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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS
LENIÉSER FAJARDO NUNES
AVALIAÇÃO DA EFETIVIDADE DE DIFERENTES SUBSTÂNCIAS
QUÍMICAS IRRIGANTES CONTRA O ENTEROCOCCUS FAECALIS. ESTUDO EX VIVO.
Cuiabá 2017
LENIÉSER FAJARDO NUNES
AVALIAÇÃO DA EFETIVIDADE DE DIFERENTES SUBSTÂNCIAS
QUÍMICAS IRRIGANTES CONTRA O ENTEROCOCCUS FAECALIS. ESTUDO EX VIVO.
Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas Integradas, da Universidade de Cuiabá – UNIC como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas – Área de Concentração Odontologia.
Orientador: Prof. Dr. Fábio Luís Miranda Pedro Coorientador: Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges
Cuiabá 2017
FICHA CATALOGRÁFICA
N972a Nunes, Leniéser Fajardo. Avaliação da efetividade de diferentes substâncias químicas irrigantes contra o Enterococcus faecalis. Estudo ex vivo / Leniéser Fajardo Nunes. – 2017. 64f.: il. color; 30 cm. Orientadora: Prof. Dr. Fábio Luís Miranda Pedro. Coorientador: Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-graduação em Ciências Odontológicas Integradas, Universidade de Cuiabá, 2017. Inclui bibliografia.
1. Ácido Etilenodiaminotetracético. 2. Endodontia. 3. Enterococcus faecalis.
4. Hipoclorito de sódio. 5. Quitosana.
CDU – 616.314.18
Dedicatória
“ Dedico esse trabalho primeiramente à DEUS, ao
meu irmão Aércio e minha cunhada Lucia, pela orientação,
incentivo, apoio, compreensão e amor. Vocês são minha base, minha
família amada. “
AGRADECIMENTOS
Ao meu Orientador Prof. Dr. Fábio Luís Miranda Pedro,
Obrigada Professor pelos ensinamentos e parceria de sempre, meu carinho é eterno.
Ao meu Coorientador Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges,
Pela oportunidade de realizar o sonho que virou realidade de fazer Mestrado, por sua paciência, sabedoria, dedicação, ensinamentos, saber o que fazer e dizer na hora certa. Obrigada pelas oportunidades, sou muito grata por tudo, levarei para a vida toda.
Ao colega de profissão e doutorando Thiago Machado Pereira, foi um anjo que o Prof. Álvaro colocou na minha vida, obrigada por sua paciência e parceria, aprendi muito com você.
Ao Professor Dr. Luiz Evaristo Ricci Volpato,
Por ter me presenteado com tantos ensinamentos, paciência e pela imensa emoção do meu 1° artigo publicado, obrigada por ter acreditado em mim e não ter desistido.
À querida Professora Dra Cyntia Rodrigues de Araújo Estrela,
Por me acolher; foi um imenso prazer executar a parte laboratorial juntas em Goiânia, foi um aprendizado enriquecedor e fundamental para a montagem do trabalho.
À todos os Professores do curso de Mestrado, pelos ensinamentos transmitidos, vocês são incríveis: Alessandra Nogueira Porto, Alex Semenoff Segundo, Alexandre Meireles Borba, Andreza Maria F. Aranha, Evanice Menezes Vieira, Mateus Rodrigues Tonetto, Matheus Bandeca, Orlando Aguirre Guedes, Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff.
Ao Diretor da Faculdade São Paulo-FSP de Rolim de Moura - RO e Professor Paulo Jacob Strieder, pelo incentivo, apoio e liberação para que eu pudesse realizar meu sonho do Mestrado.
À Coordenadora Pedagógica da Faculdade São Paulo-FSP de Rolim de Moura-RO Osana Scalzer, pelo carinho, apoio e ajuda nas minhas ausências.
Aos colegas e amigos da turma do Mestrado 2015: Christiane Lima Mondin, Cleiner Naves, Edinei Bocardi, Elâine Patricia, Everton Silva, Gilberto Siebert Filho, Gislaine F. Zarza Gonçalves, Joana Freitas, Kellin Pivatto, Leticia Fantin, Natalino Francisco Silva, Panmella Alegria, Thaise Ayres Bezerra Zulli e Valéria Teixeira de Andrade. Obrigada pela parceria, paciência, troca de experiência, amizade, #Tamojunto.
Agradeço à amiga Valéria Teixeira de Andrade, pela amizade, carinho, oportunidade de conhecê-la, companheira de viagem e que me acolheu na hora que mais precisei, que Deus te conserve sempre assim, uma querida.
À Coordenadoria de pesquisa e pós-graduação,
Na pessoa da Coordenadora Lucélia de Oliveira Santos.
À Diretoria de pesquisa e pós-graduação,
Na pessoa do Diretor Hélio Hiroshi Suguimoto.
À Faculdade de Odontologia de Cuiabá da Universidade de Cuiabá (FOC-UNIC),
Na pessoa do Coordenador Fábio Luís Miranda Pedro.
À Universidade de Cuiabá (UNIC),
Na pessoa do Reitor Fernando Ciriaco Dias Neto.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior–CAPES,
Pelo incentivo à pesquisa científica, indispensável ao desenvolvimento deste trabalho.
Obrigado a todos que, de alguma forma, colaboraram para realização deste trabalho!
“Educa a inteligência e atingirás a Sabedoria.
Educa as mãos e acentuarás a Competência.
Educa a palavra e acolherás a Simpatia e Cooperação.
Educa o pensamento e conquistarás a ti mesmo.”
Chico Xavier
RESUMO
NUNES, LF. AVALIAÇÃO DA EFETIVIDADE DE DIFERENTES SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS IRRIGANTES CONTRA O ENTEROCOCCUS FAECALIS. ESTUDO EX VIVO. 2017. 64f. Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas) Programa de Pós-Graduação, Universidade de Cuiabá – UNIC, Cuiabá 2017.
O objetivo deste estudo foi avaliar a efetividade de diferentes substâncias químicas irrigantes contra o Enterococcus faecalis (ATCC 29212). Foram utilizados 40 dentes bovinos, distribuídos nos seguintes grupos: NaOCl a 2,5%; EDTA a 17%; Quitosana a 0,2%; NaOCl 2,5% + Quitosana a 0,2% e NaOCl 2,5% + EDTA 17%). Inicialmente, as coroas dentárias foram removidas e os comprimentos radiculares padronizados em 16 mm e os espécimes mecanicamente preparados. Após isso, todos os espécimes foram inseridos individualmente em tubos de prolipropileno do tipo Eppendorf contendo Brain Heart Infusion (BHI) e autoclavados por 30 min, a 120°C. Cinco mililitros de BHI foram misturados a 5 mL do inóculo bacteriano, e os grupos experimentais foram inoculados durante 60 dias, em meio úmido a 37˚C. A avaliação da eficácia antimicrobiana das soluções experimentais foi realizada com o emprego em dispositivo formado por Bomba Peristáltica com circulação das soluções irrigadoras pelo aparato em fluxo constante durante 10 min. A análise de variância e teste de Tukey (α=0,05) foram aplicados para análise dos grupos. Os resultados mostraram a presença de E. faecalis após a utilização dos diferentes protocolos de irrigação, sem diferença entre os mesmos (p>0,05). Foi possível concluir que as diferentes substâncias químicas irrigantes não foram efetivas para eliminação completa da contaminação dentinária bacteriana com E. faecalis.
Palavras-chave: Ácido Etilenodiaminotetracético, Endodontia, Enterococcus faecalis, Hipoclorito de sódio, Quitosana.
ABSTRACT
NUNES, LF. EFFECTIVENESS ASSESSMENT OF DIFFERENT IRRIGATION CHEMICAL SUBTANCES AGAINST ENTEROCOCCUS FAECALIS. EX VIVO STUDY. 2017. 64f. Dissertation (Master’s Degree in Integrated Dental Clinic) Post-Graduate Program, University of Cuiabá – UNIC, Cuiabá 2017.
The aim of this study was to evaluate the effectiveness of different irrigation protocols against Enterococcus faecalis (ATCC 29212). Forty bovine teeth were divided into the following groups: 2.5% NaOCl; 17% EDTA; 0.2% Chitosan; 2.5% NaOCl + 0.2% Chitosan and 2.5% NaOCl + 17% EDTA. Dental crowns were removed. Root lengths standardized at 16 mm and mechanically prepared specimens. All specimens were individually inserted into Eppendorf polypropylene tubes containing Brain Heart Infusion (BHI) and autoclaved for 30 min at 120 ° C. Five milliliters of BHI were mixed with 5 ml of the bacterial inoculum. The experimental groups were inoculated for 60 days in a humid medium at 37 ° C. The evaluation of the antimicrobial efficacy of the experimental solutions was carried out using a device formed by Peristaltic Pump with circulation of the irrigating solutions by the apparatus in constant flow for 10 min. The analysis of variance and Tukey's test (α = 0.05) were applied to analyze the groups. The results showed the presence of E. faecalis after the use of different irrigation protocols, with no difference between them (p>0.05). Thus, different irrigation protocols were not effective for complete elimination of bacterial dentin contamination with E. faecalis.
