PROPRIEDADES FUNCIONAIS DAS FITOMOLÉCULAS · Fracionar o óleo essencial para obtenção do...

Prof. Dra. Marcia Ortiz Mayo [email protected]

Bento Gonçalves – RS17 a 21/10/2011

PROPRIEDADES FUNCIONAIS DAS FITOMOLÉCULAS

Marcia Ortiz Mayo MarquesLaboratório de Produtos Naturais

Centro de P&D de Recursos Genéticos VegetaisINSTITUTO AGRONÔMICO (IAC)


FITOMOLÉCULAS

PROPRIEDADES FUNCIONAIS


Função Fitomoleculas: Comunicação

Defesa herbívoros

Polinização

Dispersão sementes

Vespa (Braconidae) parasitando pulgão emuma planta de Cyphomandra betacea.

Foto: Montero & Naranjo.


HENTRICH et al, 2007

VARASSIN et al, 2000

2

1: larvas de lepidópteros (Spodoptera littoralis)

2: larvas de larvas do coleóptero Diabrotica virgifera virgifera

Difosfato de farnesila trans-cariofileno

(*) Terpeno Sintase 23 (TPS23): expressão desta enzima é controlada no nível transcricional e induzida, independentemente, pelos danos causados nas folhas por S. littoralis e nas raízes por D.virgifera

Conclusão: trans-cariofileno pode atrair os inimigos naturais dos herbívoros ( nematóides e vespas parasitas).

*

Kollner et al, The Plant Cell, v. 20, p. 482–494, 2008


Comunicação: Polinizadores

HENTRICH et al, 2007

Mamíferos:

...Polen, nectar, resinas.


linalolgeraniol

alcool benzílico


Classe Composto Planta Polinizador Referência

TerpenosPineno Antúrios

(Anthurium sp)

Orquideas(Oncidium sp)

Passifloras(P. alata)

Abelhas(Meliponinae)

HENTRICH etal, 2007

REIS et al, 2000

Geraniol

Limoneno

LinalolMamangaba(Xylocopa sp)


Benzenóides

Alcool benzílicoPassifloras(P. mucronata)

Morcego (Glossophaga sp)


Benzoato de benzila

Orquideas(Gymnadeniasp)

Borboletas(Lepidoptera)

Huber et al,2005

Derivados lipídeos

HeptadecenoAnturiosOrquideas

Abelhas(Eulossa sp)

HENTRICH et al, 2007Huber et al,2005


FLAVONÓIDES, ÁCIDOS GRAXOS E ESTILBENO

ÁCIDOS ω-3

http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://resveratrolbenefit.org/wp-content/uploads/2009/06/resveratrol-picture.jpg&imgrefurl=http://resveratrolbenefit.org/&usg=__802PiRFvpJwBq3D2oVpUQsJPp5s=&h=252&w=260&sz=11&hl=pt-BR&start=2&tbnid=aCLuFSiocELf3M:&tbnh=109&tbnw=112&prev=/images%3Fq%3D%2522resveratrol%2522%26hl%3Dpt-BR%26lr%3D%26sa%3DN


Gingerol Shogaolgengibre

Propriedade: antitumoral, antioxidante

Catharantus roseus L.Sulfato de vincristinavincristina


Espécie: Chamomilla recutita - Família: Annonaceae

Objetivo: Avaliar a atividade do (-) bisabolol, principal

componente do óleo essencial de Chamomilla recutita,

contra o Leishmania infantum.

*agente etiológico da leishmaniose nos países da bacia mediterrânica


Leishmanioses são causados por protozoários do

gênero Leishmania que afetam o homem e outras espécies de

mamíferos, incluindo os caninos, que são os principais hospedeiros da

doença.

A leishmaniose humana é encontrada em regiões

com um clima quente.

O agente patogênico da leishmaniose na Península Ibérica é

a espécie Leishmania infantum. A maior incidência está no

Mediterrâneo e da zona central da península, principalmente entre

crianças (Castro et al. 2003 ).


O tratamento farmacológico da doença, apresenta uma vasta gama de

reações adversas, motivando a busca de novos agentes no controle da doença.

