1) INTRODUÇÃO:

Conseguimos obter através de cultura de microorganismos, diversas reações químicas que precisariam de condições extremas ou remotas para ocorrer, enquanto diversos microorganismos realizam essa reação naturalmente. Para atingirmos este patamar de conhecimento é necessário antes aprendermos métodos de higiene, manipulação e cultura dentro dos laboratórios de microbiologia. Neste relatório abordaremos as diversas formas de realizar tais procedimentos citados anteriormente, em teoria, para nós.

2) OBJETIVOS:

Aprender a manipular materiais com amostras microbianas na zona de segurança visando minimizar ou extinguir contaminações diversas;

Preparar culturas diferenciadas utilizando meios de cultura seletivos; Coletar material para cultura; Observar e descrever o crescimento microbiano das amostras coletadas; Transferência de cultura entre meios; Identificar crescimento microbiano em condições adversas; Identificar agentes físicos e químicos que influenciam no desenvolvimento microbiano; Quantificar o crescimento microbiano.

3) MATERIAL:

1ª aula prática: 3 placas Petri com Agar cetrimida, citrato de Simmons e EMB; 3 tubos de ensaio com caldo nutritivo e diferentes pHs; 3 tubos de ensaio com caldo nutritivo com pH=7,0; Alça microbiana; Tubo de ensaio com cultura de Serratia marcescens; Tubo de ensaio com cultura de Escherichia coli; Tubo de ensaio com cultura de Pseudomonas aeruginosa; Bico de Bunsen; Fósforos

2ª aula prática: Nenhum material utilizado.

3ª aula prática: 2 Placas de Petri com ágar nutritivo; Alça microbiana; Tubo de ensaio com cultura de Escherichia coli; Tubo de ensaio com cultura de Bacillus cereus; Bico de Bunsen; Fósforos; Swab descartável; 4 discos de papel de filtro; Amostras de “Pinho Sol”, detergente, eosina e violeta genciana 0,1%.

4ª aula prática: Nenhum material utilizado.

5° aula prática: 7 Pipetas; Tubo de ensaio com cultura de Escherichia Coli; 7 Tubos de ensaio com solução salina; Alça de Drigalsky;

6 Placas de Petri com ágar nutritivo

4) PROCEDIMENTOS:

1ª aula prática:

Como procedimento primário e essencial de todas as práticas, ao entrarmos no laboratório, lavamos as mãos com água abundante e detergente, e também limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e álcool.

Esta primeira aula foi dividida em duas partes. Na primeira parte nós inoculamos E. coli, S. marcescens e P. aeruginosa em três placas de Petri com Agar cetrimida, citrato de Simmons e EMB. Dividimos cada placa em três áreas, marcando com retroprojetor a superfície externa da placa, e numeramos cada área com os números 1, 2 e 3, referentes aos microorganismos utilizados. Também a identificamos com turma e grupo (G3). Acendemos o bico de Bunsen e flambamos a alça microbiana ao rubro para esterilizá-la.

Na zona de segurança, abrimos o tubo de ensaio com cultura de E. coli, flambamos a entrada do tubo, recolhemos com a alça microbiana uma gota da cultura, flambamos a entrada do tubo e o fechamos. Abrimos a placa com ágar cetrimida e estriamos a gota da cultura de E. coli na zona 1. Repetimos este procedimento em todas as placas com a E.coli e, depois com os demais microorganismos, sendo a S. marcescens inoculada nas zonas 2 e a P. aeruginosa inoculada nas zonas 3 de cada placa segundo a imagem:

Em seguida iniciamos a segunda parte da prática, onde deveríamos inocular E. coli em tubos de ensaio.

