PURIFICAÇÃO DA LACTOFERRINA BOVINA A PARTIR DE … · apresentando efeito antibacteriano,...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS PARA O

DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL

DANIEL PÁSCOA CAMARGOS

PURIFICAÇÃO DA LACTOFERRINA BOVINA A PARTIR DE

SORO DE LEITE E SUA INCORPORAÇÃO COMO PRINCÍPIO

ATIVO EM UMA FORMULAÇÃO SEMI-SÓLIDA.

OURO BRANCO - MG

2014





Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Gr-

aduação em Tecnologias para o Desenvolvime-

nto Sustentável da Universidade Federal de São

João Del-Rei como parte dos Requisitos necessá-

rios à obtenção do título de Mestre em Tecnolo-

gias para o Desenvolvimento Sustentável.

O

Orientadora: Dra. Sandra de Cássia Dias

OURO BRANCO - MG

2014





Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Gr-

aduação em Tecnologias para o Desenvolvime-

nto Sustentável da Universidade Federal de São

João Del-Rei como parte dos Requisitos necessá-

rios à obtenção do título de Mestre em Tecnolo-

gias para o Desenvolvimento Sustentável.

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________________________________

Prof.ª Drª. Sandra de Cássia Dias – Universidade Federal de São João Del Rei

Orientadora

_____________________________________________________________________

Prof. Dr. Antônio Helvécio Totola – Universidade Federal de São João Del Rei

________________________________________________________________

Prof. Dr. Marcos Aurélio de Santana – Universidade Federal de Ouro Preto

OURO BRANCO - MG

2014

DEDICATÓRIA

Dedico esta monografia aos meus pais que me deram muito apoio nos momentos mais

difíceis da minha vida, a minha namorada que esteve ao meu lado, aos meus

professores que me ensinaram que por mais que achamos que o nosso conhecimento já

está bem profundo, estamos enganados, pois o conhecimento é algo que está sempre se

renovando. A minha orientadora Dra. Sandra que sempre teve muita paciência comigo

e sem seu apoio não teria conseguido chegar até aqui. Obrigado por tudo!

AGRADECIMENTO

Agradeço a todos que me apoiaram durante esta etapa, a UFSJ, professores do

programa PPGTDS, familiares. A aluna de iniciação Ariane Verdan que me ajudou nas

etapas de laboratório e principalmente a minha orientadora pela paciência e

ensinamentos.

RESUMO

O Brasil é um grande produtor de queijo e para cada quilo de queijo produzido são

gerados 9 litros de soro. A produção anual de queijo chega a mais 500 mil toneladas,

gerando milhares de litros de soro. Esse subproduto não é completamente aproveitado

nos setores alimentícios e biotecnológicos, representando um grande desperdício

nutricional e financeiro. Grandes volumes de soro são enviados para a nutrição de

suínos ou direcionados a sistemas de tratamento de efluentes. Lactoferrina é uma das

proteínas presentes no soro de leite sendo considerada uma proteína multifuncional,

apresentando efeito antibacteriano, antiviral, antifúngico, imunomodulador e

cicatrizante. Ela é comercializada em alguns países, França, Japão, Portugal, como

nutracêutico. O objetivo desse trabalho foi purificar a lactoferrina a partir do soro de

leite e avaliar sua estabilidade em uma formulação semi-sólida. O soro de leite foi

centrifugado e o sobrenadante foi submetido a ultrafiltração tangencial utilizando uma

membrana de 30NMWC. O concentrado de 30NMWC foi aplicado a coluna de SP

Sepharose Fast Flow. Planejamento experimental, DCCR, utilizando 3 variáveis

independentes em cinco níveis diferentes foi utilizado para estimar o melhor fluxo

(mL.min-1

), concentração de amostra inicial (mg) e tamanho do gradiente (VC). A

melhor condição para purificação da lactoferrina estimada pelo planejamento

experimental e estatisticamente significativa foi fluxo 0,3 mL.min-1, amostra inicial

1000mg e tamanho do gradiente 5VC. A formulação semi-sólida contendo a lactoferrina

incorporada não foi estável.

Palavras-chave: soro de queijo; cromatografia; purificação e lactoferrina.

ABSTRACT

Brazil is a major producer of cheese. Every kilogram of cheese generates about nine

liters of whey. The annual cheese production has exceed 500 thousand tons which

produce thousands liters of whey. Whey cheese is not completely used by food and

biotechnology industries, representing a major nutritional and financial wastage. A

considerable quantity of whey is used for the treatment of swine or sent to effluent

treatment plants. Lactoferrin is one of the proteins present in the whey, it is considered a

multifunctional protein showing antibacterial, antiviral, antifungal, immunomodulatory

and healing activity. Lactoferrin is commercialized in some countries as a nutraceutical

(France, Japan and Portugal). In this work, the main goal was the purification of

lactoferrin from whey and evaluates its stability in a semi-solid formulation. The whey

was centrifuged and the supernatant was submitted a tangential ultra flow filtration with

30 NMWC membrane. The 30NMWC concentrate was applied to SP Sepharose Fast

Flow column. Experimental design, DCCR was done using three independent variables

at five different levels to estimate the best flow (mL.min-1

), initial sample concentration

(mg) and gradient size (VC). Experimental design dates for lactoferrin purification were

statistical treated and the best conditions for this were 0.3 mL.min-1

flow, initial sample

1000mg and gradient size 5VC. The incorporated lactoferrin semi-solid formulation was

not stable.

Key Words: whey; chromatography; purification and lactoferrin.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Diagrama esquemático da molécula de lactoferrina bovina.................. 15

FIGURA 2 – SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras. Análise eletroforética

das frações eluídas da coluna SP Sepharose Fast Flow...............................................

31

FIGURA 3 – Cromatogramas obtidos a partir da cromatografia de troca catiônica

(coluna Hitrap SP- Sepharose Fast Flow)....................................................................

33

FIGURA 4 – SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras. Análise eletroforética

dascromatografias de troca catiônica (HiTrap SP Sepharose Fast Flow).................

35

FIGURA 5 – Gráfico dos valores preditos utilizando o modelo descrito na equação

(5) x valores observados experimentalmente para concentração de lactoferrina pico

3....................................................................................................................................

39

FIGURA 6 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para a recuperação

de lactoferrina (mg) em função da amostra inicial (mg) e do fluxo (mL.min-

1)...................................................................................................................................

40

FIGURA 7 – Superfície de resposta (A)e curva de contorno (B) para a recuperação

de lactoferrina (mg) em função da amostra inicial (mg) e do tamanho do gradiente

(VC).............................................................................................................................

40

FIGURA 8 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para a recuperação

de lactoferrina (mg) em função tamanho do gradiente (VC) e fluxo (mL.min-

1)...................................................................................................................................

41

FIGURA 9 – Gráfico dos valores preditos utilizando o modelo descrito na equação

(6) x valores observados experimentalmente para área do pico 3...............................

44

FIGURA 10 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para área do pico

3 (abs.mL) em função da amostra inicial (mg) e do fluxo (mL.min-1

)........................

45


3 (abs.mL) em função do gradiente (VC) e da amostra inicial (mg)...........................

45


3 (abs.mL) em função do gradiente (VC) e do fluxo (mL.min-1

)................................

46

FIGURA 13 – SDS-PAGE 12,5%, sob condições redutoras. Análise

eletroforéticadas formulações contendo lactoferrina 10% (m/m), durante o estudo

de estabilidade..............................................................................................................

48

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Propriedades físicas e bioquímicas das principais proteínas do soro

de leite..........................................................................................................................

13

TABELA 2 – Resinas utilizadas nas cromatografias de troca iônica........................

TABELA 3 – Valores considerados de α para o delineamento composto central

rotacional. K é o número de variáveis e ( ) ⁄ , utilizado para calcular as

variações em cada ponto do DCCR.............................................................................

TABELA 4 – Valores obtidos para uma variável hipotética utilizando cinco

níveis............................................................................................................................

19

21

22

TABELA 5 – Condições cromatográficas na cromatografia de troca-catiônica com

a coluna HiTrap™ SP Sepharose Fast Flow.............................................................

25

TABELA 6 – Níveis e parâmetros utilizados no planejamento

estatístico.....................................................................................................................

26

TABELA 7 – Concentração de proteína total do concentrado e filtrado de

30NMWC. A filtração foi realizada a 230 rpm, pressão de alimentação (Pfeed) 8 psi,

pressão de saída (Pret) 5 psi..........................................................................................

30

TABELA 8 – Purificação da lactoferrina utilizando a coluna de troca-catiônica SP-

Sepharose (10 mL)...............................................................................................................

32

TABELA 9 – Purificação da lactoferrina utilizando a coluna de troca-catiônica

HiTrapSP - Sepharose Fast Flow (5 mL)....................................................................

34


HiTrapSP - Sepharose Fast Flow (5 mL)....................................................................

34


HiTrap SP - Sepharose Fast Flow (5 mL).............................................................................

34

TABELA 12 – Perfil de eluição da lactoferrina das três corridas cromatográficas da

segunda condição.........................................................................................................

35

TABELA 13 – Valores codificados e variáveis independentes e resposta da

recuperação de lactoferrina (mg) e área do pico correspondente a eluição da

lactoferrina (abs.mL

-1)..................................................................................................

37

TABELA 14 – Coeficientes de regressão para a recuperação da lactoferrina em

mg.................................................................................................................................

38

TABELA 15 – Coeficientes de regressão para área do pico 3 (abs.min).................... 39

TABELA 16 – Análise de variância (ANOVA) da lactoferrina (mg) obtida a partir

do planejamento experimental DCCR 23, utilizando como variáveis o fluxo

(mL.min-1

), amostra inicial (mg) e tamanho do gradiente (VC)................................

42

TABELA 17 – Resultados do DCCR no estudo do fluxo (ml/min), concentração de

proteína total na amostra inicial (mg) e do tamanho do gradiente (VC) nas respostas

de recuperação de lactoferrina (mg) e área do pico correspondente a eluição da

lactoferrina (abs.mL)....................................................................................................

43

TABELA 18 – Análise de variância (ANOVA) da área do pico 3 (abs.mL obtida a

partir do planejamento experimental DCCR 23, utilizando como variáveis o fluxo

(mL.min-1

), amostra inicial (mg) e tamanho do gradiente

(VC).............................................................................................................................

44

TABELA 19 – Concentração de proteína total e pH da formulação contendo 10%

(m/m) de lactoferrina durante 3 meses.........................................................................

47

LISTA DE ABREVIATURAS

ABTS – 2,2’- azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)

DAB – 3,3'-Diaminobenzidine

DBO – Demanda bioquímica de oxigênio

DQO – Demanda química de oxigênio

DCCR – Delineamento composto central rotacional

kDa – Quilo Dalton

LA – Lactoferrina

LPS – Lipopolissacarídeo

NMWC – Membrana molecular de corte nominal

PBS – Tampão fosfato salino

pI – ponto isoelétrico

PVDF – Fluoreto de polivinilideno

SP – Sulfopropil

USPTO – Escritório de patentes dos Estados Unidos

VC – Volume de Coluna

SUMÁRIO

1INTRODUÇÃO...................................................................................................... 12

1.1Soro de leite..................................................................................................... 12

1.2 Lactoferrina.................................................................................................... 13

1.2.1 Atividades biológicas da lactoferrina....................................................... 15

1.3 Purificação da lactoferrina.............................................................................. 17

1.3.1 Cromatografia de Troca Iônica................................................................. 18

1.4 Delineamento Composto Central................................................................... 22

2 OBJETIVO............................................................................................................ 24

2.1 Objetivos específicos...................................................................................... 24

3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 25

3.1 Material.......................................................................................................... 25

3.2 Métodos.......................................................................................................... 25

3.2.1 Centrifugação........................................................................................... 25

3.2.2 Ultrafiltração tangencial........................................................................... 25

3.2.3 Cromatografia de troca-catiônica............................................................. 26

3.2.3.1 Planejamento Experimental................................................................ 26

3.2.4 Dosagem de Proteína................................................................................ 27

3.2.5Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de s

s sódio (SDS-PAGE)...................................................................................

28

3.2.6 Imunoensaio do tipo “Western Blot”........................................................ 28

3.2.7 Atividade enzimática da Lactoperoxidase................................................ 29

3.2.8 Avaliação da Formulação semi-sólida..................................................... 30

4.0 RESULTADOS e DISCUSSÃO........................................................................ 31

4.1Estabilidade da Formulação............................................................................ 47

5.0 CONCLUSÃO.................................................................................................... 50

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 51

ANEXO A................................................................................................................ 57

ANEXO B................................................................................................................ 58

ANEXO C................................................................................................................ 63

ANEXO D................................................................................................................ 64

12

1 INTRODUÇÃO

1.1 Soro de Leite

O consumo de leite de origem animal pelos humanos iniciou-se a

aproximadamente 11.000 anos a.C. O leite de origem bovina é um alimento composto

por água (87%), gordura (3,7%), proteína (3,4%), lactose (4,8%) e sais minerais (0,7%)

(PELEGRINE,2008).

As proteínas do leite são divididas em dois grupos: caseínas e proteínas do soro.

As caseínas constituem 80% das proteínas que existem no leite. Essas proteínas estão

associadas com cálcio e fosfato inorgânico formando uma suspensão coloidal de

micelas. As proteínas do soro de leite correspondem a 20% das proteínas totais,

distribuídas: α-lactoalbumina (3,7%), β-lactoalbumina (9,8%), soro albumina bovina

(1,2%), lactoferrina (0,3%), lactoperoxidase (0,1%), imunoglobulinas (2,1%), outras

proteínas (2,8%) (SGARBIERI, 2005; FARREL et al., 2004).

