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algo de bioquimica desde brasil

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  • JORGE ALEXANDRE NOGUEIRA SANTOS

    INIBIO E ESPECIFICIDADE DA Lbpro DO VRUS DA FEBRE AFTOSA

    So Paulo 2009

    Tese apresentada a Universidade Federal de So Paulo Escola Paulista de Medicina para obteno do ttulo de Doutor em Cincias.

  • Santos, Jorge Alexandre Nogueira Inibio e especificidade da Lbpro do vrus da febre aftosa/ Jorge Alexandre Nogueira Santos. - So Paulo, 2009. XI, 93 f.

    Tese (Doutorado) Universidade Federal de So Paulo. UNIFESP. Programa de Ps-graduao em Biologia Molecular.

    Ttulo em ingles: Substrate specificity and inhibition studies of FMDV Lbpro

    1. Peptidase. 2. Inibidor de peptidases. 3. Febre Aftosa. 4.FMDV.

  • Tese preparada no Departamento de Biofsica, durante o curso de Ps-graduao em Biologia Molecular e apresentada Universidade Federal de So Paulo - Escola Paulista de Medicina - como requisito parcial para obteno do ttulo de Doutor em Cincias.

    Orientador: Prof. Dr. Luiz Juliano Neto

  • Nossos agradecimentos Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) pelo auxlio financeiro concedido ao laboratrio na forma de Projetos Temticos, e tambm ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) pela bolsa concedida e pelos Auxlios financeiros concedidos ao laboratrio e seus membros.

  • Aos meus pais e meus irmos a minha eterna gratido por todo o amor e dedicao. Foi graas a todo o apoio que vocs dedicaram a mim que tive a oportunidade de concluir mais esta etapa. tambm por vocs que sinto a maior alegria ao concluir esta tese, podendo retribuir um pouco do imenso orgulho sinto de vocs.

  • AGRADECIMENTOS

    Ao Prof. Luiz Juliano, orientador e mestre, que sempre me proporcionou

    uma convivncia limpa e honesta. Continua sendo uma honra trabalhar sob to

    distinta orientao.

    Profa. Dra. Maria Aparecida Juliano, no s pela sntese de peptdeos,

    mas tambm pela amizade com a qual sempre fui recebido em seu laboratrio.

    Aos amigos, colegas e docentes da UNIFESP que me ensinam tanto.

    Agradeo em especial aqueles que tanto me ajudaram nos momentos confusos

    desta jornada, me estimulando, valorizando os meus acertos e corrigindo as

    minhas falhas.

  • ndice

    1.INTRODUO ...............................................................................................................1 1.1.ENZIMAS............................................................................................................1

    1.1.2. CLASSIFICAO DAS ENZIMAS.........................................................1 1.1.3 ENZIMAS E ENERGIA DE ATIVAO .................................................3 1.1.4. CINTICA ENZIMTICA .........................................................................4 1.1.5. PEPTIDADES..........................................................................................10

    1.1.5.1. CLASSIFICAO DAS PEPTIDASES ............................................11 1.1.5.2 ESPECIFICIDADE ..............................................................................14 1.1.5.3. CISTENO-PEPTIDASES ..................................................................15

    1.2. SUBSTRATOS PEPTDICOS FLUOROGNICOS..................................19 1.3. FEBRE AFTOSA ............................................................................................22

    1.3.1.DISTRIBUIO GEOGRFICA ............................................................22 1.3.2. PATOGENIA............................................................................................23 1.3.3. SINAIS CLNICOS ..................................................................................24 1.3.4.VACINAS...................................................................................................24 1.3.5. AGENTE ETIOLGICO.........................................................................25 1.3.6. PEPTIDASE LEADER (Lbpro) ...............................................................27

    2. OBJETIVOS ................................................................................................................38 3. MATERIAIS E MTODOS ........................................................................................39

    3.1.EXPRESSO DA Lbpro e sLbpro ...................................................................39 3.2. PURIFICAES DA Lbpro e sLbpro..............................................................40 3.3 SNTESE DE PEPTDEOS FRET ................................................................41 3.4 DETERMINAO DA CONCENTRAO DOS SUBSTRATOS PEPTDICOS FRET ..............................................................................................42 3.5. PADRONIZAO DO FLUORMETRO PARA O GRUPO ABZ (CIDO ORTHO-AMINOBENZICO). ..............................................................................43 3.6. PADRONIZAO DO FLUORIMETRO PARA Z-FR-MCA. ...................43 3.7.CINTICAS ENZIMTICAS ..........................................................................44 3.8.EFEITO DE SAIS NA ATIVIDADE CATALTICA DA Lbpro .......................45 3.9. DETERMINAO DOS pKas E DO pH TIMO DA Lbpro ...................46 3.10. EFEITOS DE DETERGENTES NA ATIVIDADE ENZIMTICA ...........47

  • 3.11. DETERMINAO DOS VALORES DE KI DOS PEPTDEOS RESISTENTES HIDRLISE PELA Lbpro .......................................................47 3.12. MODELAGEM DA Lbpro ..............................................................................48 3.13.DETERMINAO DA ENERGIA LIVRE DE LIGAO DO SUBSTRATO (GS) E ENERGIA LIVRE DE ATIVAO (GT) ..................48 3.14. ATIVIDADE ENZIMTICA EM DIFERENTES CONCENTRAES DE Lbpro E SUA MUTANTE sLbpro ........................................................................49 3.15. INIBIO DA Lbpro POR COMPOSTOS DE TELRIO ........................50

    4.RESULTADOS E DISCUSSES .............................................................................52 4.1.ESPECIFICIDADE DOS SUBSTIOS S7 AO S5. .......................................52

    4.1.1.ESPECIFICIDADE DOS SUBSTIOS S1 E S2.....................................52 4.1.2. ESPECIFICIDADE DOS SUBSTIOS S3 E S4. ..................................55 4.1.3.ESPECIFICIDADE EM S5, S6 E S7 .......................................................58 4.1.4.ESPECIFICIDADE DOS SUBSTIOS S1 E S2PARA Lbpro e sLbpro..............................................................................................................................60 4.1.5.ESPECIFICIDADE DOS SUBSTIOS S3, S4 E S5 PARA Lbpro e sLbpro ....................................................................................................................62

    4.2. EFEITO DO TAMANHO DOS SUBSTRATOS NA ATIVIDADE CATALTICA DA Lbpro e sLbpro ............................................................................64 4.3. RESULTADOS DA MODELAGEM MOLECULAR ...................................67 4.4. EFEITO DE DETERGENTES NA ATIVIDADE DA Lbpro e sLbpro.......74 4.5. INFLUNCIA DE SAIS NA ATIVIDADE DAS ENZIMAS Lbpro e sLbpro......................................................................................................................75 4.6. EFEITO DO PH NA ATIVIDADE DAS ENZIMAS .....................................78 4.7. ATIVIDADE ENZIMTICA EM FUNO DA CONCENTRAO DE ENZIMAS ................................................................................................................82 4.8. RESULTADOS DAS INIBIES DOS COMPOSTOS DE TELRIO COM A Lbpro............................................................................................................83

    4. CONCLUSO .............................................................................................................87

    5.REFERNCIAS ..........................................................................................88 6. ANEXOS..........................................................................................................96

  • ABREVIATURAS

    AMINOCIDOS

    AMINOCIDOS

    3 LETRAS

    1 LETRA

    ALANINA Ala A ASPARAGINA Asn N CIDO ASPRTICO Asp D ARGININA Arg R CISTENA Cys C FENILALANINA Phe F GLICINA Gly G GLUTAMINA Gln Q CIDO GLUTMICO Glu E HISTIDINA His H ISOLEUCINA Ile I LEUCINA Leu L LISINA Lys K METIONINA Met M PROLINA Pro P SERINA Ser S TIROSINA Tyr Y TREONINA Thr T TRIPTOFANO Trp W VALINA Val V

  • OUTRAS ABREVIATURAS

    AA Aminocido qualquer em Comprimento de onda de emisso

    ex Comprimento de onda de excitao Abz cido orto-aminobenzico

    ACN Acetonitrila Brij-35 ter lauril- polioxietilnico

    CHAPS 3-[(3-colamidopropil) dimetilamnio CTAB Brometo de cetil-trimetil amnio DMSO Dimetilsulfxido

    DTT ditiotreitol ERV Rinovrus equino

    EDDnp N-(2,4-dinitrofenil)etilenodiamino EDTA cido etilenodiaminotetractico

    E-64 N-(trans-epoxisuccinil)-L-leucina 4 guanidinobutilamida Fmoc 9-fluororenilmetoxicarbonil HPLC Cromatografia lquida de alta eficincia IPTG Isopropiltio-B-D-galactoside

    IFN Interferon PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida

    PEG Polietileno glicol 3700-4000 Pn e Sn Nomenclatura para substios de Schecter e Berger

    MCA 7-Metil cumarina RPM Rotaes por minuto TFA cido trifluoroactico Tris Tri(hidroximetil)aminometano

    TRITON ter(1,1,3,3 tetrametil)fenil-(7,8)-polioxitilnico TWEEN Monolaurato de sorbitan etoxilado

    UAF Unidade arbitrria de fluorescncia UV Ultra-violeta

    UTR Regio no traduzida

  • RESUMO

    O vrus da febre aftosa (FMDV), um patgeno que afeta animais no mundo todo, possui um RNA genmico de fita simples que, aps infectar a clula,

    imediatamente traduzido numa nica poliprotena. Esta poliprotena produzida

    processada durante a sntese em vrias protenas maduras atravs de peptidases

    codificadas pelo prprio vrus. A primeira clivagem da poliprotena viral realizada

    pela Lbpro entre sua prpria regio C-terminal e a regio N-terminal da protena VP4.

    Lbpro tambm cliva especificamente dois homlogos dos fatores eucariticos de

    iniciao (eIF) 4G, resultando na supresso da translao proteica do hospedeiro realizadas atravs dos mRNAs cap-dependentes. Consequentemente, o RNA do

    FMDV, que inicia a traduo via IRES, e no requer o eIF4G intacto, pode usar

    livremente a maquinaria de sntese protica do hospedeiro para traduo viral. Ns

    usamos uma srie de peptdeos fluorognicos desenhados especificamente para

    examinar a especificidade por substratos, efeitos do pH e fora inica sobre a

    atividade cataltica da Lbpro e sua mutante sLbpro. Comparadas com outras cistenos

    peptidases, como a papana e catepsinas, Lbpro e sLbpro possuem muitas

    caracterticas nicas como alta sensibilidade sais e um stio de ligao ao

    substrato muito especfico, extendendo-se at a posio P7. Anlises de dados

    estruturais mostraram que Lbpro liga os resduos P1-P3 do substrato em uma

    conformao extendida, enquanto os resduos P4-P7 so ligados numa curta hlice

    310. A especificidade da Lbpro, revelada atravs dos peptdios substitudos pode ser

    explicada para todas as posies, exceto para P5.

  • ABSTRACT

    Foot-and-mouth disease virus (FMDV), a global animal pathogen, possesses a single-stranded RNA genome that, on release into the infected cell, is immediately

    translated into a single polyprotein. This polyprotein product is cleaved during

    synthesis by proteinases contained within it into the mature viral proteins. The first

    cleavage is performed by the leader protease (Lbpro) between its own C-terminus and the N-terminus of VP4. Lbpro also specifically cleaves the two homologues of the

    cellular eukaryotic initiation factor (eIF) 4G, resulting in shut-off of host cap-dependent mRNA translation. Consequently, FMDV RNA, which initiates translation

    via IRES, and does not require intact eIF4G, can freely use the host protein synthesis

    machinery for viral protein synthesis. We used a panel of specifically designed

    fluorogenic peptides to examine the substrate specificity, effects of pH and ionic

    strength on Lbpro activity and of its shorter mutant sLbpro. Compared with other

    cysteine peptidases, how papain and the cathepsins, Lbpro and sLbpro possesses

    several unusual characteristics, including a high sensitivity to salt and a very specific

    substrate binding site extending up to P7. Indeed, almost all substitutions investigated

    were detrimental to Lbpro and sLbpro activity. Analysis of structural data showed that

    Lbpro binds residues P1 to P3 in an extended conformation whereas residues P4 to P7

    are bound in a short 310 helix. The specificity of Lbpro as revealed by the substituted

    peptides could be explained for all positions except P5.