Identificamos os tubos com diferentes valores de pH com turma e grupo (G3), do mesmo modo, identificamos os tubos com mesmo pH com etiquetas contendo turma e grupo (G3) e a temperatura em que seriam conservados, segundo a figura a seguir:

Feito isso, com o bico de Bunsen já aceso, flambamos a alça microbiana, abrimos o tubo de ensaio na zona de segurança contendo a cultura de E. coli, flambamos a entrada do tubo,recolhemos uma gota da amostra, flambamos a entrada do tubo e o fechamos. Em seguida abrimos na zona de segurança o tubo contendo meio de cultura com pH 3,0, flambamos a entrada do tubo, depositamos a amostra da cultura, flambamos a entrada do tubo novamente e o

fechamos. Repetimos este procedimento com os demais tubos com pHs diferentes e com os tubos de mesmo pH.

Depois do procedimento, recolhemos qualquer lixo originado durante a prática, limpamos a bancada, lavamos as mãos e saímos do laboratório.

2ª aula prática:

Como procedimento primário e essencial de todas as práticas, ao entrarmos no laboratório, lavamos as mãos com água abundante e detergente, e também limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e álcool.

Observamos o crescimento microbiano das inoculações feitas na 1ª aula prática. Discutimos resultados entre grupos e comparamos o crescimento das diferentes culturas obtidas.

3ª aula prática:

Como procedimento primário e essencial de todas as práticas, ao entrarmos no laboratório, lavamos as mãos com água abundante e detergente, e também limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e álcool.

Antes de qualquer manobra acendemos o bico de Bunsen e flambamos a alça microbiana ao rubro para esterilizá-la.

Dividimos uma placa de Petri com ágar nutritivo em duas partes, marcando com retroprojetor a área externa da placa. Posteriormente esta placa seria exposta a raios UV com metade tampada e metade aberta. Em seguida abrimos o tubo de ensaio com cultura de B. cereus, flambamos a entrada do tubo, recolhemos com a alça microbiana uma gota da cultura, flambamos novamente a entrada do tubo e o fechamos. Na área de segurança, abrimos a placa de Petri e estriamos a amostra da cultura em uma metade da placa. Repetimos esse procedimento para estriar a outra metade da placa, como mostra a figura a seguir:

Em seguida abrimos o tubo com cultura de E. coli na zona de segurança, flambamos a entrada do tubo, molhamos o swab no meio liquido, flambamos novamente a entrada do tubo e o fechamos. Feito isso expalhamos a amostra no ágar nutritivo, de modo a cobrir toda a superfície do ágar.

Mergulhamos cada um dos quatro discos de papel de filtro em quatro agentes químicos diferentes (pinho sol, detergente, eosina e violeta gienciana), abrimos a placa de Petri na zona de segurança e colocamos os discos em quatro pontos separados em cima do ágar, como mostra a figura:

Depois do procedimento, recolhemos qualquer lixo originado durante a prática, limpamos a bancada, lavamos as mãos e saímos do laboratório.

4ª aula prática:

Como procedimento primário e essencial de todas as práticas, ao entrarmos no laboratório, lavamos as mãos com água abundante e detergente, e também limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e álcool.

Observamos o crescimento microbiano das inoculações feitas na 3ª aula prática. Discutimos resultados entre grupos e comparamos o crescimento das diferentes culturas obtidas.

5° aula prática:

Como procedimento primário e essencial de todas as práticas, ao entrarmos no laboratório, lavamos as mãos com água abundante e detergente, e também limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e álcool. Nesta aula, iniciamos a quantificação bacteriana e para isto, foi escolhido o método de “spread plate” para a contagem de crescimento microbiano. Para isto, usou-se um tubo de ensaio contendo uma solução concentrada da cultura de E. Coli e dela retirou-se com uma pipeta uma alíquota de 1 ml que foi transferida para um tubo contendo 9 ml de uma solução salina, e a partir dessa solução diluída (10-1) foi retirado uma alíquota de 1 ml e transferido para um tubo contendo 1 ml de uma solução salina, possuindo assim no tubo uma diluição de 10 -2

sendo que este procedimento de se transferir sempre uma alíquota de 0,1 ml de um tubo para outro com 0,9 ml de solução é chamado de diluição seriada, este procedimento foi feito até que se houvesse 7 tubos diluídos (10-1 até 10-7). Como é mostrado na figura abaixo.

