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RAFAEL SILVEIRA PORTO

CONYZA CANADENSIS: DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS E

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA

CAMPINAS

2015

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

RAFAEL SILVEIRA PORTO

CONYZA CANADENSIS: DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS E

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA

ORIENTADORA: PROFA. DRA. SUSANNE RATH

COORIENTADORA: DRA. SONIA CLAUDIA DO NASCIMENTO

DE QUEIROZ

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA

AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA NA

ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA

POR RAFAEL SILVEIRA PORTO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SUSANNE RATH.

_______________________

Assinatura da Orientadora

CAMPINAS

2015

vii

“(...)Two roads diverged in a wood, and I—

I took the one less traveled by,

And that has made all the difference.”

The Road Not Taken – Robert Frost (1916)

ix

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, ao meu pai, Eduardo, e à minha mãe, Ana Lucia, pelo apoio

incondicional e pelo incomensurável esforço em criar as melhores condições

possíveis para que eu pudesse chegar onde cheguei. A eles, devo tudo.

À professora Dr.ª Susanne Rath pela brilhante orientação, pela incansável

paciência e pela confiança em mim depositada. Não fosse seu imprescindível

auxílio, meu mestrado não teria nem sequer começado.

À Dr.ª Sonia Queiroz, coorientadora deste projeto, pela sua inabalável

empolgação com nossa pesquisa, combustível essencial para o sucesso dessa

empreitada.

Aos meus amigos Eduardo, Sabrina e Amilcar, que tão de perto

acompanharam minhas angústias e meus sucessos, sempre dispostos a ajudar no

que fosse preciso.

Aos meus amigos do laboratório, Fabrício e Andreza, que não pouparam

esforços para me auxiliar no projeto, oferecendo não só apoio técnico, mas também

muitas risadas.

À toda equipe do Laboratório de Bioanalítica Paracelsus, tanto do primeiro

quanto do segundo lote, pelo companheirismo e pelas boas horas que passamos

juntos.

À equipe da Embrapa Meio Ambiente, em especial à Drª Suikinai Nobre, ao

Dr. Daniel Terao e ao meu amigo Rodrigo Castanha, idealizadores dos ensaios

microbiológicos e apoio constante nessa área outrora desconhecida por mim.

À equipe do Laboratório de Síntese de Produtos Naturais e Fármacos,

especialmente ao prof. Dr. Fernando Coelho e ao Bruno. À equipe do Laboratório

de Cromatografia Gasosa, especialmente ao prof. Dr. Fábio Augusto e à Gaby. À

professora Dr.ª Regina Buffon e ao Renan. Agradeço pelo uso dos equipamentos

de seu laboratório e pela enorme prestatividade com que me auxiliaram nas

atividades.

Ao CNPq e à FAPESP pelo apoio financeiro.

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CURRICULUM VITAE

Currículo Lattes: http://lattes.cnpq.br/1886425603184398

DADOS PESSOAIS Nome: Rafael Silveira Porto Data de Nascimento: 06/01/1989 Estado Civil: solteiro E-mail: [email protected] Telefone: (19) 9-8197-5230

FORMAÇÃO ACADÊMICA

2013 – 2015 Mestrado em Química Analítica. IQ/UNICAMP, Campinas/SP,

Brasil

Título: Conyza canadensis: determinação de compostos, bioativos e avaliação da atividade antifúngica.

Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath

2007 – 2012 Bacharelado em Química (com atribuições tecnológicas).

IQ/UNICAMP, Campinas/SP, Brasil.

ATUAÇÃO PROFISSIONAL

2011 – 2012 DuPont do Brasil S/A. Paulínia/SP, Brasil.

Cargo: Estagiário (analista de laboratório)

2010 Iniciação Científica em Química Analítica. IQ/UNICAMP,

Campinas/SP, Brasil

Cargo: Bolsista SAE/UNICAMP

Projeto: Controle de qualidade de medicamentos de uso veterinário à base de penicilinas associadas a anestésicos e antimicrobianos


mailto:[email protected]

xii

2009-2010 Iniciação Científica em Química Analítica. IQ/UNICAMP,

Campinas/SP, Brasil

Cargo: Bolsista CNPq

Projeto: Controle de qualidade de medicamentos de uso veterinário: penicilina G e penicilina G procaína


2008-2009 Iniciação Científica em Físico-Química. IQ/UNICAMP, Campinas/SP, Brasil

Cargo: Bolsista CNPq

Projeto: Ataque ácido a argamassas de cimento com agente impermeabilizante PVAOH + silicato de sódio.

Orientadora: Profa. Dra. Ines Joekes (in memoriam)

MONITORIAS

2º sem/2014 Programa de Estágio Docente (PED C). IQ/UNICAMP, Campinas/SP, Brasil

Disciplina: QA582 – Química Analítica Instrumental I

1º sem/2014 Programa de Estágio Docente (PED C). IQ/UNICAMP, Campinas/SP, Brasil

Disciplina: QA316 – Química Analítica III

APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM EVENTOS CIENTÍFICOS

05/2014 PORTO, R. S.; RATH, S.; QUEIROZ, S. C. N. Isolamento e caracterização de substâncias fungicidas da planta Conyza canandensis. In: 37ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (RASBQ). Natal/RN, Brasil

xiii

RESUMO

CONYZA CANADENSIS: DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS

BIOATIVOS E AVALIÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA

O Brasil é um dos maiores produtores de frutas do mundo, no entanto, estima-se

que doenças pós-colheita possam gerar perdas de até 50% em sua produção. A

forma mais comum de tratamento para essas doenças envolve a aplicação de

fungicidas sintéticos. Contudo, nos últimos anos, a demanda por tratamentos

alternativos tem crescido, com destaque para o uso de biopesticidas, produtos

desenvolvidos a partir de plantas, microrganismos e insetos. Este trabalho teve

como objetivo investigar a presença dos compostos bioativos (4Z)-lachnophyllum

lactona, (4Z,8Z)-matricaria lactona e (2Z,8Z)-matricaria ester nos espécimes

brasileiros da planta Conyza canadensis, bem como avaliar a atividade antifúngica

dessas substâncias isoladas contra diversos fungos associados a doenças pós-

colheita de frutas. Por cromatografia flash preparativa foi possível isolar a

(4Z)-lachnophyllum lactona e a (4Z,8Z)-matricaria lactona a partir de extratos da

planta obtidos com diclorometano. Os compostos foram caracterizados por

GC-MS/MS, NMR 1H e 13C, 1H-1H COSY e 1H-13C HSQC. Foram realizados ensaios

de difusão em disco com 10 fungos filamentosos causadores de doenças pós-

colheita em frutas. Os fungos Aspergillus niger, Cladosporium spp. e Penicillium

digitatum se mostraram susceptíveis ao tratamento e, para eles, a concentração

mínima inibitória dos compostos variou de 32 a 64 µg mL-1. Também foi

desenvolvido um método de extração empregando água quente pressurizada, no

qual foram otimizados os parâmetros de temperatura (100 °C), tempo de ciclo

(1 min) e número de ciclos (quatro). Com essa técnica foi possível obter um

rendimento de 1,46 mg g-1 e 0,24 mg g-1 para a (4Z)-lachnophyllum lactona e a

(4Z,8Z)-matricaria lactona, respectivamente. O extrato aquoso da Conyza

canadensis pode ser aplicado diretamente nos frutos com a vantagem de não conter

resíduos de solventes orgânicos tóxicos.

xv

ABSTRACT

CONYZA CANADENSIS: DETERMINATION OF BIOACTIVE

COMPOUNDS AND EVALUATION OF ANTIFUNGAL ACTIVITY

Brazil is one of the largest fruit producers in the world. Nevertheless, it is estimated

that postharvest diseases can lead to losses of up to 50% in its production. The most

common treatment for these diseases involves the application of synthetic

fungicides. Nonetheless, in recent years, the demand for alternative treatments has

increased, especially for the use of biopesticides, products developed from plants,

microorganisms and insects. This study aimed to investigate the presence of the

bioactive compounds (4Z)-lachnophyllum lactone, (4Z,8Z)-matricaria lactone and

(2Z,8Z)-matricaria ester in Brazilian specimens of the weed Conyza canadensis, as

well as to evaluate the antifungal activity of these isolated substances against

several fungi associated with postharvest diseases of fruits. With the use of

preparative flash chromatography it was possible to isolate (4Z)-lachnophyllum

lactone and (4Z,8Z)-matricaria lactone from plant extracts obtained with

dichloromethane. The compounds were characterized by GC-MS/MS, NMR 1H e

13C, 1H-1H COSY and 1H-13C HSQC. Disk diffusion assays were performed in order

to investigate the activity of the isolated compounds against 10 filamentous fungi

regarded as common postharvest pathogens of fruits. Aspergillus niger,

Cladosporium spp. and Penicillium digitatum proved susceptible to the treatment

and, for them, the minimum inhibitory concentration of the compounds varied from

32 to 64 µg mL-1. An extraction method using pressurized hot water was also

developed, in which the parameters of temperature (100 ° C), cycle time (1 min) and

number of cycles (four) were optimized. By using this technique, it was possible to

obtain a yield of 1.46 mg g-1 and 0.24 mg g-1 for the (4Z)-lachnophyllum lactone and

(4Z,8Z)-matricaria lactone, respectively. The aqueous extract of Conyza canadensis

can be applied directly on fruits with the advantage of not containing residues of toxic

organic solvents.

xvii

Sumário LISTA DE TABELAS ................................................................................................................. xix

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. xxi

I. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1

I.1. DOENÇAS PÓS-COLHEITA ...................................................................................... 3

I.2. TRATAMENTOS ALTERNATIVOS ............................................................................ 6

I.2.1. Controle Biológico ................................................................................................ 7

I.2.2. Indutores de resistência....................................................................................... 8

I.2.3. Pesticidas Bioquímicos ........................................................................................ 8

I.2.4. Biopesticidas e o Mercado .................................................................................. 9

I.3. A PLANTA Conyza canadensis ................................................................................ 10

I.3.1. Descrição ............................................................................................................ 10

I.3.2. Efeitos alelopáticos ............................................................................................ 11

I.3.3. Ação antifúngica ................................................................................................. 13

I.3.4. Bioativos de interesse do trabalho .................................................................... 14

I.4. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO ..................................................................................... 16

I.4.1. Técnicas convencionais..................................................................................... 17

i. Maceração .............................................................................................................. 17

ii. Extração em aparelho de Soxhlet ........................................................................ 18

iii. Hidrodestilação ....................................................................................................... 19

I.4.2. Técnicas não-convencionais ............................................................................. 20

i. Extração com fluido supercrítico (SFE) ................................................................ 20

ii. Extração assistida por ultrassom (UAE) .............................................................. 21

iii. Extração assistida por micro-ondas (MAE) ......................................................... 22

iv. Extração com líquido pressurizado (PLE) e extração com água quente

pressurizada (PHWE) .................................................................................................... 23

I.5. IMPORTÂNCIA DO PRESENTE TRABALHO ........................................................ 26

II. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 29

III. PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................. 33

III.1. EQUIPAMENTOS ...................................................................................................... 35

III.2. REAGENTES E SOLVENTES .................................................................................. 35

III.3. PADRÕES ANALÍTICOS E COMPOSTOS ISOLADOS ........................................ 36

III.4. PROCEDIMENTOS ................................................................................................... 36

xviii

III.4.1. Coleta de plantas. .............................................................................................. 36

III.4.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos extratos. ............ 36

III.4.3. Caracterização das substâncias puras isoladas. ............................................ 38

III.4.4. Teste preliminar: extração dos analitos de interesse da planta por PHWE. . 39

III.4.5. Otimização da extração via PHWE................................................................... 39

III.4.5.1. Temperatura ................................................................................................ 40

III.4.5.2. Tempo de ciclo............................................................................................ 40

III.4.5.3. Número de ciclos ........................................................................................ 40

III.4.5.4. Repetitividade do procedimento de extração ........................................... 41

III.4.6. Determinação dos analitos de interesse nos extratos purificados ................. 41

III.4.7. Bioensaios .......................................................................................................... 43

III.4.7.1. Ensaios de difusão em disco ..................................................................... 44

III.4.7.2. Concentração Mínima Inibitória ................................................................. 45

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 47

IV.1. Coleta das plantas ................................................................................................. 49

IV.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos extratos ................. 50

IV.3. Caracterização das Substâncias Puras Isoladas ................................................ 51

IV.3.1. Análises por GC-MS e GC-MS/MS................................................................... 51

IV.3.2. Análises por NMR de 1H e 13C .......................................................................... 55

IV.3.3. Análises por NMR 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY ............................................. 59

IV.4. Teste preliminar para a extração dos bioativos da planta por PHWE ............... 64

IV.5. Curvas analíticas .................................................................................................... 65

IV.6. Otimização da extração via PHWE ...................................................................... 67

IV.6.1. Temperatura ....................................................................................................... 67

IV.6.2. Tempo de ciclo ................................................................................................... 69

IV.6.3. Número de ciclos ................................................................................................ 71

IV.7. Bioensaios .............................................................................................................. 74

IV.7.1. Ensaio de difusão em disco .............................................................................. 74

IV.7.2. Concentração Mínima Inibitória ........................................................................ 75

V. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................. 79

V.1. Conclusões ................................................................................................................. 81

V.2. Perspectivas Futuras ................................................................................................. 82

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 85

xix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Concentrações em que cada extrato obtido foi analisado por GC-FID. 43

Tabela 2 - Fungos utilizados nos bioensaios para avaliação da atividade antifúngica

dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. ....................................................................... 44

Tabela 3 - Deslocamentos químicos dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos ensaios

de NMR de 1H e 13C. ............................................................................................ 55

Tabela 4 - Parâmetros da regressão linear referente às curvas analíticas obtidas e

seus respectivos desvios....................................................................................... 66

Tabela 5 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes temperaturas e

rendimento global da extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g). ....... 68

Tabela 6 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes tempos de ciclo e

rendimento global da extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g). ....... 70

Tabela 7 - Valores de CV intra e inter-ensaio para 4Z-LL e 4Z,8Z-ML ................. 74

Tabela 8 - Resumo das atividades dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML contra

diferentes fungos associados a doenças pós colheita em frutas. .......................... 75

Tabela 9 - Atividade antifúngica (MIC) dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML obtida pelo

método de microdiluição em caldo. ....................................................................... 76

xxi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Exemplos de doenças pós-colheita quiescentes. Podridão cinzenta

(Botrytis cinerea) em morangos (esq.) (adaptado de REIS; COSTA, 2011) e

antracnose (Colletotrichum spp.) em manga (dir.) (adaptado BATISTA, 2010). ..... 5

Figura 2 - Exemplos de doenças pós-colheita. Podridão mole (Rhizopus stolonifer)

em pêssegos (esq.) (adaptado de BAGGIO, 2012) e podridão azul e verde

(Penicillium spp.), respectivamente, em limões (dir.) (adaptado de HOLMES,

2009). ...................................................................................................................... 5

Figura 3 - Espécime de Conyza canadensis ........................................................ 11

Figura 4 – Compostos obtidos a partir dos extratos da Conyza canadensis ........ 15

Figura 5 - Esquema de equipamento para PHWE no modo dinâmico (adaptado de

TEO et al., 2010). .................................................................................................. 24

Figura 6 - Variação da constante dielétrica da água com a temperatura em

diferentes pressões: □ 33 bar; ■ 129 bar; ◊ 322 bar (adaptado de SMITH, 2002) 25

Figura 7 - Disposição do inóculo e dos discos de celulose na placa de Petri para o

ensaio de difusão em disco. .................................................................................. 45

Figura 8 - Teste de microdiluição em caldo para a determinação de MIC. ........... 46

Figura 9 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z-LL (acima) e seu

respectivo espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm).

