Proteção cruzada obtida em camundongos humanizados ceacam1

PROTEÇÃO CRUZADA OBTIDA EM CAMUNDONGOS HUMANIZADOS CEACAM1 CONTRA Neisseria meningitidis

ANA CLARA BARBOSA ANTONELLIANGÉLICA DE LIMA DAS CHAGAS

BRUNA AMANDA DA CRUZ RATTISBRUNA LIMA PEROBELLI

CASSIO NAZARENO SILVA DA SILVACRIS HANNY PIRES ARAUJO

GISELLA MATTOS DA SILVA WHITEGUSTAVO DO CARMO LEMESIGOR DANIEL ALVES RIBEIRO

JOÃO LUCAS LIMA CALANDRINI DE AZEVEDOJOÃO VICTOR BATALHA DE CARVALHO

Introdução

• Uso de modelos animais em pesquisas para o tratamento de doenças humanas

• ↓utilização de pessoas para testes

• Dificuldade de tratamento -estágio avançado da doença

Camundongos transgênicos

• Organismos artificialmente manipulados • Introdução, modificação ou deleção de um gene• Transmitida aos seus descendentes• Podem ser classificados em diferentes tipos de

animais:• Transgênicos por adição• Modelos knockout (gene inativado) • Modelos knockin (gene previamente modificado ou

substituído)

Introdução

Obtenção dos camundongos transgênicosOvos fertilizados

Microinjeção em pronúcleos do DNA modificado

Transferência de embriões em fêmeas pseudográvidas (fêmeas recipientes)

Análise da atividade da manipulação do gen nos embriões

F0

F1

Camundongo selvagem

Teste da atividade de transmissão e transgênese

T

Através da biopsia se analisa o DNA para identificação do animal transgênico fundador

Fêmea doadora superovulada

Introdução

BENAVIDES, Fernando J; GU

ÉNET, Jean-Louis. M

anual de Genética de Roedores de Laboratorio, Principios Básicos y Aplicaciones. (2003). Cap. La transgénesis y la clonación en los roedores de laboratorio, p: 227-262.

Camundongos humanizados

• Genes humanos • Resposta imune igual ou muito semelhante a

dos seres humanos

Introdução

Promotor Transgene

Seqüência de secreçãoSeqüência do vetor

Marcador

Origem de replicação

Meningite

Introdução

• Evolui em três etapas: nasofaríngea, septicêmica ou meningococcêmica e meningítica

• Fase nasofaríngea : pouco sintomática .Os sinais gerais são: febre, mal-estar, falta de apetite, náuseas e vômitos

• Fase septicêmica ou miningococcêmica: caracteriza-se pelo aparecimento de febre, calafrios, dores musculares e toxemia. Geralmente, aparecem lesões cutâneas purpúricas.

• Fase meningítica: ocorre inflamação das meninges, com fortes dores de cabeça, dores no pescoço e nas costas, rigidez na nuca, confusão mental, etc.

Introdução

Neisseria meningitidis • Bactéria• Diplococo gram-negativo• Classificada em sorogrupos de acordo com a

reatividade imunológica dos polissacarídeos presentes na cápsula (A, B, C, Y e W-135)

• Sorogrupos B e C os principais no Brasil• Compõe a microbiota das vias respiratórias superiores• 10% da população em geral carrega essa bactéria em

suas gargantas

Introdução

Introdução

• Vacinação – método mais viável• Dificuldade no tratamento dos pacientes em

estágio avançado• Portadores do Nme: montam uma boa

resposta imune humoral mas continuam sendo colonizados

O QUE ESTÁ ACONTECENDO?

O QUE ESTÁ ACONTECENDO?

• Objetivos: Investigar as respostas imunológicas e saídas para esse problema

COMO?• Uso de camundongo humanizado por transgenia

visando a colonização da nasofaringe desses animais por Nme cuja especificidade é dirigida para os humanos

Introdução

• Camundongos expressando a molécula de adesão celular humana -CEACAM1

• Permitiu diferenciar a resposta envolvendo anticorpos contra as distintas cepas de Nme e as suas relações com a infecção pela mucosa nasofaríngea

Introdução

Bactérias utilizadas• 57 isolados de bactérias• Sendo 43 da espécie Neisseria meningitidis• 2 Neisseria gonorrhoeae• 2 Neisseria lactamica• 1 Neisseria cinerea• 1 Neisseria flavenscens• 1 Moraxella catatthalis• 2 non-typeable Haemophilus influenzae • 5 Escherichia coli

Materiais e métodos

Inóculos obtidos por ressuspensão das colônias em 1 ml de PBS +1 mM MgCl (PBS/Mg), ajustado para 107 CFU/mL

Adicionou-se 32 mg/ml da glicoproteína "human holo-transferrin"