É importante ressaltar que após cada transferência foi utilizada uma pipeta nova para que vestígios restantes da diluição anterior na pipeta não contaminasse a nova diluição, e para evitar contaminação do material, flambamos a abertura de cada tubo antes e depois de seu uso . Após esta diluição seriada, iniciamos de fato o método “spread plate” para a contagem de crescimento microbiano em placas. Este método consiste em se transferir 0,1 ml do inóculo do tubo para uma placa de Petri que já contenha o meio de cultura, e após isto é feito o espalhamento do inóculo com a alça de Digalsky na placa. Dessa forma, retiramos uma alíquota de 0,2 ml de um tubo com diluição de 10 -5 e transferimos para 2 placas de Petri (0,1 ml para cada placa) e em seguida espalhamos a alíquota

na placa com o auxílio da alça de Drigalsky. Este procedimento foi realizado também com os tubos contendo as diluições de 10-6 e 10-7. Para que não houvesse contaminação, a alça de Drigalsky foi esterilizada após cada espalhamento na placa de forma que após o uso ela era posta num becker com álcool e quando usada, era flambada e só após que a chama se extinguisse da alça seu uso era permitido. Feito o espalhamento, a alça retornava ao becker com álcool. Depois do procedimento, recolhemos qualquer lixo originado durante a prática, limpamos a bancada, lavamos as mãos e saímos do laboratório.

6° aula prática: Como procedimento primário e essencial de todas as práticas, ao entrarmos no laboratório, lavamos as mãos com água abundante e detergente, e também limpamos a bancada de trabalho com papel toalha e álcool. Observamos as placas que foram incubadas na prática anterior e então foi iniciado a penúltima etapa da quantificação bacteriana que é a contagem. Para a contagem, as placas do Rodrigo (10-5) não foram contadas, pois houve contaminação e nas placas do Michel (10-7) ainda havia uma concentração alta de bactérias. Como nas placas de 10-5 e 10-6 não houveram contagem, apenas as 2 placas de 10 -7 foram contadas, e foram encontradas 124 e 33 UFC (unidade formadora de colônia), respectivamente em cada placa. Após a contagem, foi realizada a última etapa da quantificação que é o cálculo para se saber a concentração de bactérias/ml. O cálculo para se encontrar a concentração de bacterias na amostra original consiste na seguinte expressão: N° contado x 1/diluição x 1/ volume pipetado (ml), como houve 2 placas para a diluição de 10-7, foi feito então uma média aritmética entre os valores e assim, o numero contado da média foi de 79 UFCs. Depois do procedimento, recolhemos qualquer lixo originado durante a prática, limpamos a bancada, lavamos as mãos e saímos do laboratório.

5) RESULTADOS:

Observamos os resultados da 1ª aula prática somente na 2ª aula prática, e assim sucessivamente. Como resultados da primeira aula, observamos que os resultados da 1ª parte da prática não foram satisfatórios. Apenas a placa de coloração amarela (meio de ágar cetrimida) atingiu o resultado esperado. Esperava-se que as culturas de E. coli e S. marcescens não se desenvolvessem neste meio, e de fato não observamos crescimento microbiano nas áreas correspondentes a estas duas bactérias (áreas 1 e 2). Entretanto era esperado o crescimento da P. aeruginosa. Esta cultura se desenvolveu muito bem, como podemos visualisar na imagem a seguir:

Ainda na 1ª parte da prática ao analisarmos a placa com meio de cultura de citrato de Simmons, notamos que ele mudou de cor, de verde para azul, e que houve crescimento de todas as culturas. Entretanto este resultado não era esperado. Somente a cultura de S. marcescens deveria crescer. Apesar de não ser possível visualizar com precisão os crescimentos microbianos em todas as áreas na imagem a seguir, podemos afirmar que houve difusão de algum material da S. marcescens para as outras áreas. As outras culturas (E. coli e P. aeruginosas) aproveitaram algo expelido pela S. marcescens e cresceram.

