UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA Programa de Pós-Graduação em Agroecossistemas (NEREN)

ATIVIDADE BIOLÓGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lavandula angustifolia SOBRE A LAGARTA DO CARTUCHO Spodoptera

frugiperda

BRUNA MARIA SANTOS DE OLIVEIRA

SÃO CRISTÓVÃO SERGIPE - BRASIL

2013

BRUNA MARIA SANTOS DE OLIVEIRA

ATIVIDADE BIOLÓGICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lavandula angustifolia SOBRE A LAGARTA DO CARTUCHO Spodoptera frugiperda

Projeto apresentado à banca examinadora da disciplina Seminários II do curso de Mestrado em Agroecossistemas, Universidade Federal de Sergipe – UFS. Orientador: Dr. Leandro Bacci.

SÃO CRISTÓVÃO SERGIPE - BRASIL

2013

SUMÁRIO

ITEM PÁGINA RESUMO ........................................................................................................... 01 1. JUSTIFICATIVA E RELÊVANCIA ................................................................. 02 2. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................ 03 2.1 Compostos botânicos no controle de insetos pragas ............................ 03 2.2 Óleo essencial como alternativas para novos inseticidas ...................... 05 2.3 Utilização de óleos essenciais no controle de pragas ........................... 07 2.4 Óleo essencial de Lavandula angustifólia .............................................. 09 2.5 Lagarta do cartucho Spodoptera frugiperda .......................................... 11

3. HIPOTESE CIENCTÍFICA DO PROJETO .................................................... 13 4. OBJETIVO ..................................................................................................... 14 4.1 Objetivo geral ......................................................................................... 14 4.2 Objetivos específicos ............................................................................. 14

5. METAS .......................................................................................................... 15 6. METODOLOGIA ............................................................................................ 16 6.1 Criação de S. frugiperda ........................................................................ 16 6.2 Cultivo de Lavandula angustifolia e extração do óleo essencial ............ 17 6.3 Análise química do óleo essencial ......................................................... 17 6.4 Compostos majoritários .......................................................................... 18 6.5 Bioensaios .............................................................................................. 18

6.5.1 Toxicidade do óleo essencial ....................................................... 18 6.5.2 Toxicidade dos compostos majoritários ....................................... 19 6.5.4 Bioensaios dos efeitos sinérgicos, aditismo ou antagonismos

dos compostos majoritários ......................................................... 19 6.5.5 Bioensaios comportamentais ....................................................... 20

6.6 Análises estatísticas ............................................................................... 20 7. REFERÊNCIAL BIBLIOGRÁFICO ................................................................ 22 8. RESULTADOS E IMPACTOS ESPERADOS ................................................ 26 9. CRONOGRAMA ............................................................................................ 27

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RESUMO

A lagarta do cartucho do milho Spodoptera frugiperda é uma das

principais pragas da cultura do milho Zea mays no Brasil. O ataque tem

ocasionado grnades danos nas plantações de milho. O método de controle

mais utilizado atualmente para essa praga é o químico. O controle dessa

espécie é feito basicamente com o uso indiscriminado de inseticidas

organossintéticos o que tem resultado em prejuízos aos agroecossistemas.

Desta forma, tem-se aumentado a necessidade do desenvolvimento de

métodos e produtos alternativos para o controle desta praga. Dentre estes

produtos, os óleos essenciais de plantas têm demonstrado resultados

promissores no controle de pragas por serem eficientes, rapidamente

degradados e diminuírem os resíduos nos alimentos e no meio ambiente. No

presente projeto objetiva-se avaliar a atividade inseticida de óleo essencial de

Lavandula angustifolia sobre S. frugiperda. Para isso, S. frugiperda será tratada

com aplicações tópicas de L. angustifolia e de seus componentes majoritários

para realização de bioensaios de toxicidade e testes comportamentais. A

avaliação do potencial de utilização do óleo essencial de L. angustifolia como

alternativa de controle de S. frugiperda poderá contribuir como alternativa para

o desenvolvimento de produtos para o controle desta praga.

Palavras-chave: Lavandula angustifolia, plantas inseticidas, inseto-praga,

controle alternativo.

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1. JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA

Diversos estudos têm demonstrado a ineficiência de produtos

organossintéticos existentes no mercado no controle de pragas agrícolas. A

baixa eficiência tem contribuído para aplicações sucessivas destes produtos, o

que tem gerado vários problemas econômicos, ecológicos, sociais e

ambientais, tais como: diminuição das populações de inimigos naturais,

contaminação do ser humano, resíduos nos produtos e poluição ambiental.

Uma alternativa para o manejo de insetos resistentes aos inseticidas

convencionais é a utilização de substâncias de origem botânica. Estas

substâncias apresentam vantagens quando comparadas com os inseticidas

organossintéticos, como alta eficiência, rápida degradação, baixa a moderada

toxicidade para mamíferos e seletividade aos inimigos naturais. Dentre estes

produtos, os óleos essenciais de plantas têm demonstrado resultados

promissores no controle de pragas.