Keywords: Chitosan, Endodontics, Enterococcus faecalis, Ethylenediaminetetraacetic Acid, Sodium Hypochlorite.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Distribuição dos Grupos de acordo com as soluções experimentais.
43
Tabela 2 Eficácia antibacteriana de soluções irrigadoras em canais radiculares infectados por E. faecalis.
48
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Vista geral do aparato empregado na avaliação do efeito antimicrobiano das soluções irrigadoras. (a) Elemento dental acoplado em tubo tipo Eppendorf; (b) Sistema de irrigação com bomba peristáltica; (c) solução irrigadora circulando em fluxo constante de 50 mL min-1 por 10 min.
45
Figura 2 Imagens MEV (3.000x) A- Controle Negativo; B- Controle Positivo; C- Solução de H20; D- NaOCl; E- EDTA; F- Quitosana; G- NaOCl + Quitosana; H- NaOCl + EDTA.
49
Figura 3 Imagens MEV (5.000x) A- Controle Negativo; B- Controle Positivo; C- Solução de H20; D- NaOCl; E- EDTA; F- Quitosana; G- NaOCl + Quitosana; H- NaOCl + EDTA.
50
LISTA DE ABREVIATURAS
ADA American Dental Association
ATCC American Type Culture Collection
AASF
BHIA
Espectrofotometria
Brain Heart Infusion Agar (Agar de Infusão de Coração e Cérebro)
Ca(OH)2 Hidróxido de Cálcio
CChAgNpFNc
CDTA
Quitosana coloidal-nanopartícula de prata-nanocompósito de flúor
Ácido transciclohexanodiaminotetracético
CHX
CNPs
Crti
Cu
Co
CTR
Clorexidina
Nanopartícula de quitosana
Centro Regional para o Desenvolvimento Tecnológico e Inovação
Cobre
Cobalto
Cetrimide
EDTA
EDTAC
EDTA-T
EGTA
Ácido etilenodiaminotetracético
Ácido etilenodiaminotetracético+brometo de cetiltrimetilamônio
Ácido etilenodiaminotetracético+ sulfato de éter de lauril e sódio
Ácido etilenoglicotetraacético
E. faecalis Enterococcus faecalis
et al. Colaboradores
EUA
Fe
Estados Unidos da América
Ferro
G Grupo
MEV
MHA
Microscopia eletrônica de varredura
Placa de ágar Muller Hinton
min Minuto
mg
Mg
Miligrama
Magnésio
mL Mililitro
mm
MTAD
MTT
Milímetro
Isômero de tetraciclina+ácido+detergente
Microcultura de tetrazólio
N Amostra
NaOCl Hipoclorito de sódio
Ni Níquel
Nm Nanômetro
pH Potencial hidrogeniônico
S. aureus
UFC
Staphylococcus aureus
Unidades formadoras de colônias
UFG Universidade Federal de Goiás
°C Graus Centígrados Celsius
Zn
µm
Zinco
Micrômetro
% Porcentagem
®
#
Marca Registrada
Número
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 21
2 REVISÃO DE LITERATURA 25
2.1 SOLUÇÕES IRRIGANTES 26
2.2 PROPRIEDADES DA QUITOSANA 35
3 MATERIAIS E MÉTODOS 41
3.1 INDICADOR BIOLÓGICO 42
3.2 MATERIAIS 42
3.3 PREPARO DAS SOLUÇÕES 42
3.4 DESENHO EXPERIMENTAL 43
3.5 AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIMICROBIANO DA SOLUÇÃO IRRIGADORA
44
3.6 PREPARO PARA ANÁLISE NO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA
46
4 RESULTADOS 47
5 DISCUSSÃO 51
6 CONCLUSÃO 55
7 REFERÊNCIAS 57
ANEXOS 63
22
1. INTRODUÇÃO
O sucesso do tratamento endodôntico está relacionado à desinfecção do
sistema de canais radiculares (ESTRELA et al., 2012), proposto pela ação mecânica
de instrumentos endodônticos associada às propriedades das soluções irrigantes
que, reduzindo agentes irritantes como bactérias e seus subprodutos, restos de
tecido pulpar e dentina contaminada, geram ambiente favorável ao reparo dos
tecidos periapicais (SIQUEIRA Jr. et al., 1997; FERREIRA et al., 2004; DE-DEUS et
al., 2014; BORGES et al., 2016).
O canal radicular é ambiente acessível para várias espécies microbianas,
possibilitando a fixação na superfície dentinária e consequente formação de
biofilmes bacterianos densos (ESTRELA et al., 2009). As etapas de organização
estrutural do biofilme, sua composição e as atividades dos microrganismos
colonizadores em vários ambientes podem ser diferentes (ESTRELA et al., 2009).
Porém, o estabelecimento do biofilme segue essencialmente a mesma série de
estágios de desenvolvimento, incluindo a deposição de condicionamento, adesão e
colonização de microrganismos planctônicos na matriz polimérica e co-adesão de
outros organismos (ESTRELA et al., 2009). A sanificação dos canais radiculares
depende da inativação de microrganismos presentes no biofilme e no ambiente
planctônico, sendo que o preparo de canal radicular com agentes antimicrobianos,
como irrigantes químicos e/ou curativos intracanais, contribui para a redução da
microbiota endodôntica (SHENOI et al., 2016; VATKAR et al., 2016).
Dentre os microrganismos presentes nessa microflora, o Enterococcus
faecalis (E. faecalis) tem papel principal como agente patogênico relacionado ao
insucesso da terapia endodôntica (MORAGO et al., 2016). São microrganismos
gram-positivos que estão organizados em biofilme, com diversos fatores de
virulência, anaeróbios facultativos, com capacidade de invadir túbulos dentinários e
de se multiplicarem em condições extremas com pH elevado (KAYAOGLU e
ORSTAVIK, 2004; HOLLENBECK e RICE, 2012; ALSHWAIMI et al., 2016). No
entanto, a presente patogenicidade de E. faecalis, em infecções endodônticas
persistentes, promove a necessidade de maiores investigações neste contexto.
Durante o preparo de canais radiculares, independentemente do tipo de
instrumento utilizado ou da técnica preconizada, ocorre deposição de
remanescentes de tecidos dentinários nas paredes dos canais radiculares, o que
23
determina a formação de estrutura amorfa denominada smear layer (MORAGO et
al., 2016). A remoção da smear layer do canal radicular faz parte do processo da
terapêutica endodôntica (DE-DEUS et al., 2014). Para isso, instrumentos
ultrassônicos, aplicação de laser e agentes quelantes têm sido utilizados tanto para
sua remoção química quanto mecânica (TORABINEJAD et al., 2003).
O hipoclorito de sódio (NaOCl) é atualmente a substância mais
comumente utilizada na prática endodôntica devido às suas propriedades tais como:
capacidade de dissolução de matéria orgânica, lubrificação e neutralização de
conteúdo tóxico (HÜLSMANN et al., 2003; TORABINEJAD et al., 2003;
MARENDING et al., 2007; CHAITANYA et al., 2016). Apesar de sua atividade
antimicrobiana e capacidade de prevenir a formação da smear layer, em associação
com agentes quelantes, o NaOCl demonstrou ter efeito citotóxico no tecido vital, ao
atingir o periápice (ROSSI-FEDELE et al., 2010; CHAITANYA et al., 2016). Além
disso, foi demonstrado que o NaOCl causa alteração negativa na força necessária
para a fratura da dentinária (BERUTTI et al., 2006). O ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) foi o primeiro agente quelante utilizado na
Endodontia com a finalidade de facilitar a instrumentação de canais atrésicos
(NYGAARD-ØSTBY, 1957). A ação desses agentes quelantes permite a redução da
presença da smear layer, e a sua eficiência depende de muitos fatores, tais como:
tempo de aplicação, pH, concentração da solução, temperatura e da quantidade da
solução disponível (GOLDBERG e SPIELBERG, 1982; ÇALT e SERPER, 2002;
HÜLSMANN et al., 2003; CHAITANYA et al., 2016).
A investigação pela solução irrigadora para os canais radiculares de
maneira acessível, biocompatível e de baixo custo, que promova a eliminação da
camada da smear layer das paredes dentinárias tem sido alvo da pesquisa de vários
estudos (ESTRELA et al., 2007; CARVALHO et al., 2008; PRADO et al., 2011;
MORAGO et al., 2016). A quitosana é um polissacarídeo natural obtido por
desacetilação da quitina, a qual é obtida das carapaças de caranguejo, camarão e
siri (PENG HU et al., 2013). Possui capacidade quelante, e também
biocompatibilidade, biodegradabilidade, bioadesão e atoxidade às células
(URAGAMI et al., 2003; KURITA, 2006; AKNCBAY et al., 2007; PENG HU et al.,
2013).
