UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAPÁPRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIVISÃO DE PESQUISA

MICHELL GLEISON SÁLES CARDOSO

ATIVIDADE MICROBIOLÓGICA DOS EXTRATOS BRUTOS E ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DOS GALHOS DE H. crenata Pohl ex Benth

MACAPÁ2013

MICHELL GLEISON SÁLES CARDOSO

ATIVIDADE MICROBIOLÓGICA DOS EXTRATOS BRUTOS E ESTUDO FÍSICO-QUÍMICO DOS GALHOS DE H. crenata Pohl ex Benth

Plano de Trabalho submetido ao Programa Institucional de Iniciação Científica da Secretaria de Ciência e Tecnologia do Amapá – SETEC/FAPEAP

MACAPÁ2013

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................052 HIPÓTESES..........................................................................................................063 OBJETIVOS..........................................................................................................074 JUSTIFICATIVA....................................................................................................085 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................096 PROBLEMA...........................................................................................................127 MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................138 ANÁLISE DE DADOS............................................................................................179 CRONOGRAMA....................................................................................................18REFERÊNCIAS........................................................................................................19

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1 INTRODUÇÃO

A preocupação com a cura de doenças sempre se fez presente ao longo da

história da humanidade, muito antes do surgimento da escrita. Por esse motivo,

diversas espécies vegetais amazônicas têm despertado o interesse de estudos

científicos nas mais diversas áreas, dentre as quais se destacam aquelas com o

caráter medicinal e com propriedades terapêuticas, fomentando assim o interesse

pela investigação de espécies vegetais da Região Amazônica, dando um enfoque

maior naquelas que possuem um expressivo potencial farmacológico.

No Estado do Amapá as atividades de cultivo de plantas que possuem

finalidade terapêutica têm crescido de maneira substancial. Conforme menciona

Carvalho (2010), as práticas que associam as atividades de extração e manejo

sustentável dos produtos florestais, com processos de beneficiamento, valoração e

endogeneização das funções de produção na economia local, têm sido mencionadas

como mecanismos eficazes de promoção regional de um desenvolvimento que

mantém as condições naturais do meio ambiente na Amazônia.

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 80% da

população de países em desenvolvimento ainda utilizam práticas tradicionais na

atenção primária à saúde; desse total, 85% fazem uso de plantas medicinais. O

Brasil segue essa tendência mundial, incentivando o emprego de práticas

complementares nos programas de atenção à saúde (CARVALHO et al., 2007;

BARROS, 2008).

Como a exploração comercial de plantas medicinais, tanto para consumo

interno como para exportação é ainda muito limitada, visto que produção e

produtividade dependem de incentivos e estudos que possibilitem agregar valor a

estes produtos agrícolas, há necessidade de investigações fitoquímicas, além de

desenvolvimento de novas tecnologias na área de fitoterápicos para o controle de

qualidade das mesmas (CARVALHO et al. 2006).

Os resultados da pesquisa com plantas medicinais podem ter

desdobramentos em vários níveis. Individualmente, a descoberta de novos fármacos

ou de fármacos acessíveis, pode determinar a melhoria da qualidade de vida em

doenças crônicas ou a própria sobrevivência do paciente afetado. Socialmente, a

descoberta de fontes naturais e locais de compostos químicos usualmente

importados e/ou o desenvolvimento de fitoterápicos de fabricação nacional pode ter

consequências econômicas significativas, além de possibilitar a autonomia de cada

país no gerenciamento de suas políticas de saúde (ELIZABETSKY; SOUZA, 2003).

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2 HIPÓTESES

Hipótese Nula (H0): os extratos brutos não apresentam atividade antimicrobiana.

Hipótese Não-Nula (H1): os extratos brutos apresentam atividade antimicrobiana.

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3 OBJETIVO

3.1 OBJETIVO GERAL

Realizar ensaios microbiológicos e análises físico-químicas nos galhos da

espécie Hyptis crenata Pohl ex Benth (Lamiaceae);

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Avaliar a eficiência atividade microbiológica em linhagens bacterianas gram-

positivas e gram-negativas, bem como em fungos;

Realizar análises físico-químicas clássicas dos galhos de H. crenata tais como:

pH, teor de lipídios, resíduo por incineração, teor de carboidratos e teor de

umidade.

