Proposta de atividade didática para a disciplina QBQ3400 ... · A evolução da disciplina se deu...
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Universidade de São Paulo Instituto de Química
Proposta de atividade didática para a disciplina QBQ3400 – Bioquímica
Metabólica
Trabalho de conclusão da disciplina QBQ5825 – Prática de ensino de Química e Bioquímica
Melissa Cavalheiro Tourino
Supervisor da Disciplina: Prof. Dr. Sandro R. Marana
São Paulo, junho de 2010
2
Índice
1. Introdução................................................................................................03
2. Atividades desenvolvidas.........................................................................04
3. Dificuldades detectadas...........................................................................05
4. Proposta de atividade didática.................................................................06
5. Conclusões..............................................................................................12
6. Observações adicionais...........................................................................13
7. Sugestões adicionais...............................................................................14
8. Referências..............................................................................................17
9. Anexo I.....................................................................................................18
10. Anexo II..................................................................................................22
3
1. Introdução
O objeto de estudo foi uma turma de graduação matriculada na disciplina
QBQ3400 – Bioquímica Metabólica, lecionada pela Profa. Dra. Sayuri
Miyamoto, no Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Participaram
também da disciplina duas monitoras, Márcia Cristina, aluna de Doutorado
Direto do departamento de Bioquímica do Instituto de Química e Melissa
Tourino, aluna de mestrado do departamento de Análises Clínicas da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas.
As aulas foram ministradas no período noturno, duas vezes por semana.
A turma era composta por 57 alunos, matriculados, em média, no terceiro ano
do curso de Química. Por se tratar de uma turma noturna, a maioria dos alunos
desenvolviam atividades profissionais durante o dia, fato que acredita-se ter
influenciado no rendimento dos alunos no decorrer da disciplina. Durante o
semestre pôde-se observar certo desinteresse por parte dos alunos, com
exceção de alguns que tiveram ótimo rendimento.
A evolução da disciplina se deu diante de aulas expositivas, três aulas
práticas e listas de exercícios semanais resolvidas em sala de aula. As aulas
expositivas foram apresentadas essencialmente em Datashow, sem adoção de
outras técnicas didáticas. As aulas práticas foram referentes ao fracionamento
de proteínas, cinética enzimática e extração de lipídeos. Os exercícios eram
semanais e referentes ao conteúdo apresentado durante a semana. Eram
resolvidos em sala de aula com o auxilio de livros da área como "Princípios de
4
Bioquímica" (LEHNINGUER, A. L., et al), "Bioquímica" (VOET, D.) e
"Bioquímica Básica" (MARZZOCO, A., et al).
A avaliação do desempenho dos alunos ficou a cargo de três provas
escritas (subjetivas) e a computação das notas dos exercícios semanais e
relatório das aulas práticas. A média final foi calculada com base em média
ponderada.
2. Atividades desenvolvidas
Durante o semestre foram acompanhadas algumas aulas expositivas, as
aulas práticas, confecção e auxílio nas resoluções dos exercícios, além da
correção dos mesmos e dos relatórios.
As aulas práticas eram testadas no dia anterior para avaliação de
reagentes e condições necessárias e eram ministradas no Laboratório de
Didática do Bloco 7. Os alunos eram agrupados em trios para a execução da
prática e as aulas introdutórias, divididas entre as duas monitoras e a
professora Dra. Sayuri Miyamoto. Assim sendo, a prática de "Fracionamento de
Proteínas" foi apresentada pela monitora Márcia Cristina; a de "Cinética
Enzimática" pela monitora Melissa Tourino; e a de "Extração de Lipídeos" pela
Profa. Dra. Sayuri Miyamoto.
As listas de exercícios eram confeccionadas pelas monitoras com base
nos livros utilizados para a sua resolução em sala de aula, isto é, "Princípios de
Bioquímica" (LEHNINGUER, A. L., et al), "Bioquímica" (VOET, D.) e
5
"Bioquímica Básica" (MARZZOCO, A., et al), abrangendo de forma integrada
os assuntos abordados durante a semana.
As correções das listas de exercícios e dos relatórios das aulas práticas
eram divididas entre as monitoras e foi com base nessa experiência que pôde
se chegar a uma conclusão com relação às dificuldades enfrentadas pelos
alunos nessa disciplina.