O soro de leite é obtido a partir do processamento do queijo. Durante o processo

de fabricação do queijo a caseína é precipitada no seu ponto isoelétrico pela ação da

renina ou de um ácido. O sobrenadante da precipitação com renina é denominado soro

doce (6<pH<7) e o sobrenadante obtido a partir da ação de um ácido é denominado soro

ácido (pH<5,0) (PELEGRINE,2008). O soro de leite representa, aproximadamente, 85 a

95% do volume de leite utilizado para a produção de queijo. Em algumas circunstâncias

esse subproduto, com elevada carga orgânica, é destinado a corpos de captação sem a

preocupação com o impacto ambiental. A demanda bioquímica de oxigênio (DBO) do

soro de leite é de 30 a 50g/L e a demanda química de oxigênio (DQO) de 50 a 80g/L, a

título de ilustração o impacto ambiental gerado pelo lançamento de 50.000L de soro de

leite pode ser comparado ao impacto ambiental do esgoto doméstico de uma cidade de

25.000 habitantes (SERPA, 2009).

O soro de leite é composto por água (95%), lactose (3,5%), proteínas (0,5%),

sais minerais, vitaminas e ácido láctico (1,0%) (BARBOSA, 2010). As proteínas do

soro de leite têm alto valor nutritivo, devido à sua composição, biodisponibilidade de

aminoácidos essenciais e alta digestibilidade. Essas proteínas são ricas em resíduos de

aminoácidos que contém enxofre (metionina e cisteína) fato que favorece a sua elevada

solubilidade em tampão aquoso. As proteínas do soro de leite apresentam propriedades

de formação e estabilização de espuma, emulsibilidade, geleificação, formação de

13

filmes, estas características as tornam importantes para as indústrias de alimentos,

fármacos e cosméticos (SGARBIERI, 2005).

As principais proteínas do soro de leite são extensivamente estudadas e

caracterizadas nas suas propriedades físico-químicas (tabela 1), propriedades funcionais

e estruturais. Essas proteínas podem ser divididas em dois grupos: proteínas presentes

em maior e menor concentração. As proteínas presentes em maiores concentrações são a

-lactoalbumina (25%) e β-lactoglobulina (55%), essas duas proteínas globulares de

baixa massa molar representam, aproximadamente, 80% das proteínas totais do soro. Os

componentes protéicos do soro que apresentam menor concentração são: soro albumina

bovina, lactoferrina, imunoglobulinas, fosfoliproteínas, numerosos fatores bioativos e

enzimas (tabela 1) (ANTUNES, 2003; PEREIRA et al., 2009).

Tabela 1 – Propriedades físicas e bioquímicas das principais proteínas do soro de leite.

Proteína Massa molar (kDa) Ponto isoelétrico Concentração (g.L-1

)

-lactoglobulina 18,4 5,2 2,70

-lactoalbumina 14,15 4,2 - 4,8 1,20

Soro albumina bovina 69 4,7 - 4,9 0,4

Imunoglobulina 15 -1000 5,5 -8,3 0,65

Lactoferrina 78 8,0-9,0 0,1

Lactoperoxidase 89 9,5 0,02

Fonte: Adaptado de Pereira, 2009.

1.2 Lactoferrina

A lactoferrina bovina (LB) foi identificada no leite bovino em 1939 e isolada do

leite humano e bovino, simultaneamente, em 1960 (SANCHES, 2010). Sua

característica mais marcante é a intensa coloração vermelha quando incubada na

presença de íons Fe3+

(BAKER, 2009). Além do leite, a lactoferrina é encontrada em

secreções de mucosas, como: saliva, lágrima, sêmen, vaginal, nasais e brônquicas, bile,

fluídos gastrointestinais e urina (SANCHES, 2010; BAKER, 2009).

A lactoferrina é uma proteína básica (pI8,0-9,0), glicosilada, possui uma cadeia

simples contendo, aproximadamente, 700 resíduos de aminoácidos e massa molar de

80-84kDa. A glicosilação da lactoferrina é dependente da espécie, os prováveis sítios de

glicosilação da lactoferrina humana são: asparagina (Asn) 137, 476 e 625; já a

lactoferrina bovina apresenta os resíduos de Asn 233, 281, 368, 476 e 545 como

prováveis sítios de glicosilação (STEVANATO, 2005; BRISSON et al., 2007; BAKER

e BAKER 2009). Os genes que codificam a lactoferrina são altamente conservados

14

entre as espécies e o RNAm apresenta uma organização, com cerca de 1900-2600pb

(FARNAUD, 2003).

Transferrina, ovotransferrina, melanotransferrina, inibidor de anidrase carbônica

e lactoferrina pertencem à família das proteínas não hêmicas, transportadoras de ferro

(WARD et al., 1996). A composição de aminoácidos da lactoferrina e da transferrina

apresenta uma homologia de 55%. No entanto, essas duas proteínas diferem nas

propriedades imunológicas e antigênicas, composição de carboidratos e sítios de

glicosilação, solubilidade à água, ponto isoelétrico, sítio de ligação ao ferro. A

lactoferrina retém os íons férricos em uma faixa de pH de 3 a 4, enquanto a transferrina

dissocia-se dos íons férricos em uma faixa de pH de 5 a 6. A afinidade da lactoferrina

para os íons férricos pode ser até 300 vezes maior que a transferrina (STEVANATO,

2005).

A cadeia polipeptídica da lactoferrina é dobrada em dois lobos simétricos (Ne C-

terminal) que apresentam homologia entre si de 33 a 41%. O lobo N-terminal é formado

pelos resíduos de aminoácidos 1 a 332 e o lobo C-terminal é formado pelos resíduos de

aminoácidos 344 a 703. Os lobos N e C-terminal são formados pelas estruturas de α-

hélice e folha-β pregueada (figura 1A). Os lobos são subdivididos em dois domínios N1

e N2, C1 e C2, respectivamente. A ligação do ferro em cada lobo ocorre entre estes

domínios (MOORE et al., 1997). A lactoferrina pode existir na forma Apo que é a

forma não ligada ao Fe3+

ou na forma Holo que é a forma ligada ao Fe3+

, essa ligação é

forte (kD ~10-20

M), porém reversível (BOKKHIM et al., 2014).

Os resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação ao íon férrico são dois

resíduos de ácido aspártico (Asp, D), um de tirosina (Tyr, Y), um de histidina (His, H) e

um de arginina (Arg,R) que se liga ao íon carbonato que por sua vez se liga ao íon

férrico (figura 1B). Este sítio de ligação a cátions é conservado na lactoferrina de

diferentes espécies (BAKER; BAKER, 2009). A lactoferrina pode ligar-se aos íons Fe+2

,

Ca2+

, Cu2+

, Zn2+

e Mn2+

(GARCÍA-MONTOYA, 2011). A complexação da lactoferrina

com o ferro pode ser desfeita pela precipitação com sulfato de amônio em meio ácido

(pH2), transformando-a na forma Apo (OHASHI, 2003).

A conformação molecular da lactoferrina muda dependendo da saturação dos

sítios de ligação ao Fe3+

. A forma holo da lactoferrina apresenta uma estrutura terciária

mais compacta contribuindo para maior resistência a desnaturação térmica e proteólise

que a forma apo (BOKKHIM et al., 2014).

15

Figura 1 – Diagrama esquemático da molécula de lactoferrina bovina. A figura 1A apresenta a molécula

de lactoferrina bovina com os lobos N e C-terminal. As estruturas secundárias α-hélice estão apresentadas

como cilindro e as folhas β-pregueadas como setas. As glicosilações C-terminal estão apresentadas como

esferas pequenas. As esferas presentes no lobo N e C-terminal apresentam o Fe3+

complexado aos

resíduos de aminoácidos. Esta região foi ampliada (figura 1B) e apresenta o Fe3+

complexado aos resíduos

de tirosina (Y 92 e 192), histidina (H 253), ácido aspártico (D 60), o resíduo de arginina (R 121) que liga

o íon carbonato, que por sua vez participa da ligação ao íon Fe3+

. Modificado de MOORE et al. (1997);

BAKER; BAKER (2009).

1.2.1 Atividades biológicas da lactoferrina

A lactoferrina apresenta atividade antibacteriana contra bactérias gram-negativas

e gram-positivas; Staphylococcus aureus, Listeriamonocytogenes, Klebsiella

pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Haemophillus influenzae e Streptococcus

mutans (GARCÍA-MONTOYA, 2011). A provável ação bacteriostática da lactoferrina

ocorre através do sequestro dos íons férricos diminuindo a disponibilidade desse

nutriente para a bactéria presente no sítio da infecção (JENSSEN; HANCOCK, 2009).

O efeito bactericida da lactoferrina é devido à interação direta da proteína com a

superfície da célula bacteriana. Em bactérias gram-negativas a lactoferrina se liga ao

lipídio A do LPS (lipopolissacarídeo) presente na parede celular, esta interação

lactoferrina-LPS impede a interação do LPS com íons Ca2+

e Mg2+

, modificando a

permeabilidade da parede celular. A ligação da lactoferrina com a molécula de LPS de

bactérias gram-negativas impede a interação do LPS com as moléculas do toll-like

receptor 4, limitando a ativação da cascata inflamatória (MISHRA et al., 2013).

C-terminal

N-terminal

A B

16

Em bactérias gram-positivas a lactoferrina se liga ao ácido lipoteicóico,

molécula presente na superfície externa da parede celular que apresenta carga negativa.

A ligação da lactoferrina às moléculas de ácido lipoteicoíco diminuiu as cargas

negativas presente na parede celular bacteriana, tornando as células mais susceptíveis à

ação da lisozima, enzima que degrada peptideoglicano (JENSSEN; HANCOCK, 2009).

Lactoferricina (LFcina) é um peptídeo catiônico N-terminal, gerado pela

clivagem da lactoferrina com a pepsina. O peptídeo LFcina é formado pelos resíduos de

aminoácidos 17 a 41, esta estrutura apresenta uma ponte dissulfeto (formada entre os

resíduos de cisteína 19 e 36), oito resíduos de aminoácidos básicos (três resíduos de

histidina e cinco resíduos de arginina). O mecanismo de ação antibacteriana deste

peptídeo é devido à atração eletrostática entre a molécula do peptídeo e as moléculas da

superfície celular. A ligação de LFcina à membrana celular aumenta a liberação de K+ e

internalização de H+, perturbando a função da membrana celular (BELLAMY et al.,

1992; WAKABASHI et al., 2003).

A LA se liga à glicosaminoglicanas presentes na célula do hospedeiro,

impedindo a internalização do vírus pela célula. Esse mecanismo de ação antiviral da

lactoferrina é observado para o vírus da hepatite B e C, rotavírus e vírus herpes simplex

(FARNAUD; EVANS, 2003).

As espécies de cândida: C. tropicalis,C. krusei, C. albincans, C. guilliermondii,

C. parapsilosis e C.grabrata são suscetíveis à ação da lactoferrina (JENSSEN;

HANCOCK, 2009). O provável mecanismo de ação da LA nesses micro-organismos é o

sequestro de Fe3+

(GONZÁLEZ-CHÁVES et al., 2009).

Lactoferrina é um modulador da resposta imune inata e adquirida, auxilia a

proliferação, diferenciação e ativação de células do sistema imune. A ação anti-

inflamatória da LA é devida a inibição da liberação de citocinas no local da inflamação.

A ligação da LA ao LPS diminui a interação do LPS com receptores, diminuindo a

liberação de citocinas inflamatórias. A LA inibe a liberação do Fator de Necrose

Tumoral (TNF), interleucina1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6); promove a secreção de

citocinas anti-inflamatórias interleucina 10 (IL-10) e interleucina 4 (IL-4). Em artrite

reumatóide a ligação da lactoferrina aos íons férricos previne a catálise e produção de

radicais livres. In vivo, a LA é liberada por neutrófilos presentes no local da inflamação

(LEGRAND et al., 2005; VOGEL, 2012).

Estudos em roedores mostraram que a ingestão oral de lactoferrina reduz a

tumorigênese química. Lactoferrina induz a apoptose e inibe o crescimento do tumor,

17

provavelmente, impedindo a transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular das

células malignas. Estudo in vivo demonstrou que a ingestão da lactoferrina reduz o risco

de câncer de cólon em humanos (KOZU et al., 2009). Diversos estudos demonstraram a

ação anticarcinogênica da lactoferrina, entretanto, seu mecanismo de ação ainda não é

completamente conhecido (GARCIA-MONTOYA et al., 2012; HABIB et al., 2013).

A LA aumenta a mobilidade de fibroblastos, a migração de queratinócitos e a

contração do colágeno auxiliando no processo de cicatrização. A migração dos

queratinócitos e sua proliferação são essenciais para a re-epitalização e restabelecimento

da barreira da pele. Um dos fatores que contribui para a persistência das feridas crônicas

é a incapacidade de migração dos queratinócitos, provavelmente, devido a não

responsividade destas células (ENGELMAYER et al., 2008; TANG et al., 2010;

TAKAYAMA et al., 2003). Tang et al (2010) demonstraram que lactoferrina

recombinante humana (rhLA) estimulou a proliferação e migração de queratinócitos (in

vitro) e a re-epitetilização em modelo suíno de queimadura.

As atividades biológicas da lactoferrina tornam esta proteína um alvo para a

indústria de nutracêuticos, cosméticos, fármacos e alimentos. Formulações de leite, leite

fermentado, pasta de dente, cápsulas contendo a lactoferrina são comercializadas em

países como Japão, França e Portugal (CONESA; CALVO; SÁNCHEZ, 2010).

1.3 Purificação da Lactoferrina

A LA é purificada a partir de leite ou soro de leite utilizando vários métodos de

purificação (WAKABAYASHI et al., 2006).