Desde a Idade Média, os óleos essenciais têm sido usados como

bactericidas, fungicidas, inseticidas e antiparasitários. Recentemente, os óleos

essenciais têm sido empregados na indústria farmacêutica, alimentar, agrícola

e de cosméticos. Sua utilização nestes segmentos se deve a sua complexa

composição. Os óleos essenciais são formados por metabólitos secundários

bioativos, sendo formados em sua maioria, por monoterpenos e

sesquiterpenos. Estas substâncias podem apresentar efeitos letais e subletais

em insetos, causando a morte ou interferindo em seu desenvolvimento,

reprodução e comportamento.

Entre as espécies que produzem óleos essenciais está à lavanda

Lavandula angustifólia (Lamiaceae). Esta espécie pode conter até 38

compostos diferentes, tendo como compostos majoritários os monterpenos

linalol e acetato de linalila. Estes compostos têm apresentado efeitos sedativo,

anestésico, antibacteriano, antifúngico e inseticida.

A lagarta do cartucho Spodoptera frugiperda (J.E. SMITH, 1797)

(Lepidoptera: Noctuidae) é a principal praga da cultura do milho no Brasil.

Populações elevadas deste inseto-praga têm causado sérios danos e vem

comprometendo a produtividade de lavouras comerciais. O controle de S.

frugiperda tem sido feito com um grande volume de inseticidas

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organossintéticos, o que além de aumentar o custo de produção, tem gerado

problemas ecológicos, sociais e ambientais.

Desta forma, objetiva-se com este projeto avaliar a atividade inseticida

do óleo essencial de L. angustifolia e seus compostos majoritários sobre S.

frugiperda. Especificamente objetiva-se ainda: i) comparar o efeito letal do óleo

essencial de L. angustifolia vendido comercialmente e do óleo extraído de

plantas sobre S. frugiperda por meio da realização de bioensaios de toxicidade;

ii) realizar misturas dos compostos majoritários do óleo essencial de L.

angustifolia para compreender a importância relativa destes na toxicidade a S.

frugiperda; iii) comparar o efeito letal do óleo essencial de L. angustifolia

vendido comercialmente e das misturas dos compostos do óleo sobre S.

frugiperda por meio da realização de bioensaios de toxicidade; iv) realizar

testes comportamentais para analisar a atratividade/ repelência do óleo

essencial de L. angustifolia e de seus componentes majoritários sobre S.

frugiperda.

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2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Compostos botânicos no controle de insetos pragas

Controle de insetos representa uma grande e antiga preocupação dos

seres humanos, por constituírem o grupo mais diversificado do reino animal e

atuarem em grande parte como herbívoros (ZARBIN; RODRIGUES; LIMA,

2009). Estes organismos apresentam ampla importância econômica por

desempenham papéis ecológicos de grande relevância nos ecossistemas e

também por causarem prejuízos em diversas culturas agrícolas, danos

urbanos, e serem vetores de muitas doenças. Por isso, ao longo do tempo, o

homem tem buscado formas de combater esses organismos a fim de minimizar

os danos causados pelos mesmos (GALLO et al., 2002).

Até a primeira metade do século passado, antes da descoberta dos

inseticidas organossintéticos, os agricultores faziam o controle de insetos com

a utilização de substâncias extraídas de vegetais. Entretanto devido às

variações na eficiência e diferenças na concentração do ingrediente ativo das

plantas, baixo efeito e sucessivas aplicações em curtos períodos, fizeram com

que os inseticidas vegetais fossem gradativamente substituídos pelos sintéticos

(MACHADO et al., 2007).

Para GALLO et al. (2002), os inseticidas organossintéticos, mostraram

ser mais eficientes e baratos. No entanto, devido o a simplificação dos

ecossistemas naturais e produção em monoculturas, associado com intenso e

indevido uso de insumos químicos no controle de insetos herbívoros deu

origem ao surgimento de enormes prejuízos e muitos insetos-pragas (ZARBIN;

RODRIGUES; LIMA, 2009).

Cruz (2002) comenta que um grave problema que tem ocorrido devido o

uso indiscriminado de organossintéticos é o desenvolvimento de populações

resistentes aos inseticidas, levando muitas vezes, erroneamente, o agricultor a

tomar medidas que acabam intensificando o problema. Segundo Merlino (2009)

o Brasil é o maior consumidor do mundo em pesticidas sintéticos. A utilização

indiscriminada de produtos químicos sintéticos, embora eficientes para o

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controle de insetos-pragas, possibilita a ocorrência de efeitos adversos, como

impactos indesejáveis ao meio ambiente, contaminação das culturas com

resíduos tóxicos, e a possibilidade do surgimento de populações resistentes

(GONÇALVES et al., 2001; AGUIAR-MENEZES, 2005).

Assim outras táticas de manejo devem ser empregadas, principalmente

aquelas que causem menor impacto ambiental (ROEL et al., 2001). A utilização

de substâncias extraídas de plantas com poder inseticida é uma alternativa que

apresenta vantagens quando comparada com os sintéticos, principalmente por

serem renováveis e facilmente degradáveis (MACHADO et al., 2007).

Os óleos essenciais de plantas têm sido estudados como bioinseticidas

botânicos por apresentar atividade atraente, repelente e até tóxica aos insetos

(AGUIAR-MENEZES, 2005).