Programa de temperatura de 120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240

°C, temperatura da transferline 200 °C, temperatura da fonte 230 °C e temperatura

do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:100, vazão do gás de

arraste 1 mL min-1 e concentração da amostra 200 μg mL-1. ................................ 52

Figura 10 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z,8Z-ML (acima) e seu

respectivo espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm).

Programa de temperatura de 120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240

°C, temperatura da transferline 200 °C, temperatura da fonte 230 °C e temperatura


arraste 1 mL min-1 e concentração da amostra 200 μg mL-1. ................................ 53

Figura 11 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 162 (composto 4Z-LL). ................. 54

xxii

Figura 12 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 160 (composto 4Z,8Z-ML). .......... 55

Figura 13 - Espectro de NMR 1H a 400 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL. 56

Figura 14 - Espectro de NMR 13C a 100 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.56

Figura 15 – Espectro de NMR 1H a 500 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-

ML. ........................................................................................................................ 57

Figura 16 – Espectro de NMR 13C 125 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.

.............................................................................................................................. 58

Figura 17 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z-LL. ................. 60

Figura 18 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z,8Z-ML. ........... 61

Figura 19 - Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z-LL. ................... 63

Figura 20 -Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z,8Z-ML. .............. 64

Figura 21 – Cromatograma (TIC) obtido em análise de GC-MS de um extrato feito

via PHWE. Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura de

90-150 °C (3 °C min-1), 150-280 °C (20 °C min-1) e 280 °C por 5 minutos.

Temperatura do injetor 240 °C, temperatura da transferline 200 °C e temperatura


arraste 1 ml min-1 e concentração da amostra 1,0 mg mL-1. ................................. 65

Figura 22 - Cromatograma obtido em análise de GC-FID de um extrato feito via

PHWE (100 °C, 3 ciclos de 20 minutos). Coluna HP-5 (30 m x 320 μm x 0,25 μm).

Programa de temperatura de 115 °C (19 minutos), 115-200 °C (20 °C min-1.

Temperatura do injetor 200 °C e temperatura do detector 300 °C. Volume de

injeção 1 μL, split 1:50, vazão do gás de arraste 2 mL min-1. Concentração da

amostra 1,0 mg mL-1, concentração do padrão interno (cumarina) 15 µg mL-1 ..... 67

Figura 23 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML

nos extratos purificados em cada uma das temperaturas avaliadas (70, 90, 100,

110 e 130 °C). Teor dado em miligramas de composto por grama de planta. ...... 69

Figura 24 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML

nos extratos purificados em cada um dos tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e

30 min). Teor dado em miligramas de composto por grama de planta. ................ 71

Figura 25 – Proporção, em porcentagem, do composto 4Z-LL em cada ciclo

avaliado. ................................................................................................................ 72

xxiii

Figura 26 - Proporção, em porcentagem, do composto 4Z,8Z-ML em cada ciclo

avaliado. ................................................................................................................ 73

Figura 27 – Ensaios de difusão em disco mostrando um exemplo no qual o

composto não apresentou atividade antifúngica (fig. 27A) e um exemplo no qual o

composto apresentou atividade antifúngica (fig. 27B). .......................................... 75

1

I. INTRODUÇÃO

3

I.1. DOENÇAS PÓS-COLHEITA

O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo, com uma produção que,

em 2010, foi estimada em quase 39 milhões de toneladas, ficando atrás apenas da

China e da Índia (FAO, 2013). Dessa produção, cerca de 760 mil toneladas foram

exportadas no mesmo ano (IBRAF, 2011). No entanto, parte desta produção é

ameaçada pelas doenças pós-colheita, que ocasionam perdas quantitativas e

qualitativas (TERAO et al., 2008) em diversas etapas do processamento das frutas,

tais como: colheita, transporte, armazenagem e venda (COATES; JOHNSON, 1997;

PRUSKY, 2011). A porcentagem de perdas devido a doenças pós-colheita em frutas

é difícil de ser estimada, devido à escassez de dados, tanto para o Brasil quanto

para o mundo. Os poucos dados que existem fazem referência às perdas totais,

incluindo os descartes promovidos por consumidores e fornecedores e não

discriminam as perdas provocadas apenas por doenças pós-colheita. Estima-se

que, em países em desenvolvimento, essas perdas atinjam 50% da produção. Já

em países desenvolvidos, essa estimativa não ultrapassa os 23% (KADER, 2005;

PRUSKY, 2011), valor ainda alto, considerando-se que a produção de frutas é

medida em milhões de toneladas nos países com maior produção (FAO, 2013).

Sabe-se, no entanto, que as doenças pós-colheita são uma das principais

responsáveis pela perda de frutas ao longo da cadeia produtiva (PRUSKY, 2011;

SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS, 2014).

Uma diferença relevante entre países desenvolvidos e em desenvolvimento é

que, nos primeiros, as perdas ocorrem mais significativamente junto aos

revendedores e consumidores, principalmente devido à exigência dos compradores

por frutas esteticamente perfeitas. Já nos últimos, as perdas ocorrem nas fases de

colheita, pós-colheita e processamento, principalmente devido à falta de estrutura,

tecnologia e investimentos adequados (PRUSKY, 2011). As condições inadequadas

de armazenagem e de transporte podem ocasionar lesões nas frutas e permitir a

entrada de elementos patogênicos. Na maior parte dos casos, as perdas advêm de

doenças provocadas por fungos que se manifestam em condições propícias: baixo

pH, grande quantidade de água e nutrientes e debilidade do mecanismo de defesa

da fruta colhida (NUNES, 2012).

4

O impacto das doenças pós-colheita vai além da redução nos lucros das vendas

internas e das exportações. Com o crescimento populacional e o consequente

aumento da demanda global por alimentos, uma redução nas perdas provocadas

por essas doenças poderia diminuir a necessidade de se intensificar a produção de

frutas no futuro. Além disso, as perdas na pós-colheita representam não só um

desperdício das frutas em si, mas também do solo utilizado no cultivo, da água

utilizada na irrigação, da mão-de-obra no campo e de insumos agrícolas como

fertilizantes, defensivos e maquinário. Sendo assim, a redução das perdas na fase

de pós-colheita garante não só o lucro dos produtores e a maior disponibilidade de

alimentos, mas também o uso mais sustentável e eficiente dos recursos naturais

(PRUSKY, 2011). Além dos fatores econômicos e ambientais, as doenças pós-

colheita podem se mostrar um grande problema para a saúde humana, pois

determinados fungos, como aqueles dos gêneros Fusarium, Alternaria e Penicillium,

podem secretar micotoxinas, que são nocivas ao ser humano e podem apresentar

propriedades carcinogênicas (COATES; JOHNSON, 1997; LIU et al., 2013).

Doenças pós-colheita em frutas são causadas, geralmente, por fungos e

bactérias. Entretanto, o baixo pH da maioria das frutas inibe grande parte das

espécies de bactérias causadoras de podridões, tornando as doenças bacterianas

menos relevantes nesse campo. As doenças pós-colheita podem ser classificadas

de acordo com a forma com que se desenvolvem na fruta. Existem as doenças

quiescentes, nas quais o patógeno se instala na fruta antes da colheita, mas

permanece num estado de dormência até que os tecidos do hospedeiro passem por

uma mudança fisiológica que propicie a reativação da infecção. Essa mudança pode

ser provocada, por exemplo, pelo processo de amadurecimento do fruto após a

colheita. Exemplos desse tipo de doença são a podridão cinzenta, causada pelo

fungo Botrytis cinerea e a antracnose, causada por fungos do gênero Colletotrichum

em frutas tropicais (Figura 1) (COATES; JOHNSON, 1997; SIVAKUMAR;

BAUTISTA-BAÑOS, 2014).

5

Figura 1 - Exemplos de doenças pós-colheita quiescentes. Podridão cinzenta (Botrytis cinerea) em

morangos (esq.) (adaptado de REIS; COSTA, 2011) e antracnose (Colletotrichum spp.) em manga

(dir.) (adaptado de BATISTA, 2010).

Por outro lado, existem aquelas doenças que se instalam durante e após a

colheita, infectando o fruto a partir de lesões provocadas por choques mecânicos

ou por insetos. Os choques mecânicos ocorrem comumente na fase de colheita e

se apresentam na forma de cortes, abrasões e danos por pressão ou impacto. Como

exemplos desse tipo de doença, podemos citar a podridão (transit rot) causada pelo

fungo Rhizopus stolonifer e a podridão azul e verde provocada por fungos do gênero

Penicillium (Figura 2) (COATES; JOHNSON, 1997).

Figura 2 - Exemplos de doenças pós-colheita. Podridão mole (Rhizopus stolonifer) em pêssegos

(esq.) (adaptado de BAGGIO, 2012) e podridão azul e verde (Penicillium spp.), respectivamente,

em limões (dir.) (adaptado de HOLMES, 2009).

Uma das formas mais comuns de controle das doenças pós-colheita é a

aplicação de fungicidas sintéticos. Essa aplicação pode ocorrer tanto na fase de

pré-colheita quanto na fase de pós-colheita e o que determina o intervalo e o tempo

6

das aplicações é o tipo de infecção que se deseja combater. Normalmente, para as

infecções que se estabelecem nas frutas antes de elas serem colhidas, são

necessárias aplicações de sprays fungicidas já na fase de crescimento, aliadas a

aplicações regulares ao longo do desenvolvimento da fruta. Contra aquelas

infecções que se manifestam na fase de pós-colheita ou para os patógenos

quiescentes, a aplicação se dá, em geral, por imersão ou aspersão de soluções

fungicidas sobre a fruta já colhida (COATES; JOHNSON, 1997; SIVAKUMAR;

BAUTISTA-BAÑOS, 2014).

Durante os últimos 25 anos, esforços vêm sendo realizados no sentido de

reduzir o uso de fungicidas sintéticos, tanto para atender à crescente demanda do

mercado consumidor por produtos “verdes”, quanto para cumprir com as normas

cada vez mais rigorosas dos países importadores. Desde 1987, a ONU vem

demonstrando preocupações com relação ao uso de produtos químicos sintéticos

em alimentos, devido ao seu impacto negativo na saúde humana e no ambiente

(DROBY et al., 2009; LIU et al., 2013). Com o uso contínuo e indiscriminado dos

fungicidas sintéticos, o surgimento de cepas de fungos resistentes a esses

tratamentos convencionais são outra fonte de preocupação (NUNES, 2012), bem

como os danos ao ambiente causados pelo descarte das formulações fungicidas,

que podem atingir o solo e os corpos aquáticos (SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS,

2014). Assim, existe grande necessidade de se substituir os fungicidas sintéticos

por métodos alternativos de controle das doenças pós-colheita.

I.2. TRATAMENTOS ALTERNATIVOS

Existem diversos tratamentos alternativos para as doenças pós-colheita que

podem substituir completa ou parcialmente o uso de fungicidas sintéticos ou,

simplesmente, complementar sua ação. O controle do ambiente de armazenagem

(temperatura, umidade e porcentagem de O2) e as boas práticas de higiene ao longo

de todo o processo são fundamentais para a minimização das infecções nas frutas.

No entanto, esses tratamentos alternativos atuam somente retardando o

desenvolvimento das infecções, sem, de fato, eliminar os patógenos. Já os

7

tratamentos com calor e com radiação ionizante podem, eventualmente, matá-los,

mas, muitas vezes, os níveis de radiação e/ou calor exigidos para tal, são

prejudiciais às frutas, depreciando sua qualidade (COATES; JOHNSON, 1997).

Tratamentos mais sofisticados envolvem o uso de microrganismos antagonistas

(controle biológico), técnicas de indução de resistência e aplicação de pesticidas

bioquímicos (COATES; JOHNSON, 1997; COPPING; MENN, 2000; DUKE et al.,

2002; LIU et al., 2013; NUNES, 2012; SEIBER et al., 2014).

I.2.1. Controle Biológico

Os microrganismos antagonistas utilizados no chamado controle biológico de

doenças pós-colheita podem ser bactérias, leveduras ou até mesmo outros fungos

filamentosos, isolados a partir das mais diversas fontes (COATES; JOHNSON,

1997). A grande maioria dos agentes de controle biológico são, no entanto,

leveduras (DROBY et al., 2009). Elas são isoladas, principalmente, a partir da

superfície de frutas e vegetais, contudo, também podem ser obtidas a partir de

raízes, solos e água do mar (LIU et al., 2013). Seu mecanismo de ação envolve,

normalmente, competição por nutrientes e espaço com o fungo causador da doença

pós-colheita, todavia é sabido que outros mecanismos podem estar envolvidos,

como por exemplo, secreção de substâncias antimicrobianas e de enzimas,

parasitismo direto e indução de resistência na fruta. Ainda hoje, no entanto, o uso

de microrganismos antagonistas como forma de controle biológico para as doenças

pós-colheita é restrito, devido à inconsistência na eficácia dos produtos em

condições comerciais, dificuldades na produção em escala industrial, problemas no

registro junto às agências reguladoras e desafios na manutenção da viabilidade

celular (DROBY et al., 2009; LIU et al., 2013; NUNES, 2012; SHARMA; SINGH;

SINGH, 2009).