24
A quitosana possui alta capacidade quelante por vários íons metálicos
(incluindo Ni2+, Zn2+, Co2+, Fe2+, Mg2+ e Cu2+) em condições ácidas, e tem sido
aplicado para remoção ou recuperação dos íons metálicos em diferentes setores da
indústria (KURITA, 1998). Na odontologia vem sendo estudada, na área da
Endodontia, como opção ao EDTA para a irrigação dos canais radiculares na
concentração de 0,2% por 3 min (KUMAR, 2000; SILVA et al., 2012; SILVA et al.,
2013). As alternativas de aplicações são ainda enriquecidas pelo fato de poder
manipular a quitosana em diferentes formas como: soluções de viscosidade
controlada, géis, filmes e membranas, microesferas e nanopartículas (CAMPANA-
FILHO et al., 2007).
Alguns aspectos são relevantes ao sucesso do tratamento endodôntico,
como a técnica empregada, propriedades físico químicas das soluções irrigantes,
qualidade da sanificação e promoção da obturação tridimensional (ESTRELA et al.,
2012). Além disso, a complexidade anatômica interna do sistema de canais
radiculares torna a completa remoção bacteriana praticamente impossível, mesmo
quando o preparo biomecânico é realizado com os mais elevados padrões técnicos
(SIQUEIRA-JUNIOR et al., 1997; KELEŞ et al., 2016). Baseado na dificuldade do
controle do biofilme endodôntico pela técnica convencional de preparo biomecânico,
é necessária a investigação de substâncias biocompatíveis que sejam eficazes
contra patógenos resistentes, como o E. faecalis (ESTRELA et al., 2012;
ALSHWAIMI et al., 2016; CHAITANYA et al., 2016; JAIN et al., 2016; KELEȘ et al.,
2016; MORAGO et al.,2016; SHENOI et al., 2016; VATKAR et al., 2016; ZAND et al.,
2016). Dessa forma, foi objetivo deste estudo ex vivo avaliar a efetividade de
diferentes substâncias químicas irrigantes do sistema de canais radiculares contra o
microrganismo Enterococcus faecalis.
26
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Soluções irrigantes
Orstavik e Haapasalo (1990) avaliaram os efeitos de diferentes soluções
irrigantes e curativos endodônticos em amostras de dentina bovina infectadas
experimentalmente com E. faecalis, Streptococcus sanguis, Escherichia coli ou
Pseudomonas aeruginosa. Foram preparados cilindros de dentina, os quais foram
padronizados e sanificados por tratamento ultrassônico, EDTA e NaOCl. Os
espécimes foram infectados por períodos de até 14 dias. A avaliação do grau de
infecção nos túbulos ocorreu por meio do método Brown e Brenn, microscopia
eletrônica de varredura (MEV) e cultura de pó de dentina. Medicações endodônticas
foram aplicadas às amostras infectadas para comparar a capacidade antibacteriana.
Os resultados mostraram que o paramonoclorofenol canforado foi mais eficiente que
o Calasept®. Dentre as soluções estudadas, o iodeto de potássio apresentou maior
eficácia que o NaOCl e clorexidina (CHX). Os autores salientaram que a presença
de smear layer retardou, mas não eliminou o efeito das medicações.
Garberoglio e Becce (1994) analisaram o efeito de seis irrigantes na
smear layer criada pela instrumentação endodôntica in vitro. As soluções irrigantes
avaliadas foram NaOCl a 1%, NaOCl a 5%, combinação de ácido fosfórico a 24% e
ácido cítrico a 10%, EDTA 0,2%, EDTA 17% e EDTA 3%. Os dentes, após preparo e
irrigação, foram avaliados por MEV para verificar a presença ou ausência da smear
layer. As duas soluções de NaOCl não removeram a smear layer. A solução de
EDTA 0,2% foi mais eficiente que o NaOCl, mas não removeu totalmente a smear
layer, especialmente na entrada dos canalículos dentinários. As outras três soluções
removeram a smear layer efetivamente, mas sem diferenças estatísticas
significantes entre elas. A solução de EDTA a 3% foi tão efetiva quanto o ácido
fosfórico, o ácido cítrico e o EDTA a 17%, porém o EDTA não mostrou o significante
efeito desmineralizante dentinário como a solução ácida.
Berutti et al. (1997) analisaram a capacidade de algumas soluções
irrigadoras de penetrar nos túbulos dentinários. Os autores utilizaram vinte e quatro
incisivos centrais superiores, que foram esterilizados e, posteriormente, incubados
com E. faecalis por 20 dias. A instrumentação dos dentes foi realizada em ambiente
asséptico, irrigando os canais radiculares, entre cada instrumento com NaOCl a
27
5,25% e EDTA a 10%. Na metade da amostra, além das soluções irrigadoras
citadas, foi utilizado um detergente aniônico (Triton-X®). Os dentes foram
descalcificados e analisados por meio de microscopia óptica, onde foi observada a
presença de bactérias nos túbulos dentinários, em diferentes profundidades. No
grupo no qual não foi utilizado o tensoativo, houve a presença maciça de bactérias
na profundidade de 300 µm; enquanto no grupo no qual o tensoativo foi utilizado,
houve camada livre de bactérias, a partir da luz do canal, que se estendeu por 130
µm. Abaixo dessa zona livre de bactérias, houve contaminação. Os autores
concluíram que o tensoativo auxilia a penetração do NaOCl no interior dos túbulos
dentinários.
Buck et al. (2001) avaliaram a penetração de algumas soluções
irrigadoras no interior dos túbulos dentinários utilizando NaOCl a 5,25%, EDTA a
0,2% e CHX a 0,12%. Os canais radiculares de doze dentes anteriores foram
esterilizados e contaminados com E. faecalis por 12 h, recebendo em seguida, por 1
min, as soluções testadas. Usando brocas de baixa rotação, os autores recolheram
raspas de dentina, a partir da superfície externa da raiz, em profundidades de 0,5 e
1,0 mm, incubando-as em meio de cultura. Os resultados mostraram maior ação do
NaOCl, seguido pelo EDTA e CHX, com resultados semelhantes. Os autores
concluíram que, embora o NaOCl seja capaz de eliminar bactérias dentro dos
túbulos dentinários, maiores tempos de exposição à solução irrigadora são
necessários para a desinfecção completa do canal radicular.
Spanó et al. (2001) realizaram um estudo avaliando o efeito de 4
concentrações de NaOCl (0,5; 1,0; 2,5; e 5,0%) em tecido pulpar bovino. Níveis de
cloro residual, pH e tensão superficial, antes e depois da dissolução, foram
estudados in vitro. Um fragmento de polpa bovino foi submerso em NaOCl que
circulou em um aparelho com uma bomba peristáltica e seringa Luer Lock. Quanto
maior a concentração de NaOCl mais rápida será a dissolução da celulose do tecido
pulpar. Todas as concentrações de NaOCl reduziram o pH e a tensão superficial,
sendo que as concentrações mais elevadas necessitaram de menor consumo
durante a dissolução do tecido. Assim, este estudo indicou que o cloro residual era
diretamente proporcional à concentração no processo de dissolução de celulose e
tecidos e que não havia cloro residual em todas as concentrações utilizadas.
28
Çalt e Serper (2002) avaliaram seis dentes unirradiculares
endodonticamente instrumentados, os quais tiveram, posteriormente, o terço cervical
e médio foram cortados e desprezados. A porção referente ao terço médio foi
cortada longitudinalmente em dois segmentos iguais. Utilizaram-se 10 mL de EDTA
17% para irrigação das metades pertencentes à mesma raiz, durante 1 e 10 min,
respectivamente. Todos os dentes tiveram irrigação final com 10 mL de NaOCl 5%.
Os resultados evidenciaram que com apenas 1 min de ação, a solução de EDTA
mostrou-se eficiente na remoção da smear layer. Entretanto, a aplicação da solução
de EDTA durante 10 min, causou erosão excessiva da dentina peritubular e
intertubular. Os pesquisadores sugeriram que este procedimento não deveria ser
prolongado por mais de um min durante a terapêutica endodôntica.
Guerisoli et al. (2002) avaliaram a capacidade de diferentes soluções
irrigadoras, quando energizadas pelo ultrassom, na remoção da smear layer. Os
autores realizaram o preparo biomecânico em 03 grupos, utilizando como soluções
irrigadoras a água destilada, o NaOCl e esta solução associada ao EDTAC a 15%.
No grupo 04, os canais foram apenas irrigados com NaOCl e EDTAC. Foi utilizado
lima K #15, energizada pelo ultrassom, em todos os espécimes, com movimentos de
limagem de pequena amplitude. Os dentes foram cisalhados e observados por meio
de MEV, onde foi constatada a permanência da smear layer nos canais irrigados
com água destilada ou NaOCl e a remoção desta nos canais onde houve a
associação com EDTAC. Os autores concluíram que o uso de NaOCl associado ao
EDTAC, sob agitação ultrassônica, é capaz de remover a smear layer, enquanto que
as outras soluções testadas deixam mais resíduos aderidos às paredes do canal
radicular.
Menezes et al. (2003) avaliaram a limpeza de canais radiculares
instrumentados e irrigados com NaOCl a 2,5%, clorexidina a 2,0% e soro fisiológico.
A associação dessas soluções com o EDTA também foi estudada. Para tanto,
cinquenta dentes unirradiculares humanos foram instrumentados com as soluções
testadas e clivados no sentido de seu longo eixo para observação por meio de MEV.