Determinar biodisponibilidade mineral por espectrofotometria de absorção atômica

nos galhos de H. crenata.

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4 JUSTIFICATIVA

Pelo levantamento bibliográfico levantado para a espécie Hyptis crenata

(Pohl) ex Benth (Lamiaceae), nota-se que há informações incipientes à respeito das

atividades biológicas, do estudo químico e fitoquímico. As informações acerca de

suas propriedades terapêuticas dessa espécie se limitam ao conhecimento das

populações tradicionais, muitas das quais sem comprovações científicas sobre as

suas supostas potenciais propriedades farmacológicas, ainda que já existam

estudos comprovando sua atividade antinociceptiva e antiinflamatória de seus óleos

essenciais.

É com base nestes achados que surge a iniciativa de realizar um estudo que

vise contribuir ao conhecimento das propriedades químicas e biológicas da espécie

Hyptis crenata (Pohl) ex Benth (Lamiaceae), em nível regional, agregando valores

científicos, econômicos e culturais, ainda que a sua utilização no viés do contexto

sócio-cultural ainda repouse no âmbito do conhecimento popular, difundida na região

amazônica.

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5 REVISÃO DE LITERATURA

5.1A UTILIZAÇÃO DE PLANTAS MEDICINAIS PELO HOMEM

O uso de plantas medicinais na cura ou alívio de doenças, que para muitos

poderia parecer misticismo, feitiçaria ou folclore, torna-se hoje objeto de pesquisas

científicas com validade comprovada diante da fitoquímica e da farmacologia. Desta

forma, define-se o conceito de plantas medicinais como toda e qualquer planta que

atue de maneira benéfica no combate ou minimização de qualquer malefício no

organismo humano (BARLEM et al., 1995; MARTINS et al., 2005).

A planta denominada papoula (Papaver somniferum L.) é um exemplo de que

as plantas medicinais possuem componentes capazes de aliviar dores; dela foi

isolada em 1806 a morfina, utilizada até hoje nos tratamentos da dor, e tem papel

importante para os pacientes terminais diagnosticados com vários tipos de câncer,

por amenizar as dores intensas peculiares a estas enfermidades (RODRIGUES et

al., 2010).

Essa interseção da etnografia médica e estudos biológicos de ação

terapêutica é denominada de Etnofarmacologia, ou seja, uma exploração

transdisciplinar que abrange as ciências biológicas e sociais. O objetivo principal da

etnofarmacologia foi para descobrir novos compostos, derivados de plantas e

animais utilizados nos sistemas médicos indígenas, que podem ser empregados no

desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos. A exploração etnofarmacológica,

envolvendo ambas as visitas de campo, bem como a pesquisa experimental levou

no passado a informações altamente valiosas sobre plantas medicinais usadas em

diferentes culturas, onde muitos foram desenvolvidos em novas drogas

(CUNNINGHAN; MENEZES, 2011).

O interesse pela elucidação dos constituintes do metabolismo secundário das

plantas tem estimulado a busca, nos vegetais, de compostos com atividades

farmacológicas. A fitoquímica tem colaborado para o conhecimento da constituição

química dos vegetais, suas propriedades e funções, direcionando sua utilização,

seja como alimentos ou fármacos, confirmando ou não sua indicação no

conhecimento popular (BEZERRA et al., 2011).

5.2 ATIVIDADE MICROBIOLÓGICA DE PRODUTOS NATURAIS

A busca por novos compostos antimicrobianos é particularmente motivado

pela grande diversidade de espécies de plantas brasileiras cujas atividades

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biológicas são completamente conhecidas. Extratos de plantas e óleos essenciais

têm sido amplamente relatado para inibir o crescimento de ambos os fungos e

bactérias (RAMOS et al., 2009).

As propriedades antimicrobianas de substâncias presentes em extratos e

óleos essenciais produzidos pelas plantas como uma consequência do metabolismo

secundário, também são reconhecidas empiricamente há séculos e foram

comprovadas cientificamente apenas recentemente. Uma vez que as plantas

medicinais produzem uma variedade de substâncias com propriedades

antimicrobianas, é esperado que programas de triagem possam descobrir

compostos candidatos para o desenvolvimento de novos antibióticos (DUARTE,

2006).

