Purificação de Produtos Biotecnológicos

ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL / USP

Disciplina: Engenharia Bioquímica II APrograma de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE): Livia CarneiroProfº Arnaldo Márcio

Etapas de um Processo de Purificação

Etapa do processo Operações unitárias Princípio

Clarificação

Filtração convencional Tamanho de partículas Centrifugação Tamanho e densidade de partículas Filtração tangencial (membranas) Tamanho de partículas

Floculação Hidrofobicidade de partículas

Rompimento de células

H omegeneização Cisalhamento Ultra-som Cisalhamento Moagem em moinho de bolas Cisalhamento

Rompimento químico ou enzimático Hidrólise, solubilização ou desidratação de moléculas que compõem a parede ou a membrana celular

Purificação de baixa resolução

Precipitação Solubilidade

U Itrafiltração (membranas) Massa molar e raio hidrodinâmico de moléculas

Extração em sistemas de duas fases líquidas Solubilidade, massa molar

Purificação de alta resolução

Cromatografia de troca-iônica Tipo e densidade de carga na superfície da biomolécula

Cromatografia de afinidade (biológica ou química)

Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção)

Cromatografia de imunoafinidade Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção antígeno/anticorpo)

Cromatografia de interação hidrofóbica Hidrofobicidade

Cromatografia de exclusão molecular Massa molar

Membranas adsortivas Massa molar e características para adsorção ou sítios específicos da superfície de uma proteína

Tratamentos finais

Cristalização Solubilidade e características de equilíbrio líquido-sólido

Liofi I ização Características de equilíbrio líquido-sólido

Secagem Características de equilíbrio líquido-sólido

Rompimento Celular

Suspensão Celular

Clarificação

Rompimento Celular

Produtos Intracelulares

Produtos intracelulares tornam o processo de purificação de biomoléculas mais difícil em comparação com produtos extracelulares devido à necessidade do rompimento

Aplicados após a separação e lavagem das células;

Células animais (possuem apenas membrana), fácil rompimento com baixa força de cisalhamento;

Ex.: Células animais: rompidas por simples variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultra-som de baixa intensidade

Forma mais adequada de Rompimento?Tipo de microrganismoTamanho da célula;Tolerância a tensões de cisalhamento;Necessidade de controle de

temperatura;Gasto de energia;

Parede Celular

Métodos de Rompimento Celular

•Homogeneizador de alta pressão•Moinho de bolas•Ultrassom Mecânico

s

•Choque osmótico•Congelamento-descongelamento•Aquecimento •SecagemNão-

mecânicos

•Álcalis•Solventes•Detergentes•Ácidos

Químicos

• Lize enzimáticaEnzimáticos

Homogeneizador a alta pressão

CavitaçãoTurbulênciaCisalhamento

Mecânico - Homogeneizador a alta pressãoEste tipo de rompimento provoca aumento da

temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigeração

Pressões utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi, velocidades de alimentação da ordem de 180 a 280 m/s e concentrações celulares de 450 a 750 g/L (massa úmida).

Mecânico - Homogeneizador a alta pressãoO desempenho pode ser afetado por:

Pressão de operação;Velocidade de alimentação;Temperatura;Estado fisiológico do microrganismo;Condições de cultivo;Tipo de célula e sua concentração.tamanho das células (maior => rompimento mais

fácil)pressão (maior => maior eficiência)número de passagens (múltiplas etapas aumenta o

ren-dimento)

Existe um modelo matemático para avaliar o rompimento, que neste caso é de 1a ordem em relação ao número de passagens e de potência em relação à pressão de trabalho:

  log Rm   =    k . N . Pa (Rm – R)

onde:Rm é a concentração máxima de proteína disponível para ser liberada (g/L)R é a concentração de proteina liberada (g/L)k é a constante de velocidade que depende de T, X e do tipo de célulaN é o número de passagensP é a pressão

a é constante que depende do tipo de microrganismo e das condições de crescimento (varia de 0,86 a 2,9) (tabela)

Mecânico – Moinho de BolasConsiste na passagem da suspensão celular

por uma câmara de trituração (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas de vidro.

O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células.

Mecânico – Moinho de Bolas

Mecânico – Ultra-som

O rompimento ocorre quando ondas sonoras (~20kHz), são convertidas em vibrações em um meio líquido e causam o fenômeno de cavitação.

Escala de laboratório.

Mecânico - Ultrassom

Rompimentos MecânicosDesvantagens:

As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecânicos podem destruir organelas celulares e desnaturar enzimas;

Com o rompimento integral das células todo o conteúdo intracelular, incluindo ácidos nucléicos, organelas e fragmentos celulares é liberado junto com a molécula-alvo, sendo que o homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.