2.2 Óleo essencial como alternativa para novos inseticidas

O Brasil é o país com a maior diversidade vegetal do mundo, contando

com mais de 55.000 espécies catalogadas, de um total estimado de 350.000 a

550.000, mas poucas ainda estão em estudo (ALVES, 2001; SIMÕES et al.

2002).

Produtos naturais extraídos de plantas são usados como fragrâncias na

indústria de perfumes, farmacêutica e de alimentos (ISMAN, 2000). Um dos

principais problemas da agricultura refere-se ao controle fitossanitários. Antes

da aquisição de agrotóxicos para o controle destes, os agricultores preparavam

e utilizavam produtos naturais obtidos a partir de materiais disponíveis em suas

propriedades. Contudo, com a popularização do acesso e uso dos agrotóxicos,

estes produtos foram quase que totalmente abandonados e, hoje, passaram a

ser chamados de alternativos (BETTIOL, 2006).

Percebe-se nos últimos anos um grande interesse pela pesquisa que

atestam a eficiência de inseticidas botânicos, comprovados a partir da revisão

de literatura que diversos estudos com plantas vêm sendo realizados na busca

de produtos que apresentem maior segurança, biodegradabilidade, seletividade

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viabilidade econômica e aplicabilidade e baixo impacto ambiental, já que muitos

dos inseticidas sintéticos disponíveis no mercado são tóxicos e causam

diversos impactos negativos ao homem e meio ambiente (VIEGAS Jr., 2003).

No entanto, para (AGUIAR-MENEZES, 2005) carência de pesquisas

bem como dificuldade de registro representa grande entrave para os inseticidas

de origem vegetal.

Uma classe de substâncias que tem merecido atenção são aquelas que

fazem parte dos óleos essencial de algumas plantas (AGUIAR-MENEZES,

2005). Os óleos essenciais são obtidos a partir de plantas aromáticas e

medicinais que, ao longo da evolução, desenvolveram defesas químicas contra

herbívoros (WALLING, 2000). Estes são constituídos por misturas complexas

de compostos orgânicos voláteis como metabólitos secundários nas plantas,

principalmente monoterpenos, sesquiterpenos, ésteres, fenilpropanóides e

outras substâncias de baixo peso molecular (RAI & CARPINELLA, 2006).

Dessa forma, o uso de produtos naturais extraídos de plantas pode ser

um forte aliado a outros métodos de controle de insetos, mantendo o equilíbrio

ambiental, sem deixar resíduos químicos, sem ação tóxica aos animais e ao

homem, reduzindo os efeitos negativos ocasionados pela aplicação

descontrolada de inseticidas organossintéticos (MACHADO et al., 2007).

Para a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) óleos

essenciais são produtos voláteis de origem vegetal obtidos por processo físico

destilação ou outro método adequado, apresentado isoladamente ou

misturados entre si, retificados, ou concentrados desterpenados (ANVISA,

2007).

As principais famílias botânicas que apresentam esses compostos são

Myrtaceae, Lauraceae, Rutaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Apiaceae,

Cupressaceae, Poaceae, Zingiberaceae e Piperaceae (KNAAK; FIUZA, 2010).

Dependendo das espécies consideradas, os óleos essenciais podem ser

produzidos e armazenados em diferentes órgãos das plantas, como flores,

folhas, caules, raízes, rizomas, frutos e sementes (REGNAULT-ROGER et al.

2012). Esses óleos podem ser obtidos por hidrodestilação, destilação a vapor,

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destilação seca ou por mecanismos de prensagem mecânica das plantas

(WALLING, 2000). A utilização de extratos e óleos essenciais com

propriedades inseticidas torna-se fundamental, tendo assim mais de 2000

espécies de plantas conhecidas (VIEGAS Jr., 2003).

Os derivados botânicos podem causar diversos efeitos sobre os insetos,

tais como repelência, inibição de oviposição e da alimentação e alterações no

sistema hormonal. Como conseqüência, causa distúrbios no desenvolvimento,

deformações e mortalidade das diversas fases (GONZAGA et al., 2008).

O emprego de substâncias extraídas das plantas, e utilizadas como

inseticidas, tem trazido inúmeras vantagens quando comparado aos sintéticos

por serem naturais e obtidos de recursos renováveis, rapidamente degradáveis,

compostos da associação de vários princípios ativos tendo atuação lenta e não

deixam resíduos em alimentos (ROEL, 2001).

No Brasil, os estudos voltados à utilização de inseticidas naturais têm

obtidos grandes avanços, tanto que já existem produtos comerciais feitos a

partir de partes vegetais. Entretanto, ainda se faz necessário um esforço

conjunto de entidades pesquisadoras e governamentais para tornar seu uso

uma realidade rural, já que em nosso país há uma grande diversidade de

espécies destinadas a esse fim (SILVA, 2009).

2.3 Utilização de óleos essenciais no controle de pragas

Como as plantas não podem escapar de seus predadores, sua melhor

defesa é a produção de compostos de odor ou sabor repulsivo e toxinas

(AGUIAR-MENEZES, 2005).

