideal dos isolados MDR e, além disso, as suas

formas plasmideais possuíam tamanho molecular entre 2 e 10 Kb. Alguns representantes

estão ilustrados na Figura 7.

Figura 7: Eletroforese em gel de agarose com alguns isolados MDR e não MDR do

complexo Enterobacter cloacae. A, Supercoilled; B, Q1C2; C, Q1C3; D, Q1L2; E, Q2M1; F,

Q1R1; G, Q1R2; H, Q2L1; I, Q2R3; J, L3; Os asteriscos indicam os isolados MDR.

Excetuando-se o isolado Q2R2, todos os demais isolados com o perfil plasmideal

investigado expressaram resistência ao antimicrobiano CEP, porém nem todos os isolados

apresentaram formas plasmideais semelhantes. Já a resistência ao antimicrobiano AMC só

não ocorreu nos isolados Q2M1, BLL1 e Q2R2, mas também não apresentaram formas

plasmideais semelhantes (dados não mostrados). Por outro lado, os isolados Q2L1 e Q2R3

expressaram resistência ao antimicrobiano IPM e apresentaram algumas formas

plasmideais com tamanhos moleculares muito semelhantes. Entretanto, segundo Huang e

38

colaboradores (2012), os plasmídeos que contribuem para a resistência aos antimicrobianos

costumam ser de grande peso molecular. Davin-Regli e Pagès (2015), por exemplo,

relataram que micro-organismos da espécie Enterobacter aerogenes integraram um gene de

origem cromosssômica em um plasmídeo de grande tamanho (130 kb).

Em um trabalho realizado por nosso grupo, Damaceno e colaboradores (2015)

conseguiram isolar um representante da espécie Enterobacter cloacae a partir de uma

amostra de queijo minas frescal, e este expressou várias formas plasmidiais de tamanho

inferior a 6 kb, semelhante a alguns dos isolados do complexo Enterobacter cloacae do

presente trabalho. Vale ressaltar que o isolado do trabalho de 2015 também apresentava

resistência ao imipenem, assim como o isolado Q2L1.

Os resultados apontam que não existe uma fórmula padrão de relação entre o peso

molecular de um plasmídeo e sua ligação com determinada característica em um gênero

bacteriano como, por exemplo, a produção de substâncias antimicrobianas (SAM). Içgen e

colaboradores (2002) compartilham da ideia que as bactérias com plasmídeos de alto peso

molecular tendem a possuir um grau maior de patogenicidade que bactérias com

plasmídeos de baixo peso molecular, mas os próprios autores também relataram que isto

não é uma regra. A única regra é a de que, em bactérias sem plasmídeos, os genes

responsáveis por conferir resistência a antibióticos e outros fatores de virulência encontram-

se no cromossomo. A confirmação da associação de um plasmídeo com determinada

característica somente seria possível de ser comprovada através de experimentos de cura

plasmidial e/ou de transferência gênica.

39

7 CONCLUSÕES

Neste trabalho, pode-se considerar que as amostras de conveniência dos produtos

lácteos investigados são potenciais veículos de micro-organismos da família

Enterobacteriaceae que:

Podem expressar multirresistência aos antimicrobianos disponíveis, visto que 24

isolados expressaram resistência a, pelo menos, 1 antibiótico em 3 classes

diferentes. Vale ressaltar que os antimicrobianos usados no combate a infecções

causadas por estas bactérias estão cada vez mais escassos e a busca por novos

compostos não segue o mesmo ritmo da aquisição de resistência aos antibióticos por

estes micro-organismos;

Podem expressar fenótipos de susceptibilidade reduzida ao carbepenens (KPC) e

fenótipos de produção de β-lactamase de espectro estendido (ESBL): estes fenótipos

conferem resistência as principais classes de antibióticos utilizados no tratamento de

infecções causadas por bactérias Gram-negativas. Nesta última década, a espécie

Enterobacter cloacae, pertencente ao complexo Enterobacter cloacae, está se

destacando como a terceira maior produtora de ESBL da família Enterobacteriaceae.