A empresa Oleofina, localizada na Bélgica, em 1985 foi a primeira a purificar

esta proteína em escala industrial. Outra empresa foi a MILEI GmbH, localizada na

Alemanha, que purificou a LA bovina a partir do soro de leite ou leite desnatado

utilizando tecnologia desenvolvida pela indústria de laticínios Morinaga CO, Ltd.

Ultimamente, a LA bovina é produzida por diversas indústrias como, por exemplo,

MILEI na Alemanha, DMV International na Nova Zelândia, DOMO Food Ingredients

na Bélgica, Tatua Nutritionals e Fonterra na Nova Zelândia, MG Nutritionals na

Austrália, e Armor Proteins na França. A produção da lactoferrina bovina em escala

industrial ultrapassa 60 toneladas por ano. Embora o processo de purificação seja

relativamente simples e o Brasil produza quantidades significativas de soro de leite esta

proteína não é produzida no Brasil (TOMITA et al., 2009).

18

A cromatografia de troca-iônica é utilizada, pela maioria das patentes

depositadas no USPTO, para purificação da lactoferrina a partir de leite ou soro de leite.

A pequena concentração da lactoferrina no leite e no soro de leite é o principal desafio

destes processos para a produção de uma lactoferrina com grau de pureza adequado

(UCHIDA et al., 1996).

1.3.1 Cromatografia de Troca Iônica

A cromatografia é um método físico-químico que permite a separação de

componentes de uma mistura, através da distribuição destes componentes em duas

fases, que estão em contato íntimo. Em todas as separações cromatográficas, a amostra é

dissolvida numa fase móvel (líquido, gás ou fluído supercrítico). A fase móvel flui

através de uma fase imiscível (fase estacionária) a qual é fixa na coluna ou em uma

superfície sólida. A alimentação é introduzida na coluna como um pulso e os

componentes individuais são separados devido a sua distribuição diferencial entre as

fases (ZUÑIGA, 2003).

A cromatografia de troca-iônica é uma cromatografia adsortiva e pode ser

dividida em dois tipos de acordo com o grupo ligante ligado à matriz. Na cromatografia

de troca aniônica o ligante é um grupo funcional com carga positiva ao qual se liga

proteínas carregadas negativamente. Já a cromatografia de troca catiônica apresenta

como ligante um grupo funcional com carga negativa ao qual se liga proteínas

carregadas positivamente. Ambos os trocadores podem ser classificados como forte ou

fraco como mostrado na Tabela 2. O termo fraco ou forte não estão relacionados com a

força de ligação da proteína ao grupo ligante, mas descreve o grau de ionização do

grupo ligante em função do pH. Trocadores de íons fortes são completamente ionizados

sobre uma ampla faixa de pH, enquanto os trocadores de íons fracos são apenas

parcialmente ionizados em uma estreita faixa de pH (CUMMINS; DOWLING;

CONNOR, 2011). Grupos amino alquilado, carboxi e sulfo para trocadores de aníons,

bem como os grupos fosfato de trocadores de cátions são os grupos funcionais mais

comuns utilizados em suportes de cromatografia de troca iônica. Trocadores de ácidos

sulfônicos são conhecidos como fortes trocadores de cátions, tipo ácido. Grupos

funcionais de amina quaternária são trocadores de base forte, as aminas menos

substituídas são conhecidas como trocadores de bases fracas (ACIKARA, 2013).

19

Cromatografia de troca iônica é geralmente utilizada como um passo

intermediário num esquema de purificação de proteínas, no entanto, pode-se obter alta

resolução para algumas proteínas quando utilizado mais cedo ou mais tarde durante a

purificação (RITCHIE, 2013).

Todas as proteínas exibem uma carga líquida que depende da composição de

aminoácidos da proteína. A carga global de uma proteína é influenciada pelo pH do

meio ao qual ela se encontra. O ponto isoelétrico (PI) de uma proteína é o pH no qual a

carga líquida da proteína é zero. A proteína terá carga líquida negativa quando estiver

presente em um meio com pH acima do seu pI, enquanto que sua carga líquida será

positiva quando estiver em um meio com pH abaixo do seu pI. Assim, o pH da fase

móvel na cromatografia de troca iônica pode ser ajustado para facilitar a adsorção ou

para promover a eluição de uma proteína adsorvida à resina (RITCHIE, 2013).

Tabela 2- Resinas utilizadas nas cromatografias de troca iônica.

Tipo de

Troca

Grupo de Troca

Iônica

Contra Íons

presente no

tampão

Faixa de

estabilidade

pH

Nome Comerciais

CaptoS

Cátion Forte Ácido Sulfônico (SP) Na+, H

+, LI

+ 4-13 SP Sepharose

SP Sephadex

TSKgel SP_5PW

Cátion Fraco

Ácido Carboxílico

Na+, H

+, Li

+

6-10

CM Cellulose

CM Sepharose

CM Sephadex

CM Sepharose CL6B

TSKgel CM-5PW

Q Sepharose

Ânion Forte

Amina Quaternária

(Q)

Cl-, HCOO3

-,

CH3COO, SO42-

2-12

CaptoQ

Dowex 1X2

Amberlite/ Amberjet

QAE Sephadex

Ânion Fraco

Amina Primária

Amina Secundária

Amina Terciária

(DEAE)

Cl-, HCOO3

-

CH3COO-, SO4

2-

2-9

DEAE- Sepharose

Capto DEAE

DEAE Cellulose

Fonte: Acikara, 2013

Os grupos ionizáveis dos aminoácidos que compõem as proteínas conferem a

estas uma natureza poliônica responsável pelas interações eletrostáticas com o grupo

ligante das resinas. As moléculas de proteína se ligam ao grupo ligante do adsorvente

deslocando os contra-íons. Como consequência deste fenômeno, na região de adsorção a

resina se torna eletricamente neutra. Este mecanismo de adsorção recebe o nome de

troca de íons e possui grande importância na separação de proteínas (QUADRI; CRUZ;

20

SANTANA, 1998). Solutos com interação mais fraca com o grupamento trocador

acabam ligando-se menos fortemente à resina e são eluídos primeiro. Solutos que

apresentam ligação mais intensa com a fase estacionária são eluídos por último ou não

são eluídos, devido à forte adsorção à resina (AHAMED, 2008).

Na cromatografia de troca iônica, a fase estacionária (derivada de matriz

orgânica quimicamente inerte, com grupos funcionais inertes) é equilibrada com um

tampão de baixa força iônica 10 a 50 mM. A amostra contendo a proteína de interesse é

aplicada a coluna no mesmo tampão de baixa força iônica utilizado para o equilíbrio. A

resina é lavada antes da eluição com o mesmo tampão de equilíbrio. Durante a eluição é

utilizado um tampão com força iônica maior que o tampão de equilíbrio, íons do tampão

de eluição deslocam a proteína adsorvida à fase estacionária. Certos sais são mais

eficientes para utilização em cromatografia de troca iônica que outros, devido à sua

capacidade em deslocar as proteínas ligadas e os seus efeitos sobre a estabilidade da

proteína (TSUMOTO, 2007). O cloreto de sódio é, provavelmente, o eluente mais

amplamente utilizado para a separação de proteínas por não causar alterações na

estrutura da proteína; no entanto nem sempre é o melhor eluente para a separação de

proteínas. Os tempos de retenção, as larguras do pico eluído e a resolução do

cromatograma são afetados pela natureza dos ânions e cátions utilizados (ACIKARA,

2013).

Alternativamente, o pH do tampão pode ser alterado para reduzir a carga de

proteínas e perturbar a sua interação com a fase estacionária. Para as proteínas ligadas a

uma fase estacionária de troca catiônica, o aumento do pH do tampão conduzirá a uma

menor carga positiva sobre a proteína e subseqüente eluição a proteína adsorvida. Para

as proteínas ligadas a uma fase estacionária de troca aniônica, a diminuição do pH do

tampão conduzirá a uma menor carga negativa sobre a proteína e subsequente eluição

da proteína (RITCHIE, 2013).

A cromatografia de troca-iônica é amplamente aplicável para a análise de um

grande número de moléculas, é facilmente transferida para as escalas de produção com

baixo custo, altos níveis de purificação podem ser conseguidos e está presente na

maioria dos protocolos de purificação de proteínas. Os protocolos de purificação de

proteínas são desenvolvidos com base no conhecimento e experiência da equipe

envolvida, utilizando a abordagem da tentativa e erro. Essa abordagem torna os

protocolos trabalhosos e às vezes a melhor condição não é estabelecida (ACIKARA,

2013).

21

1.4 Delineamento Composto Central

Delineamento de Experimentos (DOE) é o plano formal para a condução do

experimento, ou seja, são testes conduzidos de forma planejada, onde os fatores (ou

variáveis controladas) são alterados de modo a avaliar seu impacto sobre uma variável

resposta. Quando se necessita desenvolver, ou melhorar um processo, o pesquisador

precisa planejar um experimento para avaliar os efeitos que suas variáveis

independentes têm sobre as respostas (RODRIGUES; IEMMA, 2005).

Técnicas de planejamento estatístico como o Delineamento Composto Central

(DCC) podem ser utilizadas para analisar o efeito de um ou mais fatores de controle ao

mesmo tempo. O Delineamento Composto Central (DCC) é um delineamento simétrico

e de segunda ordem, desenvolvido com o objetivo de permitir encontrar o ponto de

resposta máxima ou mínima, em ensaios com k fatores, cada um com cinco níveis e

com um número de pontos inferior a outros tipos de delineamentos utilizados.

Considerado um delineamento ótimo, pertence a uma família de delineamentos

eficientes, os quais requerem poucos ensaios para sua realização. Possui características

interessantes para a busca do ponto que dê a resposta ótima, que são: um número menor

de tratamentos em relação aos fatoriais completos e pode ser realizado sequencialmente,

de forma a otimizar o sistema (MATEUS, 2001).

O DCC é constituído por três partes: cúbica (fatorial), central e axial (α). O

fatorial depende da combinação do número de fatores k analisados no experimento. O

ponto central, além de ser responsável também pela estimativa dos efeitos quadráticos,

possibilita a estimativa do erro puro, quando ele é repetido (MENDONÇA, 2012). Os

pontos axiais são situados nos eixos do sistema de coordenadas com distância ± α da

origem; um delineamento Composto Central que tem pontos axiais definidos como na

Tabela 3 é dito Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) (RODRIGUES;

IEMMA, 2005).

Tabela 3 – Valores considerados de α para o delineamento composto central rotacional. K é o número de

variáveis e ( ) ⁄ utilizado para calcular as variações em cada ponto do DCCR.

K 2 3 4 5 6

Α ± 1,4142 ± 1,6818 ± 2,0000 ± 2,3784 ± 2,8284

22

De acordo com a tabela 3, o número de variáveis K está relacionada

estatisticamente com os valores limites + e - de α. Supondo que se escolha 3 variáveis

para um experimento os valores representativos de +1,6818 a -1,6818 serão escolhidos

de acordo com o intervalo de estudo que o pesquisador desejar. O pesquisador escolhe

um valor máximo ou um mínimo para cada variável analisada. Entretanto, a diferença

entre os valores deverá ser proporcional.

Suponha que um pesquisador esteja trabalhando com uma variável X em 5

níveis diferentes. Ele escolheu de acordo com seu conhecimento um nível mínimo (2

minutos) e um nível máximo (7 minutos) para a variável em questão, utilizando a

equação 1, ele determinou que o Δ é de 1,48. Os outros valores serão calculados

utilizando o valo máximo ou mínimo e o Δ é de 1,48 (equação 2, tabela 4).

Tabela 4 – Valores obtidos para uma variável hipotética utilizando cinco níveis.

Níveis -1,68 -1 0 +1 +1,68

Variável

(min)

2 3,03 4,51 5,98 7

( ) (1)

onde = valor da variável que será utilizada no nível +1 (2)

23

2 OBJETIVO

O objetivo desse trabalho foi purificar a lactoferrina bovina a partir do soro de leite,

subproduto de baixo valor agregado e estudar a estabilidade de uma formulação semi-

sólida contendo a lactoferrina como princípio ativo.

2.1 Objetivos específicos

1 Utilizar o planejamento experimental DCCR para estimar as melhores condições

cromatográficas (troca catiônica com resina SP Sepharose) da purificação da

lactoferrina bovina a partir do soro de leite;

2 Desenvolver uma formulação semi-sólida contendo a lactoferrina como

princípio ativo;

3 Avaliar a estabilidade da formulação contendo a lactoferrina bovina como

princípio ativo.

24

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material

O Soro de leite utilizado neste trabalho foi doado pela empresa Laticínio 5 estrelas

(Barbacena MG). A lactoferrina bovina, anticorpo policlonal contra lactoferrina

humana, anticorpo anti IgG de coelho conjugado com peroxidase, 3,3´-

diaminobenzidina e ABTS foram adquiridos da Sigma-Aldrich. A coluna SP-Sepharose

Hi-Trap Fast Flow, cartucho de fibra oca 30NMWC (Hollow fiber cartridge) foram

adquiridos da GE® Life Sciences. Lactoferrina bovina (comercial) foi adquirida da

Smart Pharmaceuticals (South Africa). Todos os outros reagentes utilizados no

desenvolvimento dos experimentos foram de grau analítico.

3.2 Métodos

3.2.1 Centrifugação

O soro de leite doce foi centrifugado a 3400 rpm a 4ºC durante 30 minutos.

Após a centrifugação o pellet foi descartado e o sobrenadante foi utilizado para purificar

a lactoferrina bovina.