Exceto para o grupo em que a CHX foi utilizada durante a instrumentação, a
irrigação com EDTA diminuiu significantemente a quantidade da smear layer
observada. Os autores concluíram que se faz necessária à utilização do EDTA a fim
de promover melhor limpeza das paredes dos canais radiculares.
29
Scelza et al. (2003) estudaram a capacidade de remoção da smear layer
após o uso de diferentes soluções irrigantes variando-se o tempo de irrigação.
Noventa dentes caninos foram distribuídos em 09 grupos, conforme a solução
empregada na irrigação final. Utilizaram-se 20 mL das soluções de EDTA-T, EDTA
17% e ácido cítrico 10% no período de 3, 10 e 15 min. Após os tratamentos os
espécimes foram analisados por meio de MEV. Os resultados apontaram que o
ácido cítrico 10% por 3 min foi significantemente melhor que nos tempos de 10 e 15
min de irrigação. No grupo do EDTA 17% a irrigação por 3 min também foi mais
eficiente que a de 15 min, apresentando maior quantidade de canalículos abertos.
Não houve diferença significante entre os 3 períodos no grupo do EDTA-T. Os
pesquisadores concluíram que as soluções avaliadas foram eficientes em curto
intervalo de tempo não melhorando o efeito com o aumento do tempo.
Torabinejad et al. (2003) avaliaram, por meio da MEV, a capacidade de
limpeza do MTAD®, uma substância composta de isômero de tetraciclina, ácido e
detergente, como um irrigante final na superfície dos canais radiculares. Quarenta e
oito dentes humanos unirradiculares receberam, após a biomecânica, 5 mL de uma
das seguintes soluções: água destilada, NaOCl 5,25%, EDTA 17% e MTAD®. A
quantidade de smear layer, assim como o grau de erosão sobre a superfície dos três
terços do canal radicular foi avaliado. Os resultados mostraram que MTAD® foi
eficiente na remoção da smear layer, não alterando a estrutura dos túbulos
dentinários.
Perez et al. (2005) avaliaram a eficiência do EDTA a 8% na remoção da
smear layer do canal radicular observando as paredes dentinárias por meio de MEV.
A análise das fotomicrografias revelou paredes limpas e túbulos dentinários abertos
nos grupos onde foram utilizadas soluções quelantes. O EDTA a 8%, utilizado por 1
min no interior do canal radicular, foi capaz de remover a smear layer; enquanto a
utilização por 3 min mostrou ação semelhante ao EDTA a 15% usado por 1 min. Os
autores concluíram que a utilização do EDTA a 8% por 1 min pode limpar as
paredes do canal radicular com menor erosão dentinária.
Marques et al. (2006) avaliaram a capacidade de remoção da smear layer
e de íons cálcio da dentina radicular após irrigação com três soluções quelantes.
Dezesseis dentes caninos foram instrumentados e a cada troca de lima utilizou-se 1
mL de solução quelante conforme os grupos: G1- EDTAC 17%; GII- CDTA 17%;
30
GIII- EGTA 17%. Ao final do preparo biomecânico foram coletados 8 mL de cada
solução, os quais foram levados ao espectrofotômetro de absorção atômica para
análise da quantidade de íons cálcio presentes. As raízes foram seccionadas
longitudinalmente e preparadas para avaliação em MEV. Os resultados mostraram
que o EDTAC e CDTA removeram a smear layer e íons cálcio da dentina de forma
mais eficiente que a solução de EGTA. Em relação à limpeza entre os terços, não
houve diferença entre eles.
Pérez-Heredia et al. (2006) avaliaram, por meio de MEV, a capacidade de
limpeza de 3 soluções irrigantes ácidas após a instrumentação rotatória e manual.
Oitenta dentes humanos foram distribuídos aleatoriamente em 08 grupos. Quatro
grupos foram preparados com instrumentação manual e os outros quatro com
rotatória. As soluções irrigantes utilizadas foram: ácido cítrico 15% e NaOCl 2,5%;
EDTA 15% e NaOCl 2,5%; ácido ortofosfórico e NaOCl 2,5%; e NaOCl 2,5%
(controle). As soluções ácidas associadas com o NaOCl 2,5% foram eficientes na
eliminação da smear layer e debris não havendo diferença significante na remoção
de smear layer entre as técnicas. O NaOCl 2,5% não foi capaz de promover a
limpeza.
Baumgartner et al. (2007) comparando a eficiência antimicrobiana do
protocolo de irrigação, utilizando NaOCl a 1,3% associado ao MTAD® versus
irrigação com NaOCl a 5,25% associado à EDTA a 17%, constataram que a
irrigação alternada com NaOCl e EDTA era capaz de produzir canais radiculares
livres de unidades formadoras de colônia, enquanto a associação entre NaOCl e
MTAD® não conseguia produzir canais assépticos em cerca de 50% das amostras
testadas. Desta forma, concluíram que a irrigação alternada utilizando NaOCl e
EDTA é mais eficiente na descontaminação de canais radiculares.
Naaman et al. (2007) realizaram estudo in vitro avaliando a eficiência da
capacidade de eliminação da smear layer e de debris da solução de NaOCl a 5,25%,
isolado e associado ao ácido cítrico e ao EDTA e associados ao ultrassom, após a
remoção do hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) do canal radicular. Os autores concluíram
que a utilização do ácido cítrico é eficiente na remoção dos debris e da smear layer
das paredes do canal, sendo menos eficiente do que o EDTA. Eles concluíram que a
aplicação de Ca(OH)2 dificulta a remoção dos debris e da smear layer.
31
Carvalho et al. (2008) avaliaram, por meio da MEV, a capacidade de
limpeza de diferentes soluções utilizadas para irrigação. Trinta e dois dentes
unirradiculares foram distribuídos em 04 grupos de acordo com a solução irrigante
empregada na biomecânica: G1- NaOCl 2,5%+EDTA 17%; G2- CHX em gel
2%+EDTA 17%; G3- Canal Plus (associação de EDTA com peróxido de
hidrogênio)+NaOCl 2,5%; G4- soro+EDTA 17%. Os resultados mostraram grande
quantidade de túbulos dentinários abertos no G1 e G3. Em todos os grupos, a
limpeza obtida no terço cervical foi melhor que a dos terços apical e médio, com
diferença estatística significante no grupo da clorexidina.
Khedmat e Shokouhinejad (2008) compararam, por meio da MEV, a
eficácia do Smear Clear na remoção da smear layer. Quarenta e nove dentes
unirradiculares foram preparados com instrumentos rotatórios de níquel titânio Mtwo.
Os dentes foram distribuídos em 04 grupos de acordo com o protocolo de irrigação
final por 1 min: G1– NaOCl 5,25% (controle); G2– Smear Clear; G3– EDTA 17%;
G4– ácido cítrico 10%. Os resultados mostraram que as soluções avaliadas
limparam o canal radicular de forma semelhante entre si. Em relação aos terços, não
houve diferença significante nos grupos do EDTA 17% e Smear Clear. Entretanto, o
ácido cítrico 10% limpou os terços cervical e médio de forma mais eficaz que o
apical. Os autores concluíram que as soluções não foram totalmente eficientes na
remoção da smear layer, especialmente no terço apical. A adição de um surfactante
ao EDTA não resultou em maior eficácia desta substância.
Spanó et al. (2009) avaliaram a capacidade de remoção da smear layer
promovida pela ação de agentes quelantes e desmineralizantes e quantificaram a
concentração de íons cálcio presentes nas soluções após a utilização. Quarenta e
dois incisivos centrais superiores foram instrumentados e a cada troca de
instrumento os espécimes receberam 2 mL de NaOCl 1%. Posteriormente, os dentes
foram distribuídos em 07 grupos, conforme a irrigação final estabelecida: G1-EDTA
15%; G2- ácido cítrico 10%; G3- citrato de sódio 10%; G4- vinagre de maçã; G5-
ácido acético 5%; G6- ácido málico 5%; G7- sem irrigação final (controle). Durante a
irrigação, as soluções foram simultaneamente coletas, após o extravasamento
apical, e encaminhadas à análise espectrométrica. Os autores verificaram que o
EDTA 15% e o ácido cítrico 10% removeram smear layer de forma semelhante entre
si. As demais soluções não foram eficientes para esta finalidade. A maior quantidade
32
de íons cálcio removidos foi observada no grupo do EDTA 15%, seguido do ácido
cítrico 10%. O citrato de sódio 10% apresentou as menores quantidades do íon.
Şen et al. (2009) verificaram, por meio de MEV, a capacidade de limpeza
e a erosão decorrente do uso do EDTA em diferentes concentrações na superfície
da dentina radicular. Quarenta dentes unirradiculares foram preparados pela técnica
Step Back e irrigados com NaOCl 2,5% a cada troca de instrumento. Os espécimes
foram distribuídos em 04 grupos de acordo com a solução quelante utilizada como
irrigação final: G1- EDTA 15 %; G2- EDTA 10%; G3- EDTA 5%; G4-EDTA 1%.