Sabe-se que muitas das substâncias produzidas pelo metabolismo

secundário possuem propriedades biológicas importantes e estão diretamente

envolvidas nos mecanismos que permitem a adequação da planta ao seu meio

(GOBBO-NETO e LOPES, 2007). As substâncias pertencentes a essa classe

de metabólitos possuem diversas funções biológicas, tais como defesa contra

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herbívoros e micro-organismos, proteção contra raios UV e atração de

polinizadores ou animais dispersores de sementes (FUMIGALI et al., 2008).

A utilização de plantas inseticidas para o controle de pragas não é uma

técnica recente, elas já eram usadas antes do advento de inseticidas sintéticos.

O ressurgimento dos estudos com inseticidas botânicos deu-se devido a

necessidade de se dispor de novos compostos para uso no controle de pragas

sem os problemas de contaminação ambiental, resíduos nos alimentos, efeitos

prejudiciais sobre os organismos benéficos e aparecimento de insetos

resistentes, devido a advento da utilização indiscriminada dos inseticidas

sintéticos (GALLO, 2002).

Inseticidas são substâncias químicas utilizadas para matar, atrair e

repelir insetos apresenta-se um vasto tópico de pesquisas no mundo inteiro e

que tem se desenvolvido bastante nas últimas décadas (VIEGAS Jr., 2003).

Os efeitos observados sobre os insetos quando tratados com produtos

vegetais que apresentam atividade inseticida são: inibição da oviposição,

alimentação, crescimento, esterilidade dos adultos e mortalidade, entre outros.

A caracterização da bioatividade dos inseticidas vegetais pode ser realizada

por experimentos de campo, casa de vegetação e laboratórios, por meio da

utilização de parcelas tratadas e não tratadas e avaliando-se a população e

oviposição de insetos ou danos nas plantas (CALLO, 2002).

As toxinas botânicas podem penetrar nos insetos pelas vias

respiratórias, por ingestão e contato (KNAAK; FIUZA, 2010), testados por meio

de bioensaio de toxidade.

Os efeitos biológicos dos óleos essenciais podem ser resultantes de

sinergismo, aditivo, antagonismo dos compostos majoritários, na maioria das

vezes a amplitude dos efeitos dos óleos depende da concentração desses

componentes, porém é possível que a atividade dos componentes principais

seja modulada por outros componentes de menor importância, através de

sinergismo (BAKKALI et al., 2008).

Os constituintes químicos também podem ter importantes efeitos sobre o

comportamento de diversas pragas, principalmente como deterrentes e

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repelentes, quando em adição à toxicidade dos óleos essenciais por meio de

fumigação, contato ou ingestão. As pesquisas com plantas inseticidas podem

ser realizadas, basicamente, com dois objetivos a descoberta de moléculas

com atividade contra insetos que permitam a síntese de novos produtos

inseticidas e a obtenção de inseticidas naturais para uso direto no controle de

pragas (GALLO, 2002).

2.4 Óleo essencial de Lavandula angustifolia

O gênero Lavandula são plantas arbustivas perenes, aromáticos, eretos

e com grande ramificação, contém pelo menos 28 espécies diferentes (CHU &

KEMPER, 2001).

As propriedades terapêuticas do óleo essencial de Lavandula spp. estão

associadas ao sinergismo entre os constituintes majoritários e minoritários, os

quais podem variar com as características genéticas, fatores abióticos, órgão

de armazenamento e métodos de extração (MASETTO, 2009). São plantas

aromáticas que apresentam difícil classificação taxonômica devido à sua

capacidade de hibridização e diversidade morfológica (UPSON, 2002) apud

(MASETTO, 2009).

Pertencente à família Lamiaceae, a Lavandula angustifolia Mill. é

conhecida popularmente de alfazemas ou lavandas, são aromáticas originárias

da Europa, especificamente da região do Mediterrâneo (CHU & KEMPER,

2001).

O Brasil vem despertando o interesse de produtores pela produção de

óleo essencial, que é extraído de suas flores e folhas e empregado nas

indústrias de perfumaria, cosmética, alimentícia e farmacêutica (TSURO et al.,

2000).

Alguns óleos essenciais podem conter de 20 a 60 constituintes com

diferentes concentrações. Outros óleos são caracterizados por apresentarem

dois ou três constituintes que são considerados componentes majoritários

apresentam total de (20-70%) de concentrações (BAKKALI et al., 2008).

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Entre as espécies que apresentam valor comercial está a L. angustifolia,

por conter uma composição complexa, constituída por até 38 compostos

diferentes, dentre esses, os principais componentes químicos do óleo

pertencem a classe monoterpenos, são o linalol e acetato de linalila (CHU &

KEMPER, 2001).

O acetato de linalina e linalol tem apresentado efeitos sedativo e

anestésicos, o linalol apresenta também efeito antibacteriana, antifúngica e

inseticida. Estes dois compostos são os componentes químicos mais

importantes no óleo essencial de L. angustifolia, representando até 90% do

volume do óleo (CHU & KEMPER, 2001; MACHADO, 2011).

O linalol e limoneno são usados como aromatizante em cosméticos,

alimentos, sabão, perfumes são considerados também como veneno de

contato (neurotóxico) e tem atividade fumigante (AGUIAR-MENEZES, 2005).