3.2.2 Ultrafiltração Tangencial

O sobrenadante do soro de leite foi concentrado utilizando uma membrana tipo

cartucho de fibra oca corte nominal 30 kDa, área total de 650cm2, acoplada a um

sistema QuixStand Benchtop System® (Watson Marlow). A filtração foi realizada a

230rpm, pressão de alimentação (Pfeed) 8psi, pressão de saída (Pret) 5psi. O concentrado

de 30NMW foi submetido a dialfiltração com troca de tampão fosfato de sódio 50mM

pH 6,5. Nesse processo foi adicionado um volume de tampão equivalente ao volume do

concentrado, a mistura foi filtrada até obter novamente o mesmo volume do

concentrado. Este processo foi repetido 3x utilizando as condições descritas acima. O

diafiltrado foi congelado e/ ou liofilizado, e utilizado para purificar a lactoferrina

bovina.

25

3.2.3 Cromatografia de Troca-catiônica

A coluna XK16/20 foi empacotada com10mL da resina SP Sepharose Fast Flow

e conectada ao cromatógrafo AktaPurifier 10. A coluna foi equilibrada com cinco

volumes de coluna do tampão fosfato de sódio 50mM pH6,5 (tampão A). Após o

equilíbrio, a amostra foi aplicada e a coluna lavada com tampão A até atingir a linha de

base. As proteínas adsorvidas foram eluídas utilizando 5 VC (volume de coluna) do

tampão A e tampão B (tampão A acrescido de NaCl 1,5M pH 6,5), fluxo constante de

0,5mL/min durante todo o processo.

As próximas cromatografias de troca-iônica utilizaram coluna pré-empacotada

HiTrap™ SP Sepharose Fast Flow (5mL) para diminuir o tempo gasto no processo de

empacotamento. A coluna foi conectada ao cromatógrafo AktaPurifier 10. Três corridas

cromatográficas foram realizadas (tabela 5). Na 1ª e 2ª corridas foram utilizados

diferentes volumes de amostra inicial. A terceira corrida utilizou tampão de equilíbrio e

eluição diferente da 1ª e 2ª condição (tabela 5). Em todas as corridas a coluna foi

equilibrada, lavada e eluída com fluxo constante de 0,5 mL/min durante todo o

processo.

Tabela 5 – Condições cromatográficas na cromatografia de troca-catiônica com a coluna HiTrap™ SP

Sepharose Fast Flow.

Corrida Tampão A Tampão B

1ª Fosfato de sódio 50mM, pH 6,5 Fosfato de sódio 50mM, pH 6,5 acrescido de 1,5M de

NaCl

2ª Fosfato de sódio 50mM, pH 6,5 Fosfato de sódio 50mM, pH 6,5 acrescido de 1,5M de

NaCl

3ª Fosfato de sódio 50mM, pH 7,0

acrescido de 0,1M de NaCl

Fosfato de sódio 50mM, pH 7,0 acrescido de 1,5M de

NaCl

3.2.3.1 Planejamento Experimental

O DCCR (planejamento estatístico) foi realizado para estimar as melhores

condições da purificação da lactoferrina bovina a partir do soro de leite com 3 variáveis

independentes, sendo elas: fluxo (mL/min), concentração da amostra inicial (mg),

tamanho do gradiente (VC). O delineamento foi composto por 17 ensaios (

ensaios + 6 pontos axiais + 3 centrais), aplicável a metodologia de superfície de

resposta. Cada variável foi avaliada em 5 níveis diferentes, conforme apresentado na

26

Tabela 6, com três repetições no ponto central. Através da ferramenta estatística os

níveis são determinados a partir do número de variáveis escolhidas, sendo que os

valores dos níveis são de escolha livre. As corridas foram realizadas aleatoriamente e

cada coluna usada no máximo 4 vezes.

Tabela 6 – Níveis e parâmetros utilizados no planejamento estatístico.

Variáveis

Níveis

-1,68 -1 0 +1 +1,68

Fluxo (mL/min) 0,300 0,381 0,500 0,619 0,700

Amostra inicial (mg) 280 425,7 640 854,3 1000

Tamanho do gradiente (VC) 5 7,02 10 12,98 15

Os resultados do planejamento experimental DCCR foram analisados

utililizando o Software Statistica 8.0.

3.2.4 Dosagem de Proteína

A concentração de proteína total foi determinada utilizando o método de Lowry,

essa metodologia possui alta sensibilidade para determinar concentrações de proteína.

Inicialmente foram preparadas as soluções: solução A (sulfato de cobre 1%), solução B

(tartarato de sódio e potássio 2%), solução C (2% carbonato de sódio + 0,1M de

hidróxido de sódio). Os reagentes acima foram misturados na proporção de 1:1:100 da

solução A:B:C, respectivamente, gerando o reagente E. O reagente de Folin-Ciocateau

foi diluído 1:2 com HCl 1M (LOWRY et al., 1951).

Em tubos de ensaio foram adicionados 200µL de amostra utilizando uma

diluição adequada para que a concentração de proteína da amostra estivesse dentro da

faixa de linearidade do método. Em seguida foram adicionados 2 mL do reagente E em

cada tubo, agitado e incubado a temperatura ambiente durante 10 minutos. A seguir,

200µL do reagente de Folin-Ciocateau foram adicionados em cada tubo e

imediatamente, agitado e incubado durante 30 minutos ao abrigo da luz. Decorrido o

tempo de incubação a absorbância das amostras foram lidas no comprimento de onda de

750nm. A curva padrão foi construída utilizando uma solução de soro albumina bovina

1mg/mL.

27

3.2.5 Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Contendo Dodecil Sulfato de Sódio

(SDS-PAGE)

A eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% contendo dodecil sulfato de sódio

(SDS) foi realizada com a finalidade de caracterizar o grau de pureza das amostras

obtidas em cada etapa de purificação. O gel foi submetido a uma corrente constante de

30mA à temperatura ambiente. O padrão de massa molar utilizado foi o low marker (GE

Healthcare) com padrões de massa molar 97– 66 – 45 – 30 – 20,1 e 14,4kDa. A

metodologia utilizada para a eletroforese de gel poliacrilamida contendo dodecil sulfato

de sódio foi a de Laemmli (1970), a coloração dos géis utilizou a técnica da coloração

com “coomassie blue” (MERRIL, 1990).

3.2.6 Imunoensaio do tipo “Western Blot”

A transferência eletroforética de proteínas imobilizadas separadamente no gel de

SDS-PAGE para a superfície de membranas torna essas proteínas acessíveis a vários

reagentes e sondas e assim aptos para futuras caracterizações. Com a finalidade de

caracterizar a identidade da proteína purificada foi realizada a análise imunoenzimática

do tipo western blot.

Após a corrida eletroforética o gel foi incubado por 20 minutos com tampão de

transferência Towbin (TOWBINet al., 1979). E a membrana de PVDF foi incubada por

5 segundos em metanol, 5 minutos em água ultrapurificada e 10 minutos no mesmo

tampão de transferência.

As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF em uma cuba (Loccus

Biotecnologia LWB 10x10) à corrente constante de 300mA, 120V, por 4 horas. Após a

transferência, a membrana teve seus sítios inespecíficos bloqueados, overnight a 4ºC

com solução PBS / albumina 5% (v/v). Após este período, a membrana foi lavada 3

vezes, 10 minutos cada com solução PBS / Tween 20 0,05% (v/v) (PBS/T). Na

sequência, a membrana foi incubada com o anticorpo primário (anticorpo policlonal anti

lactoferrina humana produzido em coelho, Sigma L3262) em diluições pré-

determinadas (1:5000), por 4 horas a temperatura ambiente, sob agitação. Decorrido

esse tempo a membrana foi lavada, como descrito acima. Em seguida, a membrana foi

incubada com anticorpo anti-IgG de coelho produzido em cabra conjugado com

peroxidase (Sigma A0545) por duas horas a temperatura ambiente. Após a incubação, a

28

membrana foi novamente lavada conforme descrito acima e a reação imunoenzimática

foi visualizada com solução de DAB 1 mg/mL, H2O2 0,11% (v/v) em PBS pH 7,4.

3.2.7 Atividade Enzimática da Lactoperoxidase

Devido à pequena diferença de massa molar e ponto isoelétrico da lactoferrina

(78kDa e pI 8-9) e lactoperoxidase (89kDa e pI 9,5), o ensaio enzimático foi utilizado

para confirmar a presença ou ausência da lactoperoxidase nos picos eluídos da

cromatografia de troca-iônica.

A atividade foi determinada utilizando o método descrito por Kumar e Bhatia

(1999), com algumas modificações. Seguindo o princípio da reação (equação 3):

⇒ (3)

Um ml da solução 1mmol/L de ABTS (2,2’- azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-

ácido sulfônico) em tampão fosfato de sódio 0,1mo/L pH 6,0 e 33µl de amostra foram

adicionados a uma cubeta e agitada por inversão. A seguir foram adicionados 33µl da

solução de peróxido de hidrogênio (3,2mmol/L) e a absorbância foi medida a 412nm

durante 1,5 minutos, com intervalos de leitura a cada 5 segundos. Uma unidade de

atividade (U) foi definida como a quantidade de enzima que catalizou a oxidação de

1µmol de ABTS/min a temperatura ambiente, em tampão fosfato 0,1mol/L pH 6,0. A

concentração de ABTS utilizada foi de 1mmol/L e de H2O2 0,1mmol/L na mistura da

reação. A unidade de atividade enzimática foi calculada como descrito nas equações 4 e

5.

⁄ (4)

⁄

⁄⁄ (5)

Δ412 = variação da absorbância a 412 nm

1,066 = volume total da reação enzimática

32,4 = coeficiente molar do ABTS a 1 mmol/L a 412 nm

0,033 = volume de amostra

1,5 = tempo da reação

2 = coeficiente estequiométrico (1mol de H2O2 para 2 mols de ABTS)

29

3.2.8 Avaliação da Estabilidade da Formulação Semi-sólida

Lactoferrina comercial adquirida da Smart Pharmaceuticals foi incorporada a

Allubase™ (creme não iônico) na concentração de 10% (m/m). A formulação final foi

distribuída em frascos brancos, protegidos da luz contendo, aproximadamente, 5 gramas

de creme.

Os frascos contendo a formulação foram mantidos em estufa com controle de

temperatura (40 ± 2°C). As amostras foram analisadas no tempo 0, 30 e 90 dias. Em

cada análise foram retirados três frascos para os testes de estabilidade.

O pH da solução aquosa da formulação na concentração de 0,1g/mL foi medido.

A degradação da lactoferrina incorporada à formulação foi avaliada utilizando a

eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5%, conforme descrito no item

3.2.5. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

30

4.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A membrana de 30NMWC foi escolhida com o objetivo de concentrar a

lactoferrina bovina (tabela 7), permitindo trabalhar com um volume menor de amostra

nas próximas etapas do processo de purificação.

Tabela 7 – Concentração de proteína total do concentrado e filtrado de 30NMWC. A filtração foi

realizada a 230 rpm, pressão de alimentação (Pfeed) 8 psi, pressão de saída (Pret) 5 psi.

Amostra Volume

(mL)

Concentração de proteína

(mg/mL)

Concentração de

proteína total (g)

Recuperação

(%)

Soro de leite 1000 19,69 19,69 100

Concentrado de 30

kDa

225 86,35 19,43 98,68

Filtrado 30 kDa 775 0,2815 0,218 1,11

O concentrado de 30NMWC foi utilizado como amostra inicial para purificar a

lactoferrina bovina.

O concentrado de 30NMWC foi aplicado na coluna empacotada com resina SP-

Sepharose Fast Flow e as proteínas adsorvidas eluídas com tampão fosfato de sódio

50mM pH6,5 acrescido de 1,5M de NaCl. O perfil de eluição das proteínas adsorvidas

na coluna de troca-catiônica apresentou três picos (dados não mostrados). Nas

condições cromatográficas utilizadas nesse trabalho (resina de troca-catiônica e tampão

de equilíbrio pH 6,5) a eluição da lactoferrina ocorreu entre 1,0 a 1,5M de NaCl. A

lactoperoxidase foi eluída com uma concentração menor de sal 0,5 a 0,8M. Estes

valores são coerentes com os da literatura (ANDERSSON; MATTIASSON, 2006).

Dessa forma, a lactoperoxidase foi eluída no segundo pico e a lactoferrina no terceiro

pico. O perfil eletroforético das frações eluídas foi caracterizado utilizando o gel de

SDS-PAGE (figura 2).

31

Figura 2- SDS-PAGE 12,5%sob condições redutoras. Análise eletroforética das frações eluídas da coluna

SP Sepharose Fast Flow. O concentrado de 30NMWC foi aplicado na coluna SP-sepharose, a seguir a

coluna foi lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH6,5 (Tampão A). Os picos foram eluídos com o

tampão A acrescido com NaCl 1,5M, utilizando o gradiente linear. As amostras contendo 20g de

proteína total foram aplicadas no gel sob condições redutoras. Poço1 albumina. Poço 2 padrão de massa

molar. Poço 3 amostra inicial. Poço 4 não retido. Poço5 lavado. Poço 6 pico 1. Poço 7 pico 2. Poço 8

pico 3. Poço 9 lactoferrina sigma (5g). Poço 10 albumina (5g).

O pico 3 apresentou uma banda protéica com migração eletroforética semelhante

a lactoferrina bovina comercial (figura 2, poços 8 e 9, respectivamente). O pico 2

apresentou bandas majoritárias de massa molar ao redor de 80, 50, e 30kDa (figura 2,

poço 7). Como mencionado acima, a lactoperoxidase é eluída em uma concentração

menor de NaCl, portanto a banda de 80kDa no pico 2 indica a presença dessa proteína e

não da lactoferrina.

O western blot foi realizado utilizando o terceiro e segundo pico de cada corrida

cromatográfica, para confirmar a presença de lactoferrina. Entretanto, o anticorpo

policlonal comercial anti-lactoferrina humana não reconheceu nem a lactoferrina bovina

comercial nem as bandas protéicas presentes no 2º e 3º pico.