8

I.2.2. Indutores de resistência

Muitas vezes, as próprias plantas têm a capacidade de se defenderem contra

os elementos patogênicos, tanto por mecanismos já presentes em seu metabolismo

(resistência constitutiva), quanto por mecanismos ativados em resposta às

infecções (resistência induzida). Contudo, conforme o fruto amadurece, em geral, a

concentração dos compostos com ação antifúngica produzidos pelo metabolismo

da planta tende a decair, passando a níveis abaixo da concentração letal. As

técnicas de indução de resistência operam no sentido de estimular a produção

dessas substâncias antifúngicas através do emprego de indutores químicos

(quitosana, ácido salicílico), biológicos (antagonistas microbianos) e físicos (calor,

radiação UV). Essas técnicas, entretanto, podem produzir frutas menos palatáveis

e saudáveis, impróprias para o consumo devido às elevadas concentrações de

compostos antifúngicos. A indução também está associada a riscos ecológicos,

podendo afetar insetos polinizadores e micróbios benéficos presentes nas plantas,

além de reduzir a capacidade das plantas de competir por recursos ou responder a

ataques de herbívoros (CIPOLLINI; HEIL, 2010; COATES; JOHNSON, 1997;

TERRY; JOYCE, 2004).

I.2.3. Pesticidas Bioquímicos

Os pesticidas bioquímicos se destacam como uma das mais importantes e

promissoras alternativas para o tratamento de doenças pós-colheita. Eles são

substâncias de ocorrência natural, desenvolvidos a partir de compostos bioativos

obtidos em plantas, microrganismos e insetos, podendo ser utilizados para o

controle de pragas de diversas naturezas, atuando como fungicidas, algicidas,

herbicidas, entre outros (COPPING; MENN, 2000). Os compostos bioativos

presentes em plantas são, normalmente, metabólitos secundários, ou seja,

substâncias que não possuem função reconhecida na manutenção dos processos

vitais da planta (crescimento, reprodução, etc.), mas são utilizados por ela como

estratégia de defesa natural contra diversas pragas (AZMIR et al., 2013;

MIRESMAILLI; ISMAN, 2014; ZHONG, 2011).

9

Muitas vezes, os pesticidas bioquímicos apresentam mecanismos de ação

diferentes dos pesticidas convencionais. A elucidação desses mecanismos torna

possível o surgimento de novos tratamentos fitossanitários, uma vez que é comum

que a estrutura molecular de um produto natural sirva de base para o

desenvolvimento de novas moléculas com ação pesticida. O uso de produtos

naturais contribui, ainda, para minimizar o desenvolvimento de pragas resistentes

aos tratamentos convencionais, sendo possível sua aplicação em regimes de

tratamento alternados com os pesticidas sintéticos. Como outras vantagens, os

pesticidas bioquímicos apresentam uma alta especificidade contra os organismos

alvo e um período de carência mais curto do que os agrotóxicos convencionais, o

que torna sua aplicação mais sustentável e amigável ao ambiente e menos

agressiva aos organismos não alvo (COPPING; MENN, 2000; DUKE et al., 2002;

SEIBER et al., 2014).

I.2.4. Biopesticidas e o Mercado

A Agência de Proteção Ambiental dos EUA (US EPA) divide o termo

biopesticida em três principais categorias: i) pesticidas bioquímicos, ii) pesticidas

microbianos (controle biológico) e iii) protetores incorporados à planta (PIP). As

duas primeiras categorias foram abordadas acima e, quando o termo “biopesticida”

for empregado neste trabalho, serão a elas e, principalmente aos pesticidas

bioquímicos, que estaremos nos referindo. Já os PIP, que são substâncias

pesticidas que uma planta passa a produzir a partir de material genético incorporado

a ela, não são considerados biopesticidas pela maioria das outras agências

regulatórias do mundo e, por isso, foram excluídos dessa discussão (SEIBER et al.,

2014). No Brasil, não foi encontrada definição oficial para o termo “biopesticida” no

site das principais agências regulatórias – MAPA, ANVISA e IBAMA.

Economicamente, os biopesticidas acompanham a tendência cada vez maior de

se produzir alimentos “orgânicos”, cujas vendas vêm crescendo mundialmente,

principalmente em países mais desenvolvidos. Além disso, esses compostos

oferecem aos países emergentes uma oportunidade para que eles desenvolvam

10

seus próprios pesticidas, com a vantagem de que, normalmente, produtos naturais

não possuem normas tão rigorosas quanto os compostos sintéticos para seu uso e

registro (COPPING; MENN, 2000; DUKE et al., 2002; SEIBER et al., 2014).

Atualmente, o mercado de biopesticidas no Brasil está se expandindo. O país

é o maior consumidor de agrotóxicos do mundo, mas o interesse dos produtores e

consumidores em tecnologias mais amigáveis ao meio ambiente vem crescendo.

Em 2012, os biopesticidas foram responsáveis por 1% do faturamento no setor de

defensivos agrícolas, o que corresponde a um valor de 97 milhões de reais. No

entanto, a estimativa da Associação Brasileira das Empresas de Controle Biológico

(ABCBio) é de que essa fatia chegue a 15% nos próximos 15 anos, principalmente

agora que grandes empresas, como a Monsanto, Bayer CropScience, Syngenta e

BASF estão apostando em investimentos no setor (RAMOS, 2013). Atualmente, no

país, segundo dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

(MAPA), estão registrados somente 22 produtos fitossanitários com uso aprovado

para agricultura orgânica (MAPA, 2014). Todos eles são constituídos por

microrganismos antagonistas, nenhum com ação fungicida, demonstrando que os

biopesticidas para esse fim são um nicho ainda inexplorado no mercado de

tratamentos alternativos para doenças pós-colheita, com muitas oportunidades de

crescimento.

I.3. A PLANTA Conyza canadensis

I.3.1. Descrição

Tendo em vista a importância do desenvolvimento de novos biopesticidas,

bem como a investigação do seu espectro de ação, uma pesquisa recente realizada

pela Embrapa Meio Ambiente e o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos

(USDA) apontou resultados promissores com a planta alelopática Conyza

canadensis (L.) Cronquist (QUEIROZ et al., 2012). Esta planta (Figura 3),

pertencente à família Asteraceae (ou Compositae), é originária da América do Norte,

mas amplamente distribuída pelo mundo, sendo encontrada no Brasil

principalmente nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste. Ela foi descrita pela

11

primeira vez por C. Linnaeus em 1753, na sua obra Species Plantarum, então com

o nome de Erigeron canadense. Conhecida popularmente como buva, é infestante

característica da entressafra, com seu desenvolvimento ocorrendo em áreas de

pouca cobertura vegetal ou pouca palhada. Dissemina-se por intermédio de

sementes de tamanho muito pequeno que são produzidas em grandes quantidades

e carregadas com facilidade pelo vento. Estima-se que uma única planta possa

produzir entre 100 mil a 200 mil sementes. C. canadensis infesta pomares, vinhas,

culturas de campo, tais como soja, milho e algodão, principalmente em culturas

resistentes a herbicidas, onde sistemas de plantio direto são empregados

(LAZAROTO; FLECK; VIDAL, 2008).

Figura 3 - Espécime de Conyza canadensis

I.3.2. Efeitos alelopáticos

Por ser uma planta alelopática, ou seja, por liberar substâncias conhecidas

como aleloquímicos que podem inibir o crescimento de plantas vizinhas (DEL

FABBRO; PRATI, 2015), a Conyza canandensis é uma fonte potencial de

compostos bioativos (DUKE et al., 2002). Suas propriedades alelopáticas têm sido

reportadas por estudos que, em geral, testam seus extratos aquosos (obtidos a frio)

contra outras plantas, verificando se ocorrem inibições na germinação da semente

e/ou no crescimento da plântula (broto).

12

Kobayashi et al. (1980), até onde sabemos, foram os primeiros a estudar o

potencial alelopático da C. canadensis. Estes pesquisadores estudaram os efeitos

inibitórios da fração hexânica oriunda da partição de extratos da planta obtidos com

metanol e verificaram que compostos acetilênicos, um dos quais presentes neste

trabalho, inibiram o crescimento de plântulas de arroz.

Shaukat, Munir e Siddiqui (2003) reportaram atividades inibitórias

provocadas pelo extrato aquoso da planta na germinação e no crescimento de

plântulas de tomate, rabanete, trigo, milho, milheto e feijão-da-china.

Gao et al. (2009) verificaram que os extratos aquosos provocaram os

mesmos efeitos em ensaios com pepino (Cucumis sativus), nabo (Brassica

campestres), capim-colchão (Digitaria sanguinalis), capim-arroz (Echinochloa

crusgalli) e bredo (Amaranthus retroflexus).

Marinov-Serafimov (2010) também reportou que esse mesmo tipo de extrato

apresentou efeitos inibitórios na germinação e no crescimento da plântula nas

espécies Glycine max (soja), Pisum sativum (ervilha) e Vicia sativa.

Hu e Zhang (2013), também realizando ensaios com os extratos aquosos da

planta, dessa vez obtidos tanto da parte aérea quanto da raiz, reportaram que houve

atividade inibitória na germinação, bem como redução no tamanho do broto, nas

seguintes espécies de ervas daninhas nativas: Plantago asiatica, Digitaria

sanguinalis e Youngia japônica. Houve inibição em todas as concentrações de

extrato testadas, no entanto não foram observados efeitos inibitórios significativos

na germinação ou no tamanho do broto quando os extratos foram testados contra a

própria C. canadensis, demonstrando que a planta não possui efeito autotóxico.

Uma tendência geral nestes trabalhos é a ausência de interesse em isolar e

identificar os compostos fitotóxicos. Apenas Kobayashi et al. (1980) identificaram

alguns compostos acetilênicos que apresentaram efeitos inibitórios. Mais

simplificadamente, Shaukat, Munir e Siddiqui (2003) consideraram que os efeitos

alelopáticos da C. canandensis estariam sendo causados, provavelmente, por

compostos fenólicos presentes no extrato aquoso (ácido vanílico, ácido gálico, ácido

siríngico e catecol). Eles não descartaram, contudo, a possibilidade de que outros

13

compostos não-fenólicos estariam contribuindo para os efeitos inibitórios

observados.

I.3.3. Ação antifúngica

Compostos bioativos também podem apresentar, além de efeitos fitotóxicos,

efeitos fungitóxicos (DUKE et al., 2002). Assim, também existem estudos que

aplicam os extratos de C. canandensis em ensaios contra diversos tipos de fungos.

Curini et al. (2003) reportaram que o óleo essencial da planta C. canadensis

inibiu o crescimento dos fungos fitopatogênicos Rhizoctonia solani, Fusarium solani

e Colletotrichum lindemuthianum em concentrações que variavam de 400 a 1600

mg/kg. Os ensaios antifúngicos foram realizados mediante incorporação do óleo

essencial em meio de cultura semifundente e comparação do diâmetro das culturas

neste meio e no meio de controle após determinados dias de incubação. Neste

trabalho, a composição do óleo essencial também foi determinada, evidenciando-

se o limoneno como composto majoritário, contudo, a atividade antifúngica não foi

atribuída a nenhum composto em específico.

Franzener et al. (2007) avaliaram a atividade antifúngica do hidrolato (fase

aquosa obtida na hidrodestilação da planta) contra o fungo Alternaria brassicae, que

causa doenças em plantas do gênero Brassica (couve, nabo, etc.). Para os ensaios,

o hidrolato foi incorporado em meio de cultura semifundente e foi avaliada a sua

capacidade de inibir a germinação de esporos do fungo. Neste teste, o hidrolato

demonstrou uma capacidade significativa na redução do tamanho dos tubos

germinativos, evidenciando a presença de compostos antifúngicos em sua

composição.

Mais recentemente, Veres et al. (2012) reportaram que óleos essenciais,

tanto da parte aérea quanto da raiz, da planta C. canadensis, obtidos por

hidrodestilação, apresentaram atividade contra diversos fungos patogênicos, entre

esses, Candida albicans, Candida glabrata, Candida kefyr, Candida parapsilosis,

Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Rhodotorula glutinis e Trichophyton

interdigitalis. Neste trabalho, o método de difusão em disco foi empregado para a

obtenção de dados semi-quantitativos (halo de inibição) acerca dos efeitos

14

antifúngicos dos óleos essenciais. Já para a quantificação desse efeito, a

concentração mínima inibitória (MIC) dos óleos foi determinada pelo método de

microdiluição em caldo, utilizando placa de Elisa. Os valores de MIC variaram de

1,25 a 20,00 µg mL-1.

Novamente, nos trabalhos abordados nesta revisão, não houve interesse em

investigar quais seriam os compostos com ação antifúngica presentes nos diversos

extratos avaliados. É nesse contexto que o trabalho de Queiroz et al. (2012) se

insere. Estes pesquisadores se ocuparam não só da investigação da ação

antifúngica de extratos da planta C. canadensis, como também da determinação de

quais substâncias estariam causando esse efeito. Os compostos identificados

constituem os bioativos de interesse do presente trabalho.

I.3.4. Bioativos de interesse do trabalho

No trabalho de Queiroz et al. (2012), foi realizado um fracionamento

sistemático guiado por bioensaio nos extratos da planta C. canadensis para

identificar os compostos fitotóxicos e fungitóxicos da sua parte aérea. Três

substâncias fungitóxicas, cujas estruturas estão mostradas na Figura 4, foram

identificadas: (4Z)-lachnophyllum lactona (4Z-LL), (4Z,8Z)-matricaria lactona

(4Z,8Z-ML) e (2Z,8Z)-matricaria éster (2Z,8Z-ME). Após terem sido isolados,

4Z-LL e 4Z,8Z-ML foram submetidos a ensaios contra os seguintes fungos

fitopatogênicos: Colletotrichum acutatum, Colletotrichum fragariae e Colletotrichum

gloeosporioides. Os resultados obtidos foram positivos. No estudo de dose-

resposta contra seis fungos fitopatogênicos, 4Z-LL foi mais ativo do que o fungicida

comercial contendo azoxistrobina contra os fungos Col. acutatum, Col. fragariae e

Col. gloeosporioides e com atividade próxima do fungicida comercial Captan contra

Col. gloeosporioides, enquanto que 4Z,8Z-ML foi menos ativo nessas situações

(QUEIROZ et al., 2012). O composto 2Z,8Z-ME já possuía atividade fungicida

reportada na literatura contra os fungos citados (MEEPAGALA et al., 2002).