Pesquisa tem demonstrado que a composição química do óleo essencial

de Lavandula depende grandemente das espécies de que foi obtido, dentro da

mesma espécie, os conteúdos bioquímicas do óleo essencial encontrado na

flor, haste, ou folhas podem variar significativamente dependendo de onde e

em que condições a planta foi cultivada. A presença e a concentração de

certos constituintes químicos também flutuam de acordo com a temporada e a

maturação da planta quando colhida (CHU & KEMPER, 2001).

O óleo essencial de lavanda (Lavandula angustifolia) é composto

principalmente de monoterpenos (classe C10 de isoprenóides), produzido e

armazenado na glandular tricomas, que cobre a superfície das partes aéreos

da planta. Os monoterpenos comumente encontrados em óleos de lavanda

incluem linalol, acetato linalina, 1,8-cineol. A abundância relativa destes

isoprenóides define a qualidade do óleo e é determinada principalmente pelo

genótipo da planta. Os fatores ambientais (por exemplo, intensidade de luz,

duração do dia e da temperatura) também afetam a biossíntese isoprenóide e

pode influenciar significativamente a composição do óleo em plantas (BISWAS

et al, 2009).

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De acordo com Demissie et al., (2011) os principais monoterpenos

encontrado na espécie de L. angustifolia foi linalol 25–38% acetato linalina 25–

45%.

Colheitas realizadas por meio da propagação in vitro no Sul do Brasil de

L. angustifolia apresentaram total de 21 compostos no óleo essencial e

variação de 40% a 41% para o constituinte acetato linalina; enquanto que para

o linalol a variação foi de 29% a 36% (MOON et al. 2006).

2.5 Lagarta do cartucho Spodoptera frugiperda

O milho (Zea mays L.) é uma cultura com ampla distribuição geográfica,

tendo produtividade média brasileira estimada em torno de 50 milhões de

toneladas (safra 2010/2011), (AGRIANUAL, 2011).

A principal praga do milho no Brasil é a lagarta-do-cartucho Spodoptera

frugiperda (J. E. Smith, 1797), que tem causando perdas consideráveis na

produção durante todo o ciclo da cultura (TIRELLI, 2010). Devido hábito

polífogo este inseto tem apresentado alta capacidade de dispersão, no Brasil,

ocorre praticamente em todos os estados, devido à oferta de hospedeiro ao

longo do ano (PEREIRA, 2007; BARROS, 2010).

O inseto-praga Spodoptera frugiperda, pertencente à ordem Lepidoptera

e família Noctuidae, conhecida popularmente por lagarta-do-cartucho, lagarta

dos milharais e lagarta militar e ataca principalmente as folhas mais novas

(BARROS, 2010). No estágio larval alimenta-se de plantas de milho em todas

as fases de desenvolvimento, preferencialmente dos cartuchos de plantas

jovens (TIRELLI, 2010). Vale ressaltar que a partir do 2º ínstar, as lagartas

podem apresentar canibalismo e devido a isto é comum apenas uma lagarta

desenvolvida por cartucho. No entanto podem ser encontradas lagartas em

ínstares diferentes num mesmo cartucho, separadas pelas lâminas das folhas

(PERREIRA, 2007).

Há relatos de que a redução do rendimento da cultura de milho,

provocada pela lagarta-do-cartucho, varia de 15 a 34% (CAMPOS, 2012). Além

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da perda de produção em grãos, o ataque provoca perda na qualidade do

produto, seja em grãos ou em milho verde, ou ainda na perda de biomassa

para a produção de silagem (CHAVES, 2012). A biologia de S. frugiperda

alimentadas com folhas de milho em uma temperatura de 35 ºC é dura

aproximadamente 30 dias possibilitando a essa espécie a produção de várias

gerações no ano (PERREIRA, 2007). E conseguintemente a utilização de

grandes volumes de inseticidas no controle (GALLO, 2006).

Controlada usualmente com inseticidas químicos, utilizado desde o

momento que nota-se o desfolhamento nas plantações, um grande volume de

inseticidas é utilizado anualmente, o que além de aumentar o custo de

produção, surge a médio e longo prazo, problemas econômicos, sociais e

ambientais tais como: gasto de dinheiro, contaminações humana, dos produtos,

poluição ambiental, e seleção natural de insetos resistentes com o

conseqüente desequilíbrio biológico. O que tem despertado interesse em

pesquisas com métodos que ofereçam menor risco, como por exemplo, a

utilização dos metabólicos secundários de plantas na gestão de controle deste

inseto-praga, como uma alternativa aos o uso de inseticidas sintéticos, menos

venenoso para o meio ambiente e com baixa toxicidade nos mamíferos

(PERREIRA, 2007; GALLO, 2006; COSTA, 2012).

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3. HIPÓTESES

No presente estudo serão testadas as seguintes hipóteses:

i) O óleo essencial de L. angustifolia e seus componentes majoritários

individuais apresentam efeito letal sobre S. frugiperda;

ii) O óleo essencial de L. angustifolia e seus componentes majoritários

individuais são repelentes para S. frugiperda;

iii) Os componentes majoritários do óleo essencial de L. angustifolia

apresentam interações sinérgicas em suas atividades sobre S. frugiperda.

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4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo Geral

Avaliar a atividade inseticida do óleo essencial de L. angustifolia e seus

compostos majoritários sobre S. frugiperda.