3. Dificuldades detectadas
Após acompanhamento da disciplina, chegou-se à conclusão de que
uma das dificuldades apresentadas pela maioria dos alunos era com relação à
Cinética Enzimática. Vários pontos de deficiência dentro desse assunto
contribuíram para que o entendimento do conteúdo fosse prejudicado. São
eles:
3.1 Dificuldade na visualização da formação do complexo enzima-
substrato (ES), prejudicando, assim, o entendimento da forma pela qual
variações nas concentrações de enzima e substrato podem influenciar na
velocidade de uma reação enzimática;
3.2 Utilidade da transformação de Lineweaver-Burk, uma vez que os
alunos não enxergaram essa transformação como a possibilidade de se
calcular Vmáx e Km. Pelo que foi observado, os alunos entenderam que se
tratava apenas de uma outra possibilidade de visualização do gráfico V0 x [S], e
que Vmáx e Km poderiam sim ser calculados por este gráfico.
6
3.3 Tipos de inibição enzimática, no sentido da diferenciação das
relações existentes entre enzima-inibidor-substrato (EIS) características de
cada tipo de inibição e suas consequências em termos de variação de Vmáx e
KM.
4. Proposta de atividade didática
Para auxiliar e tentar sanar a dificuldade encontrada pelos alunos
referente ao conteúdo de cinética enzimática, propõe-se a utilização do
software Enzyme [1], desenvolvido pelo Laboratório de Tecnologia Educacional
da Unicamp. Trata-se de um software interativo e relativamente completo que
possibilita aos alunos a visualização, muitas vezes animada, dos parâmetros
necessários ao entendimento do assunto. O software pode ser baixado
diretamente da Revista Brasileira de Ensino de Bioquímica e Biologia Molecular
(RBEBBM) após cadastro e necessita da instalação do programa Adobe Flash
Player, disponível para download gratuito. Sendo assim, trata-se de um
material de fácil acesso, que pode ser utilizado tanto por professores, quanto
por alunos.
Iniciando o programa, na tela principal, os autores dividem o conteúdo
em dois tópicos:
4.1 - Enzima: Estrutura e Função
4.2 - Cinética Enzimática
7
Cada tópico possui subitens como textos explicativos, imagens,
animações, simulações de experimentos e uma seção de auto-avaliação
contendo oito questões sobre os assuntos abordados nos subitens.
O tópico “Enzima: Estrutura e Função” discorre sobre assuntos básicos
ao entendimento da cinética enzimática. Está estruturado da seguinte forma:
4.1.1Textos: 4.1.1.1 Energia livre
4.1.1.2 Aumento da velocidade de reação
4.1.1.3 Conformação Protéica
4.1.1.4 Efeitos do pH
4.1.1.5 Efeitos da temperatura
4.1.1.6 Efeitos da [S]
4.1.1.7 Classificação enzimática
4.1.1.8 Enzimas alostéricas
4.1.1.9 Ligação não-covalente
4.1.1.10 Ligação covalente
4.1.2 Imagens: 4.1.2.1 Estrutura primária, secundária, terciária e quaternária
4.1.2.2 Gráfico Distribuição de energia
4.1.2.3 Gráfico Aumento de energia
4.1.2.4 Gráfico Adição do catalisador
4.1.2.5 Gráfico Redução da energia de ativação
4.1.2.6 Gráfico pH ótimo
4.1.2.7 Gráfico Temperatura ótima
8
4.1.2.8 Classificação das enzimas
4.1.2.9 Gráfico sigmóide
4.1.2.10 Gráfico Modulador alostérico
4.1.2.11 Feedback
4.1.2.12 Ligações covalentes
4.1.3 Animações: 4.1.3.1 Efeito do pH
4.1.3.2 Ação de Oxidorredutases
4.1.3.3 Ação de Transferases
4.1.3.4 Ação de Hidrolases
4.1.3.5 Ação de Liases
4.1.3.6 Ação de Isomerases
4.1.3.7 Ação de Ligases
4.1.3.8 Ação de Moduladores alostéricos
4.1.4 Simulação: Experimento interativo demonstrando os efeitos do pH,
temperatura e [S] sobre enzimas como pepsina, tripsina e TAQ-polimerase.
Auxilia na compreensão de pH e temperatura ótimos.
Embora esse tópico seja bastante relevante para a compreensão do
assunto, o conteúdo apresentado pode ser encontrado facilmente em livros da
área, não oferecendo alternativa didática tão inovadora, à exceção dos itens
animações e simulações, que são muito interessantes no sentido de
fornecerem uma opção visual e animada do que acontece durante a reação
9
enzimática de acordo com diferentes tipos de influências. Além disso, os itens
abordados neste tópico não representam o foco desse trabalho.