Interessante ressaltar que as substâncias 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME já

foram reportadas nos óleos essenciais, tanto das raízes quanto da parte aérea da

C. canadensis e também nos extratos obtidos a partir de solventes orgânicos

15

(HRUTFIORD; HATHEWAY; SMITH, 1988; LIS; GÓRA, 2000; LIS; PIGGOTT;

GÓRA, 2003; TZAKOU et al., 2005; VERES et al., 2012; XIE; GAO; JIA, 2007), o

que demonstra a possibilidade de que esses compostos possam ser um dos

responsáveis pelas atividades antifúngicas observadas no óleo essencial e no

hidrolato obtidos a partir da planta (CURINI et al., 2003; FRANZENER et al., 2007;

VERES et al., 2012).

4Z-LL 4Z,8Z-ML 2Z,8Z-ME

Figura 4 – Compostos obtidos a partir dos extratos da Conyza canadensis.

O composto 2Z,8Z-ME foi reportado pela primeira vez na planta C.

canadensis nos trabalhos de Sørensen e Stavholt (1950). Nessa mesma década,

ele foi encontrado em 29 espécies do gênero Erigeron (classificação a qual

pertencia a C. canadensis anteriormente) (HOLME; SØRENSEN, 1954).

Entretanto, sua estrutura era conhecida desde 1941, quando foi isolado pela

primeira vez a partir da planta Matricaria indora L. (SØRENSEN; STENE, 1941).

O composto 4Z,8Z-ML foi encontrado pela primeira vez nas partes aéreas da

planta Matricaria caucasica em 1967 (BOHLMANN; MÖNCH; BLASZKIEWICZ,

1967). Sua estrutura foi desvendada a partir da estrutura de seu isômero (4E-8Z),

descoberto em 1957 (BOHLMANN; BURKHARDT; ZDERO, 1973). Até onde

sabemos, esse composto foi encontrado em extratos de C. canadensis pela primeira

vez em 1988, reportado nos trabalhos de Hrutfiord, Hatheway e Smith (1988).

O composto 4Z-LL foi reportado e isolado pela primeira vez em 1970, a partir

de extratos da parte aérea da própria planta C. canadensis (BOHLMANN;

BURKHARDT; ZDERO, 1973; BOHLMANN; ZDERO, 1970).

Mais recentemente, alguns dos compostos foram descritos em trabalhos

como o de Veres et al. (2012), em que os óleos essenciais da parte aérea e da raiz

da planta C. canadensis foram separados em coluna DB-5ms (30 m x 0,25 mm x

16

0,25 µm) e analisados por cromatografia a gás associada à espectrometria de

massas (GC-MS). No óleo obtido das partes aéreas da planta foram identificados

34 compostos, sendo o limoneno de teor majoritário (79,2%). Foi identificada a

presença do composto 2Z,8Z-ME (2,1%) e traços de 4Z,8Z-ML. Já o óleo obtido da

raiz apresentou, como componente majoritário, o composto 2Z,8Z-ME, com um teor

médio de 91,1%. Nesse óleo, a 4Z,8Z-ML estava presente com um teor médio de

2,4%.

I.4. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO

A eficiência na obtenção de moléculas bioativas a partir de plantas está

intimamente relacionada com a etapa de extração (AZMIR et al., 2013).

Considerada uma parte crucial da etapa de preparo de amostra, a extração pode

ser vista como a etapa inicial do processo de separação, possuindo baixa

seletividade, porém alta capacidade. A escolha da técnica de extração mais

apropriada tem grande influência na qualidade da análise e pode ser um fator

determinante na identificação e quantificação cromatográfica (SMITH, 2003). Desse

modo, pode-se dizer que a correta separação e caracterização de um composto

bioativo só podem ser atingidas mediante o emprego de um método de extração

adequado (AZMIR et al., 2013).

O objetivo das técnicas de extração, de uma maneira geral, é separar o

analito de interesse da sua matriz, utilizando, para tanto, um solvente que

proporcione o maior rendimento e seletividade possíveis. É necessário empregar

um método que minimize a presença de interferentes, independa de variações na

matriz, sendo robusto e reprodutível e concentre os analitos de interesse,

aumentando a sensibilidade do ensaio. A extração de produtos naturais pode ser

obtida por diversas técnicas, algumas delas convencionais, empregadas há mais de

100 anos, outras mais contemporâneas (AZMIR et al., 2013; SMITH, 2003).

17

I.4.1. Técnicas convencionais

As técnicas convencionais de extração normalmente envolvem o emprego de

calor e/ou agitação aliadas ao poder extrator de um determinado solvente. As

técnicas mais comuns são: maceração, extração em aparelho de Soxhlet e

hidrodestilação (AZMIR et al., 2013).

i. Maceração

A maceração envolve, primeiramente, a moagem da matéria-prima vegetal,

com o intuito de aumentar a superfície de contato entre a matriz e o solvente. O

material moído é, então, posto em contato com o solvente extrator, podendo haver

ou não o emprego de agitação (maceração dinâmica), aquecimento (digestão) e

renovação do solvente (remaceração) (AZMIR et al., 2013; SONAGLIO et al., 1999).

Conforme citado anteriormente, essa técnica foi empregada por diversos

trabalhos recentes com o intuito de investigar a presença de compostos alelopáticos

em extratos aquosos da planta C. canadensis (GAO et al., 2009; HU; ZHANG, 2013;

MARINOV-SERAFIMOV, 2010; SHAUKAT; MUNIR; SIDDIQUI, 2003). Além da

água, solventes orgânicos também são empregados na maceração. Por exemplo,

nos estudos pioneiros acerca da alelopatia da planta C. canadensis realizados por

Kobayashi et al. (1980), a extração da planta macerada foi realizada com metanol

e, mais recentemente, Queiroz et al. (2012) obteve compostos bioativos dessa

mesma planta a partir de extrações realizadas com diclorometano.

A maceração é uma técnica de extração de baixo custo (AZMIR et al., 2013),

no entanto, diversos trabalhos buscam substituí-la devido ao seu elevado tempo de

extração (CHAN et al., 2011). Por exemplo, no trabalho de Jacques et al. (2007), a

extração de compostos da planta Ilex paraguarienses por maceração foi comparada

com a técnica de extração assistida por ultrassom (UAE). O trabalho mostrou que a

técnica de maceração obteve rendimento semelhante à UAE quando metanol foi

empregado (14,4 e 12,6% (m/m), respectivamente). Contudo, enquanto a extração

por UAE foi realizada em apenas 180 min, a maceração requereu 10 dias para obter

18

os mesmos resultados, o que demonstra sua desvantagem com relação ao tempo

de extração.

ii. Extração em aparelho de Soxhlet

A extração em aparelho de Soxhlet foi proposta pelo químico alemão Franz

Ritter von Soxhlet em 1879, primariamente com o intuito de extrair lipídeos. Hoje em

dia, é utilizada para extrair diversos compostos naturais presentes em matrizes

sólidas com o emprego de solventes voláteis. Nesta técnica, o solvente extrator é

aquecido no frasco de destilação e condensado sobre o cartucho poroso contendo

a matriz sólida. Quando o solvente atinge a altura do sifão, ele é sifonado de volta

para o frasco de destilação carregando consigo os solutos extraídos, e o processo

recomeça. Como o solvente é reciclado continuamente, a amostra está sempre em

contato com solvente renovado, possibilitando uma extração altamente eficiente

utilizando-se uma quantidade reduzida de solvente. A extração via Soxhlet é

comumente empregada como modelo de comparação para avaliação da eficiência

de outros métodos de extração (AZMIR et al., 2013; FALKENBERG; SANTOS;

SIMÕES, 1999; SMITH, 2003).

Apesar de não terem sido encontrados exemplos na literatura da aplicação

desta técnica na obtenção de extratos da planta C. canadensis, é possível encontrar

diversos trabalhos comparando o uso do aparelho de Soxhlet a outros métodos de

extração na obtenção de compostos bioativos a partir de plantas (AZMIR et al.,

2013). Exemplo disso é o trabalho de Herzi et al. (2013), que reportou o rendimento,

o tempo de extração e a composição de extratos das folhas de Tetraclinis articulata

obtidos por extração via Soxhlet com etanol ou hexano. Estes extratos foram

comparados com aqueles obtidos por hidrodestilação e extração com fluido

supercrítico (SFE). Foi demonstrado que a extração por Soxhlet levou aos maiores

rendimentos (21,2 – 40,4 g kg-1) quando comparada à hidrodestilação (0,6 g kg-1) e

à SFE (0,6 g kg-1). No entanto, seu tempo de extração foi o mais longo de todos,

durando 480 minutos contra 180 minutos da hidrodestilação e 30 minutos da SFE.

Foi também o processo menos seletivo, extraindo não só componentes voláteis,

mas também compostos de maior massa molecular, o que explica o seu maior

19

rendimento. Outras desvantagens apontadas foram a presença de solvente residual

nos extratos obtidos por Soxhlet e uma possível degradação dos compostos de

interesse (antioxidantes) pela temperatura empregada na extração.

iii. Hidrodestilação

A hidrodestilação é uma técnica de extração empregada na obtenção do óleo

essencial de plantas. Normalmente, esses óleos são ricos em compostos bioativos

que apresentam atividade antimicrobiana, alelopática, antifúngica e antioxidante,

atuando como defensivos naturais dos vegetais. Em escala laboratorial, utiliza-se

um aparato denominado Clevenger, no qual partes da planta (folhas e/ou raízes),

usualmente frescas, são aquecidas em um frasco de destilação juntamente com

água até a temperatura de ebulição. Os óleos voláteis da planta são arrastados pelo

vapor d’água e coletados em um separador, após sua passagem pelo condensador.

Em contrapartida à simplicidade da técnica, a temperatura elevada pode degradar

determinados compostos termolábeis e ocasionar a perda de substâncias mais

voláteis (AZMIR et al., 2013; HERZI et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011;

SIMÕES; SPITZER, 1999; SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS, 2014).

Esta técnica foi empregada em estudos avaliando a atividade antifúngica de

compostos bioativos da planta C. canandensis. Conforme citado anteriormente,

Curini et al. (2003) e Veres et al. (2012) obtiveram o óleo essencial da planta,

submetendo-o a bioensaios contra diversos fungos patogênicos e fitopatogênicos.

Já Franzener et al. (2007) empregou o hidrolato, fração rica em compostos

hidrofílicos da planta, em ensaios com a mesma finalidade.

Apesar do uso recorrente de óleos essenciais da parte aérea da planta em

bioensaios contra fungos, o baixo rendimento normalmente obtido pela técnica de

hidrodestilação (COSTA et al., 2012; HERZI et al., 2013; JERKOVIC et al., 2007)

aliado às baixas concentrações encontradas para os compostos de interesse deste

trabalho nos óleos essenciais (< 3,0%) (HRUTFIORD; HATHEWAY; SMITH, 1988;

LIS; GÓRA, 2000; LIS; PIGGOTT; GÓRA, 2003; VERES et al., 2012) torna a

escolha da técnica desvantajosa para a aplicação desejada neste trabalho.

20

I.4.2. Técnicas não-convencionais

As técnicas convencionais abordadas anteriormente possuem desvantagens

como o uso excessivo de solventes, a baixa seletividade e o tempo de extração

prolongado. Para superar essas dificuldades, técnicas mais sofisticadas têm sido

desenvolvidas e aplicadas, destacando-se a extração por fluido supercrítico (SFE),

a extração assistida por ultrassom (UAE), a extração assistida por micro-ondas

(MAE) e a extração com líquido pressurizado (PLE), da qual deriva a técnica de

extração com água quente pressurizada (PHWE) (AZMIR et al., 2013; HENG et al.,

2013).

i. Extração com fluido supercrítico (SFE)

A SFE emprega um fluido supercrítico, usualmente CO2, como solvente

extrator. A viscosidade e tensão superficial baixas e o alto coeficiente de difusão

dos fluidos supercríticos facilitam sua penetração na matriz, aumentando,

consequentemente, a transferência de massa e a eficiência da extração. A

capacidade de extração do fluido supercrítico pode ser modificada por alterações

na pressão e na temperatura de operação e o sistema pode trabalhar, inclusive, a

temperaturas ambientes, permitindo extração de compostos termolábeis. Outra

vantagem é a facilidade no descarte do CO2, que não gera impactos ao ambiente e

à saúde humana, podendo ser reciclado no processo. As desvantagens da técnica

são o alto custo dos equipamentos de alta pressão e a baixa eficiência na extração

de compostos mais polares, mesmo com a adição de modificadores, como o

diclorometano, ao CO2 (AZMIR et al., 2013; HENG et al., 2013).

Costa et al. (2012) investigaram o perfil químico de extratos das folhas de

Lavandula viridis obtidos por SFE com CO2, comparando-o com o do óleo essencial

obtido por hidrodestilação. Ambos os extratos se mostraram ricos em monoterpenos

oxigenados, mas o rendimento global das extrações via SFE foi maior, variando de

3,41 a 9,27% (m/m), enquanto o da hidrodestilação foi de apenas 0,53% (m/m).

Contudo, foi observado que uma variedade maior de compostos estava presente

nos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação.

21

Conforme citado anteriormente, no trabalho de Herzi et al. (2013), o extrato

das folhas de T. articulata obtido por SFE apresentou um dos menores rendimentos

globais (1,6 g/kg). Contudo, foi o extrato com a maior atividade antioxidante,

indicando alta seletividade para compostos com tal ação. A SFE foi, ainda, o

processo de extração mais rápido (30 min) em comparação com Soxhlet (480 min)

e hidrodestilação (180 min).

Ambos os trabalhos reforçam uma característica marcante da SFE, que é a

seletividade, uma vez que o poder de solvatação do fluido supercrítico pode ser

ajustado facilmente por mudanças na temperatura e na pressão do processo

(AZMIR et al., 2013).

ii. Extração assistida por ultrassom (UAE)

A UAE faz uso do fenômeno de cavitação provocado pelas ondas de

ultrassom para aumentar a eficiência da extração com solvente. Quando a onda

passa pelo meio líquido, ela cria pontos de expansão e compressão que levam à

formação, crescimento e colapso de bolhas. Desse processo, surgem forças de

cisalhamento que, associadas a efeitos mecânicos e térmicos, atuam destruindo

paredes celulares e reduzindo o tamanho das partículas da matriz, aumentando a

transferência de massa e a eficiência do processo de extração. As vantagens dessa

técnica estão relacionadas com a redução no tempo e na temperatura de extração

e também no uso de solventes. No entanto, a eficiência da técnica tem se mostrado

variável, ficando abaixo da dos métodos convencionais em algumas matrizes. Outro

problema envolvendo a UAE está na formação de radicais livres pelos efeitos da

cavitação, o que pode ocasionar a degradação dos analitos de interesse (AZMIR et

al., 2013; HENG et al., 2013; VILKHU et al., 2008; ZHANG et al., 2015).