  • INTRODUO

    1

    1.INTRODUO

    1.1.ENZIMAS

    Enzimas so molculas biolgicas capazes de aumentar em vrias

    ordens de grandeza a velocidade das reaes que catalisam. A histria das enzimas

    comea com a prpria histria da bioqumica. Podemos considerar que as primeiras

    observaes relacionadas atividade das enzimas datam do final do sculo XVIII,

    quando vrios estudos demonstraram que secrees estomacais podiam digerir a

    carne e a saliva podia converter amido em acar.

    1.1.2. CLASSIFICAO DAS ENZIMAS

    Segundo a classificao sugerida pela International Union of Biochemistry

    and Molecular Biology (IUBMB) encontrada na pgina http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/, as enzimas so divididas em seis

    Classes (TABELA 1) , de acordo com o tipo de reao que catalisam. Cada enzima descrita recebe um nmero de classificao, conhecido por E.C. (Enzyme Commission of the IUBMB), composto por 4 dgitos :

    Dgito 1= Classe

    Dgito 2= Sub-classe dentro da classe

    Dgito 3= Sub-subclasse

    Dgito 4= a enzima, propriamente dita

  • INTRODUO

    2

    Por exemplo, para a papana, uma enzima extrada do ltex da fruta

    tropical papaia (Carica papaya), o nmero de classificao E.C. 3.4.22.2, onde: 3 Classe = Hidrolase (catalisa reaes de hidrlise de ligaes covalentes) 4 Sub-Classe = Peptidase (hidrolisa ligaes peptdicas) 22 Cisteno-endopeptidases

    2papana

    TABELA 1. Classificao das enzimas e as reaes que catalisam

    CLASSE TIPO DE REAO EXEMPLO

    1. XIDO-REDUTASES xido-reduo:

    AH2 + B A + BH2

    LCOOL DESIDROGENASE

    2. TRANSFERASES Tranferncia de grupos:

    A-X +B A + B-X

    GLICOQUINASE

    3. HIDROLASE

    Hidrlise:

    A-B + H2O A-H + B-OH

    SACARASE

    4. LIASES

    Adio de grupos a duplas ligaes ou remoo de grupos, deixando a dupla ligao:

    AB + X-Y X-A-B-Y

    FUMARASE

    5. ISOMERASES

    Rearranjos intramoleculares:

    X-A-B-Y Y-A-B-X

    FOSFOGLICO ISOMERASE

    6. LIGASES

    Condensao de duas molculas associada ao consumo de ATP:

    A + B A-B

    PIRUVATO CARBOXILASE

  • INTRODUO

    3

    1.1.3 ENZIMAS E ENERGIA DE ATIVAO

    Todas as reaes qumicas tm uma barreira energtica em potencial

    (energia de ativao), que deve ser superada antes que os reagentes possam ser convertidos em produtos. Em mdia, enzimas podem aumentar as velocidades de

    reao por fator de 1010-1015 vezes em relao a uma reao no catalisada. As

    enzimas aceleram a velocidade de uma reao por diminuir a energia livre de

    ativao da mesma, sem alterar o G(Energia livre de Gibbs) e a Keq (constante de equilbrio), ou seja: a energia dos reagentes e produtos da reao enzimtica e de sua equivalente no enzimtica so idnticas. No pice da barreira energtica, est

    o complexo ativado conhecido como estado de transio, que representa os

    reagentes em seu estado ativado (FIGURA 1). A teoria do estado de transio surgiu em 1930, quando Linus Pauling

    props que esta espcie qumica (complexo ativado) seria ligada preferencialmente pelo stio ativo da enzima que ao substrato (Schramm, 1998).

    FIGURA 1. Diagramas de energia para reaes catalisadas versus no catalisadas.

  • INTRODUO

    4

    O estado de transio formado possui melhores contatos com a enzima

    que o substrato, ou seja, a ligao da enzima com o substrato otimizada e o maior nmero possvel de interaes ocorre. A passagem por esse estado de

    transio com a formao do complexo ativado leva a uma perda dos graus de

    liberdade, que existem quando consideramos enzima e substratos livres

    (contribuio entrpica), e isso seria fator fundamental para o aumento da velocidade das reaes, causado pelas enzimas (Menger, 2005).

    1.1.4. CINTICA ENZIMTICA

    A equao de velocidade para uma reao enzimtica pode ser deduzida por

    dois caminhos. O mtodo mais simples considera condies de equilbrio rpido.

    Leonor Michaelis e Maudi Menten propuseram em 1913 um modelo simples, que

    explica a maioria das caractersticas das reaes catalisadas por enzimas. Nesse

    modelo, a enzima combina-se de maneira rpida e reversvel com o substrato,

    formando um complexo enzima substrato ES. A seguir, em um passo mais lento, o

    complexo transforma-se em produto, regenerando a enzima livre. O modelo,

    envolvendo uma molcula de substrato, representado a seguir:

    k1

    k-1

    E + S ES E + Pk2

    Onde S o substrato

    E a enzima

    ES o complexo enzima-substrato

    P o produto

  • INTRODUO

    5

    k1, k-1 e k2 so as constantes de velocidade de cada etapa.

    A velocidade instantnea de formao do produto em qualquer tempo

    depende da concentrao de ES:

    V= k2[ES] (equao 1) A enzima total ([Et]) est distribuda entre E e ES:

    [Et]= [E] + [ES] (equao 2) Dividindo a equao 1 de velocidade por concentrao de enzima total , onde [E] +

    [ES] usado no termo da direita, obtemos:

    v_ = k2[ES] (equao 3) [Et] [E] + [ES]

    No equilbrio, [ES] pode ser expresso em termos de [S], [E] e Ks , onde Ks a

    contante de dissociao do complexo ES:

    Ks= [E][S] = k-1 (equao 4) [ES] k1

    Rearranjando e considerando [ES]= [S][E] , podemos substitur [ES] na Ks equao 3 obtendo :

    v_ = k2[E][S]/Ks (equao 5) [E]t [E] + [E][S]/Ks

    Multiplicando o primeiro termo por k2 e cancelando [E] na equao 5

    v_ = [S]/Ks (equao 6) k2[E]t 1 +[S]/Ks

    Se v= k2[ES], ento k2[E]total =Vmax, a velocidade mxima que ser observada quando

    toda enzima estiver presente na forma de ES:

    v_ = [S]/Ks (equao 7) Vmax 1 +[S]/Ks

    Todas as equaes de velocidade para sistemas em equilbrio rpido

    podem ser deduzidas pelo mtodo anterior (Segel, 1993). A equao de velocidade

  • INTRODUO

    6

    7 pode ser rearranjada, fornecendo uma equao mais familiar denominada Michaelis Menten:

    v_ = __[S]_ ( equao 8) Vmax Ks +[S]

    A equao de Michelis-Menten nos d a velocidade instantnea ou inicial

    relativa a Vmax para uma dada concentrao de substrato. A equao s vlida se

    a velocidade v medida num tempo pequeno o suficiente para que [S] permanea

    constante.

    Se a velocidade com a qual ES forma E + P rpida quando comparada

    com a qual ES se dissocia em E+S, ento E, S e ES no esto em equilbrio. Se a

    concentrao de substrato for bem maior que a concentrao de enzima, logo aps

    a mistura de E e S, ser estabelecido um estado estacionrio no qual a [ES]

    permanece praticamente constante num certo perodo de tempo (FIGURA 2). .

    FIGURA 2. Estado estacionrio

    Para a deduo da equao de velocidade nessa condio a

    concentrao de ES obtida a partir de equaes do estado estacionrio ao invs

  • INTRODUO

    7

    de expresses de equilbrio (deduo de Briggs e Haldane). A seqncia da reao :

    k1

    k-1

    E + S ES E + Pk2

    Como sempre,

    V= k2[ES] (equao 1) e v_ = k2[ES] (equao 3) [Et] [E] + [ES]

    Se a concentrao de ES for constante, ento a velocidade com a qual ES se

    forma igual velocidade com a qual ES se decompe e temos

    K1[Et] [S] = k-1[ES] + k2[ES] (equao 9) Resolvendo a equao 9 para ES :

    [ES]= k1[E][S] (equao 10) K

    -1 + k2

    O grupo de trs constantes de velocidade pode ser definido por uma nica

    constante, Km, chamada constante de Michaelis:

    Km= k-1 + k2 / k1 (equao 11) Manipulando a equao 10 teremos:

    [ES]= [S][E] / Km (equao 12) Substituindo [ES] na equao de velocidade temos

    v_ = __[S]__ (equao 13) Vmax Km +[S]

    Como podemos observar, a forma da equao de velocidade identica

    deduzida para condies de equilbrio rpido. Apenas as constantes de velocidade

    v_ = [S]/Km ou Vmax 1 +[S]/Km

  • INTRODUO

    8

    que compem a constante final K, so diferentes. Se k2 muito pequeno

    quando comparado com k-1, Km se reduz a Ks (Segel, 1993 ).

    O valor numrico de Km igual concentrao de substrato que produz a

    metade da velocidade mxima (FIGURA 3). Para cada sistema enzimtico, Km tem um valor caracterstico que independe de concentrao da enzima, mas depende de

    pH, temperatura, fora inica, etc.

    FIGURA 3. Efeito da concentrao do substrato na velocidade da reao enzimtica

    Se uma enzima reage em duas etapas segundo o mecanismo de

    Michaellis Menten a constante de velocidade k2 usualmente idntica ( ou muito prximo) ao denominado kcat, que uma constante de primeira ordem com unidade de tempo (min-1 ou s-1). Esta constante na verdade uma constante de velocidade de primeira ordem da quebra do complexo ES para formar E e P e descreve a

    velocidade da reao quando a enzima se aproxima da saturao e a velocidade

    somente depende da concentrao ES.

    k2 ES E + P

  • INTRODUO

    9

    Agora considerando uma enzima que reage segundo o esquema abaixo e

    k1

    k-1

    E + S ESk2

    ES'k3

    E + P

    onde a etapa limitante ES E +P, Vmax ser k3[Etotal] e kcat=k3 .

    kcat equivalente a constante de velocidade do passo limitante da reao.

    Para o clculo do kcat na prtica se determina a Vmax (velocidade mxima) que a velocidade de reao para uma concentrao infinita de substrato a uma dada

    concentrao de enzima. Como concentraes infinitas no podem ser alcanadas

    experimentalmente, 90-95% de saturao so usualmente possveis e se medidas

    suficientes de velocidade so determinadas com concentraes de substrato, acima

    e abaixo do valor de Km, Vmax pode ser calculado por extrapolao.

    Vmax = K2.[E]t kcat = Vmax / [E]t [E]t = total de enzima

    A comparao da eficincia cataltica de diferentes enzimas requer um

    melhor parmetro que kcat ou Km separadamente. Um parmetro til para se ter

    eficincia cataltica um parmetro que inclui kcat e Km. A relao kcat/Km definida

    como uma constante de especificidade caracterizada pelo acoplamento enzima

    substrato. As dimenses desta constante (M-1.s-1) so de uma reao de segunda ordem. Nos casos onde k2>>k-1 temos que a eficincia cataltica dada

    praticamente apenas pela difuso do substrato para o centro ativo da enzima (k1). Como existe um limite para a velocidade com que E e S podem se difundir na

    soluo aquosa, que de ~109 M-1.s-1, o valor de eficincia cataltica tambm ter

    esse limite. Enzimas que apresentam valores elevados de eficincia cataltica se

  • INTRODUO

    10

    aproximando deste limite, tm um elevado valor para k2 e, portanto Ks diferente de

    Km.