A única fonte de carbono presente neste meio era o citrato, logo se a bactéria era capaz de metabolizá-lo, alterava o pH do meio de 7,0 para maior que 7,0, tornando-o básico. Isso seria comprovado pela mudança na cor de verde para azul, pois o meio possuía indicador de pH, o azul de bromotimol. Sendo assim somente a área 2 (S. marcescens) ficaria azul, mas como toda a placa sofreu alteração de cor, podemos afirmar que houve difusão como mostra a figura abaixo:

Na placa com meio de cultura ágar EMB (eosina+ azul de metileno) era esperado o crescimento todas as colônias, porém elas deveriam adquirir aspectos diferentes, de modo que a cultura de E. coli deveria ficar verde metálico, mas ficou preto, como podemos ver na imagem a seguir:

Apesar da baixíssima qualidade da imagem, é possível ver que as demais culturas ficaram dentro do esperado e tiveram aspectos bastante parecidos. Ambas ficaram rosadas com aspecto gelatinoso, porém os estriamentos não foram feitos de maneira correta, logo ficou uma mancha compacta nas áreas 2 e 3 (S. marcescens e P. aeruginosa, respectivamente).

Como resultados da segunda parte da prática pudemos observar que à temperatura de 36ºC, após 36 horas, houve um crescimento mínimo da cultura de E. coli no tubo de pH 3,0, enquanto no tubo de pH 7,0 houve um bom crescimento, semelhante ao encontrado no tubo de pH 10,0. Pudemos chegar a essas conclusões observando a turbidez de cada tubo. Logo, o primeiro estava quase translúcido, mas era possível observar resíduos do meio líquido, que indicava a presença de desenvolvimento microbiano.

Já no tubo de pH 7,0 e 10,0 o meio se encontrava bastante turvo, indicando um crescimento padrão para a E. coli. Concluímos então que a bactéria E. coli não se desenvolve em condições ácidas, mas em condições neutras e alcalinas seu desenvolvimento não é afetado).Quanto aos tubos diferenciados pela temperatura de conservação, observamos que aquele que foi conservado a 4ºC durante 36 horas não apresentou crescimento microbiano, uma vez que a solução nutritiva do meio não apresentava nenhuma turbidez. Já no tubo que seria conservado a 28ºC houve um bom crescimento, pois o tubo estava translúcido, porém menos que o tubo conservado a 36ºC, uma vez que neste pudemos visualizar o meio turvo, indicando assim um excelente crescimento microbiano. Veja as imagens abaixo:

Com base em nossos resultados e nos resultados de toda a turma (que foram muito próximos aos nossos), chegamos então à conclusão que a bactéria E. coli não cresce em ambientes ácidos ou de baixa temperatura, e que seu ápice de crescimento é encontrado sob temperatura ambiente e pH neutro.

Como resultados terceira aula prática, observamos que a placa dividida em duas partes apresentou muito crescimento na parte protegida pela tampa da placa e pouco crescimento na parte não protegida. Este resultado era esperado, portanto pudemos concluir que o procedimento foi realizado corretamente. Como possíveis motivos para este resultado temos: - Bactéria sensível a UV. - Com relação ao pouco crescimento na parte exposta: Posicionamento errado da placa de teste, formação de endosporos que posteriormente, em condições não extremas, germinaram.

Também observamos os resultados do procedimento com agentes químicos na cultura de E. Coli. Tivemos como Amostras testadas na prática anterior: eosina, pinho sol, detergente e violeta gensiana; e como resultados obtivemos os seguintes valores para os halos (região de efeito bactericida) em cm:

Todos aceitos como falhas, valores encontrados não correspondem a um teste positivo.

Temos como possíveis justificativas para o erro:

- O papel foi "arrastado" na placa de teste, comprometendo a validade da amostra;

- Contaminação da amostra;

- Agente químico testado estava em baixa concentração/qualidade para o devido teste;

- Bactérias testadas eram resistentes ao agentes químicos utilizados;

- "Tapete microbiano" mal executado;

- Placa de incubação não era ideal para teste quantitativo.