No trabalho de Both, Chemat e Strube (2014), o emprego de UAE na extração

de polifenóis a partir de chá preto (Camellia sinensis) aumentou em 15% a

quantidade desses analitos no extrato, quando comparado com a técnica de

maceração convencional. Também foi detectado uma redução no tamanho das

partículas, o que pode ter favorecido a extração devido ao aumento da superfície

22

de contato entre o solvente e a matriz. Já no trabalho de Hossain et al. (2012), foi

reportado que, após otimização, a UAE aumentou significativamente os

rendimentos de diversos compostos antioxidantes extraídos de manjerona

(Origanum majorana) quando comparada à maceração tradicional.

No entanto, no trabalho de Yan et al. (2010), a UAE foi menos eficiente na

extração de compostos bioativos das raízes de Astragalus membranaceus que a

extração da raiz macerada feita sob refluxo com o mesmo solvente – etanol:água

(80:20 v/v).

iii. Extração assistida por micro-ondas (MAE)

As micro-ondas geram o calor necessário para a extração ao interagirem com

os componentes polares da matriz através de mecanismos de condução iônica e

rotação de dipolos. Com a temperatura elevada, os solutos são separados da matriz

e, em seguida, se difundem e são liberados para o solvente. Os principais fatores a

serem controlados para garantir a eficiência da extração são a temperatura e o tipo

de solvente empregado, no entanto a frequência e a duração da radiação também

devem ser considerados. Na extração de compostos bioativos, a MAE apresenta

maior rendimento, seletividade e rapidez quando comparada às técnicas de

extração convencionais e até mesmo às não-convencionais, podendo ser utilizada

tanto com água quanto com solventes orgânicos. Seu custo é moderado, sendo

consideravelmente mais baixo, por exemplo, que a técnica de SFE. As

desvantagens da técnica estão relacionadas com a limitação da polaridade do

solvente a ser empregado, já que solventes muito apolares são menos afetados

pela radiação. Além disso, a técnica apresenta baixa seletividade e, por isso, etapas

posteriores, como a extração líquido-líquido (LLE), podem ser necessárias para a

purificação de seus extratos (AZMIR et al., 2013; CHAN et al., 2011; HENG et al.,

2013).

Martino et al. (2006) reportaram que, na extração de cumarina e compostos

correlatos das flores de Melilotus officinalis, a MAE apresentou ganhos não só em

tempo, mas também em eficiência com relação às extrações realizadas por UAE e

por Soxhlet. Para a cumarina, por exemplo, a MAE levou a um rendimento de

23

3,98 mg g-1 em 10 minutos de extração, enquanto a UAE levou a 3,57 mg g-1 em

60 minutos e Soxhlet 2,16 mg g-1 em 8 horas.

Dahmoune et al. (2015) realizaram extração de ácido gálico e outros

polifenóis em folhas de Myrtus communis. A extração por MAE, empregando uma

mistura de etanol e água, foi otimizada e comparada com os rendimentos obtidos

em extrações feitas por UAE e por maceração sob aquecimento. A MAE levou aos

maiores rendimentos tanto na extração de fenóis totais, quanto na de taninos

condensados e flavonoides. Também houve ganho de tempo, uma vez que a

extração por MAE foi executa em 1 minuto, comparada com a UAE e a maceração,

que levaram 15 e 120 minutos, respectivamente.

iv. Extração com líquido pressurizado (PLE) e extração com água quente

pressurizada (PHWE)

A PLE, introduzida pela Dionex Corporation em 1995, é uma técnica que se

utiliza de solventes a altas temperaturas e pressões com o intuito de aumentar a

transferência de massa e a solubilidade dos analitos, obtendo maiores rendimentos

do que as técnicas de extração em condições ambientes. No caso da água ser o

solvente extrator, a técnica é denominada PHWE (do inglês, Pressurized Hot Water

Extraction). A técnica opera em duas modalidades: dinâmica ou estática. No modo

dinâmico, bombas de alta pressão promovem a passagem constante do solvente

através da cela de extração aquecida, que contém a amostra. São comumente

empregadas vazões entre 1,0 e 1,5 mL min-1 durante 20-30 minutos, com pressões

variando de 10 a 50 bar. No modo estático, a pressão pode ser utilizada numa faixa

maior, de 35 a 200 bar e a extração é feita em ciclos (5-15 minutos), com renovação

do solvente a cada ciclo. Ao final, purga-se a cela com algum gás inerte (e.g. N2),

para remover o solvente remanescente e evitar perdas. Em geral, nas extrações via

PLE e PHWE, a temperatura varia entre 25 e 200°C, mas valores maiores podem

ser empregados (AZMIR et al., 2013; HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER,

2011; TEO et al., 2010).

24

Existem equipamentos de PLE/PHWE disponíveis comercialmente, no

entanto é possível montá-los em laboratório (TEO et al., 2010). A Figura 5 mostra o

esquema de um equipamento de PHWE para extração em modo dinâmico.

Figura 5 - Esquema de equipamento para PHWE no modo dinâmico (adaptado de TEO et al.,

2010).

Em linhas gerais, a eficiência da PHWE está associada ao uso de

temperaturas elevadas na extração, o que diminui substancialmente a constante

dielétrica (ε) da água (Figura 6), reduzindo sua polaridade. Isso faz com que a água

se torne capaz de solubilizar compostos com caráter mais apolar. Além disso, o

aumento na temperatura da água diminui a sua viscosidade, facilitando a

penetração do solvente na matriz e melhorando a remoção dos analitos. Ocorre

também uma diminuição na tensão superficial da água, facilitando a formação de

cavidades de solvente dentro da matriz e permitindo que os analitos se solubilizem

mais rapidamente. Outro fator que influencia a eficiência da técnica, porém em

menor extensão que a temperatura, é a aplicação de pressões elevadas. A pressão

mantem o solvente em seu estado líquido, auxilia na penetração do solvente no

poro da matriz e reduz a formação de bolhas (MUSTAFA; TURNER, 2011; TEO et

al., 2010).

A PHWE apresenta como vantagem a redução no uso de solventes

orgânicos, principalmente os clorados, atendendo à crescente demanda em busca

de técnicas mais sustentáveis e menos prejudiciais ao ambiente. A água é um

solvente de baixo custo, atóxico, altamente disponível e de descarte simples e

25

pouco impactante ao ambiente, o que torna a PHWE uma técnica de extração

atrativa e eficiente para matrizes como solos, alimentos e plantas. Outras vantagens

são a possibilidade de automação, a reprodutibilidade superior e a redução no

tempo e na quantidade de solvente necessários para a extração (AZMIR et al., 2013;

TEO et al., 2010).

Figura 6 - Variação da constante dielétrica da água com a temperatura em diferentes pressões:

□ 33 bar; ■ 129 bar; ◊ 322 bar (adaptado de SMITH, 2002)

As desvantagens da técnica são, principalmente, o alto custo do

equipamento devido às altas pressões necessárias, a degradação dos analitos pela

temperatura, e a eventual necessidade de empregar a extração líquido-líquido como

forma de purificar os extratos. Com relação ao custo, é possível mitigá-lo utilizando-

se equipamentos construídos no próprio laboratório (HENG et al., 2013; MUSTAFA;

TURNER, 2011; TEO et al., 2010). A degradação dos analitos pode ser contornada

empregando-se uma temperatura mais branda, ou até mesmo temperatura

ambiente na extração, como fizeram ONG et al. (2007), na extração de gastrodina

e álcool vanílico da planta Gastrodia elata em um equipamento de PLE dinâmico.

Aplicações recentes da técnica podem ser vistas, por exemplo, no trabalho

de Pérez et al. (2013), no qual foram analisados poluentes polialogenados em

diferentes plantas utilizando como técnicas de extração a PLE (com clean-up) e

UAE (com e sem clean-up). Para PLE, foram otimizadas a temperatura (60 °C), o

Temperatura (°C)

Consta

nte

die

létr

ica

26

agente de clean-up (Florisil + carbono grafitizado), o solvente (hexano:acetato de

etila 80:20 v/v) e o número de ciclos empregados (2 ciclos de 10 minutos). Quando

comparado a ambas as modalidades de UAE, a PLE apresentou melhores valores

de recuperação para os analitos avaliados em amostras de planta fortificadas e foi

a técnica escolhida para análise de amostras nas quais alguns dos poluentes foram,

de fato, encontrados.

Já no trabalho de del Valle et al. (2005), folhas de boldo-do-Chile (Peumus

boldus) foram submetidas a extração por PHWE, Soxhlet (metanol) e SFE. A

extração por PHWE levou ao maior rendimento (51,4% m/m) comparado às outras

técnicas avaliadas (Soxhlet com 36,6 % e SFE com média de 4,3% m/m). Uma

maior atividade antioxidante também foi encontrada nos extratos obtidos com

PHWE.

Outro exemplo de aplicação está no trabalho de Herrero et al. (2010), em que

a PLE (com etanol) e a PHWE foram empregadas em diversas temperaturas para

a extração de compostos bioativos da planta Rosmarinus officinalis. A eficiência da

técnica foi comparada com a extração por SFE e, a 200 °C, tanto a PLE quanto a

PHWE levaram aos maiores rendimentos (38,6 e 37,9% m/m, respectivamente),

quando comparados com o rendimento da SFE que foi de 6,5% m/m em sua melhor

condição. A atividade antioxidante dos extratos obtidos também foi avaliada, bem

como a quantidade de fenóis totais e os maiores valores determinados foram,

novamente, para os extratos da PHWE.

I.5. IMPORTÂNCIA DO PRESENTE TRABALHO

A importância desse trabalho reside na busca de conhecimentos acerca da

atividade fungitóxica de substâncias produzidas pela C. canadensis, o que pode

levar à obtenção de um produto viável para aplicações agrícolas e que apresente

melhorias com relação aos produtos comercialmente disponíveis, principalmente no

que se refere à sua eficácia e à sua toxicidade. Mais especificamente, embora seja

conhecida a atividade antifúngica dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME,

presentes na C. canadensis contra os fungos C. acutatum, C. fragariae e C.

27

gloeosporioides, ainda não se conhece a atividade contra os fungos Alternaria

alternata, Aspergillus niger, Botryosphaeria dothidea, Cladosporium sp., Fusarium

pallidoroseum, Lasiodiplodia theobromae e Penicillium digitatum. O controle destes

fungos é de grande importância na pós-colheita de vários tipos de frutas, tais como

uva, manga, melão, laranja, dentre outros (CAMARGO et al., 2011; TERAO et al.,

2008).

Este trabalho objetivou dar continuidade aos estudos de Queiroz et al. (2012)

com a C. canadensis utilizando, para tanto, espécimes da planta coletados no Brasil.

O foco foi estudar a viabilidade dos compostos bioativos puros e dos extratos

aquosos da planta como fungicidas naturais na agricultura. O uso do extrato possui

como vantagens: a maior facilidade de obtenção a partir das plantas, uma menor

probabilidade de danos à saúde humana e ao ambiente e um menor risco de

desenvolvimento de novos mecanismos de resistência devido ao uso contínuo, uma

vez que o extrato pode possuir diversos princípios ativos com efeito sinergético

(BAKKALI et al., 2008; BURT, 2004).

De modo a se obter extratos da planta que fossem viáveis para futuras

aplicações em frutas pós-colheita, optou-se pela técnica de PHWE para se realizar

as extrações, uma vez que os extratos gerados seriam aquosos e isso eliminaria a

presença de solventes tóxicos. Como a PHWE tem sido extensivamente empregada

na extração de compostos bioativos em plantas e também na obtenção de seus

óleos essenciais voláteis, apresentando uma eficiência semelhante ou maior à das

outras técnicas aqui abordadas (HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011;

TEO et al., 2010), esta técnica se mostra ideal para a aplicação desejada neste

trabalho. Este pensamento é reforçado, ainda, pelo grande interesse em se

substituir a extração por maceração, empregada em Queiroz et al. (2012), dado ser

este um método que consome tempo e envolve um maior número de etapas de

purificação, consumindo grandes volumes de solventes orgânicos tóxicos

(SIQUEIRA et al., 2011).

29

II. OBJETIVOS

31

O objetivo geral deste trabalho foi investigar a presença dos princípios ativos

descritos por Queiroz et al. (2012) nos espécimes brasileiros de C. canadensis, bem

como avaliar a atividade antifúngica dessas substâncias isoladas contra diversos

fungos associados à doenças pós-colheita de frutas.

Como objetivos específicos, pretendeu-se:

i. Isolar e identificar os compostos fungicidas presentes nos espécimes de C.

canadensis coletados no Estado de São Paulo.

ii. Desenvolver e otimizar um método para a extração dos princípios ativos com

a utilização da técnica de PHWE em um sistema de extração acelerada por

solvente (ASE® Dionex)

iii. Estabelecer um método analítico baseado em cromatografia a gás com

detecção por ionização em chama (GC-FID), a fim de determinar o teor dos

princípios ativos nos extratos das plantas coletadas.

iv. Submeter os princípios ativos puros a bioensaios para averiguação de sua

atividade antifúngica contra diversos fungos associados a doenças pós-

colheita em frutas.

v. Avaliar a concentração mínima inibitória dos princípios ativos para os fungos

que se mostraram susceptíveis ao tratamento.