Utilizaram-se 5 mL de cada concentração de EDTA por 1 min. Os resultados
mostraram que todas as soluções limparam, de forma estatisticamente semelhante,
as paredes do canal radicular. O terço cervical mostrou-se com menor quantidade
de smear layer que o apical. As soluções de EDTA 15, 10 e 5 % apresentaram
erosões similares entre si, não havendo diferença entre os terços da raiz. Os autores
concluíram que o EDTA em pequena concentração pode ser recomendado
clinicamente, uma vez que impede a erosão excessiva da parede dentinária.
Mello et al. (2010) compararam, por meio da MEV, a capacidade de
remoção da smear layer após utilização de duas técnicas de irrigação com EDTA
17%. Sessenta dentes humanos unirradiculares foram instrumentados e distribuídos
conforme o protocolo de irrigação: G1– irrigação contínua com 5 mL EDTA 17%, por
3 min; G2– irrigação inicial de 1 mL de EDTA 17% por 6 s, seguida da inundação do
canal com EDTA 17%, por 2 min e meio, mais irrigação final com 4 mL da mesma
solução, por 24 segundos. Os autores verificaram que o grupo com irrigação
contínua apresentou maior superfície livre de smear layer quando comparado ao
outro grupo. Conclui-se que a irrigação contínua de 5 mL de EDTA 17% por 3 min
pode remover de forma eficiente a smear layer.
Zou et al. (2010) avaliaram trinta dentes superiores anteriores humanos,
instrumentados com o sistema ProTaper, seccionados e removidos seus terços
coronários e apicais. Os blocos preparados foram tratados com NaOCl a 1%, 2%,
4% e 6% por 2, 5 e 20 min, em temperaturas de 20°C, 37°C e 45°C
respectivamente. Os resultados foram medidos pela mancha de clareamento
formada através de microscópio de luz com aumentos de 20 e 40 vezes. Os autores
concluíram que a concentração, o tempo e a temperatura têm influência sobre a
33
capacidade da penetração do NaOCl na dentina, sendo que a temperatura é o fator
que afeta menos esta capacidade.
Baca et al. (2011) avaliaram a atividade antimicrobiana residual e a
capacidade de erradicar o E. faecalis de diferentes soluções irrigadoras, sozinhas ou
em combinação, num teste volumétrico de dentina humana. As soluções de NaOCl a
2,5%, CHX a 2%, cetrimida a 0,2% (CTR), EDTA a 17%, ácido maleico a 7% (MA), e
os regimes de associações do NaOCl a 2,5%, seguido por 17% de EDTA ou MA 7%,
CTR 0,2% ou CHX 2%, foram selecionados. Para determinar a atividade residual
dos regimes de irrigação propostos, foi criado biofilme de E. faecalis sobre os blocos
de dentina após 24 h de incubação a 37°C. Os resultados da atividade residual
antimicrobiana dos regimes-teste foram expressos como a taxa de inibição da
formação e eliminação do biofilme, respectivamente. CHX 2% e CTR 0,2%
apresentaram 100% de inibição do biofilme; NaOCl a 2,5% apresentou a menor
atividade residual (18,10%). A percentagem de morte bacteriana do NaOCl a 2,5% e
CTR a 0,2% foi 100% seguida por MA a 7% e CHX a 2%, enquanto que 17% EDTA
foi o menos eficaz (44%). MA 7% ou EDTA 17% seguido de CTR a 2% ou CHX a 2%
apresentaram atividade residual e antimicrobiana de 100%. Os resultados
mostraram que a solução CTR 0,2% e as combinações em que CTR 0,2% ou CHX
2% foram as soluções finais de irrigação que promoveram atividade residual
antimicrobiana máximas.
Giardino et al. (2014) compararam o poder antibacteriano de NaOCl a 1%
com ácido acético a 1%, NaOCl a 5,25% e dois NaOCl comercialmente disponíveis,
modificados com surfactantes em dentina de raiz bovina. Um total de 120 tubos de
dentina preparados a partir de incisivos bovinos intactos foram infectados durante 21
dias com E. faecalis e distribuídos aleatoriamente em 06 grupos: NaOCl a 5,25%;
Hypoclean; Chlor-Xtra; NaOCl a 1% com ácido acético a 1%; Dentina infectada
(controle positivo); e dentina estéril (controle negativo). Em tempos experimentais de
0, 7, 14, 21 e 28 dias, as microplaquetas de dentina foram colhidas utilizando brocas
redondas sequenciais com diâmetros crescentes em tubos de ensaio separados
contendo 3 mL de BHI recentemente preparado. A análise estatística foi realizada
por meio de métodos paramétricos (ANOVA unidirecional e teste de comparações
múltiplas de Bonferroni, α = 0,01). Após a cultura, o número de unidades formadoras
de colônias (UFC) foi mensurado. Todas as soluções de NaOCl apresentaram um
34
número pequeno de UFC ao longo de 28 dias. ChlorXtra e Hypoclean apresentaram
o menor número de UFC em todos os momentos com maior eficácia antimicrobiana
do que NaOCl a 5,25% e solução de NaOCl a 1% com ácido acético a 1%.
Chaitanya et al. (2016) examinaram a eficácia antibacteriana de Morinda
Citrifolia e extrato de cúrcuma com NaOCl a 3% como irrigante do canal radicular,
contra E. faecalis e S. aureus. A eficácia antimicrobiana foi avaliada in vitro
utilizando o método de difusão em ágar. As placas de ágar foram preparadas
utilizando BHI. As culturas de E. faecalis e S. aureus foram cultivadas a 37°C,
incubadas durante 24 h e as zonas de inibição microbiana foram registadas. NaOCl
a 3% apresentou zonas de inibição maiores comparados aos grupos experimentais
contra ambos os microrganismos. NaOCl a 3% mostrou atividade máxima
antibacteriana contra E. faecalis, seguido por Morinda citrifolia e extratos de
cúrcuma. Considerando o potencial para propriedades indesejáveis de NaOCl, uso
de plantas medicinais alternativas em endodontia pode revelar-se vantajoso.
Morago et al. (2016) avaliaram a influência do smear layer sobre a
atividade antimicrobiana da solução de NaOCl a 2,5% / 9% de ácido etidrônico
(HEBP) contra bactérias nos túbulos da dentina. Os túbulos dentinários foram
infectados com E. faecalis por centrifugação. Após 5 dias de incubação, o smear
layer se formou em metade das amostras, as quais foram então tratadas com NaOCl
a 2,5%, sozinho ou combinado com HEBP a 9%, durante 3 min. A porcentagem de
células mortas em túbulos dentinários infectados foi medida utilizando microscopia
confocal de varrimento a laser e a técnica viva/morta. A smear layer também foi
observada por microscopia eletrônica de varredura. Na ausência de smear layer,
NaOCl a 2,5% sozinho e combinado com 9% de HEBP apresentaram uma atividade
antimicrobiana elevada sem diferenças significativas entre os dois. A smear layer
reduziu significativamente a atividade antimicrobiana de NaOCl a 2,5%, ao passo
que a solução com HEBP não foi infectada. Não foram obtidos túbulos dentinários
livres de smear layer no grupo NaOCl a 2,5%. No caso de NaOCl/HEBP,
95,40%±3,63% dos túbulos dentinários foram limpos. A combinação de
NaOCl/HEBP exerceu atividade antimicrobiana que não foi reduzida pela smear
layer.
35
Zand et al. (2016) compararam a eficácia antibacteriana do gel de NaOCl
a 2,5% e das soluções de NaOCl a 5,25% e 2,5%, em biofilme de E. faecalis. Os
canais radiculares de sessenta dentes unirradiculares extraídos de humanos foram
contaminados com E. faecalis e incubados durante 6 semanas. As amostras foram
distribuídas aleatoriamente em 03 grupos experimentais e 01 grupo de controle. O
protocolo do estudo, nos grupos experimentais, consiste de injeção de 5 mL de cada
irrigante em canais radiculares. As amostras foram recolhidas a partir das paredes
do canal radicular e 1:10 diluições em série foram preparadas e adicionadas a
placas de ágar Muller Hinton (MHA) e incubou-se a 37° C durante 48 h. Foi utilizada
a técnica clássica de contagem de colônias para determinar as contagens
bacterianas vitais de E. faecalis em placas de MHA. O efeito antimicrobiano das
soluções irrigantes nos 03 grupos experimentais foi significativamente maior do que
o grupo de controle, sem diferença significativa entre as soluções de NaOCl a 2,5%
e 5%. O efeito das soluções de NaOCl foi significativamente superior comparado ao
do gel de NaOCl a 2,5%. Com as limitações deste estudo, o gel de NaOCl a 2,5% foi
eficaz na redução da contagem de E. faecalis; contudo este efeito foi inferior ao das
soluções de NaOCl.
2.2 Propriedades da Quitosana
Elsaka e Elnaqhy (2012) tiveram como objetivo investigar a atividade
antibacteriana do Ca(OH)2 combinado com soluções de quitosana na dentina do
canal radicular infectado com E. faecalis e o efeito deste novo medicamento
intracanal sobre a resistência adesiva do selante RealSeal à dentina radicular.