Já o segundo tópico, “Cinética Enzimática”, é o que abrange maior parte
das dúvidas apresentadas pelos alunos. Encontra-se dividido em:
4.2.1 Textos: 4.2.1.1 Cinética enzimática
4.2.1.2 Constante de Michaelis-Menten
4.2.1.3 Gráfico Duplo-Recíproco
4.2.1.4 Inibidores competitivos reversíveis
4.2.1.5 Inibidores não-competitivos e mistos reversíveis
4.2.1.6 Inibidores incompetitivos reversíveis
4.2.1.7 Inibidores irreversíveis
4.2.2 Imagens: 4.2.2.1 Gráfico V0 x [S]
4.2.2.2 Gráfico representativo do KM
4.2.2.3 Equação de Michaelis-Menten
4.2.2.4 Gráfico Duplo-Recíproco
4.2.2.5 Equação de Lineweaver-Burk
4.2.2.6 Esquema de inibição competitiva
4.2.2.7 Comportamento de inibidores competitivos
4.2.2.8 Esquema de inibição não-competitiva
4.2.2.9 Comportamento de inibidores não-competitivos
4.2.2.10 Comportamento de inibidores mistos
4.2.2.11 Esquema de inibição incompetitiva
10
4.2.2.12 Comportamento de inibidores incompetitivos
4.2.2.13 Esquema de inibição irreversível
4.2.3 Animações: 4.2.3.1 Inibição competitiva
4.2.3.2 Inibição não-competitiva
4.2.3.3 Inibição incompetitiva
4.2.4 Simulações:
4.2.4.1 Experimento de Regulação Enzimática – experimento
interativo que compara os gráficos V0 x [S] e Duplo-Recíproco diante de
inibidores competitivos e não-competitivos em concentrações variadas. O
usuário do software pode escolher um tipo de inibidor, determinar sua
concentração e a do substrato da reação e observar a conseqüência de sua
escolha na quantificação do produto formado em determinado tempo. Esse
experimento demonstra muito claramente o comportamento dos inibidores
competitivos e não-competitivos, quando presentes na reação.
4.2.4.2 Experimento de Cinética – pode-se avaliar de maneira
interativa e animada a concentração de substrato, interações ES e quantidade
de produto formado em diferentes pontos da reação enzimática, isto é,
demonstra esses parâmetros quando a velocidade de reação é igual a ¼ da
velocidade máxima, quando é ½ da velocidade máxima (referente ao KM) e
quando atinge a velocidade máxima. Basta o usuário clicar nessas posições.
11
Esse tópico também apresenta itens facilmente encontrados em livros da
área, como os textos e as imagens, porém, as animações e simulações
mostram-se bem didáticas e simples, passando de maneira clara e objetiva as
idéias que se propõem a passar. A interação de todos os subitens desse tópico
proporciona ao usuário do software ferramentas valiosas para o sucesso na
compreensão do conteúdo como um todo.
Mais especificamente, o Experimento Cinética auxilia de maneira muito
positiva no entendimento da relação entre [S] e formação de complexos ES de
acordo com o andamento da reação, um dos pontos apresentados como
deficiência dos alunos. Esse experimento pode ser um complemento à
exposição teórica e das imagens a respeito da evolução da reação como os
gráficos V0 x [S], KM e Equação de Michaelis-Menten.
O experimento de Regulação Enzimática, por promover uma
comparação entre os gráficos V0 x [S] e Duplo-Recíproco, diante de inibidores,
salienta a idéia de que um gráfico é complementar ao outro, e pode ser
utilizado com essa finalidade após discussão de imagens isoladas dos gráficos
V0 x [S], KM e Duplo-Recíproco. Essa atitude pode auxiliar na resolução do
segundo ponto deficiente dos alunos.
Na tentativa de solucionar o terceiro ponto de dúvida detectado, a
sugestão é utilizar também o experimento de Regulação Enzimática, pois
confronta os comportamentos distintos apresentados por reações na presença
de inibidores competitivos e não-competitivos, auxiliando na sua distinção.
Além disso, as animações relacionadas aos tipos de inibição são bem simples
e claras, sendo alternativas interessantes para a sedimentação dessa idéia.
12
Associado a isso há, como para os demais pontos deficientes citados, os
componentes mais teóricos como textos e imagens que podem ser utilizados
em conjunto.