Podem produzir biofilme: uma das características mais preocupantes para a indústria

de alimentos, pois bactérias com os perfis encontrados, aderidos às superfícies das

cadeias produtivas, podem trazer muitos prejuízos;

Podem produzir enzimas proteolíticas: capazes de gerar a deterioração dos produtos

lácteos e/ou causar danos às propriedades sensoriais dos alimentos, induzindo à

rejeição do produto por parte do consumidor. Além disso, podem propiciar a

sobrevivência de muitos patógenos dentro do organismo hospedeiro, logo podem

trazer sérios riscos à saúde dos consumidores;

Podem produzir enzimas lipolíticas: estas enzimas podem levar a um processo

denominado rancidez hidrolítica, que desenvolve no produto um sabor acre e um

odor desagradável. Podem, ainda, estar relacionadas à formação de tumores e

doenças coronarianas nos consumidores.

Podem produzir enzimas hemolíticas: estas enzimas podem provocar doenças nas

glândulas mamárias de animais leiteiros, e, possível contaminação do leite extraído.

No organismo hospedeiro, são capazes de afetar a sinalização celular, os

mecanismos de modulação da morte celular induzida, as vias de sinalização

inflamatória e levar à carência nutricional de ferro, já que atuam no sequestro de

ferro.

40

Apesar de nenhum dos isolados ter produzido substâncias antimicrobianas contra as

cepas indicadoras utilizadas, é importante ressaltar que esta característica é uma vantagem

para as bactérias em um nicho de competição.

O perfil plasmideal dos isolados não foi suficiente para associar determinadas

características às formas plasmidiais expressas, e, isso somente seria possível de ser

comprovado através de experimentos de cura plasmidial e/ou de transferência gênica.

Todos estes fatores representam riscos potenciais para a saúde dos consumidores

de produtos lácteos, especialmente os consumidores imunocomprometidos, situação que

vem se agravando na sociedade atual.

Diante do exposto, cabe a toda cadeia produtiva de produtos lácteos, em todas as

etapas (linhas de produção, transporte e armazenamento), seguirem as Boas Práticas de

Fabricação e Higiene, assim como boas práticas nos locais de comercialização,

principalmente para produtos consumidos sem qualquer processamento prévio. Além disso,

de acordo com a legislação vigente no Brasil, que preconiza os patógenos que devem ser

analisados e seus limites nos produtos lácteos [RDC nº 12 de 2001 (BRASIL, 2001)], apenas

os coliformes termotolerantes e o gênero Salmonella são destacados. Diante dos achados

deste trabalho, sugere-se uma revisão dos grupos de micro-organismos e dos limites de

aceitação dessa resolução.

41

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS

A presente dissertação gerou algumas produções para o nosso grupo de pesquisa do

Laboratório de Microbiologia, dentre estas: quatro comunicações em eventos, a publicação

de um artigo em revista internacional, a submissão de outro artigo para outra revista

internacional e um manuscrito de artigo, conforme descritos no item 9 (Produção Científica).

O manuscrito depende da realização de alguns testes complementares, que estão

ocorrendo, porém com previsão de serem finalizados somente após a defesa desta

dissertação. Os testes complementares são: a exposição dos isolados ao hipoclorito de

sódio para avaliar a resistência destes a um sanitizante amplamente utilizado para a

desinfecção de alimentos e a exposição ao suco gástrico simulado (SGS), mimetizando a

passagem dos isolados pelo estômago.

42

9 PRODUÇÃO CIENTÍFICA

9.1 ARTIGO ACEITO PARA PUBLICAÇÂO (ANEXO 1)

AMORIM, A. M. B. & NASCIMENTO, J. S. Acinetobacter: an underrated foodborne

pathogen? The Journal of Infection in Developing Countries, 2016. In press.

9.2 SUBMISSÃO DE ARTIGO: INTERNATIONAL FOOD RESEARCH JOURNAL (ANEXO 2)

AMORIM, A. M. B., MELO, D. H., SOUZA, B. V., MEDEIROS, L. M.; MATTOSO, J.