33

III. PARTE

EXPERIMENTAL

35

III.1. EQUIPAMENTOS

o Banho de ultrassom Ultracleaner 700 (Unique, Brasil);

o Bomba de diafragma Vario® MZ 2C NT (Vacuubrand, Alemanha);

o Câmara de germinação BF2 CGFP 275 (Biofoco, Brasil);

o Concentrador rotativo a vácuo RVC 2-25 CD plus (Martin Christ, Alemanha);

o Armadilha fria para solventes do tipo Cooling trap CT 02-50 SR (Martin

Christ, Alemanha);

o Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear Avance III 400 MHz

(Bruker, Alemanha);

o Cabine de segurança biológica Pa420 Classe II, tipo A1 (Pachane, Brasil);

o Cromatógrafo a gás modelo 3900 com detector ion trap modelo Saturn

2100T (Varian, EUA);

o Cromatógrafo a gás modelo 7890A com detector quadrupolo modelo 5975C

inert XL MSD (Agilent, EUA);

o Cromatógrafo a gás modelo 7890A com detector por ionização em chama

(Agilent, EUA);

o Cromatógrafo a gás modelo GC-2010 Plus com detector triplo quadrupolo

modelo TQ8040 (Shimadzu, Japão);

o Microscópio óptico Leitz Dialux 22 (Leica, EUA);

o Moinho de facas TE 340 (Marconi, Brasil).

o Purificador de água Milli-Q Academic (Millipore, EUA);

o Rotaevaporador RII (Büchi, Alemanha);

o Sistema de extração acelerada por solvente ASE® Dionex 350 (Thermo

Scientific, EUA);

o Sistema de cromatografia flash Isolera Four (Biotage, Suécia);

III.2. REAGENTES E SOLVENTES

o Acetato de etila, grau HPLC (Tedia, EUA);

o Clorofórmio (Carlo Erba, Itália);

o Cloreto de sódio (Synth, Brasil);

36

o Diclorometano (Carlo Erba, Itália);

o Dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich, EUA);

o Hexano (Mallinckrodt, EUA);

o Metanol (Synth, Brasil);

o Sulfato de magnésio seco (MgSO4) (Vetec Química Fina, Brasil).

o Meio de cultura em pó BDA (Himedia, Índia)

III.3. PADRÕES ANALÍTICOS E COMPOSTOS ISOLADOS

o 4Z-Lachnophyllum lactona (isolada a partir da planta C. canadensis);

o 4Z,8Z-Matricaria lactona (isolada a partir da planta C. canadensis);

o Cumarina (pureza ≥ 99,9%) (Synth, Brasil)

o Nistatina (potência ≥ 4400 U.USP/mg) (Sigma-Aldrich, EUA)

III.4. PROCEDIMENTOS

III.4.1. Coleta de plantas.

As plantas foram coletadas no município de Casa Branca/SP (junho/2013) e

no campo experimental da Embrapa Meio Ambiente, em Jaguariúna/SP

(agosto/2013). As exsicatas foram depositadas no herbário do Instituto de Biologia

da Unicamp (UEC) sob os números 179014 e 179015, respectivamente.

III.4.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos

extratos.

i) Extração: a parte aérea (caule, folhas e flores) das plantas coletadas foi seca

em estufa a 40 °C durante o período de uma semana. As plantas secas foram

moídas em um moinho de facas. Posteriormente, 250 g de planta moída

foram transferidos para um erlenmeyer e foi realizada uma extração com

solvente sob agitação magnética. Foram empregados 500 mL de

37

diclorometano (DCM) em 3 ciclos de 24 h a temperatura ambiente. A cada

ciclo, foi efetuada a renovação do solvente. Ao final, o solvente de cada ciclo

foi combinado e removido em rotaevaporador (40 °C).

ii) Partição do extrato: o extrato seco obtido com DCM foi dissolvido em 150 mL

de uma mistura metanol:água (90:10, v/v) usando banho de ultrassom. Em

seguida, o extrato foi particionado com 3 x 200 mL de hexano e a fração

hexânica foi reservada. Na fração metanólica remanescente, uma quantidade

de água foi adicionada a fim de que a proporção metanol:água passasse a

ser 70:30, v/v. Em seguida, a fração metanólica foi particionada com 3 x 200

mL de clorofórmio. A fração clorofórmica obtida foi seca com MgSO4 e o

solvente foi removido em rotaevaporador (40 °C).

iii) Análises por GC-MS: as frações hexânica e clorofórmica obtidas na partição

foram analisadas por GC-MS. Foi utilizado um cromatógrafo a gás com

detector de massas do tipo ion trap e ionização por elétrons. A separação

dos compostos foi realizada com uma coluna Restek Rxi-5ms (30 m x 0,250

mm x 0,25 μm). A programação de temperatura foi 60-240 °C (3 °C min-1) e

240 °C por 5 minutos. A temperatura do injetor foi 240 °C, a temperatura da

transferline foi de 250 °C e a temperatura do ion trap foi de 180 °C. O volume

de injeção utilizado foi de 1 μL (modo splitless), a vazão do gás de arraste foi

de 1 mL min-1 e a concentração dos extratos foi de 1 mg mL-1 em

diclorometano.

iv) Isolamento dos compostos por cromatografia preparativa tipo flash: o extrato

clorofórmico foi submetido a uma separação no sistema de cromatografia

flash utilizando-se um cartucho SNAP KP-Sil 100 g (39×157 mm, 40-50 μm,)

com 132 mL de volume de coluna (CV), uma vazão de 25 mL min−1, uma fase

móvel composta por hexano:acetato de etila (A:B) com eluição por gradiente:

2% B por 2 CV, 2 – 20% B por 10 CV e 20% B por 2 CV. As frações do

número 70 ao 90, que apresentaram sinais no detector UV do equipamento

(254 e 280 nm), foram conduzidas para a análise em GC-MS, a fim de se

avaliar sua composição. Baseado nos cromatogramas obtidos, seis frações

38

foram agrupadas e identificadas como sendo o composto 4Z-LL e outras seis

frações como sendo o composto 4Z,8Z-ML. Nove frações intermediárias

foram agrupadas para uma posterior purificação, já que apresentaram

impurezas ou eram misturas dos dois compostos obtidos.

III.4.3. Caracterização das substâncias puras isoladas.

i) Análises por GC-MS: as substâncias purificadas pela cromatografia flash

preparativa foram analisadas por GC-MS. Foi utilizado um cromatógrafo a

gás com detector de massas do tipo quadrupolo e ionização por elétrons

(70 eV). A separação foi realizada com uma coluna Agilent HP-5ms (30 m x

0,250 mm x 0,25 μm). A programação de temperatura foi 120-240 °C (8 °C

min-1). A temperatura do injetor foi 240 °C, a temperatura da transferline foi

de 200 °C, a temperatura da fonte foi de 230 °C e a temperatura do

quadrupolo foi de 150 °C. O volume de injeção utilizado foi de 1 μL, com split

1:100, a vazão do gás de arraste foi de 1 mL min-1 e a concentração das

substâncias foi de 200 μg mL-1 em acetato de etila.

ii) Análises por GC-MS/MS: a identidade das moléculas foi confirmada, ainda,

por análise por GC-MS/MS. Foi utilizado um cromatógrafo a gás com detector

de massas triplo quadrupolo e ionização por elétrons (70 eV). A separação

foi realizada com uma coluna Restek Rtx-5MS (30 m x 0,250 mm x 0,25 μm).

Foi empregada uma corrida isotérmica a 115 °C por 19 minutos. A

temperatura do injetor foi 240 °C, a temperatura da transferline foi de 200 °C

e a temperatura da fonte de íons 230 °C. O volume de injeção utilizado foi de

2 μL (modo splitless), a vazão do gás de arraste (nitrogênio) foi 2 mL min-1 e

a concentração das substâncias foi de 50 μg mL-1 em acetato de etila. O

sistema foi operado no modo SIM/Scan com energia de colisão de 12 V e

argônio como gás de colisão. Para cada composto o íon precursor foi seu

próprio íon molecular: m/z 162 (4Z-LL) e m/z 160 (4Z,8Z-ML).

iii) Análises por NMR de 1H e 13C: amostras de 10 mg dos compostos 4Z-LL e

4Z,8Z-ML previamente isolados conforme descrito na seção III.4.2, foram

analisadas por NMR de 1H e 13C. As amostras foram diluídas em CDCl3 e

39

analisadas em um espectrômetro de NMR da marca Bruker, modelo Avance,

nas frequências de 400 MHz (1H) e 100 MHz (13C) para o composto 4Z-LL e

nas frequências 500 MHz (1H) e 125 MHz (13C) para o composto 4Z,8Z-ML.

iv) Análises por NMR 2D (1H-13C HSQC e 1H-1H COSY): também foram

realizados experimentos 2D de 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY para auxiliar na

caracterização estrutural dos analitos. As frequências empregadas foram as

mesmas dos experimentos 1D descritos anteriormente.

III.4.4. Teste preliminar: extração dos analitos de interesse da

planta por PHWE.

i) Extração: uma porção de 5,0 (± 0,1) g da planta moída foi submetida à

extração por PHWE. A extração foi realizada a 100 °C em 3 ciclos de 20

minutos. Esse procedimento gerou cerca de 40 mL de extrato bruto.

ii) Partição líquido-líquido do extrato: o extrato bruto obtido por PHWE foi

particionado com 3 x 100 mL de acetato de etila. A fração orgânica obtida foi

seca com MgSO4 e, em seguida, o solvente foi removido em rotaevaporador

(40 °C).

iii) Análise por GC-MS: O extrato purificado obtido foi analisado por GC-MS

conforme descrito no item (i) da sessão III.4.3, excetuando-se a rampa de

aquecimento empregada, que foi de 90-150 °C (3 °C min-1), 150-280 °C (20

°C min-1) e 280 °C por 5 minutos. Anterior a análise, os extratos foram diluídos

com acetato de etila para uma concentração de 1,0 mg mL-1. A presença dos

compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML foi identificada pelos espectros de massas dos

picos obtidos no cromatograma.

III.4.5. Otimização da extração via PHWE

A otimização da extração via PHWE foi realizada alterando-se, de maneira

univariada, os parâmetros de temperatura, tempo de ciclo e número de ciclos, de

modo a verificar o efeito de cada um, separadamente, na eficiência da extração.

40

III.4.5.1. Temperatura

i) Extração: Porções de 5 g da planta moída foram submetidas à extração por

PHWE em cinco diferentes temperaturas: 70, 90 100, 110 e 130 °C. O

número de ciclos foi fixado em 3 e o tempo de cada ciclo em 20 minutos. As

extrações foram realizadas em duplicata para cada temperatura, gerando

~40 mL de extrato aquoso bruto por extração.

ii) Partição: Após a extração, 20 mL de cada extrato aquoso foram transferidos,

em duplicata, para tubos tipo Falcon (50 mL). A partição foi feita com

3 x 15 mL de acetato de etila. As três frações de acetato de etila obtidas foram

reunidas em outro tubo tipo Falcon (50 mL) e o solvente foi evaporado com

auxílio de N2 até que seu volume tivesse sido reduzido a aproximadamente

10 mL. O solvente remanescente foi seco com MgSO4 e filtrado em seringa

com filtro de celulose reconstituída (0,22 µm). Já seco, o solvente foi

transferido para um tubo Falcon (15 mL, previamente pesado) e removido em

evaporador rotativo a vácuo (2 horas, 50°C). Os extratos secos tiveram,

então, suas massas determinadas.

III.4.5.2. Tempo de ciclo

i) Extração: Porções de 5 g da planta moída foram submetidas à extração por

PHWE em cinco diferentes tempos de ciclo: 1, 5, 10, 20 e 30 minutos. O

número de ciclos foi fixado em 3 e a temperatura foi mantida em 100 °C As

extrações foram realizadas em duplicata para cada tempo.

ii) Partição: a partição foi realizada conforme descrito no item (ii) da sessão

III.4.5.1.

III.4.5.3. Número de ciclos

i) Extração: uma mesma cela de extração contendo 5 g da planta moída foi

submetida a 4 extrações consecutivas, de modo a simular 4 ciclos de

extração. Assim, os extratos representando cada um dos ciclos foram obtidos

41

separadamente. As extrações foram realizadas a uma temperatura de 100

°C com ciclos de 1 minuto. O procedimento foi realizado em duplicata.


III.4.5.1.

III.4.5.4. Repetitividade do procedimento de extração

Neste trabalho, foi avaliada a repetitividade intra-dia e inter-dia do método de

extração. O coeficiente de variação (CV) intra-dia foi determinado por meio da

análise, no mesmo dia, de soluções do extrato purificado nas concentrações

descritas na Tabela 1 (pág. 38). O extrato foi obtido em quintuplicata para essa

determinação. O CV inter-dia foi determinado modificando-se o dia da análise. As

concentrações das soluções de extrato purificado analisadas neste ensaio também

se encontram na Tabela 1. Neste caso, o extrato foi obtido em triplicata.

A extração e a purificação do extrato se deram da seguinte forma:

i) Extração: porções de 5 g da planta moída foram submetidas à extração por

PHWE nas condições otimizadas previamente: temperatura de 100 °C, com

4 ciclos de 1 minuto cada.


III.4.5.1, com uma modificação. Neste ensaio, o extrato aquoso bruto obtido

foi avolumado em balão de 50 mL e somente uma alíquota de 20 mL foi

particionada.

III.4.6. Determinação dos analitos de interesse nos extratos

purificados

Em todos os extratos purificados por partição deste trabalho, os analitos de

interesse (4Z-LL e 4Z,8Z-ML) foram quantificados da seguinte forma:

i) Condições cromatográficas: foi utilizado um cromatógrafo a gás com sistema

de detecção por ionização em chama (FID). A separação foi realizada em

42

uma coluna Agilent HP-5 (30 m x 0,320 mm x 0,25 μm). Para a obtenção da

curva analítica, foi empregada uma corrida isotérmica a 115 °C por 19

minutos e, na análise dos extratos, foi adicionada a esta condição uma rampa

de limpeza de 115 a 200 °C (20 °C min-1). A temperatura do injetor foi de

200 °C e a temperatura do detector foi de 300 °C. O volume de injeção

utilizado foi de 1 μL, com split 1:50. A vazão do gás de arraste (nitrogênio) foi

de 2 mL min-1

ii) Preparo das soluções-padrão: as soluções-estoque dos compostos 4Z-LL e

4Z,8Z-ML isolados da planta foram preparadas separadamente em acetato

de etila, na concentração de 1000 µg mL-1.

iii) Curva analítica: a curva analítica foi obtida a partir de soluções de trabalho

preparadas em acetato de etila contendo os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML

nas concentrações de 5, 10, 20, 30, 40 e 50 µg mL-1. Foi utilizado

padronização interna com cumarina na concentração de 15 µg mL-1

iv) Análise dos extratos purificados por partição: as amostras de extrato

purificado foram preparadas nas concentrações descritas na Tabela 1 e

analisadas nas condições cromatográficas citadas anteriormente. Para cada

um dos dois compostos, foi necessária a utilização de uma determinada

concentração de extrato, de modo a fazer com que as áreas dos seus picos

sempre estivessem dentro da faixa linear de trabalho.

43

Tabela 1 - Concentrações em que cada extrato obtido foi analisado por GC-FID.

