Purificação e Purificação e Caracterização do Caracterização do

anticorpo anti-DRG 11banticorpo anti-DRG 11b

Orientador: Prof. Dr. Carlos Reguenga Autores: Ana Filipa Pereira

Liliana Sofia Coelho

Biologia Celular e molecular

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DRG11• O Drg11 é um factor de transcrição,

expresso nos gânglios raquidianos e no corno dorsal da espinal medula, durante a vida embrionária (a expressão do drg11 decai após o nascimento).

• Drg11 participa no desenvolvimento de neurónios envolvidos no processamento da sensação dolorosa.

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Sistema Nociceptivo

Percepção do estímulo pelo órgão receptor

Produção da resposta. Nervo sensorial leva a informação à espinal medula.

Gânglio dorsal → Corno dorsal

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Organização genómica

DRG11

DRG11b

Drg11 gene47,5 Kb

Gene drg11 → cromossoma 14

homeodomainhomeodomain OAROAR domaindomainNDRG11 263 a.a.

homeodomainhomeodomainN CDRG11b 220 a.a.

Ligação ao DNA Regulação

C

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DRG11 MKINLTEARVQVWFQNRRAKWRKTERGASDQEPGAKEPMAEVTPPPVRNINSPPPGDQTRSKKEAL 133

DRG11b MKINLTEARVQVWFQNRRAKWRKTERGASDQEPGAKEPMAEVTPPPVRNINSPPPGDQTRSKKEAL 133

******************************************************************

DRG11 EAQQSLGRTVGPTGPFFPSCLPGTLLNTATYAQALSHVASLKGGPLCSCCVPDPMGLSFLPTYGCQ 199

DRG11b EAQQSLGRTVGPTGPFFPSCLPGTLLNTATYAQALSHVASLKDHFRAMLCSGSFGFRGEQTQQRAL 199

****************************************** *

DRG11 MFYFHCPPQLEGTAPFGNHSTGDFDDGFLRRKQRRNRTTFTLQQLEALEAVFAQTHYPDVFTREELA 67

DRG11b MFYFHCPPQLEGTAPFGNHSTGDFDDGFLRRKQRRNRTTFTLQQLEALEAVFAQTHYPDVFTREELA 67

*******************************************************************

DRG11 SNRTASVAALRMKAREHSEAVLQSANLLPSTSSSPGPASKQAPPEGSQDKTSPTKEQSEGEKSV 263

DRG11b TPNLYPFLIDERCSAVDMTQG------------------------------------------- 220

O anticorpo anti-drg11b foi criado usando um péptido de 15 a.a..

Este foi escolhido na sequência da drg11b que difere da drg11.

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O anticorpo foi produzido com a finalidade de se poder estudar o papel da proteína drg11b nos

mecanismos de processamento da dor.

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Objectivo

Purificar e testar o anticorpo anti-DRG 11b.

Ferramenta para estudar o papel do drg11b no desenvolvimento do sistema nociceptivo.

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Soro de coelhos imunizados com o péptido

(FGFRGEQTQQRALTP) específico do Drg11b.

Material Inicial

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1. Purificação do anticorpo• Cromatografia por afinidadeCromatografia por afinidade

Baseia-se na interacção do anti-drg11b com o péptido ligado a uma resina

Lavagens da resina-péptido drg11b

Incubar com o soro “overnight”

Separação do sobrenadante

Montagem da coluna

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Eluição por choque de pH (pH 3.0)

Recolha de 10 fracções com bomba peristáltica

Neutralização com Tris (pH=8.0)

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2. Testar o anticorpo• Dot blotDot blot

Colocamos o péptido DRG11b numa membrana de nitrocelulose

Colocamos as membranas numa solução de bloqueio

Incubamos com o anticorpo purificado overnight

Incubamos com o anticorpo secundário conjugado com a fosfatase alcalina

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Resultado

Conclusão: o anticorpo encontrava-se maioritariamente presente nas fracções 3 e 4.

Revelação com substratos

12 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Soro Soro após resina

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O anticorpo foi posteriormente testado por imunocitoquímica.

Não foram obtidos resultados positivos.

Concentrar o anticorpo.