Na 1° aula prática de quantificação microbiana, observamos que a diluição seriada é uma boa estratégia para se quantificar um crescimento microbiano, pois a cada diluição o número de bactérias é reduzido exponencialmente, e a partir de uma determinada diluição, seu número já é suficiente para que a contagem seja efetuada.

Na 2° aula prática de quantificação microbiana, observamos que nossos resultados eram próximos ao dos outros grupos, e que a contaminação das placas do Rodrigo (10-5) pode ter sido causado pelos seguintes fatores:

- Pipeta contaminada no momento da diluição seriada;

- Uso da pipeta e/ou alça de Drigalsky fora da zona de segurança;

Enquanto que as placas do Michel (10 -6) possuía um número de UFCs que extrapolavam o número permitido, sendo que esta extrapolação ocorreu na maioria dos grupos.

Placas de diluição 10-6 com numero de UFCs acima do permitido.

Logo, apenas as placas da Raquel (10-7) foram contadas, tendo em vista que não houve contaminação e nem extrapolação do número de UFCs permitidas (de 20 a 200 UFCs), demonstrando então êxito na realização da prática. Após a contagem, foi encontrado um valor de 124 UFCs numa placa e 33 UFCs na outra placa. Assim, foi calculado a média aritmética e chegou-se no valor de 79 UFCs.

Placas de diluição 10-7 contadas.

Para se determinar a concentração de bacterias na amostra original, foi feito o seguinte cálculo:

Concentração = N° contado x 1/diluição x 1/volume pipetado (ml)

Desta forma, a concentração na amostra original foi de 7,9x108 bacterias/ml

6) PESQUISAS:

Meios de cultura diferenciados:

EMB (azul de metileno e eosina): o EMB Teague Ágar é um meio seletivo e diferencial empregado no isolamento de bactérias Gram negativas. A seletividade do EMB Teague Ágar é assegurada pela presença da eosina e do azul de metileno , que inibem o crescimento de bactérias Gram positivas. O caráter diferencial é obtido através da leitura da fermentação da lactose. Vários tipos de amostra podem ser inoculadas no EMB Teague Ágar, devendo portanto o usuário definir seus critérios de coleta, armazenamento e rejeição para cada tipo de amostra usada.

Citrato de Simmons: É utilizado para diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias e não fermentadores. Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono, juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio. O indicador é o azul de bromotimol. Deve ser conservado de 4 a 10° C, de 6 a 8 semanas. Após este período realizar controle negativo e positivo semanalmente, onde: -Positivo: Klebsiella pneumoniae. -Negativo: Escherichia coli.Cor original do meio: verde -Positivo: cor azul ou crescimento no local do inoculo. -Negativo: não há crescimento e a cor permanece inalterada.

Ágar cetrimida: O Agar Cetrimide Base é usado como um meio seletivo para o isolamento de Pseudomonas aeruginosa, de pus, catarro, dreno, etc.

Composição em g/L:Digestão Pancreática de gelatina: 20.0Cloreto de Magnésio: 1.4Sulfato de Potássio: 10.0Cetrimide: 0.30Agar: 15.0

pH Final (a 25ºC): 7.2 ± 0.2

Características da cultura depois de 24-48 horas a 35-37ºC.Organismos (AATC) Crescimento

Pseudomonas aeruginosa abundantePseudomonas maltophila inibidoStaphylococcus aureus inibido

Escherichia coli inibido

Aparência do meio preparado:Cor amarelo claro, solução clara sem precipitados, apresentando solidificação firme, comparável com um gel agar 1.5%.

7) BIBLIOGRAFIA:

As fontes utilizadas foram:

-Cadernos de laboratório;

-Meio de cultura EMB:http://www.pro-analise.com.br/produtos/16853/emb_teague_agar_meio_cultura_em_placa_laborclin

-Meio de cultura citrato de Simmons:http://www.microclinica.ufsc.br/index.php/metodo/agar_citrato_de_simmons/

-Meio de cultura ágar cetrimida:http://www.biogen.net.br/products/AGAR-CETRIMIDE-BASE-Meio-de-Cultura-Desidratado-%252d-C%F3d.-M024%3B-500-gramas.html