Etapa Concentração do extrato (mg mL-1)

4Z-LL 4Z,8Z-ML

Otimização da temperatura (°C)

(3 ciclos de 20 minutos)

70 0,40 1,60

90 0,20 1,00

100 0,25 1,00

110 0,30 1,00

130 0,70 1,00

Otimização do tempo de ciclo (min)

(3 ciclos a 100 °C)

1 0,16 1,00

5 0,16 1,00

10 0,24 1,00

20 0,30 1,00

30 0,36 1,00

Otimização do número de ciclos

(ciclos de 1 min a 100 °C)

1º ciclo 1,00 1,00

2º ciclo 1,00 1,00

3º ciclo 1,00 1,00

4º ciclo 1,00 1,00

Repetitividade

(4 ciclos de 1 minuto a 100°C)

Intra-dia 0,25 1,00

Inter-dia 0,25 1,00

III.4.7. Bioensaios

Os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML, isolados da planta C. canadensis, tiveram

suas atividades antifúngicas avaliadas contra 10 fungos associados a doenças pós-

colheita de frutas. Os fungos utilizados foram isolados a partir de diferentes frutas

(laranja, manga, melão e uva) e estão identificados na Tabela 2. Foi realizado um

screening via ensaio de difusão em disco com o intuito de averiguar quais fungos

se mostrariam susceptíveis aos compostos avaliados para, posteriormente,

estabelecer qual a concentração mínima inibitória de cada composto contra os

fungos afetados.

44

Tabela 2 - Fungos utilizados nos bioensaios para avaliação da atividade antifúngica dos

compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML.

Código Fungo Fruta

CCMA 1129 Colletotrichum gloeosporioides

Manga CCMA 1130 Alternaria alternata CCMA 1131 Lasiodiplodia theobromae CCMA 1133 Botryosphaeria dothidea

CCMA 1132 Aspergillus niger

Uva CCMA 1135 Alternaria alternata CCMA 1136 Cladosporium sp.

CCMA 1134 Fusarium pallidoroseum

Melão CCMA 1137 Alternaria alternata

CCMA 1190 Penicillium digitatum Laranja

CCMA: Coleção de Cultura de Microrganismos de Importância Agrícola e Ambiental.

III.4.7.1. Ensaios de difusão em disco

i) Meio de cultura: Foram preparados 500 mL de meio de cultura BDA (batata-

dextrose-ágar) em erlenmeyer (1000 mL). O meio foi autoclavado a 120 °C

por 20 min e, após o resfriamento, vertido em placas de Petri descartáveis

(90 x 15 mm).

ii) Preparação dos discos de celulose: Discos de celulose esterilizados (Ø = 6

mm) foram impregnados com 10 µL de solução de amostra (4Z-LL ou 4Z,8Z-

ML) em acetato de etila na concentração de 5 mg mL-1, o que corresponde a

50 µg de substância por disco. Os discos foram depositados sobre as placas

conforme mostrado na Figura 7. Como controle (C), foram utilizados discos

impregnados apenas com acetato de etila puro.

45

Figura 7 - Disposição do inóculo e dos discos de celulose na placa de Petri para o ensaio de

difusão em disco.

iii) Preparo do inóculo: Os fungos de baixa esporulação e/ou crescimento mais

rápido (CMAA 1129, 1130, 1131, 1133, 1134, 1135 e 1137) foram inoculados

com um plug micelial circular obtido a partir de uma cultura do fungo isolado.

O plug foi colocado no centro da placa (Figura 7) de modo a se obter um

crescimento o mais uniforme possível. Já os fungos de esporulação mais

intensa e/ou crescimento mais lento (CMAA 1132, 1136 e 1190) foram

inoculados com uma suspensão de 106 esporos mL-1. A concentração de

esporos na solução foi determinada por contagem em câmara de Neubauer.

iv) Incubação: as placas foram incubadas em câmara de germinação a 28±1 °C

por um período que variou de 2 a 20 dias, conforme a velocidade de

crescimento de cada fungo.

III.4.7.2. Concentração Mínima Inibitória

Os ensaios de MIC foram realizados pelo método de microdiluição em caldo

empregando-se microplacas com 96 poços. Esse método foi adaptado da norma

M38-A do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute): “Referência para

Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da Sensibilidade a Terapia

Antifúngica dos Fungos Filamentosos” (CLSI, 2002).

46

Em cada poço da microplaca foram dispensados 95 µL de meio de cultura

(RPMI 1640), 100 µL de solução com determinada concentração da substância

avaliada diluída no meio de cultura e 5 µL de solução de esporos na concentração

de 106 esporos mL-1. As soluções das substâncias avaliadas foram preparadas em

diferentes concentrações a partir de uma solução estoque na concentração de

128 µg mL-1 em meio de cultura contendo 10% de DMSO. As concentrações finais

dos compostos em cada poço foram de 64, 32, 16, 8 e 4 µg mL-1. Como controle

positivo (CI) foram utilizados 100 µL de uma solução de nistatina (64 µg mL-1) e

como controle negativo (CII) foram utilizados 100 µL de solução de NaCl

(0,85% m/v). Tanto o controle (CI e CII) quanto as soluções dos compostos em

diferentes concentrações foram avaliados em quintuplicata. As placas foram

incubadas por 48 horas a 35±2 °C. A Figura 8 esquematiza o teste de microdiluição

empregado. Os fungos avaliados foram Aspergillus niger (CMAA 1132),

Cladosporium spp. (CMAA 1136) e Penicillium digitatum (CMAA 1190). A MIC foi

determinada observando-se quais poços não apresentavam crescimento visível dos

fungos após o período de incubação.

Figura 8 - Teste de microdiluição em caldo para a determinação de MIC.

47

IV. RESULTADOS E

DISCUSSÃO

49

Os resultados apresentados envolvem o isolamento e a caracterização dos

compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML encontrados nos espécimes de C. canadensis

brasileiros; os ensaios visando a extração destes compostos por PHWE; a

otimização do método de extração e os bioensaios para avaliação da atividade

antifúngica das substâncias obtidas contra os fungos descritos na Tabela 2

(pág 39).

IV.1. Coleta das plantas

Inicialmente, para que este trabalho pudesse se concretizar, foi necessário

coletar e investigar a presença dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME nos

espécimes de C. canadensis nativos do Brasil. Apesar desses compostos terem

sido encontrados em plantas nativas dos EUA, não necessariamente eles seriam

encontrados em plantas brasileiras, uma vez que são metabólitos secundários cujo

mecanismo de produção pode estar associado a fatores de estresse específicos de

cada região (temperatura, patógenos, insetos, deficiência de nutrientes, entre

outros) (MAZID; KHAN; MOHAMMAD, 2011; MIRESMAILLI; ISMAN, 2014;

ZHONG, 2011).

Visando coletar espécimes em quantidade suficiente para os ensaios, foi feita

uma busca por locais onde a C. canadensis era encontrada em abundância. Como

essa planta se estabelece em lavouras (entressafra) e áreas com manejo reduzido

do solo (LAZAROTO; FLECK; VIDAL, 2008), não houve dificuldades em se

encontrá-la numa fazenda no município de Casa Branca/SP em junho de 2013 (UEC

179014) e no campo experimental da Embrapa Meio Ambiente, no município de

Jaguariúna/SP, em agosto de 2013 (UEC 179015).

As plantas coletadas foram secas por uma semana em estufa a 40 °C e

moídas conforme procedimento descrito no item i da sessão III.4.2.

50

IV.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos

extratos

A extração e o isolamento dos compostos alvo foram realizados inicialmente

conforme descrito por Queiroz et al. (2012) e detalhado sessão III.4.2. A partir de

250 g da planta foram obtidos 13,1 g de extrato bruto. Após partição deste extrato

com diferentes solventes, as frações clorofórmica e hexânica foram analisadas por

GC-MS para averiguar a eventual presença dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e

2Z,8Z-ME. Na análise, foi constatado que os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML estavam

presentes em quantidades significativas tanto na fração clorofórmica quanto na

fração hexânica. O composto 2Z,8Z-ME também foi encontrado em ambas as

frações, no entanto, em quantidades muito reduzidas, impossibilitando seu

isolamento com o procedimento adotado.

A baixa concentração de 2Z,8Z-ME encontrada nos extratos da planta difere

do resultado obtido por Queiroz et al. (2012), no qual este é o composto isolado em

maior quantidade. No entanto, isso não é surpreendente, uma vez que diversos

artigos reportam variações na composição do óleo essencial de C. canadensis,

conforme o local coletado e a fase de crescimento da planta (LIS; PIGGOTT; GÓRA,

2003; TZAKOU et al., 2005).

Como a fração clorofórmica foi aquela que apresentou menos concomitantes,

ela foi submetida à separação em sistema de cromatografia flash preparativa para

o isolamento dos analitos de interesse. Possivelmente devido à semelhança entre

as moléculas de 4Z-LL e 4Z,8Z-ML (Figura 4), a técnica não foi capaz de separá-

las completamente. Das frações coletadas, seis delas foram agrupadas e

identificadas como sendo o composto 4Z-LL (~338 mg) e outras seis como sendo o

composto 4Z,8Z-ML (~53 mg). No entanto, nove frações intermediárias (~476 mg)

foram agrupadas para uma posterior purificação, já que eram misturas dos dois

compostos obtidos ou apresentaram impurezas.

51

IV.3. Caracterização das Substâncias Puras Isoladas

IV.3.1. Análises por GC-MS e GC-MS/MS

As análises de GC-MS das frações descritas no item IV.2 indicaram que o

isolamento dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML foi atingido com sucesso. A existência

de um único pico nos cromatogramas aliada à presença dos fragmentos

característicos de cada molécula no espectro de massas, são fortes indicativos de

que ambos os compostos foram isolados e estavam puros. As Figura 9 Figura 10

mostram os cromatogramas obtidos para os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML,

respectivamente, após o processo de isolamento. Também são apresentados os

espectros de massas correspondentes a cada pico. Os espectros obtidos estão de

acordo com a literatura e confirmam a identidade das moléculas (BÄR; SCHULTZE,

1996; CSUPOR-LÖFFLER et al., 2011; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989).

52

Figura 9 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z-LL (acima) e seu respectivo espectro

de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura de

120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240 °C, temperatura da transferline 200 °C,

temperatura da fonte 230 °C e temperatura do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split

1:100, vazão do gás de arraste 1 mL min-1, concentração do composto 200 μg mL-1, solvent delay

5 minutos.

LACH MATR MATRES

53

Figura 10 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z,8Z-ML (acima) e seu respectivo

espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura

de 120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240 °C, temperatura da transferline 200 °C,

temperatura da fonte 230 °C e temperatura do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split

1:100, vazão do gás de arraste 1 mL min-1, concentração do composto 200 μg mL-1, solvent delay

5 minutos.

LACH MATR MATRES

54

De modo a confirmar a identidade dos compostos isolados e identificados por

GC-MS, a cromatografia a gás associada à espectrometria de massas sequencial

(GC-MS/MS) foi utilizada. Para ambos os analitos, o íon precursor foi o seu próprio

íon molecular, monitorado no modo SIM (Single Ion Monitoring). Após a sua

fragmentação, os íons produto forneceram espectros de massas cujos padrões de

fragmentação foram consoantes com as estruturas das moléculas.

A Figura 11 mostra o espectro MS2 do íon molecular do composto 4Z-LL

(m/z 162). Seus íons produto estão de acordo com a fragmentação proposta na

literatura, apresentando picos em m/z 147 [M-CH3]+, m/z 133 [M-C2H5]+, m/z 119

[M-C3H7]+, m/z 105 [M-C2H5-CO]+, m/z 91 [M-C3H7-CO]+ e m/z 82 [C4H2O2]+

(QUEIROZ et al., 2012; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989).

Figura 11 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 162 (composto 4Z-LL).

A Figura 12 mostra o espectro MS2 do íon molecular do composto 4Z,8Z-ML,

(m/z 160). A fragmentação de seus íons produto foi proposta com base na

fragmentação de seu isômero 4E,8Z-ML, uma vez que, somente para este

composto, foi encontrada descrição do padrão de fragmentação na literatura (BÄR;

SCHULTZE, 1996). O espectro apresenta picos em m/z 145 [M-CH3]+,

m/z 131 [M-C2H5]+, m/z 104 [M-C2H4-CO]+, e m/z 78 [M-C4H2O2]+.

55

Figura 12 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 160 (composto 4Z,8Z-ML).

IV.3.2. Análises por NMR de 1H e 13C

As análises de NMR de 1H e 13C confirmaram as estruturas dos compostos

4Z-LL e 4Z,8Z-ML isolados a partir de extratos da planta C. canadensis. A Tabela 3

mostra os deslocamentos químicos de carbono e de hidrogênio atribuídos a cada

um dos compostos. Os dados estão em conformidade com a literatura, indicando

que os analitos de interesse foram isolados adequadamente (CSUPOR-LÖFFLER

et al., 2011; QUEIROZ et al., 2012; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989).

Tabela 3 - Deslocamentos químicos dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos ensaios de NMR de 1H e 13C.

4Z-LL (C10H10O2) 4Z,8Z-ML (C10H8O2)

Posição δ 1H (ppm), J (Hz) δ 13C (ppm) δ 1H (ppm), J (Hz) δ 13C (ppm)

1 -- 168,9 -- 168,8 2 6,22 (1H, d, J = 5,2) 120,1 6,25 (1H, dd, J = 5,4 e 0,5) 120,4 3 7,37 (1H, d, J = 5,2) 142,6 7,40 (1H, d, J = 5,0) 142,4 4 -- 156,0 -- 155,9 5 5,31 (1H, t, J = 2,4) 95,1 5,48 (1H, d, J = 2,5) 94,6 6 -- 104,6 -- 88,0 7 -- 74,8 -- 99,4 8 2,43 (2H, td, J = 7,2 e 2,4) 21,8 5,72 (1H, dm, J = 10,5) 109,9 9 1,62 (2H, sext, J = 7,2) 22,1 6,16 (1H, dq, J = 10,5 e 7,0) 141,8

10 1,03 (3H, t, J = 7,2) 13,5 1,97 (3H, dd, J = 7,0 e 1,5) 16,5

Os espectros de NMR 1H e 13C para o composto 4Z-LL estão mostrados nas

Figura 13 e Figura 14, respectivamente.

56

Figura 13 - Espectro de NMR 1H a 400 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.

Figura 14 - Espectro de NMR 13C a 100 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.

CHDDD

Cl3

TMS 3 2 5

8 9

10

CHCl3

10 9

7

5

6

2 3

4 1

CDCl3

8

57

Os espectros de NMR 1H e 13C para o composto 4Z,8Z-ML estão mostrados

nas Figura 15 e Figura 16, respectivamente.

Figura 15 – Espectro de NMR 1H a 500 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.

TMS

CHCl3 3 2

9 8 5

10

58

Figura 16 – Espectro de NMR 13C 125 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.