Preparou-se um medicamento intracanal experimental misturando diferentes
concentrações de solução de quitosana (25%, 50% e 100%) a pó de Ca(OH)2. A
atividade antibacteriana foi avaliada e o número total de unidades formadoras de
colônias foi determinado. A capacidade de ligação do selante RealSeal à dentina
radicular foi avaliada utilizando o teste de força de tração. Os dados foram
analisados utilizando a análise de variância unidirecional (ANOVA) e os testes de
comparação múltipla de Tukey. O Ca(OH)2 combinado com diferentes
concentrações de soluções de quitosana apresentou melhor atividade antibacteriana
do que Ca(OH)2 misturado com solução salina, sem afetar significativamente a
resistência adesiva do selante RealSeal à dentina radicular. Os resultados sugerem
36
que Ca(OH)2 combinado com quitosana é medicamento intracanal promissor e pode
ser eficaz na terapia endodôntica.
Silva et al. (2012) avaliaram os efeitos da quitosana, em diferentes
concentrações, na remoção da smear layer e na estrutura da dentina, após 3 e 5 min
de aplicação. Doze dentes caninos superiores, recém extraídos, foram
instrumentados pela técnica crown-down e irrigados com hipoclorito de sódio 1%. Os
espécimes foram distribuídos em seis grupos conforme o tempo e a concentração da
solução irrigante final: G1: quitosana 0,1% por 3 min; G2: quitosana 0,2% por 3 min;
G3: quitosana 0,37% por 3 min; G4: quitosana 0,1% por 5 min; G5: quitosana 0,2%
por 5 min; G6: quitosana 0,37% por 5 min. Todas as amostras foram preparadas
para avaliação em MEV. Os resultados mostraram que o G1 apresentou remoção da
smear layer, mas não da smear plug. O G2 mostrou túbulos visíveis e abertos com
ligeira erosão da dentina peritubular. A limpeza no G3 foi semelhante à do G2, no
entanto, o efeito erosivo foi maior. No G4 houve ampliação do diâmetro dos túbulos
e no G5 e G6, severa erosão com deterioração da superfície dentinária. De acordo
com a metodologia aplicada pode-se concluir que a quitosana 0,2% por 3 min foi
eficiente na remoção da smear layer, ocasionando pequena erosão.
Silva et al. (2013) avaliaram por meio de espectrofotometria (AASF) e
MEV, a eficácia da remoção da smear layer utilizando quitosana comparado a
diferentes agentes quelantes. Foram utilizados vinte e cinco canais radiculares de
caninos, preparadas pela técnica crown-down e irrigados com NaOCl a 1%. Os
dentes foram distribuídos aleatoriamente em 05 grupos, de acordo com o tipo de
irrigação final: EDTA 15%, quitosana 0,2%, ácido cítrico 10%, ácido acético 1% e de
controle (sem irrigação final). O volume total de cada solução quelante foi recolhido
a partir dos canais e analisadas por AASF para quantificação de íons de cálcio das
soluções. Em seguida, as raízes foram seccionadas longitudinalmente e examinadas
por MEV para avaliação da remoção da smear layer nos terços, médio e apical.
EDTA 15%, quitosana 0,2% e ácido cítrico 10%, apresentaram capacidade de
remoção de smear layer semelhante com diferença significativa comparado ao ácido
acético a 1% e o grupo de controle. Não houve diferença significativa entre a smear
layer remanescente nos terços médio e apical. A concentração de íons cálcio mais
elevada foi observada com EDTA 15% (121,80 ± 5,13) e quitosana 0,2% (104,13 ±
19,23), sem diferença significativa. A concentração de íons de cálcio mais baixa foi
37
obtida com ácido acético a 1% (25,62 ± 7,68), enquanto que o ácido cítrico a 10%
(70,38 ± 11,15) obteve resultados intermédios, diferindo significativamente das
outras soluções. Se conclui que o EDTA 15%, quitosana 0,2% e ácido cítrico a 10%
removeram efetivamente a smear layer dos terços médio e apical do canal. O EDTA
15% e a quitosana 0,2%, foram associados com o maior efeito sobre a
desmineralização da dentina da raiz, seguido de ácido cítrico a 10% e ácido acético
a 1%.
Grover e Shetty (2014) avaliaram a liberação de íons cálcio e mediram a
variação do pH do ambiente que ocorreu quando o Ca(OH)2 foi combinado com
diferentes veículos (água destilada, propilenoglicol, Ca(OH)2, contendo guta-percha e
quitosana) em diferentes períodos de tempo. Foram utilizados quarenta dentes pré-
molares inferiores com raiz foram escolhidos para este estudo. O comprimento de
trabalho foi estabelecido e os canais radiculares foram ampliados e a irrigação foi
realizada com 2 ml de solução de NaOCl após cada estocagem. Os dentes foram
então divididos aleatoriamente em 04 grupos. Os canais foram então embalados
com diferentes preparações de Ca(OH)2 utilizando os seguintes veículos: água
destilada, propilenoglicol, pontos de guta-percha e quitosana. A libertação de íons de
cálcio em diferentes grupos foi analisada utilizando um espectrofotômetro ultravioleta
a 220 nm. A alteração no pH foi determinada usando medidor de pH. Os resultados
foram estatisticamente avaliados utilizando um teste ANOVA de sentido único. Para
liberação de íons cálcio, o grupo 2 apresentou liberação cumulativa de fármaco de
81,97% ao final de 15 dias, enquanto que os grupos 1, 3 e 4 apresentaram liberação
de 99,53, 17,98, 74,93%, respectivamente, com diferença significativa entre todos os
grupos. O grupo 1 atingiu o maior nível de Ca+2 (39,79%) ao final de 1 dia, mas
apresentou liberação quase completa de Ca(OH)2 ao final de 15 dias. O grupo 3
apresentou menor liberação de íons cálcio (17,98%) aos 15 dias. O grupo 4 mostrou
liberação prolongada de íons Ca+2 de 74% aos 15 dias para 95% no final dos 30
dias. Após a primeira hora; o grupo 1 apresentou o nível de pH mais alto (11,8). No
entanto, o pH foi reduzido para 7,8 no final de 30 dias neste grupo. O grupo 2
apresentou o valor de pH mais alto (10,35), seguido do grupo 4 (10,32), após 30
dias. A quitosana pode ser utilizada como veículo promissor para o Ca(OH)2 manter
pH alcalino e permitir a libertação sustentada de íons cálcio no sistema de canais
radiculares.
38
Del Carpio-Perochena et al. (2015) estudaram a capacidade da
nanopartícula de quitosana (CNPs) na remoção da smear layer e inibição da
recolonização bacteriana sobre a dentina. Foram usadas cem secções de dentina
bovina distribuídas em cinco grupos. As soluções irrigantes utilizadas foram NaOCl
2,5% durante 20 min, EDTA 17% durante 3 min e 1,29 mg/mL de CNPs durante 3
min. As amostras foram irrigadas com água destilada (controle), NaOCl,
NaOCl+EDTA, NaOCl+EDTA+CNPs e NaOCl+CNPs. Após o tratamento, metade da
amostra foi utilizada para avaliar o efeito quelante das soluções usando MEV,
enquanto a outra metade foi infectada intraoralmente para examinar a capacidade
de formação de biofilme bacteriano pós-tratamento. O volume e viabilidade celular
dos biofilmes foi analisado sob Microscopia Confocal. A smear layer foi
significativamente reduzida em todos os grupos, exceto o grupo NaOCl e controle.
CNPs apresentou resistência à formação de biofilme significativamente superior
comparado aos outros grupos de tratamento. CNPs pode ser usado como um
irrigante final durante o tratamento do canal radicular com a dupla vantagem de
remover a smear layer e inibir a recolonização bacteriana sobre a dentina da raiz.
Geethapriya et al. (2016) avaliaram a eficácia da quitosana e quitosana-
EDTA (3:1, 1:1, 1:3) em comparação com NaOCl 5,2% na desinfecção de biofilme
em E. faecalis na dentina do canal radicular e na remoção da smear layer com
erosão mínima. Foram selecionados neste estudo, setenta pré-molares inferiores
unirradiculares extraídos. Quarenta amostras de dentes foram biomecanicamente
preparados, cortados verticalmente, e esterilizados em autoclave. As seções de
dentes foram artificialmente infectadas com E. faecalis (ATCC 29212 e isolado
clínico [SBEF2]) para formar biofilme dentinária madura in vitro. As amostras de
dentes foram tratadas com as soluções de ensaio: quitosana e quitosana-EDTA (3:1,
1:1, 1:3), e o tempo de morte bacteriana foi determinado. A capacidade de remoção
de smear layer das soluções de teste (grupo A: quitosana-EDTA [1: 1]; grupo B:
EDTA; grupo C: controle) foi avaliada. A quitosana e quitosana-EDTA (3:1, 1:1, 1:3)
exibiu atividade antibacteriana contra ambas as estirpes de E. faecalis. A quitosana
e quitosana-EDTA causaram redução de log 3 na contagem viável das células
sésseis de E. faecalis em 15 min, enquanto o NaOCl 5,2% exibiram inibição 99,98%
em 15 min. A quitosana-EDTA (1:1) foi eficaz na remoção da smear layer e mostrou
menor erosão comparada ao EDTA nas porções coronais e médias. Quitosana-
39
EDTA (1:1) é um potencial irrigante para o canal radicular que executa um duplo
papel - desinfecção do canal e remoção de smear layer.