5.3 A ESPÉCIE Hyptis crenata Pohl ex Benth (Lamiaceae)

A espécie Hyptis crenata (Pohl) ex Benth pertence à família Lamiaceae e à

ordem Lamiales – segundo classificação taxonômica proposta por Dahlgren. Esta

família é constituída por ervas, arbustos ou árvores (FALCÃO, 2003) e compreende

mais de 252 gêneros e 7.000 espécies (HUSSAIN, 2009).

O gênero Hyptis compreende cerca de 400 espécies (MAIA et al., 2001;

ANDRADE et al., 2002 apud REBELO et al., 2008) é exclusivamente neotropicais,

distribuídas desde o sul dos Estados Unidos e Caribe até a Argentina, excluindo-se

somente o extremo sul. Algumas espécies invasoras são bem estabelecidas na Ásia,

África e norte da Austrália. O centro da diversidade do gênero se encontra nos

campos cerrados do Brasil Central, mais especificamente nos estados de Minas

Gerais, Bahia e Goiás (FALCÃO, 2003).

Já descrita por Corrêa à espécie Hyptis crenata (Pohl) ex Benth (Lamiaceae)

é uma planta aromática e medicinal (BRAVIM, 2008) e é conhecida como "salva-do-

marajó", "salsa-do-campo" ou "hortelã-do-campo” e utilizada pelas comunidades

ribeirinhas como especiarias para aromatização de alimentos e na medicina como

antiinflamatória (REBELO et al., 2009).

O chá de suas folhas é usado popularmente como sudorífico, tônico,

estimulante, para tratar inflamação dos olhos e garganta, constipação e artrite

(BERG, 1993 apud BRAVIM, 2008). Além do chá, suas folhas são utilizadas como

repelente de insetos quando friccionadas sobre a pele (BRAVIM, 2008). O néctar de

suas flores é utilizado para a produção de mel (BRAVIM, 2008). O óleo e extrato

apresentam atividade antioxidante e citotóxica (REBELO, 2009). Estudos sobre a

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composição química de seu óleo essencial demonstraram a riqueza de

monoterpenos e sesquiterpenos (SCRAMIN et al., 2000; ZOGHBI et al., 2002).

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6 PROBLEMA

Diante do levantamento bibliográfico realizado neste projeto, observou-se que

existem muitos estudos envolvendo a família Lamiaceae, o gênero Hyptis e as suas

espécies. Esses estudos tem mostrado a ampla utilização das espécies do gênero

Hyptis principalmente na fitoterapia e medicina popular.

Regionalmente, porém, os estudos de atividade biológica e fitoquímica

envolvendo a espécie Hyptis crenata (Pohl) ex Benth (Lamiaceae) ainda são muito

incipientes necessitando de investigações científicas que venham contribuir

principalmente no campo da farmacologia de produtos naturais, percebendo assim a

escassez de informações a respeito das atividades biológicas, de estudo químico e

fitoquímico encontradas na estrutura da planta em análise, a salva-do-Marajó,como

é conhecida popularmente. Informações estas que se limitam ao conhecimento das

populações tradicionais, muitas das quais sem comprovações científicas acerca das

suas supostas potenciais propriedades farmacológicas, ainda que já existam

estudos comprovando sua atividade antinociceptiva e antiinflamatória de seus óleos

essenciais.

Que componentes químicos bioativos estão presentes em seus galhos? Quais

grupos de metabólitos são potencialmente ativos na condição de princípios ativos

com atividade farmacológica considerável? Seu extrato inibe pragas em outras

plantas?

Com essa pesquisa pretende-se averiguar quais as propriedades químicas e

biológicas que os galhos dessa espécie podem oferecer na condição de droga

vegetal no que se refere ao seu uso enquanto planta medicinal, através da

investigação experimental na busca da confiabilidade dos resultados encontrados

após a conclusão do projeto.

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7 MATERIAIS E MÉTODOS

Este estudo tem caráter experimental, exploratório e de natureza quali-

quantitativa.