Foi inoculado 10 µL (105 CFU) em camundongos CEACAM1 humanizados de seis semanas de idade por via intranasal*anestésico isoflurano

Materiais e métodosInfecção intranasal

Infecção intranasal• Monitoramento da resposta imune reinfecção• Os camundongos receberam uma dose da cepa

de N.meningitidis (6 e 9 semanas de idade) • Com doze semanas, cada camundongo foi

desafiado com um isolado diferente• Eutanasiados em câmaras de CO2


Esfregaço da mucosa-ressuspendido em 500 µL de PBS/Mg

Materiais e métodosInfecção intranasal


• ELISA com células totais para a detecção de imunoglobulinas específicas;

• Ensaio de anticorpos bactericidas séricos (SBA);

• Werstern blotting para detecção da Opa e PorA e PorB;

• Camundongos CEACAM1 humanizados podem ser colonizados por cepas de diferentes sorotipos de N. menigitidis ???

Resultados e discussões

• Recuperação N. menigitidis viáveis da cavidade nasal de camundongos humanizados CEACAM1 após 3 dias da inoculação com cepas de diferentes sorogrupos

Sorogrupo A

Fonte: JOHSWICH et al., 2014


Sorogrupo C

Colonização de camundongos humanizados com cepas de N. menigitidis do sorogrupo C



Sorogrupo B



Western Blot para detecção de proteína OPA em cepas de N.menigitidis.


Proteína Opa não expressa em B16B6 – Uma cepa que apresentou baixas taxas de colonização em camundongos CEACAM1 humanizados

• Anticorpos produzidos em uma infecção por determinada cepa de N. menigitidis possui reação cruzada para demais estirpes ???


• determinar a reatividade cruzada de anticorpos induzidos pelas cepas H44/76 ou 90/18311 para diferentes cepas

• as duas cepas inoculadas para indução de anticorpos são bastante heterólogas.


Demonstra-se que a colonização nasal por N. meningitidis

em camundongos CEACAM1 humanizados induz a produção

de anticorpos ( IgG ) específicos para a cepa inoculada.


• Considerando relatos de seu potêncial imunogênico , como é a expressão de Porinas A e Porinas B nas diferentes cepas de N. meningitidis ?

Porina B ( Por B) é amplamente expressa em diferentes cepas

A expressão de Porina A ( Por A ) está concentrada entre as cepas que apresentam maior homologia a H44/76



A proteína Opa é um antígeno importante para ligação de anticorpos gerados contra

N. meningitidis ?


Efeito da expressão da proteína Opa e cápsula em reação cruzada

H44/76∆opa :Cepa modificada para não expressar a proteína Opa

MC58∆siaD:Variedade mutante para a capsúla

• A infecção intranasal de camundongos humanizados CEACAM1 influencia na colonização nasal posterior por outras cepas ?

6Sem.

9 Sem.


Não recuperação de Bactérias após de 3 dias de inoculação em animais préviamente infectados



Níveis de anticorpos específicos para cepa 90/18311 durante o curso da infecção


Títulos de anticorpos específicos para diferentes cepas



• Como é a atividade de Anticorpos Bactericidas Séricos (SBA ) em camundongos infectados com diferentes cepas ?

• Qual a influência do crescimento bacteriano em um meio com níveis limitantes de Ferro ?


Obrigado!!

• BENAVIDES, Fernando J; GUÉNET, Jean-Louis. Manual de Genética de Roedores de Laboratorio, Principios Básicos y Aplicaciones. (2003). Cap. La transgénesis y la clonación en los roedores de laboratorio, p: 227-262.

• JOHSWICH et al. Sterilizing elicited by Neisseria meningitidis carriage shows broader protection than predicted by serum antibody cross-reactivity in CEACAM1-humanized mice. Infection and Immunity. American Society for Microbiology, 2014.

• MCENERY, Regina. Boletim sobre a pesquisa de vacinas contra a aids. VAX, v.10,n. 5, 2012. • MINISTÉRIO DA SAÚDE. Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br/index. php/o-ministerio/principal/leia-

mais-o-ministerio/659-secretaria-svs/vigilancia-de-a-a-z/meningites/11336-descricao-da-doenca. Acessado: 16. Nov 2014.

• MORALES, Marcelo M.. Métodos alternativos à utilização de animais em pesquisa científica: mito ou

realidade?. Cienc. Cult., São Paulo, v. 60, n. 2, 2008 . Disponível em: <http://cienciaecultura.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0009-67252008000200015&lng=en&nrm=iso>. Acessado: 16 Nov. 2014.

• NEVES, Silvânia M.P. Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratório do Biotério de Produção e Experimentação da FCF-IQ/USP. São Paulo FCF-IQ/USP, 2013.

Referências

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Science

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