Shenoi et al. (2016) compararam a eficácia antimicrobiana dos irrigantes
BioPure MTAD, quitosana 0,2%, quitosana 1%, CHX 2% e NaOCl 3% contra E.
faecalis, frequentemente isolado de infecções persistentes do canal radicular. O
método de difusão de ágar-ágar foi utilizado para medir as atividades
antimicrobianas destes irrigantes. Soro fisiológico foi utilizado como controle
negativo. A ordem de eficácia foi determinada pela medição de zonas de inibição.
BioPure MTAD apresentou zona de inibição média significativamente maior contra E.
faecalis do que os outros irrigantes. Embora quitosana 0,2% não apresentasse
quaisquer zonas de inibição, quitosana 1% apresentou eficácia semelhante ao
NaOCl a 3%, e ambos os irrigantes apresentaram eficácia significativamente maior
do que CHX a 2%. Assim, quitosana 1% pode ser substituto antimicrobiano natural
eficaz para irrigantes sintéticos.
Freire et al. (2016) avaliaram a atividade antimicrobiana e citotoxicidade
da quitosana coloidal - nanopartículas de prata - nanocompósitos de flúor
(CChAgNpFNc), com diferentes formas e tamanhos de nanopartículas de prata. As
sínteses de CChAgNpFNc foram realizadas com nitrato de prata adicionado a
solução de quitosana, solução de boro-hidreto de sódio e fluoreto de sódio sólido.
Solução de ácido ascórbico foi adicionada para sintetizar nanopartículas de prata
maiores. CChAgNpFNc obtido: S1- 100% esférica, 8,7 ± 3.1nm; S2- esférica 97%,
15.0 ± 2.5% e 7.9nm triangular, 22,2 ± 9.5nm; S3- 77,3% esférico, 31,8 ± 10.4nm,
15,9% triangular, 27,1 ± 10.1nm e 6,8% elíptica, 33,2 ± 7.8nm; S4- e 75,2% esférica,
43,2 ± 14.3nm; 23,3% triangular 38,2 ± 14.8nm, e 1,5% elípticas 38,4 ± 11.6nm.
CChAgNpFNc mostrou atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, E. faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. A
influência sobre o crescimento de microrganismos foi avaliada usando ensaio de
fluorescência, demonstrando aumento da fase retardamento e diminuição da fase
log bacteriana. A citotoxicidade foi investigada usando ensaios de Artemia salina e
MTT. As amostras S3 e S4 apresentaram baixa citotoxicidade. As amostras S1 e S2
inibiu macrófagos e revelou dose letal acima de concentrações de 1000 mg/mL, que
foram classificados como moderadamente tóxico. Assim, CChAgNpFNc são
40
potenciais opções para o controle de microrganismos resistente a múltiplos fármacos
e não representam riscos substanciais para a saúde humana.
42
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Indicador Biológico
No presente estudo foi utilizado o microrganismo obtido da American
Type Culture Collection, E. faecalis (ATCC 29212). A cepa foi inoculada em 7 mL de
BHI (BHI; Difco Laboratories, Detroit, EUA) e incubada a 37°C por 24 h. O
microrganismo foi cultivado na superfície do Brain Heart Infusion Agar (BHIA; Difco
Laboratories, Detroit, EUA) sob as mesmas condições da incubação. Células
microbianas foram suspensas em solução fisiológica para dar concentração final de
cerca de 3 X 108 células/mL, semelhante ao tubo no 1 da escala MacFarland.
3.2 Materiais
Foram utilizados quarenta dentes incisivos inferiores bovinos obtidos
através da empresa Mondelli por meio da Faculdade de Odontologia de Bauru -USP
de acordo com Anexo I. As coroas foram removidas, com disco diamantado
(American Burrs, São Paulo, Brasil) em peça reta com baixa rotação, num ângulo de
90º com o longo eixo do dente. Os comprimentos radiculares foram padronizados
em 16 mm e os canais radiculares esvaziados até o zero apical com instrumento K-
Flex #15 (Maillefer, Ballaigues, Suíça), com irrigação convencional com 3 mL de
NaOCl 2,5% (Longevitá, Goiânia, Brasil) recém-preparada. A seguir, os canais
radiculares foram secos com pontas de papel esterilizadas (Tanari, Tanariman
Indústria Ltda., Manacaru, Brasil) nº 45 e preenchidos com EDTA 17% (pH 7.2 –
Biodinâmica, Ibiporã, Brasil) por 5 min para remoção da smear layer e secos
novamente de acordo com o método descrito anteriormente. Todos os espécimes
foram colocados individualmente em tubos de polipropileno do tipo Eppendorf com
capacidade de 1,5 mL (Cral, São Paulo, Brasil) contendo BHI e autoclavados por 30
min a 120˚C.
Em todos os grupos experimentais foi realizada coleta inicial (antes dos
procedimentos endodônticos) para checar a viabilidade bacteriana de cada amostra.
A coleta foi realizada de forma idêntica a descritas anteriormente para os controles
positivo e negativo.
3.3 Preparo das soluções
As soluções testadas neste experimento foram o NaOCl a 2,5%
(Longevitá, Goiânia, Brasil), EDTA 17% (Longevitá, Goiânia, Brasil) e quitosana
43
0,2% (Longevitá, Goiânia, Brasil).
3.4 Desenho Experimental
Cinco mililitros de BHI foram misturados a 5 mL do inóculo bacteriano, e
os grupos experimentais foram inoculados durante 60 dias empregando-se seringas
esterilizadas com volume suficiente para preencher o canal radicular. Este
procedimento foi repetido a cada 72 h, sempre utilizando cultura pura com 24 h. As
raízes foram mantidas em meio úmido a 37˚C. Cinco espécimes não contaminados
formaram o grupo controle negativo. Foram incubados a 37ºC durante o período de
contaminação, para testar a esterilidade das amostras, enquanto 05 espécimes
contaminados serviram como controle positivo. Os espécimes foram aleatoriamente
distribuídos em 08 grupos experimentais (n=05) (Tabela 1).
Após o período de contaminação, foi realizada coleta em todos
espécimes. Os canais radiculares foram preenchidos com água destilada
esterilizada e pontas de papel esterilizadas nº 45 foram introduzidas no canal
radicular e mantidas por 1 min. Foram realizadas três coletas de cada espécime e as
pontas foram imersas em 7 mL de Letheen Broth (BHI, Difco Laboratories, Detroit,
EUA), e meio acrescido de neutralizantes [Lecitina, Tween 80 e Tiossulfato de sódio
(P.A., Art Laboratories, Campinas, Brasil), seguido de incubação a 37˚C por 48 h. A
coleta foi realizada com o objetivo de confirmar a presença ou ausência bacteriana
pela turvação do meio de cultura.
Tabela1. Distribuição dos Grupos de acordo com as soluções experimentais:
Grupos Soluções Experimentais Concentração de Diluição
C-*
C+**
G1
Controle Negativo
Controle Positivo
Solução de H20 destilada
G2 NaOCl 2,5%
G3 EDTA 17%
G4 Quitosana 0,2%
G5 NaOCl + Quitosana 2,5% + 0,2%
G6 NaOCl + EDTA 2,5% + 17%
* C- (Controle negativo): Amostra sem contaminação. **C+ (Controle positivo): Amostra contaminada sem utilização de material experimental.
44
3.5 Modelo Experimental
A avaliação da eficácia antimicrobiana das soluções experimentais foi
realizada com o emprego de dispositivo formado por bomba peristáltica (Sarlo 90,
São Paulo, Brasil) ligada a uma mangueira plástica esterilizada adaptada a um tubo
do tipo Eppendorf, conectado ao dente através da entrada dos canais radiculares
(ESTRELA et al., 2007). A entrada deste aparato foi o tubo plástico conectado ao
tubo do tipo Eppendorf e a saída correspondeu ao ápice dos canais radiculares (Fig.
1a–c). As soluções irrigantes circularam pelo aparato em fluxo constante durante 10
min sob uma pressão de 50 mL/min-1.
45
Figura 1 Vista geral do aparato empregado na avaliação do efeito antimicrobiano das soluções
irrigadoras. (a) Elemento dental acoplado em tubo tipo Eppendorf; (b) Sistema de irrigação com
bomba peristáltica; (c) solução irrigadora circulando em fluxo constante de 50 mL min-1 por 10 min.
46
Após o intervalo de 10 min, cada dente foi removido do aparato sob
condições assépticas e, realizada irrigação com 5 mL de água destilada esterilizada.
Foi feita a coleta, conforme descrito anteriormente, seguida de incubação a 37˚C por
48 h. Após a avaliação do meio de cultura, um inoculo de 0,1 mL foi transferido para
7mL de BHI, subsequentemente, incubado sob as mesmas condições. Após 48 h, foi
realizada a avaliação visual da presença ou ausência de turbidez pelo meio de
cultura.