    As interaes enzima-substrato so caracterizadas pela determinao

    das constantes cinticas Km e kcat e da relao kcat/Km. O chamado bom substrato

    caracterizado geralmente por um valor de Km baixo, um valor de kcat alto e

    conseqentemente por uma relao kcat/Km de valor elevado, muitas vezes se

    aproximando de 108 M-1s-1.

    1.1.5. PEPTIDADES

    Peptidase, protease ou proteinase referem-se classe de enzimas

    hidrolases que catalisam a hidrlise de ligaes peptdicas e exibem diversas

    funes nos mais variados sistemas biolgicos. O Comit de Nomenclatura da Unio

    Internacional de Bioqumica e Biologia Molecular (NC-IUBMB) recomenda o uso do termo peptidase.

    As peptidases participam de uma grande variedade de processos

    fisiolgicos que incluem a reciclagem de protenas, sinalizao celular, digesto de

    alimentos, coagulao sangunea, cicatrizao, resposta imunolgica, diferenciao

    e crescimento celular, fertilizao e apoptose (Twining,1994). Em humanos a atividade proteoltica descontrolada, desregulada ou indesejada est envolvida em diversos quadros patolgicos como enfisemas, derrames, infeces virais, cncer,

    mal de Alzheimer, inflamao e artrite (Powers et al., 2002). Peptidases so essenciais a todos os patgenos que afetam o homem,

    sendo diretamente relacionadas vrus, protozorios, bactrias e fungos

    patognicos (Dunn, 1999; Monod et al., 2002).

  • INTRODUO

    11

    1.1.5.1. CLASSIFICAO DAS PEPTIDASES As peptidases so classificadas de acordo com (i) a reao catalisada, (ii)

    a natureza qumica do stio cataltico e (iii) sua origem evolucionria com base na estrutura primria (Rawlings & Barrett, 1993).

    i) As peptidases so divididas em endo e exopeptidases. As endopeptidases hidrolisam preferencialmente em ligaes internas da cadeia

    polipeptdica enquanto que as exopeptidases atuam somente nas extremidades das

    mesmas. As exopeptidases que atuam na poro N-terminal so denominadas

    aminopeptidases quando liberam um nico aminocido, e aminodipeptidases e

    aminotripeptidases quando liberam di ou tripeptdeos respectivamente. De forma

    similar, as enzimas que atuam na extremidade C-terminal so denominadas

    carboxipeptidases ou carboxidipeptidases. J as oligopeptidases, hidrolisam

    polipeptdeos pequenos, no hidrolisando protenas.

    ii) De acordo com seu mecanismo de ao e os resduos de aminocidos do stio ativo que esto envolvidos na catlise, as peptidases so classificadas em

    aspartil-, cisteno-, glutamil-, metalo-, serino- e treonino-peptidases, e enzimas com

    mecanismo de catlise desconhecido.

    iii) As peptidases so ainda agrupadas em famlias e cls. Em uma famlia de peptidases agrupam-se as enzimas cuja sequncia primria de aminocidos de cada membro apresenta uma relao estatstica significativa com a sequncia de

    pelo menos outro membro da famlia, geralmente na regio da molcula responsvel

    pela atividade proteoltica.

    Cl o termo utilizado para descrever um conjunto de famlias de enzimas nas quais os membros evoluram a partir de um ancestral comum, mas

  • INTRODUO

    12

    divergiram de tal maneira que sua relao comparada com a estrutura primria, no

    pode ser mais comprovada (Rawlings &Barrett, 1993). A TABELA mostra de maneira resumida a classificao das principais

    peptidases:

  • INTRODUO

    13

    Tabela 2. Principais peptidases classificadas de acordo com seu mecanismo de catlise.a

    Peptidases Representativas Aminocidos presentes

    no stio cataltico Serino-peptidases Cl PA(S) Tripsina

    Quimotripsina His, Asp, Ser

    Cl SB Subtilisina Asp, His, Ser Cl SC Carboxipeptidase C Ser, Asp, His

    Cl SE Carboxipeptidase de Streptomyces

    Ser, Lys

    Cl SF Repressor Lexa Ser, Lys Cl SH Assemblina de Citomegalovrus His, Ser, His

    Cisteno-peptidases Cl CA Papana Cys, His, Asn Cl PA(S) Endopeptidases virais

    quimotripsina-smile His, Cys, Glu

    Cl CD Caspase His, Cys Cl CE Endopeptidase de Adenovrus His, Glu, Cys

    Aspartil-peptidases Cl AA Pepsina Asp, Asp Cl AB Endopeptidase de Nodavrus Asp, Asp

    Metalo-peptidases

    Cl MA Termolisina Enzima Conversora de Angiotensina I

    Glu, Asp, His/ Zn2+

    Cl MC Metalocarboxipeptidase His, Glu, His/ Zn2+ a = Adaptado do banco de dados MEROPS:

    http://merops.sanger.ac.uk/indexes.clans.htm

  • INTRODUO

    14

    1.1.5.2 Especificidade

    A habilidade de uma enzima para discriminar dois ou mais substratos que

    competem entre si funo tanto das caractersticas qumicas dos substios da

    peptidase quanto da natureza do substrato que com ela interage. A natureza das

    interaes (eletrostticas, pontes de hidrognio, van der Waals etc.) dos resduos de aminocidos do substrato com aminocidos da enzima, envolvidos no mecanismo

    de catlise, determinam a especificidade de uma peptidase, frente diferentes

    seqncias peptdicas.

    Na descrio da especificidade das peptidases utilizado o modelo

    proposto por Schechter e Berger (1967) para a papana, no qual o stio cataltico est flanqueado em um ou nos dois lados por substios de especificidade. Cada

    substio capaz de acomodar a cadeia lateral de um nico aminocido e

    numerado a partir do stio de catlise em direo ao lado N-terminal de S1, S2,..., Sn

    e para o lado C-terminal de S1, S2,..., Sn. Os resduos de aminocidos dos

    substratos que estes substios acomodam so denominados P1, P2,..., Pn e P1, P2,

    ..., Pn respectivamente, como mostrado no esquema da FIGURA 4.

    FIGURA 4 - Modelo de interao enzima-substrato proposto para a papana por Schechter & Berger, 1967.

  • INTRODUO

    15

    As interaes entre os substios de uma peptidase e os resduos de

    aminocidos de um substrato peptdico podem contribuir de maneira significativa

    para o entendimento da eficincia cataltica de uma determinada enzima. Para a

    maioria das endopeptidases existe uma interao substio-resduo de aminocido

    que essencial para a catlise eficiente.

    Estudos com cisteno-peptidases vem demonstrando que, de forma geral,

    o stio mais importante de especificidade dessa classe de enzimas definido pelo

    substio S2, sendo que a grande maioria tem interaes favorveis com substratos

    contendo resduos hidrofbicos na posio P2 (Turk et al., 1998). No que se refere s anlises de mapeamento de substios, segundo a

    proposta de Schechter e Berger (1968), o stio cataltico da papana liga sete resduos de aminocidos do substrato apropriadamente nos substios. Os substios

    seriam localizados em ambos os lados do stio ativo, sendo quatro do lado N-

    terminal e trs substios do lado C-terminal.

    1.1.5.3. Cisteno-peptidases

    As enzimas cujo agente nucleoflico no mecanismo de catlise um grupo tiol da cadeia lateral da cistena, so conhecidas como cisteno-peptidases. A

    papana foi a primeira enzima a ser classificada como cisteno-peptidase e sua

    estrutura tridimensional foi determinada em 1968 por Drenth e colaboradores. A

    papana , sem dvida, a cisteno-peptidase mais estudada quanto s propriedades

    moleculares e catalticas, sendo uma referncia muito utilizada para o estudo de

    especificidade dessa classe de enzimas.

    As catepsinas que fazem parte da famlia da papana podem ser

    encontradas em diversos tipos celulares. Foram identificadas 11 membros dessa

  • INTRODUO

    16

    famlia (catepsinas B, C, F, H , K, L, O, S, V, X e W). Sintetizadas a partir de pr-pro-catepsinas, so ativadas sob pH cido dos lisossomos e representam a maioria das

    proteases presentes nesta organela. So distribudas de maneira desigual entre os

    diversos tecidos humanos (Turk et al., 2000). As cisteno-peptidases possuem mecanismo cataltico similar ao

    encontrado nas serino-peptidases, pois em ambas um intermedirio covalente tio-

    ster formado. Porm, nas serino-peptidases, a formao do estado de transio

    e do intermedirio tetradrico acompanhada por separao de cargas, onde o

    prton da hidroxila transferido para o imidazol da His57 por um mecanismo de

    catlise bsica geral (FIGURA 5). No caso das cisteno-peptidases o par inico tiolato-imidazol j est presente na enzima livre (FIGURA 6a) e a formao do estado de transio e do intermedirio tetradrico causa apenas uma reorientao

    das cargas (Fersht, 1998).

    FIGURA 5 Imidazol da His57 atuando como base geral cataltica.

    O mecanismo cataltico das cisteno- peptidases usando a papana como

    modelo est esquematizado na FIGURA 6:

  • INTRODUO

    17

    FIGURA 6. Mecanismo cataltico da papana. a) Formao do par inico Cys-S- (25) / His-ImH+ (159). b) Complexo de Michelis. c) Primeiro intermedirio tetradrico. d) acilao da enzima. e) ataque nucleoflico da gua. f) Formao do segundo intermedirio tetradrico. g) regenerao da enzima livre. Adaptado de Otto e Schirmeister (1997).

    Aps a ligao do substrato peptdico enzima, o resduo da C25 fica

    numa posio ideal para atacar o grupo acila da ligao petdica (6b), ao mesmo tempo que se rompe a ligao da carbonila.

    Um intermedirio tetradrico ento formado (6c) e sua estabilizao ocorre atravs de pontes de hidrognios formadas entre o oxignio da carbonila da

    ligao peptiddica a ser clivada e as ligaes N-H (nitrognio-hidrognio) da cadeia

  • INTRODUO

    18

    principal da C25 e da cadeia lateral da N19. O on imidazlico (ImH+) suficientemente cido (pKa=4) para protonar o nitrognio da ligao peptdica. Com o rompimento da ligao peptdica forma-se a estrutura acil-enzima. O grupo amino

    da nova poro N-terminal da cadeia peptdica clivada liberada pela enzima (6d). Depois disso, ocorre um ataque nucleoflico de uma molcula de gua na

    enzima acilada (6e) e posteriormente protonao da H159. As etapas 6f e 6g do mecanismo constituem a formao de um segundo intermedirio tetradrico e a

    formao do segundo produto (RCOOH) respectivamente. As cisteno-peptidases so inibidas por agentes alquilantes do grupo tiol

    (iodoacetato, clorometilcetonas), complexantes do grupo tiol (compostos mercuariais inorgnicos e orgnicos e ons de metais pesados) e inibidores peptdicos e proteicos ( Otto & Schirmeister., 1997).

    O E-64, um inibidor natural de cisteno-peptidases descoberto nos anos

    70 (Hanada et al., 1978) utiliza um grupo epoxisuccinil para interagir covalentemente com o enxofre reativo do stio ativo das cistenos (FIGURA 7).

  • INTRODUO

    19

    FIGURA 7. Alquilao da cisteno protease pelo E- 64

    A primeira estrutura tridimensional obtida com a papana e o inibidor

    clorometilcetona revelou que os resduos P68, V133, V157, F207 compem o substio S2

    ,

    confirmando seu carter hidrofbico (Drenth et al., 1976).