4.2 Objetivos específicos

i) Verificar o efeito letal do óleo essencial de L. angustifolia sobre S.

frugiperda por meio da realização de bioensaios de toxicidade;

ii) Verificar o efeito letal isolado dos compostos majoritários do óleo

essencial de L. angustifolia sobre S. frugiperda por meio da realização de

bioensaios de toxicidade;

iii) Determinar o efeito comportamental do óleo essencial e dos

compostos majoritários de L. angustifolia sobre S. frugiperda por meio da

realização de bioensaios de repelência/atratividade;

iv) Verificar se a interação dos compostos majoritários do óleo essencial

de L. angustifolia apresentam efeitos sinérgicos, aditivos ou antagônicos nos

efeitos letais e subletais sobre S. frugiperda.

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5. METAS

i) Coletar lagarta do cartucho S. frugiperda para criação em laboratório no

11º mês do projeto;

ii) Obter a análise química do óleo essencial de L. angustifolia e as

proporções de seus componentes majoritários, assim como os componentes

isolados do óleo essencial até o 11º mês do projeto;

iii) Realizar bioensaios de toxicidade do óleo essencial de L. angustifolia e

seus compostos majoritários sobre S. frugiperda até o 16º mês do projeto;

iv) Realizar montagem e avaliação dos bioensaios de sinergismo,

aditismo e antagonismo do óleo essencial de L. angustifolia e seus compostos

majoritários sobre S. frugiperda até o 18º mês do projeto;

v) Realizar montagem e avaliação dos bioensaios de atração/ repelência

do óleo essencial de L. angustifólia e seus compostos majoritários sobre S.

frugiperda até o 20º mês do projeto.

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6. METODOLOGIA

6.1 Criação de S. frugiperda

Para realização dos bioensaios, a espécie S. frugiperda será criada em

laboratório na Clinica Fitossanitária da Universidade Federal de Sergipe (UFS),

São Cristovão-SE. O estabelecimento da criação inicial será realizado por meio

da coleta de lagartas em áreas de cultivo de milho no Estado de Sergipe. As

lagartas serão colocadas em tubos de ensaio de 15cm de altura x 1,5cm de

diâmetro contendo dieta natural (folhas de milho). As criações serão mantidas

em temperatura e umidade ambiente.

Após a emergência, as mariposas adultas serão acondicionadas em

tubos de PVC (cloreto de polivinila) de 10cm de diâmetro por 20cm de altura

revestido internamente com papel de filtro, com as extremidades superior e

inferior tampadas com placas de Petri de 15cm de diâmetro revestidas

internamente com papel de filtro. A alimentação das mariposas será realizada

diariamente com solução de mel a 10%, oferecida dentro de um recipiente de

vidro de 5cm de altura, vedado com tampa de borracha com um pequeno

orifício onde será introduzido um fio de algodão para permitir a alimentação.

Diariamente as posturas serão transferidas para placas de Petri esterilizadas.

As larvas recém-eclodidas serão colocadas em tubos de ensaio contendo a

dieta artificial de BOWLING (1967).

A dieta das larvas será elaborada pesando 100 gramas de feijão. Este

será depositado em becker de 500ml e cozido em forno de microondas.

Posteriormente será feita uma mistura com 275ml de água destilada, levedura

de cerveja, ácido ascórbico, nipagin e benzoato de sódio em 100ml de água

destilada. A mistura será misturada ao feijão juntamente com mais 1,0ml de

formaldeído. Em seguida será adicionado Agar à água (250ml) e levado ao

fogo até ficar dissolvido. Por fim será realizada a junção das misturas feitas nas

etapas anteriores e agitada no liquidificador.

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6.2 Cultivo de Lavandula angustifolia e extração do óleo essencial

A espécie L. angustifolia será cultivada no Centro Avançado em Plantas

Medicinais do Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras-

UFLA, Lavras, Minas Gerais, Brasil, 37200-000. Os especimens serão trazidas

e depositado no Herbário da Universidade Federal de Sergipe, CCBS,

Departamento de Biologia, São Cristóvão, Sergipe, Brasil, 49100-000. As

folhas de L. angustifolia serão colhidas e secas a 40 ± 1ºC por 4 dias em estufa

de secagem (SANT`ANA et al., 2010). O óleo essencial será obtido através da

hidrodestilação do pó das folhas, em aparelho do tipo Clevenger em parceria

com laboratório de Fitotecnia da UFS.

Posteriormente, o óleo será separado da fase aquosa e mantido em

freezer até sua utilização.

6.3 Análise química dos óleos essenciais

As análises dos componentes dos óleos essenciais serão realizadas em

parceria do laboratório de química da UFS - Universidade Federal de Sergipe,

São Cristóvão-SE, Brasil.

Utilizando a metodologia do CG-MS/CG-DIC (GC-2010 Plus; GCMS-

QP2010 Ultra, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão) equipado com um

amostrador automático AOC-20i (Shimadzu). As separações serão realizadas

usando uma coluna capilar de sílica fundida Rtx®-5MS Restek (polissiloxano

5%-difenil-95%-dimetil) de 30m x 0,25mm de diâmetro interno (d.i.), 0,25-µm de

espessura de filme, em um fluxo constante de hélio (99,999%) com taxa de

1,2mL.min-1. Será utilizado um volume de injecção de 0,5uL (5 mg.mL-1), com

uma razão de split de 1:10. A programação de temperatura do forno utilizada

será a partir de 50 °C (isoterma durante 1,5 min), com um aumento de 4 °C /

min, à 200 °C, em seguida, a 10 °C / min até 250 °C, terminando com uma

isoterma de 5min a 250 °C.