Assim, tem havido um crescente interesse na utilização de componentes do óleo

essencial contra a leishmaniose (Rosa et al. 2003)

Teste da pureza do (-)α-bisabolol

(-)α-bisabolol foi fornecido por Sensient

Fragrances S.A. (Granada, Spain).

A purificação foi avaliada por GC-MS (Gas

Chromatograph Hewlett-Packard 5973)


Padronizou-se a concentração de promastigotas de 1x106

nas culturas de Leishmania infantum em meio RPMI-1640 no inicio

do experimento.

(-)α-bisabolol foi diluído em 1% dimetilsulfóxido (DMSO),

com meio RPMI-1640 nas concentrações de 1,000 mg / mL. Obtendo

a partir desta as concentrações de 1000, 500, 250, 125, 100, 75, 62,5,

50, 37,5, 31,2, 25; 18,75, 15,6, 12,5, 7,8 e 6,25 mg/mL


Família: Asteraceae

Nome popular: catinga-de-bode, mentrasto, maria-

preta, picão-branco, picão-roxo, erva-de-São João,

erva-de-São-José, erva-de-Santa-Lúcia


Aflatoxinas são produtos do metabolismo secundário de Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus.

Contaminam grande variedade de alimentos,principalmente o amendoim, nozes, sementes de algodão, milho, trigo, sementes oleosas em geral, ração animal, produzindo a aflatoxina em condições ambientais adequadas, como temperatura entre 25-30 Celsius e atividade de água superior a 0,86.

A contaminação de grãos com micotoxinas e fungos toxigênicos, pode ocasionar,além de problemas de saúde, perdas econômicas consideráveis já que lotescontaminados devem ser descartados.

A FAO (Food and Agriculture Organization) estima uma perda mundial de 25%dos grãos produzidos.


Aflatoxina B1: altamente tóxica


OBJETIVOS

Avaliar o potencial do óleo essencial de folhas e flores de mentrasto (Ageratum conyzoides) na inibição do crescimento e da produção da aflatoxina B1 (AFB1) em cultura de Aspergillus flavus,

Avaliar a composição química do óleo essencial das folhas e flores de mentrasto;

Fracionar o óleo essencial para obtenção do princípio ativo inibidor do crescimento e da produção de aflatoxina B1;

Avaliar possíveis alterações na ultra-estrutura celular do fungo.


Óleo essencial das folhas e flores : hidrodestilação

Concentrações de óleo essencial : 30 μg/mL; 20 μg/mL; 10 μg/mL; 5μg/mL; 1 μg/mL; 0,40 μg/mL; 0,20 μg/mL; 0,10 μg/mL; 0,04μg/mL; 0,020μg/mL; 0,01 μg/mL and 0,00 μg/mL (controle).

Microscopia eletrônica: avaliação da atividade dos óleos essenciais nas células do fungo.

Frações foram purificadas por : CCDP

Identificação das substâncias: EM

MATERIAL E MÉTODOS


Estruturas químicas dos principais componentes do óleo essencial de folhas e flores de Mentrasto.


Composição química: principais componentes foram o precoceno II (46,35%), precoceno I (42,78%), cumarina (5,01%) e trans-cariofileno(3,02%).

Precoceno II é o composto ativo do óleo essencial.

Atividade: Inibiram significativamente o crescimento do fungo m 58%, 61% 44%, 45%, 63%, 63%, 57%, 49%, 30%, 29% e 20%.

As concentrações (58 a 49%) inibiram a produção da aflatoxina B1 completamente.

Observada alterações ultraestruturais dependente da concentração do óleo essencial de Ageratum conyzoides utilizado. Mais evidentes no sistema das endomembranas, afetando principalmente a mitocôndria.

RESULTADOS


• Brasil – maior mercado de agrotóxicos no mundo;

•Mercado Pessoal, Perfumaria e Cosméticos * :

3ª posição mundial

Crescimento médio de 10,5% (últimos 15 anos)

US$ 37,4 bilhões

•Aromas: crescimento de cerca de 5% ao ano,

* ABIHPEC; 2011 Euromonitor International

IMPORTÂNCIA ECONÔMICA


Pesquisas com Plantas Aromáticas e Medicinais (IAC)