    1.2. SUBSTRATOS PEPTDICOS FLUOROGNICOS

    Os substratos peptdicos sintticos permitem detectar facilmente a

    atividade enzimtica, determinar as constantes cinticas caractersticas da interao

    enzima-substrato e ainda comparar, de maneira eficiente e direta, a especificidade

    primria entre enzimas de uma mesma famlia.

    A vantagem em se utilizar substratos sintticos em relao a substratos

    peptdicos naturais, alm de maior sensibilidade e facilidade de ensaio, se baseia no

    fato de que podemos variar os aminocidos de maneira especfica, substituindo

    sistematicamente cada aminocido e estudando o efeito dessa substituio na

    catlise enzimtica.

  • INTRODUO

    20

    Substratos peptdicos contendo uma seqncia de aminocidos entre um

    grupo fluorescente e outro supressor da fluorescncia, constituem compostos muito

    convenientes para o estudo das peptidases, pois, com a fragmentao da molcula,

    desaparece a supresso e h um aumento na fluorescncia, que pode ento ser

    mensurada (FIGURA 8).

    FIGURA 8 - Representao do mecanismo de supresso intramolecular da fluorescncia do Abz devido transferncia de energia.

    Essas observaes permitiram um avano bastante significativo no

    desenvolvimento de substratos artificiais para peptidases. Nos mtodos

    cromognicos, a ligao amida entre o peptdeo e os grupos cromognicos constitui

    o nico stio de clivagem detectvel do substrato pelas peptidases. A grande maioria

    dos cromforos utilizados apresenta propriedades diferentes das dos resduos de

    aminocidos. A necessidade de se colocar esses grupos diretamente nos pontos de

    CONH2

    AA AA AA NO2O2N

    NH(CH2)2NH

    CONH2

    AA AA AA NO2O2N

    NH(CH2)2NH

    hidrlise

    transferncia de energia320 nm 420 nmbaixa fluorescncia

    alta fluorescncia320 nm 420 nm

  • INTRODUO

    21

    clivagem cataltica, alm da ligao qumica diferir das ligaes peptdicas normais,

    constitui a grande desvantagem destes substratos.

    Sob o ponto de vista da interao enzima-substrato evidente que, para

    esses substratos sintticos, a interao fica limitada ao lado carboxlico da ligao

    susceptvel, isto , P1, P2, P3, etc. Porm tratando-se de um substrato fluorognico

    com supresso intramolecular (Chagas et al., 1991), o grupo supressor e o grupo fluorescente esto situados em regies opostas do peptdeo, relativamente ao stio

    de hidrlise, isto permite aumentar a especificidade dos substratos pela enzima,

    podendo incluir os resduos P1, P2, etc. Desta forma evita-se a maior parte dos

    inconvenientes citados anteriormente para os substratos com o grupo cromforo ou

    fluorforo colocado diretamente no stio de hidrlise (Juliano et al., 1991; Oliveira et al., 1992; Prado et al., 1986; Juliano & Juliano, 1985).

  • INTRODUO

    22

    1.3. FEBRE AFTOSA

    A febre aftosa, tambm conhecida como foot-and-mouth disease (FMD) uma doena viral altamente contagiosa que infecta principalmente animais

    ungulados, incluindo bovinos, caprinos, ovinos e sunos, mas pode ocorrer tambm

    em seres humanos (Grubman & Bast, 2004) . A doena foi descrita pela primeira vez na Itlia em 1514 e o agente

    responsvel foi identificado em 1897 por Loeffler e Frosh (Bacharach,1968). A febre aftosa representa uma importante ameaa sobre a economia

    nacional de diversos pases, onde o comrcio com o exterior e estabilidade,

    dependem diretamente da confiabilidade dos alimentos de origem animal, que

    devem ser oriundos de animais isentos desta enfermidade (Grubman & Baxt, 2004) .

    1.3.1. DISTRIBUIO GEOGRFICA

    Sete sorotipos do vrus da febre aftosa identificados at agora esto

    distribudos em diferentes regies geogrficas como mostra a FIGURA 9. No Brasil

    j foram identificados os tipos O, A e C. Atualmente so considerados como zona livre da FMD somente o continente Australiano e Amrica do Norte (Grubman & Baxt, 2004). Na Amrica do Norte a ltima ocorrncia de FMD foi no Mxico em 1946-1954 e no Canad em 1952. Nos EUA o ltimo surto ocorreu em 1929 (House & House, 1999, Sutmoller et al., 2003). Na frica so reportados seis sorotipos: A, O, C, SAT1, SAT2 e SAT3 (Southern African Territories). Na sia e no Oriente Mdio esto os sorotipos A, O, C e sia 1.

  • INTRODUO

    23

    FIGURA 9. Distribuio da FMD entre 1990 e 2002. Disponvel em www.iah.bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/aphthovirus.

    1.3.2. PATOGENIA

    A principal forma de transmisso do vrus da febre aftosa a aerossol,

    embora a infeco tambm possa ocorrer via abrases na pele ou nas membranas

    mucosas. O vrus pode ser excretado via smen, urina e fezes (Donaldson,1987). A replicao do vrus ocorre tambm no epitlio da glndula mamria,

    podendo o vrus ser encontrado no leite de bovinos at 10 dias aps a infeco

    (Blackwell et al., 1983). Depois de atingir tecidos como epitlio, mucosa e miocrdio, o vrus

    replica-se e a viremia pode persistir por 3-5 dias. (House & House, 1999). Os sunos tambm podem se contaminar ingerindo comida infectada pelo vrus, por contato

    direto com animais infectados ou por serem colocados em um local onde foi

  • INTRODUO

    24

    previamente habitado por animais infectados. Porm, os sunos so menos

    susceptveis infeco por aerossol do que os bovinos; todavia excretam muito

    mais aerossis que os bovinos e ovinos (Alexandersen & Donaldson, 2002).

    1.3.3. SINAIS CLNICOS

    Os sinais clnicos iniciam com a diminuio na ingesto de alimentos,

    febre e salivao intensa, principalmente devido a dificuldades na deglutio. Muitas

    vezes, os animais abrem e fecham a boca com estalar dos lbios e apresentam

    diminuio na produo de leite. Tambm aparecem vesculas e leses na lngua,

    boca e patas (Bachrach, 1968).

    1.3.4.VACINAS

    No existe tratamento contra a Febre Aftosa e sim medidas profilticas

    especficas pelo uso de vacinas. Atualmente, as vacinas convencionais preparadas

    com o vrus inteiro inativado tem sido utilizadas. Como o vrus possui uma grande

    variabilidade antignica (Kitching et al., 1989), a imunidade para um sorotipo no confere proteo para outros, o que representa uma dificuldade para os programas

    de vacinao (Doel, 2003). Como a vacina inativada no protege de imediato o animal, o mesmo fica suscetvel antes de uma resposta imunolgica eficaz.

    Diversas pesquisas vem sendo conduzidas na tentativa de se obter outros

    tipos de vacinas para febre aftosa. Essas vacinas alternativas utilizam o vrus

    atenuado, o capsdeo viral vazio, protenas e peptdeos derivados do capsdeo.

    (Grubamn & Baxt, 2004).

  • INTRODUO

    25

    1.3.5. AGENTE ETIOLGICO

    O agente etiolgico da febre aftosa um vrus do gnero aftovrus,

    membro da famlia Picornaviridae, o FMDV (foot-and-mouth disease virus). Picornaviridae uma das maiores famlias de vrus e inclui alguns dos mais

    importantes vrus, capazes de infectar humanos e animais, causando doenas como

    a poliomelite, meningite, hepatite A, resfriado comum, febre aftosa, entre outros.

    Como o nome indica, estes vrus so pequenos (pico) vrus de RNA (cido ribonucleico) que possuem uma estrutura de capsdeo no envelopado. A famlia tem mais de 230 membros, os quais, so divididos em cinco gneros: Enterovrus,

    Rhinovirus, Heparnavirus, Cardiovirus e Aphthovirus.

    O genoma do FMDV (FIGURA 10) formado por uma fita simples de RNA de polaridade positiva, com aproximadamente 8500 nucleotdeos. O FMDV

    possui em seu RNA uma cauda de poli A na extremidade 3 e uma pequena

    protena, a VPg, covalentemente ligada na extremidade 5. O RNA viral contm uma

    nica ORF (open reading frame), sendo traduzido como uma nica poliprotena, a qual processada em vrias protenas maduras (estruturais e no estruturais), atravs de proteases codificadas pelo prprio vrus (Leader ou Lbpro, 2A e 3C) durante a traduo e aps a mesma (Mason et al.,2003).

  • INTRODUO

    26

    Os vrus da famlia Picornaviridae, iniciam o processo de traduo do seu

    genoma pela presena de uma sequncia de RNA estruturado na sua 5UTR,

    denominado stio de entrada interno do ribossomo (IRES). A IRES recruta e direciona o ribossomo primeira trinca de bases codificadora da poliprotena viral.

    A sntese da protena comea em dois cdons funcionais AUG, separados

    por aproximadamente 80 nucleotdeos, e codificam uma poliprotena de

    aproximadamente 2330 amino-cidos. A regio P1 codifica quatro protenas

    estruturais do capsdeo: 1A, 1B, 1C e 1D, e as regies P2 e P3 codificam as

    protenas no estruturais envolvidas na replicao do RNA e na maturao viral

    respectivamente (Mason et al., 2003; Domingo et al., 2002).

    [---------------------------][-----------------][---------------------------------] P1 P2 P3

    FIGURA 10. Esquema do RNA do FMDV. O genoma divido em trs principais regies: a regio codificadora da poliprotena ORF subdividida em L/P1, P2 e P3 e as regies regulatrias 5UTR e 3UTR. Adaptado de Mason et al., 2004.

    STIOS DE CLIVAGEM: desconhecido LPRO 3C 2A

  • INTRODUO

    27

    1.3.6. PEPTIDASE LEADER (Lbpro)

    Na famlia Picornaviridae, a peptidase Lbpro (E.C. 3.4.22.46) encontrada apenas no gnero Aphthovirus como mostra a FIGURA 11 abaixo.

    FIGURA 11. Representao do processamento primrio dos seis gneros da famlia Picornaviridae. Adaptado de Seipelt et al., 1999.

    A primeira protena a ser traduzida do genoma viral do FMDV a Lbpro

    (FIGURA 12A). No genoma de todos os sorotipos de FMDV existem dois cdons de iniciao AUG, separados por 84 nucleotdeos, traduzindo duas formas da peptidase

    leader : Labpro e Lbpro. Essas duas formas da peptidase leader so encontradas in

    vivo e possuem as mesmas propriedades enzimticas in vitro (Medina et al., 1993). A Lbpro liberada da poliprotena viral atravs de uma auto-clivagem entre

    a sua prpria regio carboxi-terminal e a regio amino-terminal da protena VP4

    entre os aminocidos K e G da seqncia KVQRKLKGAGQSS de maneira intra ou

    intermolecular como mostra a FIGURA 12 B.

    [----------- -][----------------------------] Precursores do Precursores no estruturais Capsdeo

  • INTRODUO

    28

    FIGURA 12. Atividade biolgica da Lbpro . A) RNA viral. B) Autoclivagem da Lbpro na poliprotena viral. C) Clivagem do eIF4G. Adaptado de Guarn et al., 1998.

    Em eucariotos superiores, a traduo proteica se inicia a partir da montagem

    do ribossomo junto ao RNA mensangeiro (mRNA), com a participao de fatores de iniciao da traduo (eIF). Dentre esses, se destacam aqueles que formam o complexo eIF4 (eIF4A, eIF4E e eIF4G), que permitem a associao da subunidade menor ribossomal ao mRNA e iniciam todo o processo (FIGURA 12). A grande maioria dos mRNAs eucariticos dependente de uma guanosina

    modificada presente em sua extremidade 5, denominada Cap 5' (7-metil-guanosina) para realizar o processo de traduo proteica. Esse Cap 5 reconhecido pelo fator

    de iniciao de eucaritico eIF4E, iniciando o processo em cadeia que recruta a

    subunidade 40S do ribossomo.