A recuperação da lactoferrina foi estimada, utilizando a informação: para cada

5,07g de proteína total, 0,1g é lactoferrina (tabela 1, item 1.1) a equação 6 foi utilizada

para calcular o rendimento (tabela 8).

32

Tabela 8 – Purificação da lactoferrina utilizando a coluna de troca-catiônica SP-Sepharose (10mL). A

coluna foi carregada com diferentes volumes de amostra, equilibrada e lavada com tampão fosfato de

sódio 50mM pH 6,5 (tampão A). As proteínas adsorvidas à coluna foram eluídas com gradiente linear

utilizando o tampão A e o tampão B (tampão A acrescido de 1,5M de NaCl)

Corrida

cromatográfica

Amostra inicial

proteína total (mg)

Proteína total do

lactoferrina (pico 3) (mg)

Concentração de

NaCl (M)

Recuperação

Lactoferina* (%)

1ª 1240 7,80 1,11 - 1,35 31

2ª 1598 13,7 1,00 - 1,37 43

3ª 2416 21,80 1,04 - 1,40 45

4ª 1495 12,65 1,05 - 1,44 42

5ª 3801 21,88 1,44 - 1,50 29

6ª 5204 44,46 1,39 - 1,50 43

*A recuperação da lactoferrina foi calculada como descrito na equação 6.

(

) * (6)

*Considerando 2% de lactoferrina bovina por litro de soro

De acordo com Anderson e Mattiasson (2006) o tampão de equilíbrio utilizado

para purificar a lactoferrina é fosfato de sódio 50mM pH6,5, entretanto, o preconizado

pela literatura para cromatografia de troca catiônica é o uso do tampão de equilíbrio

equivalente ao pI da proteína menos uma unidade de pH. Uma hipótese para explicar o

rendimento das corridas cromatográficas pode ser devido à forte adsorção da

lactoferrina à resina, dificultando a sua eluição durante o gradiente, provocada pela

diferença de aproximadamente 3 unidades entre o pI da proteína e o pH do tampão de

adsorção.

Para averiguar a influência do pH do tampão de adsorção na recuperação da

lactoferrina, três cromatografias de troca catiônica utilizando a coluna HiTrap SP

Sepharose Fast Flow foram feitas. A primeira e a segunda cromatografia utilizaram o

mesmo tampão de equilíbrio (50mM de fosfato pH 6,5), diferentes volumes e

concentração de proteína. A terceira condição utilizou o tampão 50mM de fosfato pH

7,0 acrescido de NaCl 100mM nas etapas de equilíbrio e lavagem. Os resultados obtidos

estão apresentados (figuras 3 e 4; tabelas 9 a 12).

33

Figura 3- Cromatogramas obtidos a partir da cromatografia de troca catiônica (coluna Hitrap SP-

Sepharose Fast Flow). A coluna foi carregada com diferentes volumes de amostra, equilibrada e lavada

com tampão fosfato de sódio 50mM pH6,5 (cromatogramas A e B) e tampão fosfato de sódio 50mM,

pH7,0, acrescido de 100mM NaCl (cromatograma C). As proteínas adsorvidas à coluna foram eluídas

com gradiente linear utilizando o tampão de equilíbrio e lavagem com 1,5M de NaCl. Fluxo 0,5ml/min,

gradiente linear 5 volumes de coluna. P1, P2 e P3 são referentes ao primeiro, segundo e terceiro pico,

respectivamente.

A recuperação da lactoferrina foi 30,73, 71,23 e 47,36% para a 1ª, 2ª e 3ª

corridas cromatográficas, respectivamente. A diferença entre a 1ª e a 2ª cromatografia

foi a quantidade de amostra inicial aplicada à coluna (175,7mg de proteína total na 1ª

cromatografia e 762,28mg de proteína total na segunda cromatografia) (tabelas 9 a 12).

A concentração de proteína total da amostra inicial utilizada na 2ª e 3ª

cromatografia foi semelhante. Contudo a recuperação da lactoferrina eluída no 3º pico

da segunda cromatografia foi 1,5 vezes maior que a recuperação da lactoferrina da 3ª

cromatografia (tabelas 9 a 11). As condições de equilíbrio da 3ª cromatografia (tampão

fosfato de sódio 50mM pH7,0 acrescido de 100mM de NaCl) alterou o perfil de eluição

da lactoperoxidase (pico 2) e da lactoferrina (pico 3) (figura 3B e 3C). Traços de

atividade da lactoperoxidase foram detectados nos picos 3 das três corridas (tabela 9 a

11).

34

Tabela 9 – Purificação da lactoferrina utilizando a coluna de troca-catiônica HiTrap SP – Sepharose Fast

Flow (5 mL). A coluna foi equilibrada e lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH6,5 (tampão A).

As proteínas adsorvidas à coluna foram eluídas com gradiente linear utilizando o tampão A e o tampão B

(tampão A acrescido de 1,5M de NaCl).

Amostra Volume (ml) Concentração

(mg/ml)

Proteína Total

(mg)

Recuperação

lactoferrina

*(%)

Atividade

lactoperoxidase

(U/mg)

Amostra

Inicial

12,5 14,06 175,75 100 Nd

Flow Through 14,5 13,67 198,21 --- Nd

Lavado 22,0 2,18 47,96 --- Nd

Pico 1 11,5 1,25 14,37 --- 0,011

Pico 3 1,5 0,72 1,08 30,73 0,0009

*A recuperação da lactoferrina foi calculada como descrito na equação 5. nd = não detectado

Tabela 10 – Purificação da lactoferrina utilizando a coluna de troca-catiônica HiTrap SP - Sepharose

Fast Flow (5 mL). A coluna foi equilibrada e lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH6,5 (tampão

A). As proteínas adsorvidas à coluna foram eluídas com gradiente linear utilizando o tampão A e o

tampão B (tampão A acrescido de 1,5M de NaCl).


(mg/ml)

Proteína Total

(mg)

Recuperação

lactoferrina *

(%)

Atividade

lactoperoxidase

(U/mg)

Amostra

Inicial

10 76,23 762,30 100 Nd

Flow Through 26 23,29 605,54 --- Nd

Lavado 24 2,57 61,68 --- Nd

Pico 1 8,5 2,51 21,33 --- Nd

Pico 2 9,5 1,25 11,87 --- 0,724

Pico 3 6,0 1,81 10,86 71,23 0,002

*A recuperação da lactoferrina foi calculada como descrito na equação 5. nd = não detectado

Tabela 11 – Purificação da lactoferrina utilizando a coluna de troca-catiônica HiTrap SP – Sepharose

Fast Flow (5 mL). A coluna foi equilibrada e lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH7,0,

acrescido de 100mM de NaCl (tampão A). As proteínas adsorvidas à coluna foram eluídas com gradiente

linear utilizando o tampão A e o tampão B (tampão fosfato de sódio 50mM, pH7,0 acrescido de 1,5M de

NaCl).


(mg/ml)

Proteína Total

(mg)

Recuperação

lactoferrina

total* (%)

Atividade

lactoperoxidase

(U/mg)

Amostra

Inicial

10 77,91 779,10 100 0,0012

Flow Through 21 23,98 503,58 --- 0,0006

Lavado 36 4,25 153 --- 0,0003

Pico 1 4,4 0,47 2,07 --- 1,90

Pico 2 5,8 0,44 2,55 --- 2,25

Pico 3 8,2 0,90 7,38 47,36 0,011

*A recuperação da lactoferrina foi calculada como descrito na equação 5

35

Tabela 12 – Perfil de eluição da lactoferrina das três corridas cromatográficas da segunda condição. Na

primeira e segunda corrida, a coluna foi equilibrada e lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH6,5 e

as proteínas adsorvidas à coluna foram eluídas com gradiente linear utilizando o tampão A e o tampão B

(tampão A acrescido de 1,5M de NaCl). Na terceira corrida, a coluna foi equilibrada e lavada com tampão

fosfato de sódio 50mM pH7,0, acrescido de 100mM de NaCl (tampão A). As proteínas adsorvidas à

coluna foram eluídas com gradiente linear utilizando o tampão A e o tampão B (tampão fosfato de sódio

50mM pH7,0 acrescido de 1,5M de NaCl).

Corridas

Picos

Concentraçãode

NaCl (M)

Proteína Total (mg) Recuperação de

Lactoferrina (%)*

1a

Pico 1

Pico 2

Pico 3

0,18 - 0,72

0,84 - 1,08

1,17 - 1,23

14,37

nc

1,08

---

---

30,73

2a

Pico 1 0,17 - 0,59 21,33 ---

Pico 2 0,60 - 1,05 11,87 ---

Pico 3 1,12 - 1,36 10,86 71,23

3a

Pico 1 0,58 - 0,72 2,068 ---

Pico 2 0,72 - 0,88 2,55 ---

Pico 3 0,88 - 1,14 7,38 47,36

*A recuperação da lactoferrina foi calculada como descrito na equação 5. nc = não coletado

O perfil eletroforético do pico 3 das três corridas cromatográficas foi semelhante

ao da lactoferrina bovina comercial. Apresentando uma banda de 80kDa e pequenos

traços de impureza que podem ser produtos de degradação da lactoferrina, pois alguns

destes traços foram visualizados na lactoferrina comercial (figura 4 A, poços 3 a 5).

A B

Figura 4 – SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras. Análise eletroforética das cromatografias de troca

catiônica (HiTrap SP Sepharose Fast Flow). A- Poço 1 albumina. Poço 2 padrão de massa molar. Poço 3

pico 3 (corrida 1). Poço 4 pico 3 (corrida 2). Poço 5 pico 3 (corrida 3). Poço 6pico 2 (corrida 3). Poço 7

pico 2 (corrida 2). Poço 8 pico 1 (corrida 1). Poço 9 pico 1 (corrida 2). Poço 10 pico 1 (corrida 3). B-

Poço 1 albumina. Poço 2 padrão de massa molar. Poço 3 amostra inicial (corrida 1). Poço 4 amostra

inicial (corrida 2). Poço 5 amostra inicial (corrida 3). Poço 6 flow through (corrida 1). Poço 7 flow trough

(corrida 2). Poço 8 flow through (corrida 3). Em todos os poços foram aplicados 20g de proteína total

exceto para albumina (5g) e padrão de massa molar. Na primeira e segunda corrida, a coluna foi

equilibrada e lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH6,5 e as proteínas adsorvidas à coluna foram

eluídas com gradiente linear utilizando o tampão A e o tampão B (tampão A acrescido de 1,5M de NaCl).

Na terceira corrida, a coluna foi equilibrada e lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH7,0 acrescido

de 100mM de NaCl (tampão A). As proteínas adsorvidas à coluna foram eluídas com gradiente linear

utilizando o tampão A e o tampão B (tampão fosfato de sódio 50mM pH7,0 acrescido de 1,5M de NaCl).

36

Diversos fatores do processo cromatográfico como: composição da fase

estacionária (densidade e tipo de grupos ligantes, tamanho dos poros), fase móvel (força

iônica, pH) interferem nos resultados da cromatografia. Além desses fatores os

procedimentos cromatográficos podem interferir na cromatografia aumentando ou

diminuindo a recuperação da molécula alvo, o tempo de retenção, a forma e largura do

pico e o grau de pureza da proteína de interesse. Fatores cromatográficos como fluxo,

inclinação do gradiente e quantidade de amostra aplicada na coluna podem interferir na

cromatografia de troca-iônica.

Para investigar a influência desses fatores na purificação da lactoferrina bovina a

partir da cromatografia de troca-iônica foi utilizado o planejamento experimental

Delineamento Composto Central Rotacional utilizando três variáveis e cinco níveis

conforme apresentado na Tabela 6 (item 3.2.3.1). Dezessete corridas cromatográficas

utilizando a coluna HiTrap Fast Flow SP-Sepharose foram realizadas. A concentração

de proteína total foi determinada para os picos 1, 2 e 3, a atividade de lactoperoxidase e

o perfil eletroforético dos picos 2 e 3 foram analisados (anexo A).

A concentração de amostra inicial, o fluxo e o tamanho do gradiente foram

selecionados e estudados através de um DCCR para as respostas: recuperação de

lactoferrina (mg) e área do pico da lactoferrina. O valor original de cada nível utilizado

e os valores das respostas de recuperação de lactoferrina (mg) e área do pico da

lactoferrina estão apresentados na Tabela 13.

A maior recuperação de lactoferrina (mg) foi apresentada pelo ensaio 6 e 4,

respectivamente. O ensaio 6 utilizou o fluxo e tamanho de gradiente no nível 1 (0,619

mL.min-1

e 12,89 VC, respectivamente) e concentração de amostra inicial no nível -

1(425,7mg). O ensaio 4, por outro lado, utilizou fluxo no nível -1 (0,381mL.min-1

),

concentração de amostra inicial e gradiente no nível 1(854,3 mg e 12,98VC) (tabela 13).

37

Tabela 13 – Valores codificados e variáveis independentes e resposta da recuperação de lactoferrina (mg)

e área do pico correspondente a eluição da lactoferrina (abs.mL

-1).