M. V.; NASCIMENTO, J. S. A reddish problem: antibiotic-resistant Serratia marcescens in

dairy food commercialized in Rio de Janeiro.

9.3 MANUSCRITO EM PREPARAÇÂO

AMORIM, A. M. B., ARAÚJO, B. C. A., MELO, D. H., FRAZÃO, A. M.; COSTA, L. V.;

NASCIMENTO, J. S. Multidrug resistance and viability in simulated gastric fluid exhibited by

Enterobacter cloacae complex isolated from dairy products.

9.4 COMUNICAÇÔES EM EVENTOS (ANEXOS 3 E 4)

AMORIM, A. M. B.; ARAÚJO, B. C.; YANG, E.; SOUZA, B. V.; NASCIMENTO, J. S.

Avaliação da significância de produtos lácteos como potenciais fontes de

transmissão de Acinetobacter spp. multirresistentes. XXXV Semana da Química - Rio

de Janeiro - Produzindo Ciências há 450 anos / VIII Jornada da Pós-Graduação em

Alimentos. Instituto Federal do Rio de Janeiro / Campus Rio de Janeiro – 19 a 24 de outubro

de 2015. Disponível em: http://www.ifrj.edu.br/sites/default/files/webfm/images/JPAL-15.pdf

AMORIM, A. M. B.; MELO, D. H.; ARAÚJO, B. C.; SOUZA, B. V.; NEVES, H. V. M.;

NASCIMENTO, J. S. Avaliação do papel de produtos lácteos como possíveis veículos

de transmissão de bactérias multirresistentes da família Enterobacteriaceae. X

Jornada Interna de Iniciação Científica e Tecnológica” (X JIT) / V Fórum de Inovação,

Tecnologia e Educação” (V Fórum ITE). Instituto Federal do Rio de Janeiro / Campus

Nilópolis – 21 e 22 de junho de 2016.

AMORIM, A. M. B.; MELO, D. H.; SOUZA, B. V.; COSTA, L. V., FRAZÃO, A. M.;

http://www.ifrj.edu.br/sites/default/files/webfm/images/JPAL-15.pdf

43

NASCIMENTO, J. S. Avaliação da multirresistência a drogas por isolados do complexo

Enterobacter cloacae obtidos de produtos lácteos comercializados no Rio de Janeiro.

IV Seminário em Inovação e Tecnologia na área de Alimentos. Instituto Federal do Rio de

Janeiro / Campus Rio de janeiro – 06 e 07 de outubro de 2016.

AMORIM, A. M. B.; ARAÚJO, B. C.; SOUZA, B. V.; NASCIMENTO, J. S. Avaliação

da produção de enzimas proteolíticas, lipolíticas e hemolíticas por isolados da

espécie Serratia marcescens obtidos de produtos lácteos comercializados no Rio de

Janeiro. IV Seminário em Inovação e Tecnologia na área de Alimentos. Instituto Federal do

Rio de Janeiro / Campus Rio de janeiro – 06 e 07 de outubro de 2016.

44

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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11 ANEXOS

ANEXO 1

E-MAIL DE ACEITE DO ARTIGO PELO PERIÓDICO THE JOURNAL OF INFECTION IN

DEVELOPING COUNTRIES

60

ANEXO 2

COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DE ARTIGO PELO PERIÓDICO INTERNATIONAL

FOOD RESEARCH JOURNAL

61

ANEXO 3

CERTIFICADO DA APRESENTAÇÃO DE TRABALHO NA XXXV SEMANA DA QUÍMICA -

RIO DE JANEIRO - PRODUZINDO CIÊNCIAS HÁ 450 ANOS / VIII JORNADA DA PÓS-

GRADUAÇÃO EM ALIMENTOS.

62

ANEXO 4

CERTIFICADO DA X JORNADA INTERNA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA E

TECNOLÓGICA” (X JIT) / V FÓRUM DE INOVAÇÃO, TECNOLOGIA E EDUCAÇÃO” (V

FÓRUM ITE)

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