  • INTRODUO

    29

    Aps o processo de auto-clivagem na poliprotena viral, a Lbpro cliva o fator

    eucaritico de iniciao da traduo do hospedeiro, o eIF4G (FIGURA 12C). Essa clivagem resulta na supresso da traduo dos RNA mensageiros (mRNA) do hospedeiro e na traduo dos mRNAs virais independente da estrutura 7-metil-

    guanosina (Cap 5) , ou seja, por meio do stio de entrada interna do ribossomo (Guarn et al., 1998).

    A Lbpro cliva duas isoformas do eIF4G na clula hospedeira. A clivagem

    do eIF4GI ocorre entre os resduos de aminocidos G e R da seqncia FANLGRTT

    , e entre G e S da seqncia LLNVGSRRTT no eIF4GII ( Kuehnel et al., 2004). Um vrus mutante do sorotipo A12 da febre aftosa, denominado de

    leaderless virus 2 (LLV2), no qual foi deletado do seu genoma a regio codificadora da peptidase leader Lbpro, causou menor efeito citoptico do que o vrus no

    deletado. Porm, este vrus demonstrou crescimento similar ao vrus que continha a

    Lbpro nas clulas do tipo BHK-21(Baby Hamster Kidney), sugerindo que a Lbpro no requerida para o crescimento viral (Piccone et al., 1995).

    Posteriormente, quando o LLV2 foi inoculado em animais, foram

    evidenciados sinais clnicos de febre aftosa mais brando e o vrus no foi transmitido

    aos animais no inoculados que estavam em contato. Isso indicou que a virulncia

    do FMDV est relacionada presena da Lbpro, ou seja, ela importante para causar a forma mais aguda da febre aftosa e permitir a transmisso entre os animais

    que so suscetveis doena (Chinsangaram et al., 1998; Mason et al., 1997). A clivagem do eIF4G acarreta a dimuio da sntese dos interferons tipo I

    pelas clulas do hospedeiro. A supresso da produo IFN permite a rpida

    replicao e disseminao do FMDV nas clulas do hospedeiro. No entanto, o

    mutante LLV2 replicou de maneira ineficiente em clulas capazes de sintetizar

  • INTRODUO

    30

    ambos IFN e . Clulas previamente tratadas com o IFN tornaram-se resistentes

    ao FMDV (Chinsangaram et al., 1999 & 2001 ). Lbpro uma cisteno-peptidase da famlia da papana e apresenta um

    grau de homologia maior que 15% quando sua estrutura primria comparada com

    esta enzima (FIGURA 13). As duas peptidases tambm possuem grandes semelhanas na estrutura tridimensional apresentando dois domnios, sendo que um

    deles predominantemente formado por -hlices e o outro por folhas (FIGURA 14).

    As peptidases da famlia da papana so caracterizadas pela trade

    cataltica Cys/His/Asn. A Lbpro possui um cido asprtico no lugar da asparagina no

    stio ativo.

  • INTRODUO

    31

    FIGURA 13. Estrutura primria da papana, ERV-1, e Lbpro (sorotipos FMDV-01K, FMDV-A10, FMDV-SAT2 e FMDV-C1). Adaptado de Guarn et al., 1998.

  • INTRODUO

    32

    FIGURA 14. A) Lpro B) Papana. Adaptado de Seipelt et al., 1999

    A estrutura da Lbpro apresenta uma regio compacta globular com uma

    dimenso de aproximadamente 30 de dimetro, formada por 172 resduos de aminocidos, possuindo uma regio C-terminal (CTE), constituda pelos resduos D184 ao K201.

    Os resduos catalticos C51 e H148 se encontram no topo da fenda que

    separa os dois domnios, como observado em outros membros da famlia da

    papana, ou seja, a localizao e o arranjo espacial dos resduos catalticos so bem conservados nessa famlia de enzimas como mostra a FIGURA 14.

    A B

  • INTRODUO

    33

    FIGURA 15. A) Centro ativo da Lpro. B) Centro ativo da Papana. Adaptado de Guarn et al., 1998.

    A papana possui um resduo de triptofano (W177) em seu stio ativo (FIGURA 15) e acredita-se que esse resduo estabilize as pontes de hidrognio formadas entre a H159 cataltica e o resduo de N175 no estado de transio formado

    durante a catlise. Esse resduo de triptofano ausente na Lbpro, e os resduos

    catalticos H148 e C51 so expostos ao solvente. Diferente dos outros membros da

    famlia da papana, o stio ativo da Lbpro contm um grupo de resduos carregados

    negativamente D163, D164, E165 e D166 (Guarn et al., 1998). A extenso C-terminal (CTE) flexvel de 18 aminocidos

    (DQEPLNGEWKAKVQRKLK) est envolvida na auto-clivagem da Lbpro na poliprotena viral. Para isso, a CTE (FIGURA 13) se dobra dentro do stio ativo da enzima, e uma clivagem intramolecular ocorre (Cencic et al., 2007).

    As principais interaes da CTE com o stio ativo da Lbpro, ocorrem

    atravs dos seus resduos K201 e L200.

    A poro aliftica da cadeia lateral da K201, que ocupa o substio S1,

    posicionada entre as cadeias principais dos resduos H95 e E96 e a cadeia lateral da

    A B

  • INTRODUO

    34

    E147, enquanto o grupo amino estabelece interaes eletrostticas com os

    carboxilatos do E96 e E147. Nos outros membros da famlia da papaina o substio S1

    um local amplo e irrestrito, exercendo pouca influncia na especificidade do

    substrato. A cadeia lateral da K200 completamente enterrada no substio

    hidrofbico S2, formado pelos resduos W52, G97, P100, L143, E147-A149 e L178 (FIGURA 16 A).

    A arquitetura do substio S2 na Lbpro muito similar ao da papana. Alis,

    todos os resduos so idnticos entre as duas enzimas, com exceo da L143, que

    equivale V133 na papana.

    Os resduos da CTE, K199(P3) e R198(P4), ocupam os substios S3 e S4, respectivamente. A poro aliftica da cadeia lateral da K199 realiza interaes de

    van der Waals com os tomos da cadeia principal dos resduos G97 e G98. O grupo

    amino desses dois resduos faz uma ponte de hidrognio com a carbonila da cadeia

    principal do E93 e interage atravs de uma interao inica com os carboxilatos das

    cadeias laterais do E93 e E96. A interao da R198 atravs de foras de van der

    Waals com G98, P99, L143 e extensivamente com Q146. O grupo guanidino da R198,

    tambm realiza pontes de hidrognio com o grupo amida da cadeia lateral da Q146

    (Guarn et al., 1998). O substio S5 bem aberto e o resduo Q197(P5) tem sua cadeia lateral

    exposta ao solvente, mas ainda interage com a cadeia principal da P99. Finalmente,

    V196 enterrada numa cavidade hidrofbica (substio S6 formado pelos resduos P99, A101, V127 e L178).

    O primeiro domnio da estrutura da Lbpro contem quatro -hlices (1, 2, 3 e 4) e duas folhas (1 e 2) formadas pelos resduos E30 ao T32 e K38 ao T40, respectivamente (FIGURA 16 B).

  • INTRODUO

    35

    A -hlices 1 e 3 so as mais longas (dos resduos N50- E64 e L78-G91, respectivamente), sendo que as duas -hlices se estendem de maneira perpendicular, com a C51sendo localizada rumo ao N-terminal da -hlice 1. A -

    hlice mais curta 2 formada de apenas seis resduos de aminocidos (F68-S73) e se estende de maneira pararela -hlice 3.

    O segundo domnio da Lbpro formado por uma mistura de folhas em

    paralelo (3 com 4) e seis folhas estendidas de maneira antiparalela (4-9). A H148 cataltica localizada na volta que conecta as folhas 5 e 6 (formadas pelos resduos F137-L143 e A149-T155, respectivamente).

    As regies mais conservadas entre a papana e a Lbpro esto localizadas

    ao redor do stio ativo, especialmente entre as sequncias das -hlice 1 e folhas

    5 e 6, que contm os resduos do stio cataltico C51e H148.

    A cristalografia de raio X mostrou que a CTE de uma molcula da enzima

    est no centro ativo de uma molcula adjacente e vice-versa formando um dmero. Esses dados cristalogrficos sustentam tambm a hiptese de que uma clivagem

    intermolecular possvel de ocorrer (Cencic et al., 2007). Em soluo tambm ocorre a formao do dmero, fato este confirmado

    por gel filtrao e ressonncia magntica nuclear. Para uma melhor compreenso do

    papel da CTE, uma enzima mutante para a Lbpro foi construda, denominada sLbpro,

    onde a extenso C-terminal apresenta apenas 12 aminocidos (D184-K195). A CTE da mutante apresentou-se em soluo de maneira desordenada e flexvel na anlise

    por ressonncia magntica nuclear, e no ocorreu formao de dmero (Cencic et al., 2007).

  • INTRODUO

    36

    FIGURA 16. A) Resduos de aminocidos dos substios S1-S6. B) Estrutura terciria da Lbpro. Adaptado de Guarn et al., 1998.

    A

    B

  • INTRODUO

    37

    A CTE juntamente com os resduos Cys133 , D184 e E186 da Lbpro (FIGURA 17), esto envolvidos no reconhecimento do eIF4GI . A interao da enzima com o fator eucaritico eIF4GI ocorre atravs dos resduos K643, K646 e E650. Essas

    interaes foram demonstradas atravs de mutaes stio-dirigidas nos resduos

    D183 e E186 da Lbpro e K643, K646 e E650 do eIF4GI. As substituies desses resduos

    por alanina reduziram a interao do fator eucaritico eIF4GI com a enzima (Foeger et al., 2005).

    FIGURA 17. C133 envolvida no reconhecimento do eIF4G. Adaptado de Foeger et al., 2005.

  • OBJETIVOS

    38

    2. OBJETIVOS

    O objetivo desse projeto caracterizar as peptidases Lbpro e sLbpro atravs da :

    a) Realizao do estudo de especificidade comparativa para a Lbpro e sLbpro, empregando substratos fluorognicos derivados da seqncia de aminocidos da

    auto-clivagem (Lb/VP4) e dos fatores eucariticos eIF4GI e eIF4GII . b) Avaliar o efeito do pH em diferentes tampes sobre a atividade enzimtica c) Avaliar o efeito de sais e detergentes sobre a catlise enzimtica. d) Desenvolvimento de inibidores contra a Lbpro.

  • MATERIAIS E MTODOS

    39

    3. MATERIAIS E MTODOS

    3.1.Expresso da Lbpro e sLbpro

    Os plasmdeos de expresso pet11d Lbpro e pet11d sLbpro , contendo as

    seqncias de nucleotdeos 892-1411 e 892-1393 do FMDV, sorotipo Ok1, foram

    gentilmente cedido pelo Dr.Tim Skern da Universidade de Viena. A metodologia de

    expresso e purificao foi semelhante para ambas as enzimas. Uma alquota de

    Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS competente foi transfectada por choque trmico de acordo com pET System Manual (Novagen, 2002). As colnias selecionadas em placa de cultura contendo meio LB-gar foram inoculados 500 mL de meio LB

    contendo ampicilina(100g/mL) e cloranfenicol(30g/mL)

    sob agitao constante

    at uma densidade ptica de 0,5 em 600 nm, quando se adicionou IPTG (0,4 mM)

    para induo da expresso. A cultura foi incubada por 18 horas 28C e ento

    submetida centrifugao a 5000 RPM por 30 minutos. O precipitado foi

    ressuspenso em tampo A (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, contendo 25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM 2-mercaptoetanol e 5 % glicerol) , sonicado (4 ciclos de 30 segundos) e

    centrifugado a 12000 RPM por 20 minutos 4C. O sobrenadante contendo a

    frao solvel da enzima, foi filtrado em membranas de 0,45m e submetido ao

    processo de purificao.