2. Testar o anticorpo

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3. Concentração do anticorpo

• As imunopurificações foram repetidas várias vezes e as fracções 3 e 4 misturadas.

• Colocou-se a solução final num centricon (tubo com uma membrana que retém proteínas maiores que 30 kDa).

• Centrifugação a 2500 rpm. 25KDa

50 KDa

150 KDa

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•ImunocitoquímicaImunocitoquímica

Usaram-se lâminas com cortes de Usaram-se lâminas com cortes de embrião E13.5 e E16.5 de ratinhos embrião E13.5 e E16.5 de ratinhos

wild-type wild-type

Desparafinação (banhos em soluções de Desparafinação (banhos em soluções de xilol, de seguida concentrações xilol, de seguida concentrações

decrescentes de etanol e por fim água).decrescentes de etanol e por fim água).

Bloqueio com soroBloqueio com soro

4. Testar o anticorpo concentrado

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Incubaram-se os cortes com o anticorpo Incubaram-se os cortes com o anticorpo primário (anti-DRG 11b) e como controlo primário (anti-DRG 11b) e como controlo

positivo com anti-drg11positivo com anti-drg11

Incubaram-se com anticorpo secundário Incubaram-se com anticorpo secundário conjugado com um fluorocromo vermelhoconjugado com um fluorocromo vermelho

Observaram-se os locais de expressão da Observaram-se os locais de expressão da proteína usando microscopia de proteína usando microscopia de

fluorescênciafluorescência

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É possível que o anticorpo não tenha reconhecido a proteína pelo o facto do epítope poder estar

mascarado pelo folding da proteína.

E13.5 E13.5 E16.5

Anti-Drg11b Anti-Drg11(reconhece Drg11 e Drg11b)

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• Western-blotting com extractos Western-blotting com extractos de medula espinal de embriõesde medula espinal de embriões

1. Preparação da electroforese em gel 1. Preparação da electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10%.de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10%.

2. Preparação das amostras de medula 2. Preparação das amostras de medula espinal com idades (embrionárias e espinal com idades (embrionárias e pós-natais)diferentes.pós-natais)diferentes.

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3. Colocaram-se as soluções nos poços formados 3. Colocaram-se as soluções nos poços formados pelo pente no gel, como esquematizado abaixo.pelo pente no gel, como esquematizado abaixo.

Marcador

E15 E18 P7 P14P14P7E18E15

Marcador: contem uma mistura de proteínas de tamanho conhecido.

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5. No final da electroforese, 5. No final da electroforese, transferiram-se as proteínas transferiram-se as proteínas do gel para uma membrana do gel para uma membrana de nitrocelulose.de nitrocelulose.

6. Cororou-se com Panceau S.6. Cororou-se com Panceau S.

7. Incubaram-se com o 7. Incubaram-se com o anti-anti-drg11drg11 (reconhece tanto (reconhece tanto drg11 como drg11b) e com o drg11 como drg11b) e com o anticorpoanticorpo anti-drg11b anti-drg11b concentrado.concentrado.

8. Revelação pelo método 8. Revelação pelo método quimioluminescentequimioluminescente Anti-drg11 Anti-drg11b

97kDa

66kDa

45kDa

31kDa21kDa

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Não foram obtidos resultados. O anticorpo não tem sensibilidade suficiente para detectar o Drg11b por

métodos desnaturantes.

Conclusão Conclusão quimioluminescênciaquimioluminescência

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Com este conjunto de experiências podemos concluir que o anticorpo

não é funcional.

Ponderações

O anticorpo só reconhece a proteína apenas em grandes quantidades (resultado do dot blot).

O anticorpo não tem sensibilidade para detectar a proteína com os métodos utilizados.

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Perspectivas futuras

• Produção de uma proteína recombinante correspondente à parte C-terminal específica do Drg11b de modo a produzir um novo anticorpo.

• Imunoprecipitação das bandas reconhecidas pelo anti-Drg11 e identificação por espectroscopia de massa (MALDI-MS).

• Experiências de hibridação “in situ” com sondas específicas para o exão de cada uma das isoformas.

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AgradecimentosAgradecimentos

• Professor Doutor Carlos Professor Doutor Carlos Reguenga Reguenga

• Laboratório Biologia Celular e Laboratório Biologia Celular e Molecular Molecular