Nativas/Cultivadas

Bioprospecção

Óleos Essenciais Extratos Vegetais

• Caracterização Química•Caracterização Olfativa• Avaliação Biológica

• Domesticação • Diversidade Genética

•Genômica e metabolômica

• Melhoramento Genético


BIOPROSPEÇÃO DE PLANTAS AROMÁTICAS NATIVAS

Objetivo : avanço do conhecimento da flora aromática nativa sob o ponto de vista:

• levantamento taxonômico;

• variabilidade química e genética;

•agregar valor as espécies;

• contribuir para o uso sustentável ;

• conservação das espécies


Família Gênero Espécie

36 82 157

Número de famílias botânicas, gêneros e espécies do Cerrado e Mata Atlântica avaliadas


EXPEDIÇÃO DE COLETA

EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS E PREPARO DE EXTRATOS

ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA

DIVERSIDADE QUÍMICA E GENÉTICA

DOMESTICAÇÃO

AVALIAÇÃO OLFATIVA E DA ATIVIDADE BIOLÓGICA *

MELHORAMENTO GENÉTICO


EXTRAÇÃO DE FITOMOLÉCULAS VOLÁTEIS (ÓLEOS ESSENCIAIS)

HIDRODESTILAÇÃO


DESTILAÇÃO POR ARRASTE A VAPOR


ROTINA DE ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS

Óleos essenciais

CG - EM CG - DIC

EM IR co-injeção de padrões IR co-injeção de padrões

Isolamento: CCDC; CC; CLAE

IV EM RMN de 1H RMN de 13C

* Substâncias não identificadas


Atividade bacteriana dos óleos essenciais de

Baccharis dracunculifolia e Vernonia scorpioides **

(*): José P. de Siqueira-Júnior/ Lab. Genética de Microorganismos – UFPB)

Óleos essenciais: avaliados em linhagens de Staphylococcus aureus

Bombas de efluxo: proteínas integrantes da membrana plasmática bacteriana e que tem sido responsabilizadas por diversos casos de resistência a drogas , as quais são expelidas para fora da célula ;

CIM: método da diluição em meio de cultura solidificado em diferentes concentrações


Linhagens/Antibiótico OE de B. dracunculifolia OE de V. scorpioides

IS-58 / Tetraciclina 5 ≥20

RN-4220 / Eritromicina 10 ≥20

SA-1199B / Norfloxacina ≥20 ≥20

Tabela 1. CIM (µg/mL) dos óleos essenciais (µL/mL) de B. dracunculifolia e V. scorpioides.

OEBd - óleo essencial de B. dracunculifolia; OEVs - óleo essencial de V. scorpioides

Tabela 2. CIM (µg/mL) do norfloxacina (Nor) na ausência e na presença de concentrações

subinibitórias dos óleos essenciais.

NORNOR + OEBd

(CIM 1/4)

NOR + OEBd

(CIM 1/8)

NOR + OEVs

(CIM 1/4)

NOR + OEVs

(CIM 1/8)

64 4 (16) 16 (4) 8 (8) 64 (0)

*entre parênteses, os fatores de redução da CIM.

Resultado: OE não apresentaram atividade antiestafilococicaOE + NOR : atividade moduladora da resistência, indicando inibição

de bomba de efluxo


Principais componentes do óleo essencial de Baccharis dracunculifolia

E-nerolidol


β-pineno


limoneno


Principais componentes do óleo essencial de Vernonia scorpioides

E-cariofileno


germacreno D


α-E-E-farneseno


ÓLEO ESSENCIAL DE Lychnophora pinaster MART

M eO OM eO O

cinamato de metila

•Família: Asteraceae

•Nome popular: arnica, arnica mineira

•Ocorrência - restrita a complexos rupestres de MG, BA e GO

•Substância majoritária:

• indústria alimentícia: aromatizante (sintético);

• atração de insetos


CARACTERIZAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA,

VIA MARCADOR MICROSSATÉLITE, E CONSTITUINTES DO ÓLEO ESSENCIAL DE

Lychnophora pinaster MART

Doutorado : LENITA LIMA HABER/FCA-UNES-Botucatu (2008)Co-orientação: Dra. Maria Imaculda Zucchi – APTA Polo Regional Centro Sul


• Uso popular:

• folhas e flores : extrato alcoólico e pomada

antiinflamatória, analgésica e cicatrizante ferimentos,

contusões ou hematomas, picadas de insetos

(Pinheiro, 2002; Souza, 2003)

• uso cosmético

sabonete - eliminar asperezas e rachaduras, suavizar

hematomas e contusões

(Almeida et al., 1998)

Lychnophora pinaster


OBJETIVOS

Avaliar a variabilidade genética de Lychnophora pinaster por

meio de marcador molecular microssatélite;

Avaliar a composição química dos óleos essenciais dos

indivíduos coletados em populações nativas no estado de MG;

Avaliar a composição química dos óleos essenciais cultivados

em Botucatu – SP


COLETA


• População

• amostrados 20 indivíduos a;

• material vegetativo para propagação;

• folhas para análises do O.essencial e genética;

• amostras de solo;

• material para a confecção de exsicatas – depositadas no herbário do

IAC;

• dados de localização geográfica;

MATERIAL E MÉTODOS


CULTIVO L. pinaster


•Coleta do material nativo: Lavras (Antena , Estrada Real), Carrancas (Estrada

Real)

Colheita do material cultivado: 3 estações do ano ( verão, outono e inverno);

• Secagem: 40 C até peso constante;

• Extração do óleo essencial: hidrodestilação em aparelho Clevenger por 2hs;

•Análise do óleo essencial: CG-EM

•Avaliação dos resultados : análise multivariada (ACP)

Colheita, Extração e análise dos óleos essenciais


CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR

•Extração do DNA - construção da biblioteca enriquecida com locos microssatélites e estudo

da variabilidade genética e da estrutura populacional;

• Protocolo de extração de DNA baseado no uso de CTAB com modificações.

Doyle e Doyle (1990 )

• Quantificação do DNA - gel de agarose,

• Comparação do tamanho e da intensidade das bandas do DNA com bandas de DNA

do fago λ - 10ng/µL.

Marcador molecular: microsatélite


CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR

• Construção da biblioteca enriquecida com locos SSR,

• Protocolo descrito por Billotte et al. (1999) com modificações;

• primers obtidos - seqüenciados, desenhados (Centro de Citricultura -

Cordeirópolis) e sintetizados (Imprint do Brasil).

• Otimização das condições de amplificação dos primers - série de amplificações com a Taq

polimerase,

• temperatura de reassociação (48º - 54ºC);

• concentração de MgCl2 (0,375 – 1,5µL);

• DNA (2,5 - 5,0µL);

• primers (1,0 - 4,0µL).


AVALIAÇÃO DOS LOCOS

• Programa Micro-Checker

• freqüência de alelos nulos,

• amplificação preferencial de alelos menores

• possíveis erros de genotipagem devido à presença de bandas

fantasmas (bandas duplicadas);

• Freqüências alélicas e genotípicas Teste exato de Fisher

• aderência às proporções de Equilíbrio de Hardy-Weinberg;

• Desequilíbrio genotípico entre pares de locos desequilíbrio de ligação;


DIVERSIDADE GENÉTICA

• Freqüências alélicas FSTAT,

• Diversidade genética GDA,

• número médio de alelos (A),

• heterozigozidades esperada (He) e observada (Ho),

• índice de fixação;

• taxa de cruzamento aparente.

ESTRUTURA GENÉTICA

• Variâncias das freqüências alélicas estatísticas F

• índice médio de fixação dentro das populações – f,

• índice de fixação total das populações – F

• divergência genética entre populações – θp

• parâmetro Rst

• fluxo gênico aparente (Nm) entre populações


RESULTADOS

Populações nativas : substâncias majoritárias

.

M eO OM eO O

cinamato de metila

OH

H

cedr-8(15)-em-9-alfa-ol

H

H

H

H

trans-cariofileno

E E

E

-humuleno

E E

E

E E

E

-humuleno


Componentes majoritários (%) dos óleos essenciais das populações nativas de Lavras(Antena e Poço Bonito) e de Carrancas (Estrada Real e Estrada Real 1), Minas Gerais.