Ensaios Fluxo

(mL/min)

Amostra inicial

(mg)

Gradiente

(VC)

LA

Experimental

(mg)

Área pico lactoferrina

Experimental

(Abs.mL

-1)

1 -1 (0,381) -1 (425,7) -1(7,02) 1,6 501,50

2 -1 (0,381) -1(425,7) 1 (12,98) 1,39 655,70

3 -1 (0,381) 1 (854,3) -1 (7,02) 3,25 1897,80

4 -1 (0,381) 1 (854,3) 1 (12,98) 6,39 2403,90

5 1 (0,619) -1 (425,7) -1 (7,02) 0,66 637,50

6 1 (0,619) -1 (425,7) 1 (12,98) 7,56 1706,80

7 1 (0,619) 1(854,3) -1 (7,02) 3,12 2195,70

8 1 (0,619) 1(854,3) 1 (12,98) 4,09 408,30

9 -1,68 (0,3) 0 (640) 0 (10) 1,71 1218,80

10 1,68 (0,7) 0 (640) 0(10) 2,49 1237,20

11 0 (0,5) -1,68 (280) 0 (10) 1,02 348,50

12 0 (0,5) 1,68 (1000) 0 (10) 3,86 1944,30

13 0 (0,5) 0 (640) -1,68 (5) 2,67 1526,50

14 0 (0,5) 0 (640) 1,68 (15) 2,65 1365,80

15 0(0,5) 0 (640) 0 (10) 2,74 1319,20

16 0 (0,5) 0 (640) 0 (10) 2,4 1147,60

17 0 (0,5) 0 (640) 0 (10) 2,8 1311,60

Os dados obtidos de recuperação da lactoferrina (mg) de cada ensaio foram

tratados estatisticamente utilizando o programa Statistica 8.0. A Tabela 14 apresenta os

coeficientes de regressão, a distribuição de Student (t) e p valores para a recuperação de

lactoferrina (mg).

38

Tabela 14 – Coeficientes de regressão para a recuperação da lactoferrina (mg).

Variável Coeficiente Erro Padrão T P

Média 2,57107 0,999021 2,57359 0,036815

Fluxo (mL.min-1

) (L) 0,301182 0,469366 0,64168 0,541516

Fluxo (mL.min-1

) (Q) 0,056693 0,516763 0,10971 0,915720

Amostra inicial (mg) (L) 0,763035 0,469457 1,62536 0,148114

Amostra inicial (mg) (Q) 0,177436 0,517169 0,34309 0,741604

Gradiente (VC) (L) 0,789886 0,469692 1,68171 0,136508

Gradiente (VC) (Q) 0,256559 0,518227 0,49507 0,635710

Fluxo (mL.min-1

) x

Amostra inicial (mg) -0,957500 0,613087 -1,56177 0,162313

Fluxo (mL.min-1

) x

Gradiente (VC) 0,617500 0,613087 1,00720 0,347380

Amostra inicial (mg)x

Gradiente (VC) -0,322500 0,613087 -0,52603 0,615118

Analisando a Tabela 14, as variáveis utilizadas: fluxo, tamanho do gradiente e

concentração de amostra inicial não apresentaram grau de significância na correlação

dos coeficientes com P< 0,05 ou P<0,1. Apesar desse resultado a equação quadrática do

modelo foi construída, utilizando o coeficiente das variáveis descrito na Tabela 14

(equação 7).

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

Os valores previstos pelo modelo apresentaram variabilidade significativa dos

valores obtidos experimentalmente. Dessa forma o modelo não é adequado para estimar

a concentração de lactoferrina eluída da cromatografia de troca iônica utilizando o

DCCR descrito nesse trabalho (figura 5).

(7)

39

Figura 5 – Gráfico dos valores preditos utilizando o modelo descrito na equação (7) x valores observados

experimentalmente para concentração de lactoferrina eluída da cromatografia de troca catônica (tabela

13).

A análise de variância (ANOVA) (tabela 15) apresenta importantes dados do

experimento, como os valores de Probabilidade de Fisher, que indica a significância

estatística dos fatores avaliados, as suas interações, erros e a falta de ajuste do

experimento (RODRIGUES; IEMMA, 2005). De acordo com a análise de variância

(tabela 14) as variáveis: fluxo (mL.min-1

), concentração de amostra inicial (mg) e

tamanho do gradiente (VC) não apresentaram efeito significativo na recuperação da

lactoferrina (mg).

Tabela 15 – Análise de variância (ANOVA) da lactoferrina (mg) obtida a partir do planejamento

experimental DCCR 23, utilizando como variáveis o fluxo (mL.min

-1), amostra inicial (mg) e tamanho do

gradiente (VC).

Soma quadrados Grau de liberdade Quadrado médio F*

Regressão 29,79138 9 3,310153 1,101

Resíduos 21,04904 7 3,007005

Total 50,84042 16

F*= Probabilidade de Fisher Calculado F calculado (1,101) < F tabelado (9;7;0,1) = 2,27

As Figuras 6 a 8 apresentam os gráficos superfícies de respostas e curvas de

contorno para a recuperação da lactoferrina (mg) em função do fluxo (mL.min-1

),

concentração de amostra inicial (mg) e tamanho do gradiente (VC).

40

Figura 6 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para a recuperação de lactoferrina (mg) em

função da amostra inicial (mg) e do fluxo (mL.min-1

).

De acordo com a Figura 6, as melhores condições para recuperação da

lactoferrina (mg) são: fluxo baixo e concentração de amostra inicial elevada ou fluxo

elevado e concentração de amostra inicial baixa.


função da amostra inicial (mg) e do tamanho do gradiente (VC).

O aumento do tamanho do gradiente e o aumento da concentração de proteína da

amostra inicial resultaram na melhor recuperação da lactoferrina (mg) (figura 7).

41


função tamanho do gradiente (VC) e fluxo (mL.min-1

).

De acordo com a Figura 8 o aumento do fluxo (mL.min-1

) e do gradiente (VC)

favoreceram a melhor recuperação da lactoferrina (mg).

A melhor combinação das variáveis seria gradiente alto (12VC), alta

concentração de amostra (1000mg) e fluxo baixo (0,30mL.min

-1) ou baixa concentração

de amostra (280mg) e fluxo alto (0,70mL.min

-1) (figuras 6 a 8), mas o procedimento não

foi considerado estatisticamente significativo. A variável de saída, recuperação de

lactoferrina (mg), não permitiu determinar a melhor condição do processo

cromatográfico utilizando as três variáveis (fluxo, concentração de amostra inicial e

tamanho do gradiente).

Não foi encontrado na literatura trabalhos que utilizaram o planejamento

experimental para processos cromatográficos cuja amostra inicial é complexa (contendo

uma mistura de proteínas e outras biomoléculas como, por exemplo, o soro de leite)

(NOVOTNÁ et al., 2005; ISHIHARA et al., 2007).

A partir dos resultados surgiram duas hipóteses: 1ª o planejamento experimental

DCCR não é adequado para processos cromatográficos com amostras complexas; 2ª a

concentração de lactoferrina não seria a melhor variável para a construção de um

modelo matemático e a análise das variáveis de entrada, fluxo (ml.min-1

), amostra

inicial (mg) e tamanho do gradiente (VC).

Outra análise estatística foi realizada utilizando a área do pico 3 (pico

correspondente a eluição da lactoferrina). As áreas dos picos 3 das dezessete corridas

cromatográficas foram calculadas utilizando o software UNICORN 5.0 (Ge Life

Scienses) (anexo B e tabela 13).

42

O ensaio 4 com fluxo no nível -1 e concentração da amostra inicial e gradiente

no nível 1 e o ensaio 7 com fluxo e concentração de amostra inicial no nível 1 e

gradiente no nível -1 apresentaram as maiores áreas do pico 3 (tabela 13).

A Tabela 16 apresenta os efeitos das três variáveis estudadas e seus respectivos

erros, obtidos a partir de análise estatística, considerando a área do pico 3 eluído dos

dezessete ensaios.

Tabela 16 – Coeficientes de regressão para área do pico 3 (abs.min).

Variável Coeficiente Erro Padrão T P

Média 1257,694 251,8146 4,99453 0,001575

Fluxo (mL.min-1

) (L) -35,143 118,3089 -0,29704 0,775055

Fluxo (mL.min-1

) (Q) -5,273 130,2558 -0,04048 0,968888

Amostra inicial (mg)

(L)

445,979 118,3318 3,76889 0,006993


(Q)

-34,189 130,3583 -0,26227 0,800666

Gradiente (VC) (L) -24,022 118,3911 -0,20290 0,844981

Gradiente (VC) (Q) 72,217 130,6248 0,55286 0,597564

Fluxo (mL.min-1

) x


-360,600 154,5354 -2,33345 0,052348

Fluxo (mL.min-1

) x

Gradiente (VC)

-172,300 154,5354 -1,11495 0,301680

Amostra inicial (mg)x

Gradiente (VC)

-313.100 154,5354 -2.02607 0,082389

Os valores em vermelho são os correspondentes as variáveis que apresentaram significância estatística p< 0,1.

A variável concentração de amostra (mg) apresentou efeito estatisticamente

significativo para a área do pico 3, p < 0,05. A combinação da concentração de amostra

(mg) x tamanho do gradiente (VC) e a combinação da concentração da amostra (mg) x

fluxo (mL.min-1

) foram estatisticamente significativo se considerarmos p<0,1(tabela 16;

anexo C).

A partir dos dados da Tabela 16, o modelo matemático foi desenvolvido e

apresentado na equação 8.

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

A Tabela 17 foi construída a partir dos dados do planejamento experimental e do

modelo matemático descrito nas equações 7 e 8. O erro relativo para a variável área do

pico 3 foi menor que o erro relativo para a variável concentração de lactoferrina. As

maiores áreas do pico 3 apresentaram erros relativos baixos. Esse resultado é

confirmado pela Figura 9, onde os dados previstos pelo modelo para área do pico 3

(8)

43

correspondente a lactoferrina apresentam pouca variabilidade em relação aos dados

experimentais.

Tabela 17 – Resultados do DCCR no estudo do fluxo (ml.min-1

), concentração de proteína total na

amostra incial (mg) e do tamanho do gradiente (VC) nas respostas de recuperação de lactoferrina (mg) e

área do pico correspondente a eluição da lactoferrina (abs.mL).

Ensaio Fluxo

(mL/mi

n)

Amostra

inicial

(mg)

Gradient

e (VC)

LA Ex

(mg)

LA

Pre

(mg )

Erro

relativo

(%) *

Área Ex

(abs. mL)

Área Pre

(abs.

mL)

Erro

relativo

(%) *

1

-1

(0,381)

-1

(425,7)

-1

(7,02) 1,6 0,55 65,63

501,50 741,88 -47,93

2

-1

(0,381)

-1

(425,7)

1

(12,98) 1,39 4,68 -236,69

655,70 693,84 -5,82

3

-1

(0,381)

1

(854,3)

-1

(7,02) 3,25 1,48 54,46

1897,80 1.978,44 -4,25

4

-1

(0,381)

1

(854,3)

1

(12,98) 6,39 4,33 32,24

2403,90 1.930,40 19,70

5

1

(0,619)

-1

(425,7)

-1

(7,02) 0,66 1,83 -177,27

637,50 1.016,20 -59,40

6

1

(0,619)

-1

(425,7)

1

(12,98) 7,56 2,14 71,69

1706,80 968,15 43,28

7

1

(0,619)

1

(854,3)

-1

(7,02) 3,12 5,23 -67,63

2195,70 1.563,55 28,79

8

1

(0,619)

1

(854,3)

1

(12,98) 4,09 4,25 -3,91

408,30 1.515,51 -271,17

9

-1,68

(0,3)

0

(640)

0

(10) 1,71 2,23 -30,41

1218,80 1.331,62 -9,26

10

1,68

(0,7)

0

(640)

0

(10) 2,49 3,24 -30,12

1237,20 1.213,54 1,91

11 0 (0,5)

-1,68

(280)

0

(10) 1,02 1,79 -75,49

348,50 411,95 -18,21

12 0 (0,5)

1,68

(1000)

0

(10) 3,86 4,35 -12,69

1944,30 1.910,44 1,74

13 0 (0,5)

0

(640)

-1,68

(5) 2,67 1,97 26,22

1526,50 1.501,88 1,61

14 0 (0,5)

0

(640)

1,68

(15) 2,65 4,62 -74,34

1365,80 1.421,16 -4,05

15 0(0,5)

0

(640)

0

(10) 2,74 2,57 6,20

1319,20 1.257,69 4,66

16 0 (0,5)

0

(640)

0

(10) 2,4

2,57 -7,08

1147,60

1.257,69 -9,59

17 0 (0,5)

0

(640)

0

(10) 2,8

2,57 8,21

1311,60

1.257,69 4,11

Ex= experimental Pre= previsto pelo modelo

* ( ) (

)

44

Figura 9 – Gráfico dos valores preditos utilizando o modelo descrito na equação (7) x valores observados

experimentalmente para área do pico 3.

De acordo com análise de variância (tabela 18) o modelo quadrático apresentou

um ajuste adequado aos resultados experimentais, considerando um limite de confiança

de 90%, o F calculado foi maior que o F tabelado.

Tabela 18 – Análise de variância (ANOVA) da área do pico 3 (abs.mL obtida a partir do planejamento

experimental DCCR 23, utilizando como variáveis o fluxo (mL.min

-1), amostra inicial (mg) e tamanho do

gradiente (VC).

Soma quadrados Grau de liberdade Quadrado médio F*

Regressão 4899117 9 544346,33 2,85

Resíduos 1337347 7 191049,5714

Total 6236464 16

F*= Probabilidade de Fisher Calculado /Fcalculado (2,85) > F tabelado (9;7;0,1) = 2,27

A superfície de resposta e curva de contorno para a área (abs.mL) do pico 3 em

função da concentração da amostra inicial (mg) e fluxo (mL.min-1

) (figura 10),

apresenta uma interação negativa entre o fluxo e a concentração da amostra, pois o

ponto ótimo (maior área do pico 3) é atingido com maiores concentrações de amostra e

fluxo baixo. A Figura 11 mostra a interação negativa entre o tamanho do gradiente (VC)

e da concentração da amostra inicial (mg), uma vez que maior área do pico 3 está

localizada na região de maior concentração de amostra e tamanho do gradiente em torno

de 5VC. A concentração de amostra inicial (mg) e a relação: amostra inicial e fluxo;

amostra inicial e gradiente tem significância estatística para p= 0,1 (tabela 16 e anexo

C), sendo que a melhor condição cromatográfica seria a utilização de alta concentração

45

de amostra inicial (mg), baixo fluxo e gradiente (1000mg de proteína total, 0,3mL.min-1

e 5VC, respectivamente).