3.6 Preparo para análise no microscópio eletrônico de varredura
A determinação qualitativa da contaminação dos blocos de dentina foi
realizada utilizando MEV. Após o experimento foi feito um sulco longitudinalmente ao
longo eixo sentido cérvico-apical com disco diamantado para exposição de toda a
extensão do canal radicular, sem penetrar no canal radicular. Para a exposição de
toda a extensão do canal radicular, o seccionamento foi feito com um cinzel e um
martelo. Após separação longitudinal, os fragmentos ficaram com 2 metades. Os
fragmentos foram fixados em solução tamponada de formalina por 7 dias. A
desidratação foi realizada em solução crescente de etanol 70%, 95% e 100% com
três trocas de 10 min, em cada solução. Os fragmentos foram submetidos ao
preparo metalográfico para análise no MEV (MEV, JEOL, JSM-IT300, Tokyo, Japan).
As amostras foram fixadas em fita adesiva de carbono sobre porta amostras de
alumínio e recobertas com ouro, como material condutor e analisadas no MEV de
alto vácuo com magnificação 3.000 e 5.000 vezes. As imagens foram analisadas
para verificar o padrão de contaminação presente após o experimento.
48
4. RESULTADOS
A eficácia antibacteriana das substâncias químicas estudadas está
presente na tabela 2. Nenhuma substância irrigante testada foi efetiva para eliminar
a contaminação dentinária bacteriana com E. faecalis.
Tabela 2. Eficácia antibacteriana de soluções irrigadoras em canais radiculares
infectados por E. faecalis.
Grupos/ Período Antes Depois
Controle Negativo - -
Controle Positivo + +
Solução de H20 destilada + +
NaOCl + +
EDTA + +
Quitosana + +
NaOCl + Quitosana + +
NaOCl + EDTA + +
(+ : presença de bactéria; - : ausência de bactéria)
As fotomicrografias com magnificação de 3.000x (Figura 2) e 5.000x
(Figura 3), demonstram o padrão de contaminação por meio da presença de E.
faecalis nos respectivos grupos.
49
Figura 2. Imagens MEV (3.000x) A- Controle Negativo; B- Controle Positivo; C- Solução de H20; D- NaOCl; E- EDTA; F- Quitosana; G- NaOCl + Quitosana; H- NaOCl + EDTA.
50
Figura 3. Imagens MEV (5.000x) A- Controle Negativo; B- Controle Positivo; C- Solução de H20; D- NaOCl; E- EDTA; F- Quitosana; G- NaOCl + Quitosana; H- NaOCl + EDTA.
52
5. DISCUSSÃO
A ação mecânica de instrumentos endodônticos associada às
propriedades químicas das soluções irrigantes reduz agentes irritantes e proporciona
ambiente favorável para o reparo tecidual (FERREIRA et al., 2004; DE-DEUS et al.,
2014; BORGES et al., 2016).
A escolha de dentina bovina para testes de infecção e desinfecção tem
sido indicada comumente (ORSTAVIK E HAAPASALO, 1990; GIARDINO et al.,
2014; DEL CARPIO-PEROCHENA et al. 2015). Fatores como facilidade de obtenção
e manuseio, assim como a utilização em testes similares relacionados com a
remoção da smear layer alicerçaram essa indicação (ORSTAVIK E HAAPASALO,
1990). A topografia é fator relevante à sobrevivência de biofilmes, uma vez que as
superfícies irregulares melhoram a adesão e a retenção microbiana, fornecendo
pontos de fixação para os microrganismos e seus nutrientes (DEL CARPIO-
PEROCHENA et al., 2015). Com relação à metodologia empregada, a utilização do
dispositivo formado por bomba peristáltica conectada à entrada dos canais
radiculares simula o processo de irrigação de canais radicular (ESTRELA et al.,
2007) e em sequência a avaliação visual de turbidez do meio de cultura de
microrganismos coletados nos canais radiculares possibilita relação entre a
proporção de crescimento de microrganismos (ESTRELA et al., 2007). Estudos
investigaram a eficácia antimicrobiana de soluções irrigantes em diferentes modelos
experimentais, tais como, método de difusão em ágar (SHENOI et al., 2016), ensaio
de fluorescência (FREIRE et al., 2016) e avaliação por meio de MEV
(GEETHAPRIYA et al., 2016). Contudo, diferenças metodológicas entre estes
métodos são susceptíveis a apresentar resultados que não possam ser comparados
e tão pouco extrapolados para as condições clínicas.
O NaOCl, solução irrigante utilizada na desinfecção dos canais
radiculares, pode ser aplicada em variadas concentrações (CHAITANYA et al.,
2016). Embora soluções menos concentradas tenham demonstrado eficácia
antimicrobiana, concentrações mais elevadas apresentam efeito bactericida mais
rápido e maior, no entanto, elevam seu efeito citotóxico (CARVALHO et al., 2008). A
ação antimicrobiana de NaOCI ainda não foi totalmente compreendida. O cloro ativo
formado na dissociação do NaOCl em meio aquoso consiste em poderoso agente
oxidante que produz efeito antimicrobiano por oxidação irreversível da célula
53
bacteriana (ESTRELA et al., 2012). A literatura aponta aumento no efeito
antimicrobiano do NaOCI quando utilizado alternadamente com solução de EDTA
(TARTARI et al., 2017). Isto está relacionado com a ação de desmineralização do
EDTA, que previne a formação de camada de smear layer durante a instrumentação,
resultando na penetração aumentada de NaOCI nos túbulos dentinários (BACA et
al., 2011; TARTARI et al., 2017). No entanto, estudos relatam que esta associação
pode proporcionar erosão da estrutura dentinária comprometendo sua integridade
(BERUTTI et al., 2006).
Neste cenário, estudos relacionados às propriedades quelantes da
quitosana na dentina do canal radicular (SILVA et al., 2013) encorajaram o estudo
de outras propriedades, como sua capacidade antimicrobiana (DEL CARPIO-
PEROCHENA et al., 2015; SHENOI et al., 2016). A quitosana apresenta além de
propriedade quelante, biocompatibilidade, biodegradabilidade, bioadesão e
atoxidade às células humanas (KURITA, 1998; AKNCBAY et al., 2007). O
mecanismo quelante da quitosana na dentina não foi totalmente elucidado. No
entanto, este biopolímero bioativo é amplamente utilizado como agente quelante
para absorver metais pesados de águas residuais (DEL CARPIO-PEROCHENA et
al., 2015). Esta substância pode ser alternativa viável dentre as soluções irrigantes
utilizadas na Odontologia, buscando ação eficaz contra microrganismos e menor
ação citotóxica.
E. faecalis foi escolhido como marcador biológico devido ao seu papel
microbiano na infecção persistente do canal radicular (DEL CARPIO-PEROCHENA
et al., 2015). Por ser encontrado com maior frequência em infecções endodônticas
secundárias assintomáticas, ser capaz de invadir os túbulos dentinários, possuir
capacidade de competição com outros microrganismos, ser gram-positivo e
anaeróbico facultativo, adquiriu papel fundamental na investigação endodôntica
(ESTRELA et al., 2012). A resistência do biofilme de E. faecalis pode ser atribuída a
uma série de fatores microbiológicos inerentes à complexidade anatômica do
sistema radicular e à estrutura da dentina (ESTRELA et al., 2012). CAMACHO-
ALONSO et al. (2017) relata que este microrganismo chama a atenção por sua
capacidade de sobrevivência com nutrição limitada, de manter seu nível de pH
devido à capacidade de bloqueio do citoplasma e sua capacidade de adesão ao
túbulo dentinário. A presença deste microrganismo gera a necessidade de estudos
54
que elucidem seu comportamento dentro dos túbulos dentinários e que ofereçam
meio de eliminação deste no sistema de canais radiculares.
A avaliação qualitativa da contaminação dos blocos de dentina bovina
realizada por MEV e a avaliação visual da turbidez do meio de cultura evidenciaram
que os diferentes protocolos de irrigação e as substâncias testadas neste estudo
não foram efetivos para completa eliminação da contaminação dentinária bacteriana
pelo E. faecalis. Embora alguns autores relatem eficácia limitada tanto do NaOCl
associado ao EDTA quanto da quitosana (SONG et al., 2013; GEETHAPRIYA et al.,
2016; SHENOI et al., 2016; CAMACHO-ALONSO et al., 2017; YADAV et al., 2017),
não houve relato destes autores de ação totalmente eficaz destas soluções contra o
E. Faecalis, o que aponta necessidade de novas investigações e aplicação de novas
metodologias neste contexto. Os resultados de estudos ex vivo são importantes para
determinação de parâmetros de condutas clínicas. Considerando os resultados
previamente descritos, novos avanços e pesquisas relacionados à sanificação
poderão sanar infecções persistentes do sistema de canais radiculares contribuindo
com a recuperação do periápice.
56
6. CONCLUSÃO
Baseado na metodologia empregada, foi possível concluir que as
diferentes substâncias químicas irrigantes testadas não foram efetivos para eliminar
a contaminação dentinária bacteriana com E. faecalis.
58
7. REFERÊNCIAS
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