  • MATERIAIS E MTODOS

    40

    3.2. Purificaes da Lbpro e sLbpro

    A frao solvel contendo a enzima foi submetida a uma cromatografia de

    troca inica Resource-Q de 1 mL (Amersham Biosciences) acoplada a um sistema de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) previamente equilibrada com tampo A(50 mM de Tris-HCl, pH 8, contendo 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de DTT e 5 % de glicerol), sob fluxo de 0.5 mL/min.

    Em seguida, foi estabelecido um gradiente salino com o tampo ''B''(50 mM de Tris-HCl, pH 8, contendo 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de DTT e

    5 % de glicerol ) com variao de fora inica de 0 a 500 mM de NaCl, sob fluxo de 1 mL/min. As enzimas eluiram ao redor de 300 mM de NaCl.

    A alquota contendo a enzima foi concentrada por ultrafiltrao em um

    sistema Amicon PM 10 (10 KDa) 4C e ento aplicadas em uma coluna HR16/50

    Superdex75 (50 x 1.6cm) e submetidas a um fluxo de 0,5 mL/min de tampo A. As fraes com atividade hidroltica sobre o substrato Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-

    EDDnp em tampo Tris-HCl 50 mM pH 8,0 foram analisadas por eletroforese em gel

    de poliacrilamida (SDS/PAGE) 12% , corado com Coomassie Brilhant Blue. As fraes contendo apenas a banda relativa a Lbpro e sLbpro foram reunidas e

    concentradas conforme descrito anteriormente. As duas enzimas foram

    posteriormente tituladas com o inibidor irreversvel E-64, para determinao de suas

    respectivas concentraes molares pelo mtodo descrito por Barrett et al., 1982.

  • MATERIAIS E MTODOS

    41

    3.3 Sntese de Peptdeos fluorognicos

    Os substratos utilizados neste trabalho tm as extremidades amino e

    carboxi-terminais bloqueadas por um grupo fluorescente, o cido orto-

    aminobenzico (Abz) e um grupo supressor, o N-(2,4-dinitrofenil)-etilenodiamino (Eddnp), respectivamente.

    Os substratos FRET foram sintetizados em fase slida utilizando a

    metodologia Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonil), conforme descrita por Hirata e colaboradores (1994), recentemente revisada por Korkmaz e colaboradores (2008).

    Os peptdeos sintticos foram caracterizados em cromatografia lquida

    analtica de alta eficincia, em uma coluna de fase reversa Econosil C18 (5m, 4,6 X

    150 mm), acoplada a bombas Shimadzu modelo LC-8A, dotadas de um detector de UV-Vis Shimadzu e um detector de fluorescncia em comprimentos de ondas de 220

    nm e 320 nm para a excitao e 420 nm para a emisso, respectivamente. O

    sistema utilizou dois sistemas de solventes, sendo: 1 - (A) TFA/H2O (1:1000) e (B) TFA/ACN/ H2O(1:900:100) e 2 - (A) H3PO4/H2O(1:1000) e (B) H3PO4/H2O/ACN(1:100:900).

    Os peptdeos foram purificados por cromatografia lquida semi-preparativa

    de alta presso, em uma coluna de fase reversa Econosil C18 (5 m, 22,5 X 250

    mm), acoplada a bombas Shimadzu modelo LC-8A, dotadas de detector de UV-Vis Shimadzu e um detector de fluorescncia, programados para leituras em

    comprimentos de onda de 220 nm, excitao de 320 nm e emisso de 420 nm,

    respectivamente. Sendo utilizados dois sistemas de solventes: (A) TFA/H2O (1:1000) e (B) TFA/ACN/ H2O(1:900:100).

  • MATERIAIS E MTODOS

    42

    Os peptdeos sintetizados foram analisados por espectrometria de massa

    atravs do mtodo da medio do tempo do vo do on em um espectrmetro de

    massa modelo Microflex LT, da empresa Bruker Daltonics, dotado de tecnologia

    MALDI-TOF (Matrix Laser Desorption Ionization Time-of-Flight). Em todas as

    anlises, a matriz empregada foi o cido -ciano-4-hidroxicianamnico. Os

    fragmentos de hidrlise foram determinados atravs de cromatografia lquida de alta

    eficincia associada a um espectrmetro de massas do tipo eletron spray,

    utilizando um LC/MS-2010 da empresa ShimadzuSI. A cromatografia foi realizada

    monitorando-se a amostra atravs de detectores de UV (220 e 365 nm) Shimadzu UV-vis SPD-20AV e fluorescncia (320 420nm) (Shimadzu RF), acoplado em uma coluna C18 Ultrasphere (5 M, 4.6 mm X 250 mm), utilizando-se dois sistemas de solventes: (A) TFA/H2O (1:1000) e (B) TFA/ACN/ H2O(1:900:100).

    3.4 Determinao da concentrao dos substratos peptdicos

    fluorognicos

    A concentrao de cada um dos substratos peptdicos

    FRET foi determinada quantificando o EDDnp por espectrofotometria, em

    comprimento de onda de 365 nm utilizando um espectrofotmetro modelo U-3210

    (Hitachi, Japo). Foram utilizadas cubetas de caminho ptido de 10 mm, para um volume final de soluo de 1,0 mL.

    Os valores de absorbncia obtidos foram analisados por regresso linear

    pelo programa GRAFIT verso 5.0, obtendo-se uma reta (absorbncia por volume de substrato) cujo coeficiente angular foi utilizado para a determinao da

  • MATERIAIS E MTODOS

    43

    concentrao do substrato em micromolar (M) atravs da equao [substrato] =

    coeficiente angular/ , sendo = 17300 M-1, coeficiente de extino do grupo EDDnp.

    3.5. Padronizao do Fluormetro para o Grupo Abz (cido ortho-aminobenzico).

    Para a padronizao do fluormetro modelo F-2500 (Hitachi, Japo), foi realizada inicialmente a hidrlise total por Lbpro (20 nM) de quatro concentraes (0,25 a 1,0M) do substrato Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp. Foi efetuada a medio da fluorescncia desses hidrolisados usando em = 420nm e ex = 320nm.

    Os valores obtidos foram analisados por regresso linear pelo programa GRAFIT,

    obtendo-se uma reta (fluorescncia x concentrao) cujo coeficiente angular corresponde a constante do aparelho em UAF/M.

    3.6. Padronizao do Fluormetro para Z-FR-MCA.

    Diferentes concentraes do substrato Z-RKLK-MCA (0,2 a 3M), foram submetidas a hidrlise total por Lbpro (~50 nM) e efetuada a leitura da fluorescncia (UAF) nos ex = 360nm e em = 480nm. Os valores obtidos foram analisados por regresso linear pelo programa GRAFIT 5.0 (Leatherbarrow, 1992) obtendo-se uma reta em UAF/M.

  • MATERIAIS E MTODOS

    44

    3.7.Cinticas enzimticas

    Para a realizao das cinticas, as enzimas foram previamente ativadas

    com 1m M de DTT e incubadas 37C por 5 minutos.

    A hidrlise dos substratos fluorognicos foi monitorada utilizando-se um

    espectrofluormetro Hitachi F-2500, com fendas de excitao e emisso 5nm e 5nm,

    respectivamente, e comprimentos de onda ajustados para ex 320 nm e em 420 nm

    para substratos FRET e ex 380 nm e em 460 nm para MCA. Foram utilizadas

    cubetas de caminho ptido de 10 mm, para um volume final de soluo de 1,0 mL.

    As constantes cinticas kcat, Km e kcat/Km para a Lbpro e sLbpro foram

    determinadas a partir das velocidades iniciais de hidrlise (

  • MATERIAIS E MTODOS

    45

    As cinticas com a Lbpro e sLbpro foram realizadas em tampo cido Brico/Brax 50 mM, pH 7.8 contendo 1mM de EDTA e DTT . As cinticas com

    papana e catepsinas recombinantes em tampo acetato de sdio 100 mM , 5 mM

    de DTT, 2 Mm de EDTA, pH 5.5 37o C. Para catepsina S foi utilizado tampo

    fosfato de sdio 50 mM e pH 7.0. A papana utilizada foi adquirida da Sigma e as

    catepsinas B, L, K, V e S foram expressas em nosso laboratrio conforme descrito

    em Rowan et al., (1992), Carmona et al., (1996), Linnevers et al., (1997) e Bromme & McGrath (1996).

    3.8.Efeito de sais na atividade cataltica da Lbpro

    O efeito de diferentes concentraes de NaCl e KCl na atividade

    cataltica da Lbpro foi avaliado utilizando-se 5 M do substrato Abz-

    KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp em tampo cido Brico/Brax 50 mM, pH 7.8 , contendo 1mM de EDTA, 1 mM de DTT, temperatura de 37C, e incubao prvia

    da enzima por 5 minutos.

    Os parmetros cinticos kcat, Km e kcat/Km foram determinados na

    presena e ausncia do NaCl utilizando peptdeos derivados do eIFG4I, eIFG4II e da

    juno Lb/VP4.

  • MATERIAIS E MTODOS

    46

    3.9. Determinao dos pKas e do pH timo da Lbpro

    O estudo da variao de atividade da Lbpro em diferentes valores de pH foi

    realizado utilizando-se os tampes cido Brico/Brax 50 mM, Tris 50mM contendo EDTA 1 mM , DTT 1 mM e o outro uma mistura contendo de 25 mM glicina, 25 mM

    de cido actico, MES 25 mM , Tris 75 mM , EDTA 1 mM e DTT 1 mM. Todas as

    reaes foram realizadas a 37C com incubao prvia da enzima por 2 minutos.

    Condies de pseudo-primeira ordem foram empregadas para a

    determinao dos valores de kcat/Km no caso do tampo contendo a mistura de 25

    mM glicina, 25 mM de cido actico, 25 mM MES , 75 mM Tris , EDTA 1 mM , DTT

    1 mM. Os resultados foram analisados por regresses no lineares utilizando o

    software GRAFIT 5.0 atravs da equao 14:

    kcat/Km = kcat/Km (limit)[1/(1 + 10pK1 - pH + 10pH - pK2)] Equao 14

    onde K1 e K2 so as constantes de dissociao dos resduos catalticos cido e

    bsico respectivamente.

    Velocidade inicial de hidrlise do substrato Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-

    EDDnp na concentrao de 5 M

    foram utilizadas nas medidas realizadas nos

    tampes cido Brico/Brax 50 Mm e Tris 50mM.

  • MATERIAIS E MTODOS

    47

    3.10. Efeitos de detergentes na atividade enzimtica

    Curvas de velocidade inicial da enzima na presena de diferentes

    concentraes de detergentes, foram realizadas com a Lbpro na presena de 5 M do

    substrato Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-Eddnp . Os detergentes utilizados foram: SDS,

    CHAPS, BRIJ-35, TWEEN-20, TRITON e CTAB. Todos os experimentos foram

    realizados tendo como soluo tampo cido brico/Brax 50 mM , pH 7.8, contendo EDTA 1,0 mM e DTT 1 mM 37C.