Nesse momento do software foi detectada uma deficiência já que nas
animações são apresentados os comportamentos de três tipos de inibidores
(competitivos, não-competitivos e incompetitivos) e no experimento de
regulação enzimática são utilizados apenas dois tipos (competitivos e não-
competitivos). Essa variação, associada à ausência do quarto tipo de inibição
(mista) em ambos os subitens, pode gerar dificuldade ao docente no momento
de sua apresentação aos alunos, porém, como trata-se de um software de
auxílio, sugere-se que o docente intercale seu uso com a apresentação em
powerpoint ou até mesmo em quadro negro. Uma outra opção é, após
passados os conceitos e comportamentos dos tipos de inibidores ausentes no
software na aula expositiva, o docente estimule a participação dos alunos a
desenharem no quadro negro, a exemplo do software, os gráficos V0 x [S] e
duplo recíproco característicos de cada tipo de inibição.
5. Conclusões
Diante do que foi exposto conclui-se que trata-se de um software
relativamente completo, com uma distribuição didática bem ampla, uma vez
que fornece informações de várias naturezas, abrangendo todas as
capacidades, seja por meio da leitura de textos, da visualização de imagens
e/ou de animações.
13
Pode-se dizer que sua utilização alcança o objetivo desse trabalho pois
conseguiu fornecer ferramentas úteis para a solução dos pontos detectados
como deficientes nos alunos da disciplina acompanhada.
O software pode ser apresentado aos alunos por partes, à medida que o
conteúdo avança nas aulas expositivas, principalmente as imagens e
animações, ficando as simulações de experimentos para a sedimentação da
idéia como um todo. Não é necessária a divisão da turma, a apresentação
pode ser feita pelo docente em sala de aula após a aula expositiva, utilizando o
computador já em uso.
O fato de não representar custos à Universidade valoriza ainda mais o
uso do software, pois trata-se de uma opção didática interessante, ampla e de
qualidade, ao alcance do docente, possibilitando-o desenvolver e enriquecer
suas atividades com uma ferramenta mais chamativa aos olhos dos alunos.
É importante salientar que embora seja um software de qualidade,
apresenta falhas, não devendo ser utilizado com a finalidade de substituição
das aulas expositivas e sim como uma complementação, uma opção de
enriquecimento visual do conteúdo.
6. Observação adicional
Aulas práticas revelam-se ser atividades úteis e essenciais para os
alunos visualizarem, na prática, os assuntos que foram abordados na teoria,
possibilitando a sedimentação das informações. Associado a essa idéia, vem o
fato de que os alunos apresentam aptidões diferentes no tocante ao
14
entendimento dos conteúdos ministrados, isto é, há alunos com habilidades
mais teóricas, outros práticas e, ainda, alunos que conseguem associar ambas
as formas de conhecimento. Cabe ao docente promover certa variabilidade
didática para que possa alcançar e satisfazer essas diferentes capacidades.
Além disso, o contato íntimo com a prática propicia aos alunos um treinamento
valioso para o futuro no mercado de trabalho, tanto com relação ao manuseio
de equipamentos e insumos do laboratório quanto ao senso de trabalho em
equipe e organização.
Durante o acompanhamento da disciplina pôde-se observar um número
reduzido de aulas práticas em laboratório. Foram ministradas apenas três aulas
durante o semestre, o que acredita-se ser um número muito reduzido por se
tratar de uma disciplina de conteúdo extenso e variado.
Ao longo do semestre foram abordados em aula prática o fracionamento
de proteínas, a cinética enzimática e a extração de lipídeos. Ambas são
relevantes para o entendimento do conteúdo da disciplina e abordam pontos
importantes, porém, acredita-se que há outros assuntos que poderiam ser
abordados para o enriquecimento da disciplina.
7. Sugestões adicionais
Sugerem-se dois assuntos para serem abordados em aula prática:
Caracterização de Proteínas e Propriedades das Enzimas, retirados do material
didático da disciplina de Bioquímica, ministrada ao curso de Farmácia da
15
Universidade Federal de Alfenas (Unifal). As aulas são compostas pelos
seguintes experimentos (os protocolos encontram-se no Anexo I):
7.1 Aula 1: Caracterização de Proteínas:
7.1.1 Determinação do ponto isoelétrico da caseína [2] – os alunos
preparam tubos contendo caseína (leite desnatado) em
variados valores de pH e observam a precipitação da proteína
em seu ponto isoelétrico.