As análises físico-químicas e a avaliação da atividade antimicrobiana serão

realizadas nos laboratórios de Química e Microbiologia, respectivamente, da

Universidade do Estado do Amapá (UEAP). A análise de metais através da

espectrofotometria por absorção atômica será feita em parceria com a Universidade

Federal do Amapá (UNIFAP), no Laboratório de Bioprospecção e Absorção Atômica.

Esta pesquisa utilizará micro-organismos (fungos e bactérias), onde serão

adquiridos do Laboratório de Farmacognosia e Fitoquímica da Universidade Federal

do Amapá (UNIFAP).

7.1 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS BRUTOS

Os galhos serão secos à temperatura ambiente e em seguida fragmentados

mecanicamente em moinho de facas. Este será submetido a um processo de

extração etanólica a quente sob refluxo à 45 °C, durante 45 minutos, sendo este

processo repetido 3 vezes. Em seguida, o material será filtrado e o extrato etanólico

obtido será concentrado em evaporador rotatório, sob pressão reduzida, obtendo-se

assim, os Extratos Brutos Etanólico dos galhos de H. crenata (EBEGHC)

(FALKENBERG et al., 2003; FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2010; KIANTIKOSKI,

2011). Os EBEFHC e EBEGHC foram utilizados para a triagem fitoquímica. Apenas

o EBEFCH foi utilizado nos ensaios antimicrobianos.

Para a obtenção do extrato aquoso, o material vegetal moído (galhos) será

submetido à extração aquosa à quente sob refluxo, em 45 °C, durante 45 minutos,

em 700 mL de água destilada. O extrato aquoso será obtido por filtração simples e

seco à temperatura ambiente obtendo-se assim, o Extrato Bruto Aquoso dos Galhos

de H. crenata (EBAGHC) (TREVISAN, 2010).

Os EBEGHC e EBAGHC serão utilizados para os testes antimicrobianos.

7.2 ANÁLISE FÍSICO-QUÍMICA

Entre os parâmetros físico-químicos que serão avaliados nesta pesquisa

estão o pH, teor de lipídios, teor de cinzas e umidade. As análises seguirão as

recomendações de Macêdo (2005), as normas do Instituto Adolfo Lutz (2008) e da

Farmacopéia Brasileira (2010) e realizadas em triplicatas.

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7.2.1 Determinação de pH

A determinação de pH, será feita de acordo com Macêdo (2005) e com as

normas estabelecidas pelo Instituto Adolfo Lutz (2008). Serão pesados 10 g do

material vegetal em um béquer e diluídos com auxílio de 100 mL de água. O

conteúdo será agitado até que as partículas fiquem uniformemente suspensas. O pH

será determinado utilizando-se um aparelho pHmetro previamente calibrado,

operando-o de acordo com as instruções do manual do fabricante.

7.1.2 Determinação de Lipídios

Serão pesados 2 a 5 g do material vegetal em cartucho de Soxhlet ou em

papel de filtro e amarrados com fio de lã previamente desengordurado. O cartucho

ou o papel de filtro amarrado será transferido para o aparelho extrator tipo Soxhlet.

O extrator será acoplado ao balão de fundo chato previamente tarado a 105° C. Será

adicionado éter em quantidade suficiente para um Soxhlet e meio adaptando-se a

um refrigerador de bolas. O aquecimento será mantido em chapa elétrica em

extração contínua por 8 (quatro a cinco gotas por segundo) ou 16 h (duas a três

gotas por segundo). O cartucho ou o papel de filtro amarrado será retirado, o éter

destilado e o balão com o resíduo extraído transferido para uma estufa a 105° C,

mantendo por cerca de 1 h. Após, este material será resfriado em dessecador até a

temperatura ambiente. Este será pesado repetindo-se as operações de aquecimento

por 30 min. na estufa e resfriamento até peso constante (no máximo 2 h).

