Purificação de Produtos Biotecnológicos

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ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL / USP . Purificação de Produtos Biotecnológicos. Disciplina: Engenharia Bioquímica II A Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro Profº Arnaldo Márcio . Etapas de um Processo de Purificação. Rompimento Celular. - PowerPoint PPT Presentation

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Purificao de Produtos Biotecnolgicos

Purificao de Produtos BiotecnolgicosESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL / USP

Disciplina: Engenharia Bioqumica II APrograma de Aperfeioamento de Ensino (PAE): Livia CarneiroProf Arnaldo Mrcio

Etapas de um Processo de PurificaoEtapa do processoOperaes unitrias Princpio Clarificao Filtrao convencional Tamanho de partculas Centrifugao Tamanho e densidade de partculas Filtrao tangencial (membranas) Tamanho de partculas Floculao Hidrofobicidade de partculas Rompimento de clulas H omegeneizao Cisalhamento Ultra-som Cisalhamento Moagem em moinho de bolas Cisalhamento Rompimento qumico ou enzimtico Hidrlise, solubilizao ou desidratao de molculas que compem a parede ou a membrana celularPurificao de baixa resoluo Precipitao Solubilidade U Itrafiltrao (membranas) Massa molar e raio hidrodinmico de molculas Extrao em sistemas de duas fases lquidas Solubilidade, massa molar Purificao de alta resoluo Cromatografia de troca-inica Tipo e densidade de carga na superfcie da biomolcula Cromatografia de afinidade (biolgica ou qumica) Stios especficos da superfcie de uma protena (adsoro) Cromatografia de imunoafinidade Stios especficos da superfcie de uma protena (adsoro antgeno/anticorpo)Cromatografia de interao hidrofbica Hidrofobicidade Cromatografia de excluso molecular Massa molar Membranas adsortivas Massa molar e caractersticas para adsoro ou stios especficos da superfcie de uma protena Tratamentos finais Cristalizao Solubilidade e caractersticas de equilbrio lquido-slido Liofi I izaoCaractersticas de equilbrio lquido-slidoSecagem Caractersticas de equilbrio lquido-slido Rompimento CelularProdutos IntracelularesProdutos intracelulares tornam o processo de purificao de biomolculas mais difcil em comparao com produtos extracelulares devido necessidade do rompimentoAplicados aps a separao e lavagem das clulas;

Clulas animais (possuem apenas membrana), fcil rompimento com baixa fora de cisalhamento;

Ex.: Clulas animais: rompidas por simples variao da presso osmtica do meio, adio de detergentes ou aplicao de ultra-som de baixa intensidadeForma mais adequada de Rompimento?Tipo de microrganismoTamanho da clula;Tolerncia a tenses de cisalhamento;Necessidade de controle de temperatura;Gasto de energia;

Parede CelularMtodos de Rompimento CelularLize enzimticaEnzimticosHomogeneizador a alta presso

CavitaoTurbulnciaCisalhamentoMecnico - Homogeneizador a alta pressoEste tipo de rompimento provoca aumento da temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigerao

Presses utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi, velocidades de alimentao da ordem de 180 a 280 m/s e concentraes celulares de 450 a 750 g/L (massa mida).Mecnico - Homogeneizador a alta pressoO desempenho pode ser afetado por:

Presso de operao;Velocidade de alimentao;Temperatura;Estado fisiolgico do microrganismo;Condies de cultivo;Tipo de clula e sua concentrao.

tamanho das clulas (maior => rompimento mais fcil)presso (maior => maior eficincia)nmero de passagens (mltiplas etapas aumenta o ren-dimento)

Existe um modelo matemtico para avaliar o rompimento, que neste caso de 1a ordem em relao ao nmero de passagens e de potncia em relao presso de trabalho:log Rm = k . N . Pa (Rm R)onde:Rm a concentrao mxima de protena disponvel para ser liberada (g/L)R a concentrao de proteina liberada (g/L)k a constante de velocidade que depende de T, X e do tipo de clulaN o nmero de passagensP a presso a constante que depende do tipo de microrganismo e das condies de crescimento (varia de 0,86 a 2,9) (tabela)Mecnico Moinho de BolasConsiste na passagem da suspenso celular por uma cmara de triturao (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitao e preenchida com esferas de vidro.

O rompimento ocorre devido fora de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das clulas.

Mecnico Moinho de BolasMecnico Ultra-somO rompimento ocorre quando ondas sonoras (~20kHz), so convertidas em vibraes em um meio lquido e causam o fenmeno de cavitao.

Escala de laboratrio.

Mecnico - UltrassomRompimentos MecnicosDesvantagens:

As elevadas foras de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecnicos podem destruir organelas celulares e desnaturar enzimas;

Com o rompimento integral das clulas todo o contedo intracelular, incluindo cidos nuclicos, organelas e fragmentos celulares liberado junto com a molcula-alvo, sendo que o homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.