    3.11. Determinao dos valores de Ki dos peptdeos resistentes

    hidrlise pela Lbpro

    Os peptdeos FRET resistentes hidrlise pela Lbpro identificados durante

    o estudo de especificidade foram ensaiados como inibidores competitivos sobre a

    hidrlise de Z-LR-MCA (Km=13M e kCAT =0.002 s-1) numa concentrao fixa de 40 M. Os valores de Ki para os ensaios de inibio competititiva dos substratos foram

    determinados de acordo com ( Nicklin & Barrett , 1984 ). As equaes utilizadas para os clculos de Ki foram :

    Ki = Kiapp / (1+ [S]/Km) (Equao 15) Onde: [S] = concentrao molar do substrato

    Kiapp= constante de inibio aparente

    Ki= constante de inibio

    Km= constante de Michaellis

    Para o clculo do Kiapp :

    Kiapp = [I] / (V0/V1 1) (Equao16)

  • MATERIAIS E MTODOS

    48

    Onde Vo a velocidade de hidrlise sem a presena do inibidor, V1 a

    velocidade de hidrlise na ausncia do inibidor e [I] a concentrao do inibidor. Num grfico V0/V1 1 versus [I], o coeficiente angular igual a 1/ Kiapp Substituindo o valor de Kiapp na equao possvel determinar o valor de

    Ki.

    Essas inibies foram realizadas em soluo tampo cido Brico/Brax 50 mM, pH 7.8, contendo EDTA 1,0 mM e DTT 1 mM , 37C.

    3.12. Modelagem da Lbpro

    A modelagem molecular da interao da poro N-terminal do substrato

    Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp (seqncia KVQRKLKG) com a Lbpro, baseada na estrutura cristalogrfica desta enzima foi realizada pelo colaborador Prof. Dr. Tim

    Skern da Medical University of Vienna (ustria), utilizando o software PYMOL (De Lano, 2002 ) .

    3.13.Determinao da energia livre de ligao do substrato (Gs) e energia livre de ativao (GT)

    Os clculos da energia livre de ligao do substrato (Gs) e a energia livre de ativao (GT) foram obtidos atravs dos valores de parmetros cinticos Km e kcat/Km ( Marana et al., 2002), utilizando as equaes 17 e 18:

    Gs= - RTln(1/Km) ( Equao 17)

    GT = - RTln(kcat /Km) + RTln(KBT/h) (Equao 18)

  • MATERIAIS E MTODOS

    49

    onde T= 303 K , R a constante universal dos gases, KB (1,4 x 10-23 J/K) e h (6.6 x 10-34 J.s) so as constantes de Boltzman e Planck respectivamente. O coeficiente angular do grfico de GT versus Gs relaciona a energia do estado de transio e

    energia de ligao do substrato.

    3.14. Atividade enzimtica para diferentes concentraes de Lbpro e sua

    mutante sLbpro

    As atividades enzimticas da Lbpro e sua mutante sLbpro em diferentes

    concentraes molares foram medidas atravs das velocidades iniciais de hidrlise

    dos substratos Abz-KAKVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp e Z-LK-MCA em

    concentraes fixas de 2 M e 45 M respectivamente. A variao da concentrao

    molar das enzimas ocorreu na faixa de 0.002 M at 6 M. Todos os ensaios foram

    realizados em tampo cido brico/Brax 50 mM , pH 7.8 contendo EDTA 1,0 mM e DTT 1 mM 37C.

  • MATERIAIS E MTODOS

    50

    3.15. Inibio da Lbpro por compostos de telrio

    Antes de ser utilizada nos ensaios de inibio, a Lbpro foi ativada com

    DTT, e em seguida foi separada do excesso de redutor por gel-filtrao usando uma

    coluna PD10(Amershan). Os ensaios de inibio foram realizados medindo-se a velocidade inicial de hidrlise do substrato fluorognico, Abz-KVQRKLKGAGQSSQ

    ([0.3 M]), na ausncia e na presena de diferentes concentraes das teluranas 37C, em tampo cido Brico/Brax 50 mM, pH 7.8.

    O substrato pode proteger a enzima da ao do inibidor, sendo assim,

    esse fato deve ser levado em considerao na construo do modelo (Marangoni, 2003). Para a inibio na presena do substrato podemos considerar as seguintes etapas como mostra o esquema :

    E + I EI*

    E + S ES

    k2

    Ks

    Onde E, I, S, EI*, ES, k2 e KS so enzima, inibidor, substrato, complexo

    enzima-inibidor, complexo enzima-substrato, constante de inibio de segunda

    ordem e constante de dissociao do complexo enzima substrato respectivamente.

    Para obteno do k2, determinamos primeiro a constante de pseudo

    primeira ordem k atravs da mudana da concentrao do complexo [EI*].

    A reao de inibio foi monitorada continuamente pela fluorescncia do

    produto formado, atravs da comparao entre a atividade da enzima livre e a

    atividade da mesma na presena de diferentes concentraes dos inibidores. Assim,

    para cada concentrao de inibidor, a diminuio da atividade expressa pela

  • MATERIAIS E MTODOS

    51

    variao da fluorescncia com o tempo resultando em hiprboles. As curvas

    hiperblicas obtidas so melhores ajustadas de acordo com equao 19: [EI*] = [Et ](1-exp-kt) (Equao 19)

    Onde Et corresponde a concentrao de enzima total (Marangoni, 2003). As constantes de velocidade de segunda ordem das reaes inibidor/enzima, k2,

    foram obtidas atravs dos grficos das constantes de primeira ordem (k) frente s respectivas concentraes de inibidores utilizadas. A regresso linear dessa relao

    gera uma inclinao que corresponde :

    Inclinao= k2.KS / KS + [S]

    Os compostos de telrio foram sintetizados pelo Prof.Dr. Rodrigo Cunha

    da Universidade Federal do ABC.

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    52

    4.RESULTADOS E DISCUSSES

    4.1.Especificidade dos substios S7 ao S5.

    A especificidade da Lbpro e sLbpro foi estudada utilizando-se substratos

    FRET baseados na seqncia de aminocidos da juno Lbpro-VP4, Abz-KVQRKLXGAGQSSQ-EDDnp com mudana sistemtica dos resduos de

    aminocidos em posies P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1, P1, P2, P3, P4 e P5 em relao

    a ligao ...X-G... hidrolisada pela Lbpro e sLbpro .

    O perfil de especifidade da Lbpro e sLbpro foram semelhantes para todos

    substios estudados, mas a atividade cataltica da sLbpro foi levemente superior ao da

    Lbpro em praticamente todas as cinticas realizadas.

    4.1.1.Especificidade dos substios S1 e S2

    Os parmetros cinticos para as hidrlises das sries Abz-

    KVQRKLXGAGQSSQ-EDDnp e Abz-KVQRKXKGAGQSSQ-EDDnp pela Lbpro e

    sLbpro, onde X corresponde s substituies em P1 e P2 e esto apresentados na

    TABELA 3. Todas as clivagens ocorreram entre X-G e K-G , respectivamente.

    Observamos que o substios S1 da Lbpro e sLbpro apresentam grande

    preferncia pelos aminocidos bsicos arginina e lisina.

    Interessante notar que os peptdeos contendo prolina, serina, cido

    glutmico, e triptofano no foram hidrolisados pela Lbpro e sLbpro, porm esses

    peptdeos interagem com o centro ativo e, portanto foram caracterizados como

    inibidores competitivos para ambas as enzimas.

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    53

    Os baixos valores de kcat/Km para aminocidos carregados (arginina e cido asprtico) e aromticos (fenilalanina e tirosina) mostraram que o substio S2 tem preferncia por aminocidos apolares com grupos alquila na cadeia lateral como

    leucina e valina, e em menor grau, por isoleucina e alanina. Essa preferncia por

    leucina em P2 pela Lbpro tambm foi observada por Kuehnel e colaboradores (2004), atravs de mutaes stio dirigidas, onde a substituio da L200 por outros resduos

    de aminocidos reduz a auto-clivagem da Lbpro.

    O peptdeo contendo triptofano na posio P2 mostrou-se resistente

    clivagem, apresentando inibio competitiva para a Lbpro e sLbpro .

    A Lbpro apresentou semelhanas na especificidade com as catepsina F,

    S e K em P2, que tambm possuem maior preferncia por leucina, enquanto a

    papana aceita melhor valina nessa posio (Choe et al., 2006). O substio S1 da papana no seletivo como o substio S2, mas possui

    grande preferncia por arginina e lisina e no aceita valina nessa posio (Barret et al., 2004).

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    54

    TABELA 3 . Parmetros cinticos de hidrlise das peptidases Lbpro e sLbpro utilizando as sries de peptdeos FRET Abz-KVQRKLXGAGQSSQ-EDDnp e Abz-KVQRKXKGAGQSSQ-EDDnp, com variaes (X) nas posies P1 e P2 .

    Km (M)

    kcat (s-1)

    kcat/Km (mM-1.s-1)

    X Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro

    P1 Abz-KVQRKLXGAGQSSQ-EDDnp K(ref.)a 0.50.05 0.600.04 1.8 0.2 5.2 0.5 3600 8667

    R 0.5 0.03 1.20.1 1.9 0.2 7.0 0.8 3800 5833

    L 2.0 0.1 0.90.07 0.1 0.02 0.20.01 50 222

    P Ki=2.60.06 uM (WT) Ki=3.0 0.3uM (sLb)

    S Ki=6.1 0.5 uM (WT) Ki=111 uM (sLb)

    Q 3.1 0.2 4.3 0.3 0.2 0.01 0.70.05 65 163

    E Ki=2.20.3 uM (WT) Ki=2.00.2 uM (sLb)

    F 2.5 1.7 0.2 0.2 0.02 0.2 0.01 80 118

    G 112 8.61.5 0.10.01 0.10.01 9 12

    W Ki=0.9 0.08uM (WT) Ki=1.70.1 uM (sLb)

    P2 Abz-KVQRKXKGAGQSSQ-EDDnp R 0.6 0.08 1.4 0.2 0.010.002 0.090.00

    1 17 64

    L(ref)a 0.5 0.05 0.6 0.04 1.8 0.2 5.2 0.5 3600 8667

    V 0.5 0.04 0.8 0.1 1.4 0.1 3.5 0.3 2800 4375

    I 0.2 0.3 0.7 0.08 0.1 0.02 0.5 0.06 500 714

    P 5 0.06 5.20.05 0.140.002 0.160.01 28 31

    A 0.9 0.08 1.0 0.6 0.4 0.07 1.5 0.1 444 1500

    D 2.0 0.2 4.4 0.4 0.0020.000

    3

    0.010.00

    2

    1 2.3

    F 0.300.03 0.9 0.08 0.04 0.006 0.2 0.02 133 222

    Y 0.7 0.05 2.5 0.3 0.02 0.003 0.1 0.02 29 40

    W Ki=0.70.05 uM (WT) Ki=0.80.03 uM (sLb) a Substrato referncia: Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    55

    4.1.2. Especificidade dos substios S3 e S4.

    Para o estudo de especificidade dos substios S3 e S4 da Lbpro e sLbpro

    foram utilizadas as sries de substratos Abz-KVQRXLKGAGQSSQ-EDDnp e Abz-

    KVQXKLKGAGQSSQ-EDDnp, onde X corresponde s substituies em P3 e P4

    respectivamente, sendo que todas as clivagens ocorreram entre K-G. Os parmetros

    cinticos para essas duas sries so apresentados na TABELA 4. O substrato

    contendo o resduo lisina em P3, apresentou maior valor de kcat/Km desta srie.

    Surpreendentemente, o substrato tambm contento arginina em P3 no foi to bem

    aceito pela Lbpro e sLbpro e apresentou um valor de kcat/Km menor do que fenilalanina

    nessa mesma posio. Em todas as outras substituies (histidina, leucina, prolina, asparagina, alanina e glutamina) ocorreu uma significante diminuio da eficincia cataltica das enzimas, sendo que para o resduo de cido asprtico a reduo foi

    drstica, indicando que esse substio no acomoda bem aminocidos carregados

    negativamente.

    Essa rejeio por resduo de aminocido cido no substio S3 tambm foi observada por Kuehnel e colaboradores (2004) onde a mutao da K200 por um resduo de cido asprtico reduz drasticamente a auto-clivagem da poliprotena do

    FMDV.