Os dados de CG-EM e CG-DIC serão simultaneamente adquiridas

empregando um sistema de separação de detector; a razão de separação de

escoamento foi de 4:1 (EM: FID). Um tubo restritor de 0,62 m x 0,15 milímetros

d.i. (coluna capilar) será usado para ligar o divisor para o detector do EM; um

tubo restritor de 0,74m x 0,22mm d.i. será usado para ligar o divisor para o

18

detector do DIC. A temperatura do injetor será de 250 °C e a temperatura da

fonte de íons será de 200 °C. Os íons serão gerados à 70 eV; a uma

velocidade de varredura de 0,3 fragmentos (scans) s-1 detectados no intervalo

de 40-350 Da. A temperatura do DIC será ajustada para 250ºC, e os

suprimentos de gás para o DIC serão ar sintético, hidrogênio, hélio em taxas de

fluxo de 30, 300 e 30 mL.min-1, respectivamente. A quantificação de cada

constituinte será estimada por normalização área do pico gerado no DIC -(%).

As concentrações dos compostos serão calculados a partir das áreas dos picos

de CG e foram dispostos por ordem de eluição do CG.

A identificação dos constituintes será realizada com base na

comparação dos índices de retenção da literatura. Para o índice de retenção

será utilizado à equação de Van den Dool e Kratz em relação a uma série

homóloga de n-alcanos (nC9-nC18). Serão utilizadas três bibliotecas do

equipamento WILEY8, NIST107 e NIST21 que permite a comparação dos

dados dos espectros com aqueles constantes das bibliotecas utilizando um

índice de similaridade de 80%.

6.4 Compostos majoritários

Os constituíntes em maior proporção no óleo essencial de L. angustifolia

serão adquiridos da empresa SIGMA-ALDRICH e utilizados em bioensaios

posteriores.

6.5 Bioensaios

6.5.1 Toxicidade do óleo essencial de L. angustifolia

Os bioensaios para verificar a toxicidade do óleo essencial sobre

lagartas de S. frugiperda serão conduzidos na Clínica Fitossanitária da

Universidade Federal de Sergipe (UFS), São Cristóvão-SE, Brasil.

Para realização dos bioensaios, inicialmente serão preparadas soluções

do óleo essencial em acetona nas concentrações de 0,1; 1 e 10%. O

delineamento experimental será inteiramente casualizado com 5 repetições.

19

Cada repetição será composta por um grupo de 10 lagartas de terceiro instar

(10 dias) de S. frugiperda. As lagartas serão transferidas para placas de Petri e

em cada uma será aplicado topicamente com uso de uma microseringa, na

região protorácica, 1µL das concentrações da solução do óleo essencial. Para

o controle será aplicado apenas 1µL do solvente sobre as lagartas. Uma vez

determinada a faixa de mortalidade superior a 0 e inferior a 100% serão

testadas doses intermediárias (de 3 a 6 concentrações) a fim de obter curvas

de dose-mortalidade. Serão oferecidas pequenas porções (300mg) da dieta

artificial a fim de evitar possível morte do inseto por inanição.

A toxicidade do óleo essencial de L. angustifolia será avaliada pela

contagem de lagartas mortas após 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 99, 108 e 120

horas. Em todas as avaliações dos experimentos de toxicidade, as lagartas

serão consideradas mortas quando se apresentarem imóveis. Serão calculadas

as mortalidades dos insetos em cada unidade experimental.

6.5.2 Toxicidade dos compostos majoritários

Para determinar a contribuição potencial de cada constituinte na

toxicidade do óleo essencial de L. angustifolia serão realizados bioensaios

separados com cada componente majoritário. Os componentes testados serão

selecionados com base na composição química do óleo essencial e os

procedimentos serão os mesmos utilizados nos bioensaios de toxicidade do

óleo essencial.

6.5.3 Bioensaios dos efeitos sinérgicos, aditismo ou antagonismos dos

compostos majoritários

Para a realização destes bioensaios serão misturados os compostos

majoritários dois a dois procurando manter a proporção encontrada no óleo

essencial e seus efeitos serão comparados com a toxicidade individual de cada

composto. Os procedimentos utilizados nestes bioensaios serão os mesmos

descritos anteriormente.

20

6.5.4 Bioensaios comportamentais

Para se avaliar a resposta olfativa dos adultos de S. frugiperda aos

compostos do óleo essencial de L. angustifolia, será utilizado um olfatômetro

do tipo “Y” de dupla escolha. Os bioensaios serão realizados na Clínica

Fitossanitária da Universidade Federal de Sergipe.

O olfatômetro em “Y” será constituído por um tubo de vidro bifurcado, de

4 cm de diâmetro, que opera horizontalmente. A corrente de ar será produzida

por uma bomba de ar comprimido ou por sucção a vácuo. O ar que operará no

olfatômetro será umidificado e purificado por meio de filtro de carvão ativo.