A relação entre fluxo e gradiente não apresentou significado estatístico. A

relação entre fluxo e gradiente é inversa: maiores áreas são obtidas com a combinação

fluxo alto e gradiente baixo ou fluxo baixo e gradiente alto (figura 12).

Figura 10 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para área do pico 3 (abs.mL) em função

da amostra inicial (mg) e do fluxo (mL.min-1

).


do gradiente (VC) e da amostra inicial (mg).

46


do gradiente (VC) e do fluxo (mL.min-1

).

O emprego do DCCR teve como objetivo principal determinar o melhor fluxo,

tamanho do gradiente e concentração de amostra inicial adequada a máxima

recuperação de lactoferrina, com maior grau de pureza. Aparentemente, o pico 3 dos

dezessete ensaios apresentaram grau de pureza semelhante (anexo D).

A área do pico indica à concentração de proteína do respectivo pico. Os ensaios

5 e 8 apresentaram uma grande diferença entre a concentração de proteína total e a área

do pico calculada pelo UNICORN (tabela 17). A natureza complexa da amostra inicial

(soro de leite) torna o modelo matemático e análise dos dados obtidos trabalhoso, como

já era esperado.

No desenho do planejamento experimental é de suma importância a escolha das

variáveis independentes ou fatores e das variáveis dependentes. A escolha da

recuperação de lactoferrina (mg) como variável dependente não foi adequada, já a

escolha da área do pico 3 (que contém a lactoferrina) foi adequado e estatisticamente

significativo. O fluxo de 0,35 mL.min-1

, concentração de amostra inicial de 1000mg e

tamanho de gradiente de 5VC foi a melhor condição cromatográfica utilizando a coluna

SP-Sepharose Fast Flow.

4.1 Estabilidade da formulação

As propriedades antibacteriana, antioxidante e de re-epitelização da lactoferina

tornam essa proteína um ativo promissor para o desenvolvimento de formulações

farmacêuticas e cosméticas (TANG et al., 2010; GARCIA-MONTOYA et al., 2012). A

47

estabilidade da formulação semi-sólida contendo 10% (m/m) de lactoferrina foi avaliada

durante três meses a 40oC e 65% de umidade.

Durante os três meses de análise, não houve alteração de pH (tabela 19).

Entretanto, as amostras apresentaram diferentes concentrações de proteína total no

decorrer do estudo de estabilidade. No 1o e no 3º, o método de dosagem de proteína

detectou uma maior quantidade de proteína total, sendo que no terceiro mês houve um

aumento de 48,6% (tabela 19). O aumento na concentração de proteína total está

relacionado à degradação da lactoferrina (figura 13).

Tabela 19 – Concentração de proteína total e pH da formulação contendo 10% (m/m) de lactoferrina

durante três meses. A concentração de proteína total foi obtida pelo método de Lowry e o pH medido a

partir de uma solução 0,1mg/mL da formulação. Para cada ensaio foram utilizadas três amostras.

Tempo (meses) Ph Proteína total (mg/mL)

0 6,66 ± 0,023 11,28 ± 0,68

1 6,50 ± 0,015 12,09 ± 0,47

3 6,57 ± 0,04 14,86 ± 1,44

O principal mecanismo de degradação da lactoferrina a 40oC e 65% umidade foi

a hidrólise (figura 13). Reações de oxidação e deamidação e hidrólise são rotas químicas

mais frequentes de degradação de proteínas. Alguns fatores como temperatura e pH

podem contribuir para uma menor velocidade de degradação por exemplo: pH neutro

diminui a deamidação de proteínas ( CAPELLE et al, 2007). A estabilidade térmica da

lactoferrina depende da sua saturação com íons Fe+3

, holo-lactoferrina é mais estável

termicamente que a apo-lactoferrina (BOKKHIM et al, 2014). A lactoferrina comercial

utilizada no preparo da formulação apresentava uma coloração rosa indicativa da

presença de holo-lactoferrina.

48

A B C

Figura 13 – SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras. Análise eletroforética das formulações contendo

lactoferrina 10% (m/m) durante o estudo de estabilidade. A (tempo 0) – Poço1 padrão de massa molar.

Poço 2 e Poço 3 amostra A. Poço 4 e Poço 5 amostra B. Poço 6 e Poço 7 amostra C. Poço 8 Albumina. B

(1º mês) – Poço 1Ø. Poço 2 padrão de massa molar. Poço 3 Ø. Poço 4 albumina. Poço 5 Ø. Poço 6

amostra A. Poço 7 Ø. Poço 8 amostra B. Poço 9 Ø. Poço 10 amostra C. C (3º mês) – Poço 1 padrão de

massa molar. Poço 2 Ø. Poço 3 albumina. Poço 4Ø. Poço 5 amostra A. Poço 6 amostra B. Poço 7

amostra C. Poço 8 Ø. Poço 9 lactoferrina comercial. Ø Amostra não foi aplicada.

A formulação desenvolvida pela simples incorporação da lactoferrina à base não

foi estável nas condições estudadas. Portanto, se faz necessário o desenvolvimento de

uma formulação contendo substâncias que desacelerem a degradação da lactoferrina.

49

5 CONCLUSÃO

A lactoferrina bovina foi purificada a partir do soro de leite utilizando a coluna

SP-Sepharose Fast Flow (5mL).

Através do planejamento experimental DCCR, utilizando como variável

dependente á área do pico correspondente a eluição da lactoferrina, a melhor condição

cromatográfica de troca catiônica com a resina SP Sepharose, com efeito

significativamente estatístico foi: 0,3mL.min-1

, concentração de soro de leite 1000mg e

tamanho do gradiente 5VC. A utilização da variável independente recuperação de

lactoferrina não foi uma boa escolha, pois não teve o resultado estatisticamente

significativo.

A formulação semi-sólida contendo a lactoferrina bovina não foi estável. Uma

formulação com agentes estabilizantes deve ser avaliada.

A partir de trabalhos futuros espera-se que a lactoferrina seja purificada com um

grau de recuperação maior e que a mesma seja estável em uma formulação semi-sólida

para uso dermatológico.

50

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ACIKARA, O. B. Ion- Exchange Chromatography and Its Applications. Intech, 2013.

AHAMED, et al. Selection of pH-related parameters in ion-exchange chromatography

using pH-gradient operations. Journal of Chromatography A, v. 1194, p. 9-22, 2008.

ANDERSSON, J.; MATIASSON, B. Simulated moving bed technology with a

simplified approach for protein purification. Separation of lactoperoxidase and

lactoferrina from whey protein concentrate. Journal of Chromatography A, v. 1107,

p. 88-95, 2006.

ANTUNES, A. J. Funcionalidade de proteínas do soro de leite bovino. São Paulo:

Editora Manole, p.22, 2003.

BAKER, E. E. N. et al. Three-dimensional structure of lactoferrin. Lactoferrin:

Advances in Experimental Medicine and Biology, v. 443, p. 1-14, 1998.

BAKER, H. M.; BAKER, E. N. A structural framework for understanding the

multifunctional character of lactoferrin. Biochimie:Advances in Lactoferrin Research.

V. 91, Issue 1, p. 3-10, 2009.

BARBOSA, A. S. et al. Utilização do soro como substrato para produção de aguardente:

estudo cinético da produção de Etanol. Revista Verde, v. 5, p 7-25, 2010.

BELLAMY, W. et al. Identification of the bactericidal domain of lactoferrin.

Biochimica et Biophysica Acta, v. 1121, p. 130-136, 1992.

BERKHOUT, B. et al. Characterization of the anti-HIV effects of native lactoferrin and

other milk proteins and protein-derived peptides. Antiviral Research,v. 55, p. 341-355,

2003.

BOKKHIM, H. et al. Evaluation of different methods for determination of the iron

saturation level in bovine lactoferrin. Food Chemistry, v.152, p. 121-127, 2014.

BOOTS, J. W.; FLORIS, R. Lactoperoxidase: From catalytic mechanism to practical

applications. International Dairy Journal, v. 16, p. 1272–1276, 2006.

BRISSON, G.; BRITTEN, M.; POULIOT, Y. Heat-induced aggregation of bovine

lactoferrin at neutral pH: Effect of iron saturation. International Dairy Journal, v. 17,

p. 617-624, 2007.

CAPELLE, M. A. H.; GURNY, R.; ARVINTE, T. High throughput screening of protein

formulation stability: Practical considerations. European Journal of Pharmaceutics

and Biopharmaceutics, v. 65, p. 131–148, 2007.

CONESA, C.; CALVO.; SÁNCHEZ, L. Recombinant human lactoferrin:

Avaluable protein for pharmaceutical products and functional foods.

Biotechnology Advances, v. 28, p. 831-838, 2010.

51

CORNISH, J.; CALLON, K.; NAOT, D. Lactoferrin is a potent regulator of bone cell

activity and increases bone formation in vivo. Endocrinology, v. 145, p. 4366-4374,

2004.

CUMMINS, M.; DOWLING, O.; CONNOR, F. Ion-Exchange Chromatography: Basic

Principles and Application to the Partial Purification of Soluble Mammalian Prolyl

Oligopeptides. In: Walls D, Loughran ST. (ed.) Protein Chromatography Methods

and Protocols. p215-228. New York: Springer; 2011.

DAMIENS, E. et al. Lactoferrin inhibits G1 cyclin-dependent kinases during the cell

growth arrest of human breast carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry, v. 74,

p.486-498, 1999.

ENGELMAYER, J. et al. Talactoferrin stimulates wound healing with modulation of

inflammation. J Surg Res, v. 149, p. 278-286, 2008.

ESAGUY, N. et al. Activation of human neutrophils with phorbol ester diminishes the

compactness of lactoferrin content and cytoplasm of granulocytes. Journal of

Leukocyte Biology, v. 50, p. 444-452, 1991.

FARNAUD, S.; EVANS, R. W. Lactoferrin- a multifunctional protein with

antimicrobial properties.Metalloprotein Research Group. Molecular Immunology, v.

40, p. 395-405, 2003.

FARREL, H. M. et al. Nomenclature of the proteins of cows milk-sixth revision.

Journal of Dairy Science, v. 87, p. 1641-1674, 2004.

GARCÍA-MONTOYA, I. A. et al. Lactoferrin a multiple bioactive protein: An

overview. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1820, p. 226-236, 2012.

GONZÁLEZ-CHÁVEZ, S, A. et al. Lactoferrin: structure, function and applications.

International Journal of Antimicrobial Agents, v. 33, p. 301-308, 2009.

HABIB, H, M. et al. Camel milk lactoferrin reduces the proliferation of colorectal

cancer cells and exerts antioxidant and DNA damage inhibitory activities. Food

Chemistry, v. 141, p.148-153, 2013.

HARRIS, E. L. V.; ANGAL, S. Protein purification methods a pratical approach.

Oxford University Press, 165 p. 2001.

HAVERSEN, L. et al. Lactoferrin down-regulates the production of cytokines induced

by LPS in monocytic cells via NF-kappa B. Cellular Immunology, v. 220, p. 83 -95,

2002.

HIBBERT, D. B. Experimental design in chromatography: A tutorial review. Journal

of Chromatography B, v. 910, p. 2-13, 2012.

IFSCC – International Federation of the Scienties of Cosmetics - monografia nº 2. The

Fundamental of Stability Testing. Micelle Press: Weymouth, 23 p. 1992.

52

JENSSEN, H.; HANCOCK, R. R. E. Antimicrobial properties of lactoferrina.

Biochimie, v. 91, p. 19-29, 2009.

JUNIOR, D. L. A. Lactoferrina e sua Utilização na Conservação de Carnes. 2006.

32f. Monografia (Pós-Graduação em Medicina Veterinária)– Universidade Castelo

Branco e Instituto Qualittas de Pós-Graduação em Medicina Veterinária. Rio de Janeiro,

RJ, Brasil. 2006.

KOZU, T. et al. Effect of orally administered bovine lactoferrin on the growth of

adenomatous colorectal polyps in a randomized, placebo-controlled clinical

trial.Cancer Prev Res, v. 11, p. 975-983, 2009.

KUMAR, R.; BHATIA, K. L. Standardization of method for lactoperoxidase assay in

milk. Lait, v.79, n.2, p. 269-274, 1999.

KUNZS, C. et al. Nutritional and Biochemical Properties of Human Milk, Part II:

Lipids, Micronutrients and Bioactive Factors. Clinical Periodontal, v.26, p.59-335, 26

de Jun, 1999.

LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage t4. Nature, v. 33, p. 680-685, 1970.

LEGRAND, D. et al. Lactoferrin: a modulator of immune and inflammatory responses.

Cellular and Molecular, v. 62, p. 2549-2559, 2005.

LOWRY, O. H. et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal

Biological Chemical, v. 193, p. 265-275, 1951.

MATEUS, N. B.; DARBIN, D.; CONAGIN, A. Viabilidade de uso do delineamento

composto central. Acta Scientiarum, v. 23, n. 6, p. 1537-1546, 2001.

MENDONÇA, L. A.; Desempenho do delineamento composto central em

experimentos com alto coeficiente de variação. 2012. 80f. Dissertação (Mestrado

Estatística Aplicada e Biometria) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Brasil.

2012.