Populações nativas

Antena x Estrada Real x Poço Bonito

10,24

61,07

81,95

75,55

8,71

12,16

15,7 4,61

3,39

15,89 12,3

6,16

0,79

0,79

25,22

1,9

0 20 40 60 80 100 120

Antena

Estrada Real

Poço Bonito

Estrada Real 1

trans-cinamato de metila trans-cariofileno alfa-humuleno

sesquiterpeno oxigenado 1 sesquiterpeno oxigenado 4 cedr-8(15)-em-9-alfa-ol


(14,

37%

)

◊ Antena ◊ Poço Bonito◊ Estrada Real◊ Antena ◊ Poço Bonito◊ Estrada Real (57,27%)

B

A

(14,

37%

)


(14,

37%

)


B

A

Populações nativas

Análise de componentes principais (ACP) para os indivíduosnativos genotipados nas populações de Lychnophora pinaster.


Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleoessencial de folhas de L. pinaster, oriundas de Antena, município deLavras (MG), e cultivadas em Botucatu (SP).

Populações cultivadas

Antena

41,77 57,05 12,46

5,35

1,35

19,06

63,48

2,41

0,71

9,11

3,56

12,26

0,9

0,93

2,07

27,85

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

trans-cinamato de metila

trans-cariofileno

alfa-humuleno

cedr-8(15)-em-9-alfa-ol

Verão Outono Inverno Nativa


Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo essencial defolhas de L. pinaster, oriundas de Estrada Real, município de Carrancas (MG), ecultivadas em Botucatu (SP).


Estrada Real

40,19

20,14

59,09

28,91

8,16

55,27

18,25

5,00

46,02

5,86

14,37

4,16

0 50 100 150 200 250

trans-cinamato de

metila

trans-cariofileno

alfa-humuleno



Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo essencialde folhas de L. pinaster, oriundas de Estrada Real 1, município de Carrancas(MG), e cultivadas em Botucatu (SP).


Estrada Real 1

16,82

4,86

43,49

14,50

4,16

59,45

14,41

4,11

59,37 77,01

14,52

4,33

0 50 100 150 200 250 300

trans-cinamato de

metila

trans-cariofileno

alfa-humuleno



Porcentagem relativa média (%) dos principais componentes do óleo essencial defolhas de L. pinaster, oriundas de Poço Bonito, município de Lavras (MG), ecultivadas em Botucatu (SP).


Poço Bonito

63,07 68,18 72,44 79,74

16,51

5,09

14,44

4,45

13,07

4,07

14,78

4,13

0 50 100 150 200 250 300

trans-cinamato de

metila

trans-cariofileno

alfa-humuleno



Padrão de divergência genética entre as três populações de L. pinasterdefinido pelo agrupamento UPGMA, a partir das distânciasgenéticas de Nei (1972). Correlação cofenética igual0,96% (1000 reamostragens bootstrap para porcentagemde consistência dos nós).

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA


Variabilidade genética: as populações podem ser agrupadas em 2 grupos:Poço Bonito (grupo 1) e Antena e Estrada Real 1 e 2 (grupo 2).

As populações apresentaram uma porcentagem de endogamia, compequena taxa de autofecundação e com uma alta taxa de cruzamento,sugerindo um sistema de reprodução misto, com tendência a alogamia.

A maior variabilidade genética ocorre dentro das populações, enquantoque 9,43% de diversidade entre as populações, sendo considerada umadivergência intermediária.

CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA


CONCLUSÃO

Populações nativas: perfil químico dos óleos essenciais divide-se em 2grupos

-Grupo 1: populações Estrada Real, Estrada Real 1 e Poço Bonito, principalconstituinte o trans-cinamato de metila.

-Grupo 2: população Antena, principal substância o cedr-8(15)-en-9-alfa-ol .

A população de Antena cultivada em Botucatu apresentou divergência nacomposição química em relação a região de origem .

Houve influência da época de colheita na proporção relativa doscomponentes mais abundantes no óleo essencial das populações cultivadas.


AGRADECIMENTOS

Comissão Organizadora do XVI MET

Dra. Vera Quecini – Embrapa Uva e Vinho

Dra Maria Imaculada Zucchi - APTA Polo Regional Centro SulDr. Carlos A. Colombo - IACDra. Lenita Lima Haber –IACDra. Roselaine Facanali – IAC

Maria A. R. Vieira –IAC/FCA-UNESPMônica Tiho Chisaki –IAC/FCA-UNESP

http://www.finep.gov.br/

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