    Para o substio S4, novamente observamos uma preferncia por um

    resduo carregado positivamente, porm nesta posio somente o resduo de

    arginina foi bem aceito. Todas as outras substituies em P4 resultaram em

    substratos hidrolisados com o valores de kcat/Km menores em maior ou menor grau.

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    56

    Como observado nos substios S1, S2 e S3, aminocidos com carga

    negativa no so bem aceitos no substio S4, como mostra os resultados de kcat/Km

    (Tabelas 4 e 5). Outros resultados interessantes foram obtidos com os substratos

    contendo prolina em P3 e P4. Na posio P3 ocorreu hidrlise do substrato com baixa

    eficincia cataltica, enquanto que em P4, o substrato foi resistente hidrolise e foi

    ensaiado como inibidor competitivo. Isso sugere que o substrato contendo prolina

    nessa posio tem uma conformao no stio ativo no favorvel hidrlise.

    Ensaios realizados utilizando-se uma biblioteca combinatria de

    peptdeos, Choe e colaboradores (2006), mostraram que a papana e as catepsinas L, V, K, S, F e B apresentam baixa

    especifidade para as posies P3 e P4.

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    57

    TABELA 4 . Parmetros cinticos de hidrlise das peptidases Lbpro e sLbpro utilizando as sries de peptdeos FRET Abz-KVQRXLKGAGQSSQ-EDDnp e Abz-KVQXKLKGAGQSSQ-EDDnp, com variaes (X) nas posies P3 e P4

    Km (M)

    kcat (s-1)

    kcat/Km (mM-1.s-1)

    X Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro

    P3 Abz-KVQRXLKGAGQSSQ-EDDnp R 1.10.1 1.90.2 0.90.05 3.60.3 818 1895

    K(ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667

    H 2.40.3 2.00.4 1.00.2 1.40.1 417 700

    L 1.40.2 0.60.06 0.60.05 1.60.1 429 2667

    P 2.50.03 2.20.04 1.20.005 1.40.006 480 636

    A 3.00.4 1.10.1 0.50.08 0.90.06 168 818

    D 4.50.4 8.60.7 0.010.002 0.10.02 2 12

    N 1.20.1 0.80.06 0.70.06 2.00.2 583 2500

    Q 2.00.3 3.00.3 0.30.04 1.10.1 150 367

    F 0.70.08 1.50.1 0.80.06 3.70.04 1142 2467

    P4 Abz-KVQXKLKGAGQSSQ-EDDnp R (ref)a 0.5 0.05 0.6 0.04 1.8 0.2 5.2 0.5 3600 8667

    H 2.4 0.3 1.8 0.2 1.4 0.1 2.8 0.3 583 1556

    L 1.3 0.1 1.3 0.2 1.6 0.1 2.1 0.1 1231 1615

    P Ki=222 uM (WT) Ki=16.7 1.2uM (sLb)

    A 2.40.2 1.50.1 1.60.2 2.00.2 667 1333

    D 11.21 8.10.8 0.20.02 0.60.07 18 74

    N 2.90.2 2.30.4 0.90.05 0.90.08 310 391

    Q 2.30.2 2.00.2 1.70.1 3.80.3 739 1900

    F 1.00.01 0.70.05 0.90.06 1.30.1 900 1857 a Substrato referncia: Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    58

    4.1.3.Especificidade em S5, S6 e S7

    Os parmetros cinticos de hidrlise obtidos para Lbpro e sLbpro para as

    sries de substratos FRET Abz-KVXRKLKGAGQSSQ-EDDnp, Abz-

    KXQRKLKGAGQSSQ-EDDnp e Abz-XVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp, com

    substituies na posio X, so apresentados na TABELA 5.

    Essas variaes correspondem s posies P5, P6 e P7, ocorrendo

    clivagens somente entre K-G. Apesar de distantes do stio de clivagem, os substios

    S5, S6 e S7 interagem com os resduos de aminocidos dos substratos afetando a

    catlise enzimtica da Lbpro e sLbpro como podemos observar atravs dos resultados

    dos parmetros cinticos destas posies.

    O substio S5 na Lbpro e sLbpro uma cavidade aberta ao solvente.

    Glutamina e leucina so bem aceitas na posio P5, e em menor proporo prolina.

    As outras substituies nessa posio no foram eficientes, como mostrado pelos

    valores de kcat/Km. Os melhores valores de kcat/Km para a posio P6, foram

    observados com os substratos contendo o resduo de valina seguido de serina,

    enquanto que, os piores resultados foram apresentados pelos resduos carregados.

    Na posio P7, o substrato contendo lisina foi o que apresentou a maior

    relao kcat/Km, enquanto leucina e cido asprtico, promoveram uma drstica

    reduo na atividade cataltica. As substituies contendo leucina e cido aspartico

    provocaram um grande aumento no valor de Km e diminuio no valor de kcat ,

    reduzindo desse modo, os valores de kcat/Km .

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    59

    TABELA 5 Parmetros cinticos de hidrlise da Lbpro e sLbpro das sries de substratos FRET Abz-KVXRKLKGAGQSSQ-EDDnp, Abz-KXQRKLKGAGQSSQ-EDDnp e Abz-XVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp, com variaes (X) nas posies P5, P6 e P7 . Km

    (M) kcat (s-1)

    kcat/Km (mM-1.s-1)

    X Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro

    P5 Abz-KVXRKLKGAGQSSQ-EDDnp

    R 4.4 0.5 3.50.4 1.70.2 2.60.1 386 743

    L 0.40.2 0.50.1 1.20.2 4.70.2 3000 9400

    S 6.00.6 1.80.2 1.30.1 1.50.1 217 833

    Q (ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667

    D 3.60.3 1.70.2 1.40.1 2.1 0.3 389 1235

    F 3.80.4 1.50.2 2.10.1 3.3 0.3 552 2200

    P 0.8 0.2 0.6 0.1 1.2 0.1 2.6 0.2 1515 4343

    P6 Abz-KXQRKLKGAGQSSQ-EDDnp

    R 1.60.1 3.60.4 0.50.3 2.10.1 313 583

    V (ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667

    S 0.70.06 0.80.08 1.50.1 4.0 0.1 2143 5000

    D 3.50.3 1.80.2 1.60.1 2.10.2 457 1167

    F 2.30.4 3.60.2 3.00.1 5.30.7 1304 1472

    P 2.20.2 1.00.3 2.60.2 1.70.1 1182 1730

    P7 Abz-XVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp

    K (ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667

    L 3.40.2 3.60.1 0.40.2 1.30.2 118 389

    D 6.10.3 9.40.2 0.60.1 2.10.3 98 223 a Substrato referncia: Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    60

    4.1.4.Especificidade dos substios S1 e S2para Lbpro e sLbpro

    As sries de subtratos FRET Abz-KVQRKLKXAGQSSQ-EDDnp, Abz--

    KVQRKLKGXGQSSQ-EDDnp, com substituies na posio X, e seus respectivos

    parmetros cinticos so apresentados na TABELA 6.

    O substio S1 mostrou-se altamente seletivo, aceitando bem na posio

    P1, somente os resduos de glicina seguido por alanina. Os substratos contendo

    arginina, prolina e triptofano nesta posio mostraram-se resistentes hidrlise e

    foram ensaiados como inibidores competitivos.

    Mnard e colaboradores (1993), utilizando substratos fluorognicos do tipo Dns-Phe-Arg-X-Trp-Ala, onde X um aminocido qualquer, mostraram que os

    substios S1 da papana e catepsina S aceitam uma ampla variedade de resduos de

    aminocidos, sendo a especificidade desse substio de difcil determinao para

    estas enzimas. Puzer e colaboradores (2004), utilizando substratos do tipo Abz-KLRXSKQ-EDDnp, mostraram que as catepsina V e L tambm possuem baixa

    especificidade para o substio S1.

    O substio S2 para a Lbpro e sLbpro foi menos seletivo que o substio S1,

    mostrando preferncia por resduos hidrofbicos na posio P2. De maneira

    surpreendente, o resduo de prolina nessa posio, apresentou uma eficincia

    cataltica superior at mesmo quando comparado com o substrato de referncia.

    Portaro e colaboradores (2000), utilizando substratos do tipo Abz-AFRSXAQ-EDDnp mostraram que a papana e a catepsina L tambm apresentam preferncia por

    aminocidos hidrofbicos como triptofano e tirosina na posio P2 do substrato,

    enquanto que, catepsina B, prefere asparagina nessa posio .

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    61

    TABELA 6. Parmetros cinticos de hidrlise pela Lbpro e sLbpro das series de substratos FRET Abz-KVQRKLKXAGQSSQ-EDDnp e Abz-KVQRKLKGXGQSSQ-EDDnp, com variaes(X) nas posies P1 e P2.

    Km (M)

    kcat (s-1)

    kcat/Km (mM-1.s-1)

    X Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro Lbpro sLbpro

    P1 Abz-KVQRKLKXAGQSSQ-EDDnp

    R Ki=1.10.02 uM (WT) Ki=1.20.01 uM (sLb)

    L 1.10.1 1.50.1 0.30.05 1.40.1 273 933

    P Ki=2.60.1 uM (WT) Ki=3.0 0.2uM (sLb)

    A 2.30.2 1.00.05 2.30.1 4.00.1 1000 4000

    G (ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667

    S 2.60.2 1.40.1 1.60.2 2.70.3 615 1929

    E 3.10.3 1.90.2 0.040.006 0.080.1 13 42

    Q 2.20.2 1.10.1 0.50.07 0.70.09 228 636

    F 1.70.2 2.40.2 0.050.008 0.30.05 30 125

    W Ki=110.8 uM (WT) Ki=13.3 0.7uM (sLb)

    P2 Abz-KVQRKLKGXGQSSQ-EDDnp

    R 1.00.06 1.20.1 2.10.08 4.00.2 2100 3333

    L 0.30.03 0.20.03 1.10.03 1.50.05 3667 7500

    P 0.20.01 0.20.02 2.70.05 3.50.06 13500 17500

    A (ref)a 0.50.05 0.60.04 1.80.2 5.20.5 3600 8667

    D 111 121.5 1.70.2 2.60.15 155 217

    F 1.10.1 0.70.05 2.10.1 1.40.1 1909 2000

    W 1.10.1 0.50.06 1.40.05 1.40.2 1272 2800 a Substrato de referncia: Abz-KVQRKLKGAGQSSQ-EDDnp

  • RESULTADOS E DISCUSSES

    62

    4.1.5.Especificidade dos substios S3, S4 e S5 para Lbpro e sLbpro

    A TABELA 7 apresenta os parmetros cinticos de hidrlise obtidos para

    as sries de subtratos FRET Abz-KVQRKLKGAXQSSQ-EDDnp, Abz-

    KVQRKLKGAGXSSQ-EDDnp e Abz-KVQRKLKGAGQXSQ-EDDnp, com

    substituies na posio X, correspondentes s posies P3, P4 e P5.

    Para posio P3 do substrato, somente os resduos carregados no foram

    bem aceitos pela Lbpro e sLbpro, enquanto que, leucina e prolina apresentaram

    valores de kcat/Km superiores ao substrato de referncia.

    Segundo o trabalho realizado por Portaro e colaboradores (2000), os melhores resduos para a papana no substio S3 so triptofano, tirosina e

    asparagina seguidos de fenilalanina e leucina. J para as catepsinas B e L, no h

    preferncia por nenhum resduo em especial, sugerindo que os resduos P3 dos

    substratos no interagem com as enzimas.

    Para a posio P4, os substratos contendo prolina e triptofano nessa

    posio, apresentaram eficincias catalticas maiores que o substrato de referncia.

    O resduo de prolina na posio P5 tambm resultou em um substrato hidrolisado

    com grande eficincia cataltica, enquanto que, aminocidos carregados no foram

    to eficientes nessa posio. Os resultados dos substratos contendo prolina em P2,

    P3, P4 e P5 sugerem que este resduo de aminocido confere ao substrato uma

    conformao que favorea a