MERRIL, C. R. Gel staining techiniques. Methods Enzymol, v. 182, p. 477–478, 1990.

MISHRA, B. et al. A novel antimicrobial peptide derived from modified N-terminal

domain of bovine lactoferrina: design, synthesis, activity against multidrug-resistant

bacteria and Candida. Biochimica et Biophysica Acta, v. 1828, p. 677-686, 2013.

OHASHI, A. et al. New functions of lactoferrin and B-casein in mammalian milk as

cysteine protease inhibitors. Biochemical and Biophysical Research

Communications, v. 306, p. 98-103, 2003.

ORSI, N. The antimicrobial activity of lactoferrin: current status and perspectives.

Biometals. Biometals, v. 17, p. 189-196, 2004.

53

PELEGRINE, D. H. G.; Aproveitamento do soro do leite no enriquecimento nutricional

de bebidas. Brazilian Journal of Food Technology. VII BMCFB, dez. 2008.

PEREIRA, I. O. Análise e otimização do processo de ultrafiltração do soro de leite

para produção de concentrado proteico. 2009. 92f. Monografia (Pós Graduação em

Engenharia de Alimentos) – Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia. Pro-Reitoria

de pesquisa e Pós-Gradução em Engenharia de Alimentos. Itapetinga, BA, Brasil. 2009.

QUADRI, M. B.; CRUZ, J. M.; SANTANA, C. C. Modelagem numérica do processo

de adsorção em coluna de insulina sobre a resina Accel Plus. Anais do II Encontro

Brasileiro de Adsorção, p. 231-240, 1998.

QUEIROZ, V. A. O.; ASSIS, A. M. O.; JÚNIOR, H. C. R. Efeito protetor da

lactoferrina humana no trato gastrintestinal. Revista Paulista de Pediatria, v. 31, 2013.

RITCHIE, C.; Protein purification through column chromatography. Labome: the

world of laboratories, May, 2013.

RODRIGUES, M. I.; IEMMA, A. F. Planejamento de experimentos e otimização de

processos: uma estratégia sequencial de planejamentos. 1. ed. Campinas: Casa do Pão,

2005.

ROSSI, et al. Ca2+

binding to bovine lactoferrin increases protein stability and

influences the release of bacterial lipopolysaccharide. Biochemistry and Cell Biology,

v. 80, p. 41-48, 2002.

SANCHES, L.C. C.; CALVO, M. Recombinant human Lactoferrin: A valuable protein

for pharmaceutical products and functional foods. Biotechnology Advances, p. 831-

838, 2010.

SERPA, L.; PRIAMO, W. L.; REGINATTO, V. Destino Ambientalmente Correto a

Rejeitos de Queijaria a Análise de Viabilidade Econônima. INTERNATIONAL

WORKSHOP ADVANCES IN CLEANER PRODUCTION. São Paulo, SP. 20-22 de

maio, 2009.

SGARBIERI, V. C.; Revisão: Propriedades Estruturais e Físico-Químicas das Proteínas

do Leite. Brazilian Journal of Food Technology, v.8, n.1, p. 43-56, 2005.

SHESTAKOV, A. et al. Lactoferricin but not lactoferrin inhibit herpes simplex virus

type 2 infection in mice. Antiviral Research, v. 93, p. 340-345, 2012.

SILVA, F. R. C.; PEREIRA, J. A. M.; ARAÚJO, M. O. D,; SANTANA, C. C. Mass

transfer parameters evaluation in protein adsorption on macroporous resin. Hungarian

Journal of Industrial Chemistry, v. 27, p. 183-187, 1999.

STEVANATO, M. B.; Estudo da eficiência da lactoferrina como conservante em

formulações semi-sólidas para produtos cosméticos e farmacêuticos. 2005. 160f.

Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Ciências Farmacêuticas

de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, Brasil. 2005.

54

TAKAYAMA, Y. et al.Low density lipoprotein receptor-related protein (LRP) is

required for lactoferrin-enhanced collagen gel contractile activity of human fibroblasts.

J Biol Chem, v. 278, p. 22112-22118, 2003.

TANG, L. et al. A rice-derived recombinant human lactoferrin stimulates fibroblast

proliferation, migration, and sustains cell survival. Wound Repair Regen, v. 18, p.

123-131, 2010.

TANG, L. et al. Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-

epithelialization. British Journal of Dermatology, v.163; p. 38-47, 2010.

TOMITA, M. et al. Twenty-five years of research on bovine lactoferrin applications.

Biochimie, v. 91, p. 52-57, 2009.

TORRES, D. P. M.; Gelificação térmica de hidrolisados enzimáticos de proteínas do

soro de leite bovino. 2005. 100 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia/Engenharia

de Bioprocessos) – Departamento de Engenharia Biológica, Universidade do Minho,

Braga, Portugual.2005.

TOWBIN, H.; STAEHELIN, T.; GORDON, J. Electrophoretic transfer of proteins from

polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc.

Natl. Acad. Sci., v. 76, p. 4350–4354, 1979.

TRODLER, P. et al. Rational design of a new one-step purification strategy for Candida

antarctica lipase B by ion-exchange chromatography. J Chromatogr A, v.1179, p. 7-

161, 2008.

TSUMOTO, et al. Effects of salts on protein-surface interactions: applications for

column chromatography. J Pharm Sci, v. 96, p. 90, 2007.

UCHIDA, T. at. Separation of lactoperoxidase, secretory component and lactoferrin

from milk or whey with a cation exchange resin.US Pat 5,516,675. P. 15.14, Maio.

1996.

VALENTI, P.; ANTONINI, G. The Lactoferrin: An important host defense against

microbial and viral attack. Cellular and Molecular, v. 62, p. 2576-2587, 2005.

VAN DER STRATE, B. W. A. et al. Review: Antiviral activities of lactoferrin.

Antiviral Research, v. 52, p.225-239, 2001.

VOGEL, H, J. Lactoferrin, a bird’s eye view. Biochem Cell Biol, v. 90, p. 233-244,

2012.

WAKABAYASHI, et al. Lactoferrin research, technology and applications. Int. Dairy

J, v. 16, p. 1241-1251, 2006.

WAKABAYASHI, W.; TAKASE, K.; TOMITA, M. Lactoferricin derived from milk

protein lactoferricin. Current Pharmaceutical Design, v. 9, p. 1277-1287, 2003.

55

WANG, W. P. et al. Activation of intestinal mucosal immunity in tumor-bearing mice

of lactoferrin. Japanese Journal of Cancer Research, v. 91, p. 1022-1027, 2000.

WARD, P. P.; PAZ, E.; CONNEELY, O. M. Multifunctional roles of lactoferrin: a

critical overview. Cellular and Molecular, v. 62, p. 2540-2548, 2006.

WARD, P. P.; ZHOU, X.; CONNEELY, O. M. Cooperative interactions between the

amino- and carboxyl-terminal lobes contribute to the unique iron-binding stability of

lactoferrin. J Biol Chem, p. 271. 1996.

XANTHOU, M. Immune Protection of Human Milk. Karger. Biology Neonate, v.74,

p.121-133, 1998.

ZUÑIGA, A, D, G.; Estratégia de purificação das proteínas α-lactoalbumina e β-

lactoglobulina do soro de queijo. 2003. 168f. Tese (Doutorado em Ciência e

Tecnologia de Alimentos) – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Brasil. 2003.

56

ANEXO A

Perfil de eluição da lactoferrina de corridas cromatográficas em diferentes condições. Em todas as

corridas a coluna foi equilibrada e lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH 6,5 e as proteínas

adsorvidas à coluna foram eluídas com gradiente linear utilizando o tampão A e o tampão B (tampão A

acrescido de 1,5M de NaCl). O que variou foi o fluxo, a concentração de proteína total aplicada e o

número de volumes de coluna na eluição.

Picos

Atividade

Lactoperoxidase (U/mg)

Proteína Total (mg) Area do pico 3

Pico 1 - 7,53 --

Condição (1)

Pico 2 0,058 1,24 --

Pico 3 0,000 1,60 501,5

Pico 1 -- 7,37 --

Condição (2)

Pico 2 0,001 0,49 --

Pico 3 0,000 0,66 655,7

Pico 1 -- 10,15 --

Condição (3)

Pico 2

Pico 3

0,001

0,000

2,72

3,58

--

1897,8

Pico 1 -- 8,55 --

Condição (4) Pico 2 0,072 2,38 --

Pico 3 0,000 3,12 2403,9

Pico 1 -- 9,10 --

Condição (5)

Pico 2 0,001 1,23 --

Pico 3 0,000 1,10 637,5

Pico 1 -- 4,73 --

Condição (6)

Pico 2

Pico 3

0,191

0,000

0,36

7,56

--

1706,8

Condição (7)

Pico 1 -- 17,83 --

Pico 2 0,027 4,62 --

Pico 3 0,000 6,39 2195,7

Pico 1 -- 12,2 --

Condição (8) Pico 2 0,540 1,60 --

Pico 3 0,000 4,09 408,3

Pico 1 -- 14,0 --

Condição (9) Pico 2 0,001 3,85 --

Pico 3 0,000 1,71 1218,8

Pico 1 -- 8,92 --

Condição (10) Pico 2

Pico 3

0,001

0,000

0,70

2,49

--

1237,2

Pico 1 -- 5,42 --


Pico 3

0,003

0,000

0,54

1,02

--

348,5

Pico 1 -- 16,9 --


Pico 3

0,001

0,000

0,71

3,86

--

1944,3

Pico 1 -- 12,7 --

Condição (13) Pico 2 0,001 0,15 --

Pico 3 0,000 2,67 1526,5

Pico 1 -- 9,35 --

Condição (14) Pico 2 0,001 0,32

Pico 3 0,000 2,65 1365,8

Pico 1 -- 6,02 --

Condição (15) Pico 2 0,001 1,06 --

Pico 3 0,000 2,74 1319,2

Pico 1 -- 6,17 --

Condição (16) Pico 2 0,001 0,80 --

Pico 3 0,000 3,25 1147,6

Condição (17)

Pico 1

Pico 2

Pico 3

--

0,001

0,000

0,52

29,04

1,89

--

--

1311,6

57

ANEXO B

Cromatogramas obtidos a partir da cromatografia de troca catiônica (coluna HiTrap SP- Sepharose Fast

Flow). As corridas tiveram alterações em 3 parâmetros: volume coluna, proteína total aplicada e fluxo.

Equilibrada e lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH 6,5. As proteínas adsorvidas à coluna foram

eluídas com gradiente linear utilizando o tampão de equilíbrio e lavagem com 1,5M de NaCl. P1, P2 e P3

são referentes ao primeiro, segundo e terceiro pico, respectivamente.

62

ANEXO C

Diagrama de Pareto para o efeito estimado das variáveis sob área do pico 3 (abs.mL),

considerando o intervalo de confiança de 90% (p<0,1). 1 fluxo (mL.min-1); 2

concentração da amostra inicial (mg); 3 tamanho do gradiente (VC).

63

ANEXO D

SDS-PAGE 12,5%sob condições redutoras. Análise eletroforética das frações eluídas da coluna SP

Sepharose Fast Flow. Análise do Pico 2 e Pico3.

Pico 2 das dezessete corridas. O concentrado de 30 NMWC foi aplicado na coluna SP-sepharose, a seguir

a coluna foi lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH6,5 (tampão A). Os picos foram eluídos com o


proteína total foram aplicadas no gel sob condições redutoras. A- Poço1- albumina; Poço 2- padrão de

massa molar; Poço 3- Pico 2 (condição 2); Poço 4- Pico 2 (condição 12); Poço5- Pico 2 (condição 11);

Poço 6- Pico 2 (condição 15); Poço 7-Pico 2 (condição 16); Poço 8-Pico 2 (condição 10); Poço 9- Pico 2

(condição 5); Poço 10- Pico 2 (condição 8); Poço 11- Pico 2 (condição 1). B- Poço1- albumina; Poço 2-

padrão de massa molar; Poço 3- Lactoferrina Sigma (5g); Poço 4- Pico 2 (condição 3); Poço5- Pico 2

(condição 13); Poço 6- Pico 2 (condição 6); Poço 7- Pico 2 (condição 2); Poço 8- Pico 2 (condição 17);

Poço 9- Pico 2 (condição 9); Poço 10- Pico 2 (condição 7); Poço 11- Pico 2 (condição 4).

Pico 3 das dezessete corridas. O concentrado de 30 NMWC foi aplicado na coluna SP- sepharose, a seguir

a coluna foi lavada com tampão fosfato de sódio 50mM pH6,5 (tampão A). Os picos foram eluídos com o


proteína total foram aplicadas no gel sob condições redutoras. A- Poço1- Albumina; Poço 2- padrão de

massa molar; Poço 3- Lactoferrina Sigma (5g); Poço 4- Pico 3 (condição 1); Poço5- Pico 3 (condição

5); Poço 6- Pico 3 (condição 3); Poço 7- Pico 3 (condição 7) ; Poço 8- Pico 3 (condição 2); Poço 9- Pico

3 (condição 6); Poço 10- Pico 3 (condição 4); Poço 11- Pico 3 (condição 8). B- Poço1- Albumina; Poço

2- Padrão de massa molar; Poço 3- Pico 3 (condição 9); Poço 4- Pico 3 (condição 10); Poço5- Pico 3

(condição 11); Poço 6- Pico 3 (condição 12); Poço 7- Pico 3 (condição 13); Poço 8- Pico 3 (condição 14);

Poço 9- Pico 3 (condição 15); Poço 10- Pico 3 (condição 16); Poço 11- Pico 3 (condição 17); Poço 12-

Lactoferrina Sigma (5g).

PURIFICAÇÃO DA LACTOFERRINA BOVINA A PARTIR DE … · apresentando efeito antibacteriano,...

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