Cálculo:

= % LIPÍDIOS, m/m

Onde:

N = massa em g de lipídios

P = massa em g da amostra

7.1.3 Determinação de Resíduo por Incineração – Cinzas Totais

As cinzas totais incluem cinzas fisiológicas e cinzas não fisiológicas. Serão

pesados, exatamente, cerca de 3 g do material vegetal pulverizado e transferindo

para um cadinho (de silício ou platina) previamente tarado. Distribuir a amostra

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uniformemente no cadinho e incinerar aumentando, gradativamente a temperatura

até, no máximo, 600 ± 25º C, até que todo o carvão seja eliminado. Um gradiente de

temperatura (30 min. a 200º C, 60 min. a 400º C e 90 min. a 600º C) poderá ser

utilizado. Resfriar em dessecador e pesar. Em caso de borbulhamento, será

adicionado inicialmente algumas gotas de óleo vegetal para auxiliar o processo de

carbonização. Nos casos em que o carvão não puder ser eliminado totalmente,

resfriar o cadinho e umedecer o resíduo com cerca de 2 mL de água ou solução

saturada de nitrato de amônio. Evaporar até secura em banho-maria e, em seguida,

sobre chapa quente, e incinerar até peso constante. Calcular a porcentagem de

cinzas em relação à droga seca ao ar.

Cálculo:

= % CINZAS, m/m

Onde:

N = massa em g de cinzas

P = massa em g da amostra

7.1.4 Determinação de Carboidratos

Para determinação do teor de carboidratos, 0,5 g do material vegetal serão

pulverizados, fazendo-se a extração usando 10 mL de etanol-água destilada (8:2

v/v) por centrifugação por duas vezes e depois coletando-se os sobrenadantes. O

resíduo da extração hidroetanólica será posteriormente utilizado para a extração de

polissacarídeos com água fervente. Será utilizado um espectrofotômetro UV-visível

para a medição da absorbância e o conteúdo de carboidratos será estimado por

método colorimétrico.

7.1.5 Determinação de Umidade – Método Gravimétrico

Serão pesados cerca de 1 a 2 g do material vegetal e transferida para pesa-

filtro chato previamente dessecado. Após resfriamento em dessecador, pesar o

pesa-filtro, tampado, contendo a amostra. Um agitamento brando será feito no pesa-

filtro para que o material vegetal seja distribuída da maneira mais uniforme possível,

a uma altura ideal de 5 mm. O pesa-filtro será colocado na estufa para secagem da

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amostra (geralmente a 105 °C) e por um determinado prazo, geralmente 2 h. A

amostra será esfriada até temperatura ambiente em dessecador. Será pesada,

repetindo-se a operação até peso constante.

Cálculo:

X 100

Onde:

Pa = massa da amostra em g.

Pu = massa do pesa-filtro contendo a amostra antes da dessecação.

Ps = massa do pesa-filtro contendo a amostra após a dessecação.

7.2 PESQUISA DE BIODISPONIBILIDADE MINERAL

As amostras serão calcinadas em mufla à 580-600°C durante 10-12h, até que

se constate a decomposição de toda a matéria orgânica. As cinzas obtidas serão

solubilizadas em ácido clorídrico 1:1 (v/v) e transferidas para balões volumétricos,

completando-se o volume de 100mL com água destilada. Os metais com presença

evidenciada nas amostras calcinadas serão determinados quantitativamente

empregando-se espectrofotometria de absorção atômica para Ca, Mg, Zn, Mn, Al,

Fe, Na e K (ALMEIDA et al., 2002).

7.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

Para a determinação das atividades antimicrobiana, será adotada como

referência a metodologia do Clinical and Laboratory Standards Institute - CLSI

(2009), com algumas modificações pertinentes. Para estes testes serão utilizadas as

cepas de duas bactérias Gram-positivas, Staphylococcus aureus e Staphylococcus

epidermidis e, duas Gram-negativa, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa,

assim como para a atividade fungicida que utilizará linhagens da espécie Aspergillus

niger.

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8 ANÁLISE DOS DADOS

Para os ensaios físico-químicos clássicos e de determinação

espectrofotométrica por absorção atômica, serão utilizados testes estatísticos

convencionais como média e desvio-padrão, além de obtenção de curvas de

absorbância obtidos do equipamento e gerados em software específico. Para os

testes antimicrobianos, serão aplicados testes estatísticos de análise de variância

(ANOVA) obtidos a partir da utilização do software Biostat®.

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9 CRONOGRAMA

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REFERÊNCIAS

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