7.1.2 Identificação de aminoácidos:
7.1.2.1 Reação Xantoprotéica – demonstra a presença de anel
aromático de aminoácidos como fenilalanina, tirosina e
triptofano.
7.1.2.2 Reação de Millon – específica para a identificação de
tirosina, pela reação de seu grupo hidroxifenil com
fenilato de mercúrio.
7.1.2.3 Reação de enxofre – evidencia a presença de enxofre
na estrutura de cistina e metionina.
7.1.2.4 Reação de Pauly – específica para a identificação de
tirosina e histidina, pela reação do anel imidazólico da
histidina e grupo fenil da tirosina com ácido sulfônico.
7.1.2.5 Reação de Sakaguchi – Identifica o guanido grupo da
arginina.
16
7.2 Aula 2: Propriedades das enzimas:
7.2.1 Influência da temperatura - demonstra a variação de atividade
enzimática na presença de temperaturas diferentes.
7.2.2 Influência do pH – demonstra a variação da atividade
enzimática na presença de diferentes valores de pH.
7.2.3 Especificidade enzimática – compara resultados de atividade
de enzimas quando reagem com seus substratos e quando
reagem com outros compostos que não são substratos.
A primeira aula evidencia, principalmente, características estruturais das
proteínas e seus aminoácidos. As reações são bem simples e seus resultados,
claros. É possível que a execução dessa prática auxilie na sedimentação do
conhecimento a respeito das estruturas dos aminoácidos e da ocorrência do
estado de Zwitterion ou ponto isoelétrico.
A aula de "Propriedades das Enzimas" reforça idéias abordadas nas
aulas expositivas e funciona até como um complemento ao software sugerido
como proposta de atividade didática neste trabalho. Apresenta resultados
práticos das influências sofridas pela temperatura e pH, além de elucidar
claramente a propriedade de especificidade enzimática, o que auxilia na
resolução do primeiro ponto de dificuldade apresentado no item 3 desse
trabalho.
As aulas pode ser executadas conforme os procedimentos já adotados
pela disciplina com relação a aulas práticas, descritos na introdução. Os
17
reagentes utilizados são de fácil acesso e provavelmente já constam da lista de
insumos do Laboratório de Didática, onde são ministradas as aulas práticas.
8. Referências
1. GALEMBECK, E.; FILHO, C. E. S. P. Enzyme Revista Brasileira de
Ensino de Bioquímica e Biologia Molecular, 03 sep. 2007. Disponível
em:
<http://www.ib.unicamp.br/lte/rbebbm/visualizarMaterial.php?idMaterial=
528>. Acesso em: 05 abr. 2010.
2. IB, D. B. -. Desnaturação de Proteínas Revista Brasileira de
Ensino de Bioquímica e Biologia Molecular, 05 abr. 2007.
Disponível em:
<http://www.ib.unicamp.br/lte/rbebbm/visualizarMaterial.php?i
dMaterial=454>. Acesso em: 23 jun. 2010.
3. Manual de técnicas em histologia e biologia celular do
laboratório de biologia celular da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo, 2002.
18
Anexo I
Protocolos das aulas práticas
Aula 1: Caracterização de proteínas
1. Determinação do ponto isoelétrico da caseína (proteína do leite)
Tubos Água destilada
(mL)
Ac acético
0,01M (mL)
Ác acético
0,1M (mL)
Ac acético
1M (mL)
Caseína
(mL)
pH
1 8,4 0,6 - - 1,0 5,9
2 7,7 1,3 - - 1,0 5,5
3 8,7 - 0,3 - 1,0 5,3
4 8,5 - 0,5 - 1,0 5,0
5 8,0 - 1,0 - 1,0 4,7
6 7,0 - 2,0 - 1,0 4,4
7 5,0 - 4,0 - 1,0 4,1
8 1,0 - 8,0 - 1,0 3,8
9 7,4 - - 1,6 1,0 3,5
Numere os tubos de acordo com a tabela acima e adicione os reagentes nesta
ordem: água destilada, ácido acético e leite desnatado (caseína). Observe o
que aconteceu e determine o ponto isoelétrico da caseína (pI).
19
2. Identificação de aminoácidos
Solução protéica = clara de 1 ovo + 200 mL de água
3.1 Reação Xantoprotéica
Em um tubo de ensaio colocar 2 mL de solução protéica e 10 gotas de
ácido nítrico concentrado. Aquecer até o aparecimento de coloração amarelo
claro. Adicionar amoníaco concentrado ou hidróxido de amônio e agitar até que
a coloração se fixe em alaranjado, indicando a presença de um anel aromático.