Tiras de papel de filtro embebidas no óleo essencial e nos compostos

majoritários serão colocadas em um dos braços do sistema Y. As tiras de papel

serão substituídas a cada bioensaio. O óleo essencial e seus majoritários serão

considerados atrativos quando atraírem os insetos em direção à câmara do

óleo. O controle será realizado com utilizando-se acetona nas tiras de papel. As

posições dos braços do olfatômetro serão invertidas entre tratamento e controle

para evitar qualquer efeito tendencioso. A intensidade do fluxo de ar será

regulada através de fluxômetros e mantida por aproximadamente 4L/min.

6.6 Análises estatísticas

Os resultados de mortalidade obtidos para todos os bioensaios de

toxicidade serão corrigidos em relação à mortalidade ocorrida na testemunha

usando-se a fórmula de Abbott (1925). Análises de Próbit serão realizadas para

determinar as curvas de dose-mortalidade do óleo essencial, compostos

majoritários, misturas de compostos para S. frugiperda.

Serão aceitas curvas cuja probabilidade de aceitação da hipótese de

nulidade (de que os dados possuem distribuição de Próbite) pelo teste x² seja

maior que 0,05. Por meio destas curvas serão estimadas as doses letais para

50% e 90% das populações (DL50 e DL90 respectivamente) e seus respectivos

intervalos de confiança a 95% de probabilidade a partir do programa

estatísticos SAEG.

21

Serão calculadas as razoes de resistência (RR50) entre as populações

de S. frugiperda e os índices de toxicidade relativa (ITR50) dos óleos essenciais

para cada população por meio das seguintes formulas:

i) RR50 = DL50 das populações resistentes / DL50 da população

suscetível, para cada óleo essencial.

ii) ITR50 = DL50 do óleo essencial menos tóxico / DL50 dos óleos

essenciais, para cada população de S. frugiperda.

Os dados dos bioensaios de atratividade/ repelência serão submetidos a

analise de variância e as medias serão comparadas pelo teste de Tukey a 5%.

Óleos essenciais com maior e menor numero de insetos que a testemunha a

p<0,05, indicam atratividade ou repelência/deterrência, respectivamente.

22

7. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

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26

8. RESULTADOS E IMPACTOS ESPERADOS

A determinação da toxicidade do óleo essencial de L. angustifolia sobre

S. frugiperda dará subsídios ao desenvolvimento de novos produtos mais

eficientes e com menor impacto ao meio ambiente. Dessa forma, o projeto cria

uma demanda estratégica através da possibilidade de geração de patentes

A execução do projeto permitirá a mestranda o título de Mestre em

Ciências, bem como a publicação de artigos científicos em periódicos

internacionais com alto JCR (por exemplo, Acta Tropica - A1 e Industrial Crops

and Products – A2).

A utilização do óleo essencial como alternativa de controle e o melhor

entendimento sobre os efeitos dos compostos majoritários do óleo nos

parâmetros comportamentais de S. frugiperda irão contribuir para reduzir os

riscos inerentes ao uso inadequado de inseticidas organossinteticos. Assim,

espera-se diminuir os impactos ambientais e sociais inerentes ao atual manejo

dado no controle desta praga, além da possibilidade de diminuição do custo de

controle e aumento da lucratividade com a redução dos danos ocasionados por

S. frugiperda.

Este projeto contribuirá para um controle mais eficiente de forma a

prevenir, retardar ou reverter à evolução da resistência de S. frugiperda aos

novos produtos que sejam lançados no mercado. Por fim, além do potencial de

geração de produtos, poderá ocorrer a transferência de tecnologia aos

pequenos e médios produtores, promovendo dessa forma maior retorno sócio-

econômico a comunidade local e contribuindo para o desenvolvimento da

região Nordeste e do estado de Sergipe.

27

9. CRONOGRAMA

Atividades do Projeto Bimestre

2013 2014 2015 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 1

1) Revisão bibliográfica. x x x x x x x x x x x x

2) Criação de S. frugiperda. x x x x x x x

3) Extração do óleo essencial de plantas de L. angustifolia. x x

4) Análise da composição química do óleo essencial de L. angustifolia. x x

5) Montagem e avaliação dos bioensaios de toxicidade do óleo essencial de L. angustifolia sobre S. frugiperda.

x x

6) Montagem e avaliação dos bioensaios de toxicidade dos compostos majoritários do óleo essencial de L. angustifolia sobre S. frugiperda.

x x x

7) Montagem e avaliação dos bioensaios de sinergismo, aditismo e antagonismo dos compostos majoritários do óleo essencial de L. angustifolia sobre S. frugiperda.

x x x

8) Montagem e avaliação dos bioensaios de atratividade/ repelência do óleo essencial de L. angustifolia sobre S. frugiperda.

x x x

9) Montagem e avaliação dos bioensaios de atratividade/repelência dos compostos majoritários do óleo essencial de L. angustifolia sobre S. frugiperda.

x x x

10) Tabulação dos dados. x x x

11) Análise estatística e representação dos dados. x x x

12) Elaboração da dissertação/resumos. x x x x

13) Defesa da dissertação. x x