3.2 Realção de Millon
Colocar em um tubo de ensaio 2 mL de solução protéica e 8 gotas do
reativo de Millon (protocolo no Anexo II), agitar. Aquecer em chama direta até
que o precipitado se torne avermelhado, indicando a presença de tirosina.
3.3 Reação de enxofre
Colocar em um tubo de ensaio 2 mL de solução protéica e 1 mL de
NaOH 10%, agitar. Aquecer por 2 minutos e em seguida acrescentar 4 gotas
de acetato de chumbo 10%, agitar. Observar o escurecimento da mistura,
devido à formação de sulfeto de chumbo.
3.4 Reação de Pauly
Colocar em um tubo de ensaio 5 mL da solução protéica, 1mL de
carbonato de sódio 10%, 1 mL de diazo-reagente de Ehrlich (comercial), agitar.
20
A reação positiva se traduz pelo aparecimento de coloração alaranjada,
indicando a presença de tirosina e histidina.
2.5 Reação de Sakaguchi
Colocar em um tubo de ensaio 2 mL da solução protéica, 4 gotas de
NaOH 10%, 8 gotas de solução alcoólica de alfa-naftol 5%, 2 mL de solução de
hipoclorito de sódio, agitar. O aparecimento de cor vermelha intensa indica a
presença de arginina.
Aula 2: Propriedades das enzimas
Lavar bem a boca e coletar cerca de 5 mL de saliva (amilase). Depois
fazer a diluição da saliva (1:1) colocando 2 mL de saliva e 2 mL de água
destilada.
1. Influência da temperatura
Numerar dois tubos de ensaio e colocar em cada um deles, 3 mL de
solução de amido 1%. Levar o primeiro tubo ao banho maria à 37oC, e
mergulhar o segundo tubo em banho de gelo, durante 10 minutos. Adicionar
0,4 mL de saliva diluída (1:1) em cada tubo e agitar. Após 5 minutos, retirar os
tubos do banho maria e banho de gelo e adicionar 3 gotas de iodo (lugol) em
cada tubo, agitar. Interpretar o resultado.
21
2. Influência do pH
Numerar 3 tubos de ensaio de adicionar a cada um deles:
Tubo 1: 3 mL de solução de amido 1% + 1 gota de NaOH 0,1M + 0,4 mL
de saliva diluída (1:1), agitar.
Tubo 2: 3 mL de solução de amido 1% + 1 gota de ácido acético 1N +
0,4 mL de saliva diluída (1:1), agitar.
Tubo 3: 3 mL de solução de amido 1% + 0,4 mL de saliva diluída (1:1),
agitar.
Levar os tubos ao banho maria 37oC durante 15 minutos. Após esse
tempo adicionar 3 gotas de iodo em cada tubo e agitar. Interpretar o resultado.
3. Especificidade enzimática
Colocar em 4 tubos de ensaio numerados:
Tubo 1: 1,0 mL de sacarase + 1 mL de sacarose 1%
Tubo 2: 1 mL de sacarase + 1 mL de amido 1%
Tubo 3: 1 mL de saliva + 1mL de amido 1%
Tubo 4: 1 mL de saliva + 1 mL de amido 1%
Agitar todos os tubos. Levar os tubos ao banho maria 37oC por 10
minutos. Adicionar a cada um dos tubos, 1 mL do reativo de Benedict
(identificador da presença de açucares redutores). Aquece-los até a diluição.
Observar e interpretar os resultados.
22
Anexo II
Protocolos de preparo de reagentes
1. Reativo de Millon [3]
Preparar solução aquosa de ácido nítrico 40%, dissolvendo o ácido gota
a gota na água (40 mL de ácido nítrico + 60 mL de água destilada). Deixar
solubilizar por 48 horas. Diluir 40 mL dessa solução em 360 mL de água
destilada para obtenção de 400 mL de ácido nítrico 4%. Deixar repousar por 24
horas. Saturar essa solução com excesso de cristais de nitrato de mercúrio.
Filtrar e adicionar 1,4g de nitrato de sódio e 4 mL da solução aquosa de ácido
nítrico 40% (preparada inicialmente). O reativo de Millon assim preparado pode
ser guardado em geladeira por muito tempo.