No espectro de NMR 1H da Figura 13, é importante ressaltar que a integração

do sinal em 1,62 ppm foi de 2,8 e não de aproximadamente 2, como era esperado

para a molécula de 4Z-LL. Isso ocorreu devido à presença de água na amostra ou

no solvente, pois, em CDCl3, o deslocamento químico da água ocorre em,

aproximadamente, 1,56 ppm (GOTTLIEB; KOTLYAR; NUDELMAN, 1997). A

presença de tal deslocamento também pode ser observada no espectro da Figura

15, porém, nesse caso, ele não interferiu com nenhum outro sinal.

As análises de NMR foram imprescindíveis para a determinação da

estereoisomeria dos compostos isolados. Tal dado é relevante, pois entre as

espécies da tribo Astereae – a qual pertence a planta C. canadensis – é comum

encontrarem-se os isômeros E e Z dos analitos de interesse (CHRISTENSENT;

LAM, 1991; CSUPOR-LÖFFLER, 2012). No caso do composto 4Z-LL, que foi

encontrado na planta, é possível diferi-lo do isômero 4E-LL principalmente pelo

deslocamento químico do H-5, que ocorre em torno de 5,30 ppm para o isômero Z,

TMS

CDCl3

TMS 1 4

3 9

2 8 10

6

5

7

59

mas é deslocado para menor campo (0,35–0,45 ppm) no isômero E (RIVERA;

ARANCIBIA; CASTILLO, 1989). Para o composto 4Z,8Z-ML, obtido a partir dos

extratos da planta, temos uma situação semelhante. Sua diferenciação do isômero

4E,8Z-ML, cuja presença foi reportada em exemplares de C. canadensis por

Csupor-Löffler et al.(2011), é possível, novamente, graças ao deslocamento

químico do H-5, que ocorre em torno de 5,48 ppm para o isômero 4Z,8Z, mas em

torno de 5,79 ppm para o isômero 4E,8Z (CSUPOR-LÖFFLER et al., 2011).

IV.3.3. Análises por NMR 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY

A análise por NMR 1H-13C HSQC traz informações acerca do acoplamento

entre o carbono e o(s) hidrogênio(s) ligado(s) diretamente a ele (1JCH). A sigla HSQC

quer dizer heteronuclear single quantum coherence (coerência quantica

heteronuclear única), o que significa que dois diferentes tipos de núcleo (no caso,

1H e 13C) são correlacionados em um experimento 2D. Os picos desse tipo de

espectro aparecem no cruzamento entre o sinal do carbono (vertical) e o sinal do

hidrogênio (horizontal), indicando que existe correlação entre estes dois núcleos, ou

seja, que existe uma ligação simples entre eles (JACOBSEN, 2007a).

Para o composto 4Z-LL, o espectro de NMR 1H-13C HSQC (Figura 17)

confirmou a estrutura da molécula, mostrando correlações entre os três hidrogênios

(H-10) em 1,03 ppm e o carbono (C-10) em 13,5 ppm; entre o hidrogênio (H-5) em

5,31 ppm e o carbono (C-5) em 95,1 ppm; entre o hidrogênio (H-3) em 7,37 ppm e

o carbono (C-3) em 142,6 ppm e entre o hidrogênio (H-2) em 6,22 ppm e o carbono

(C-2) em 120,1 ppm.

Com o auxílio desta técnica, também foi possível descobrir um equívoco na

atribuição encontrada na literatura para os carbonos C-8 e C-9 do composto

4Z-LL (RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989). Via de regra, espera-se que,

quanto maior a proximidade da ligação tripla, maior o deslocamento do sinal do

hidrogênio no espectro de NMR 1H para campos menores (maiores frequências),

devido à redução de sua blindagem pelo efeito anisotrópico dos elétrons π da

instauração (PAVIA; LAMPMAN; KRIZ, 2001). Desse modo, no espectro de

60

NMR 1H (Figura 13), os hidrogênios em 1,62 e 2,43 ppm devem ser atribuídos a

H-9 e H-8 respectivamente, como atesta a literatura anteriormente citada. No

entanto, estes mesmo artigos atribuem aos carbonos C-9 e C-8, os sinais

encontrados, respectivamente, em 21,8 e 22,1 ppm, no espectro de NMR 13C

(Figura 14). Contudo, o espectro de NMR 1H-13C HSQC revela que o hidrogênio

H-9 se correlaciona com o carbono em 22,1 ppm e, portanto, este sim deveria ser

identificado como C-9. O hidrogênio H-8, por sua vez, se correlaciona com o

carbono em 21,8 ppm, sendo este aquele que deveria ser identificado como C-8.

Estes dados são, ainda, compatíveis com tabelas encontradas na literatura para o

deslocamento de carbonos e hidrogênios próximos a triplas ligações (PRETSCH;

BÜHLMANN; BADERTSCHER, 2009).

Figura 17 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z-LL.

61

Para o composto 4Z,8Z-ML, o espectro de NMR 1H-13C HSQC (Figura 18)

apenas confirmou a estrutura da molécula, mostrando correlações entre os três

hidrogênios (H-10) em 1,97 ppm e o carbono (C-10) em 16,5 ppm; entre o

hidrogênio (H-9) em 6,16 ppm e o carbono (C-9) em 141,8 ppm; entre o hidrogênio

(H-8) em 5,72 ppm e o carbono (C-8) em 109,9 ppm; entre o hidrogênio (H-5) em

5,48 ppm e o carbono (C-5) em 94,6 ppm; entre o hidrogênio (H-3) em 7,40 ppm e

o carbono (C-3) em 142,4 ppm e entre o hidrogênio (H-2) em 6,25 ppm e o carbono

(C-2) em 120,4 ppm. Especial destaque à região ampliada do espectro, que

diferencia com clareza os carbonos C-3 e C-8 a partir dos hidrogênios diretamente

ligados a eles. Estes dados estão de acordo com o descrito na literatura para o

composto 4Z,8Z-ML (CSUPOR-LÖFFLER et al., 2011).

Figura 18 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z,8Z-ML.

62

A análise por NMR 1H-1H COSY correlaciona um próton a outro através de

seus acoplamentos, usualmente com duas ou três ligações de distância (2J e 3J) e,

em alguns casos, com quatro ou cinco ligações (4J e 5J). A sigla COSY significa

correlation spectroscopy (espectroscopia de correlação) e os seus espectros

mostra, nos dois eixos, as frequências de um mesmo isótopo, no caso, o 1H. Existem

dois tipos de picos nos espectros gerados por esse experimento: os picos diagonais,

que possuem a mesma frequência em ambos os eixos e são equivalentes aos picos

do espectro de NMR 1H e os picos cruzados, que são espelhados acima e abaixo

da diagonal e marcam o acoplamento entre os dois núcleos que o formam

(JACOBSEN, 2007b).

Para o composto 4Z-LL, o espectro de NMR 1H-1H COSY (Figura 19)

confirmou a estrutura molecular do composto e a atribuição realizada para os

prótons na literatura (QUEIROZ et al., 2012; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO,

1989), identificando os acoplamentos existentes entre eles.

63

Figura 19 - Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z-LL.

Para o composto 4Z,8Z-ML, o espectro de NMR 1H-1H COSY (Figura 20)

também confirmou a estrutura molecular do composto e a atribuição realizada para

os prótons na literatura (CSUPOR-LÖFFLER et al., 2011), identificando os

acoplamentos existentes entre eles.

64

Figura 20 -Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z,8Z-ML.

IV.4. Teste preliminar para a extração dos bioativos da planta

por PHWE

Um estudo preliminar foi realizado a fim de investigar a capacidade da técnica

de PHWE de extrair os princípios ativos de interesse. Como a extração foi feita

exclusivamente com água, optou-se por particionar o extrato obtido com acetato de

etila, de modo a verificar se esse solvente seria adequado para remover os analitos

65

da fase aquosa e permitir sua determinação por GC. A Figura 21 mostra o

cromatograma obtido para o extrato testado. Os resultados foram satisfatórios e

mostraram que, de fato, a técnica de PHWE é capaz de extrair os compostos 4Z-LL

e 4Z,8Z-ML da planta. Observa-se, ainda, uma preponderância significativa de

4Z-LL nos extratos, resultado coerente com o observado na extração por maceração

(item IV.2).

A obtenção de um extrato aquoso destes compostos representa um avanço

no que se refere à aplicação direta de extratos em frutos pós-colheita, pois, quando

comparado com aqueles obtidos a partir de solventes clorados, o extrato aquoso

oferece menos riscos em sua utilização.

Figura 21 – Cromatograma (TIC) obtido em análise de GC-MS de um extrato feito via PHWE.

Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura de 90-150 °C (3 °C min-1),

150-280 °C (20 °C min-1) e 280 °C por 5 minutos. Temperatura do injetor 240 °C, temperatura da

transferline 200 °C e temperatura do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:100, vazão

do gás de arraste 1 mL min-1 e concentração do extrato 1,0 mg mL-1.

IV.5. Curvas analíticas

Embora tenha sido empregado anteriormente o GC-MS para a determinação

dos dois compostos de interesse, foi avaliada também a possibilidade de realizar as

4Z-LL

4Z,8Z-ML

66

análises por GC-FID, uma vez que esta técnica é de fácil operação e de menor custo

e esse equipamento possuía uma maior disponibilidade de uso. Pelos

cromatogramas obtidos por GC-FID dos extratos (Figura 22) não foi verificada a

presença de outros compostos da matriz que pudessem causar interferência e,

portanto, a curva analítica foi obtida também nesta técnica e as subsequentes

determinações realizadas por esta. Para a determinação da linearidade e da faixa

linear foram construídas curvas analíticas por padronização interna em seis níveis

de concentração no intervalo de 5 a 50 µg mL-1. Como padrão interno foi utilizada a

cumarina em uma concentração de 15 µg mL-1. Cada ponto da curva foi analisado

em duplicata independente. Na Tabela 4 são apresentados os coeficientes

angulares, lineares e de correlação (r) determinados pelo método dos mínimos

quadrados ordinários, bem como seus respectivos desvios.

Tabela 4 - Parâmetros da regressão linear referente às curvas analíticas obtidas e seus

respectivos desvios.

Composto Coeficiente

Angular (mL µg-1) Desvio

(mL µg-1) Coeficiente

Linear Desvio

Coeficiente de correlação

1 0,0476 0,0002 -0,045 0,009 0,999 2 0,0595 0,0009 -0,107 0,027 0,997

A Figura 22 é um exemplo de cromatograma característico obtido para a

quantificação por GC-FID dos compostos nos extratos.

67

Figura 22 - Cromatograma obtido em análise de GC-FID de um extrato feito via PHWE (100 °C, 3

ciclos de 20 minutos). Coluna HP-5 (30 m x 320 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura de

115 °C (19 minutos), 115-200 °C (20 °C min-1. Temperatura do injetor 200 °C e temperatura do

detector 300 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:50, vazão do gás de arraste 2 mL min-1.

Concentração do extrato 1,0 mg mL-1, concentração do padrão interno (cumarina) 15 µg mL-1

IV.6. Otimização da extração via PHWE

Dentre os principais fatores que afetam a eficiência e a seletividade da

extração por PHWE, estão a temperatura, o tempo do ciclo e o número de ciclos

empregados. Desse modo, é fundamental a otimização desses parâmetros para

que se atinja uma extração adequada dos analitos de interesse (HENG et al., 2013;

TEO et al., 2010).

IV.6.1. Temperatura

A temperatura é um fator determinante para a eficiência da extração via

PHWE, afinal sua influência regula a polaridade do solvente extrator e a sua

capacidade de penetrar na matriz através da redução da tensão superficial e da

4Z-LL

4Z,8Z-ML

Cumarina

68

viscosidade da água. Além disso, a escolha adequada da temperatura é

fundamental para prevenir a degradação de compostos termolábeis e evitar a

ocorrência de reações de hidrolise e oxidação em temperaturas mais elevadas

(HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011; TEO et al., 2010).

Desse modo, foi de grande importância avaliar o seu efeito na extração em

questão. Como ponto de partida, a temperatura de 100 °C foi selecionada, pois era

comumente encontrada em trabalhos envolvendo extração de produtos naturais a

partir de plantas (TEO et al., 2010). Como forma de estabelecer uma condição de

contorno, as temperaturas de 70, 90, 110 e 130 °C também foram selecionadas

para integrar o estudo de otimização.

Após a realização das extrações em diferentes temperaturas, as massas de

extrato purificado seco foram determinadas e estão compiladas na Tabela 5,

juntamente com o rendimento de cada extração com relação à massa inicial de

planta (5,0 g). Observou-se que o aumento da temperatura de extração provocou

um aumento na massa dos extratos, denotando que, de fato, quanto maior a

temperatura, maior a eficiência da água como solvente extrator. No entanto, massas

maiores não necessariamente indicam que os analitos de interesse foram extraídos

com maior rendimento. Assim, faz-se necessária a quantificação dos compostos

4Z-LL e 4Z,8Z-ML em cada extrato obtido.

Tabela 5 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes temperaturas e rendimento global da

extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g).

Temperatura (°C) Replicata Massa (mg) Rendimento

70 1 63 1,2% 2 56 1,1%

90 1 70 1,4% 2 59 1,2%

100 1 85 1,7% 2 81 1,6%

110 1 88 1,8% 2 87 1,7%

130 1 108 2,2% 2 120 2,4%

69

No intuito de verificar se a extração dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML seria

afetada pela temperatura os extratos obtidos foram analisados por GC-FID e os

resultados estão apresentados na Figura 23

Figura 23 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos extratos

purificados em cada uma das temperaturas avaliadas (70, 90, 100, 110 e 130 °C). Teor dado em

miligramas de composto por grama de planta.

Como é possível observar, a extração a 100 °C foi aquela que levou ao maior

rendimento para ambos os analitos. Nas temperaturas de 70 e 90 °C, foram obtidos

menores rendimentos, provavelmente devido à redução menos significativa da

tensão superficial e da viscosidade da água, o que prejudicou sua capacidade de

penetrar na matriz e extrair os analitos. Já acima de 100 °C, embora não tenha sido

possível observar produtos de degradação no cromatograma, provavelmente,

houve degradação dos analitos pela temperatura.

IV.6.2. Tempo de ciclo

O processo de extração por PHWE pode ser descrito em quatro etapas:

i) dessorção dos compostos a partir dos sítios ativos da matriz; ii) difusão dos

compostos pela matriz até atingirem a interface entre o solvente e a matriz; iii)

solubilização dos analitos na fase extratora e iv) eluição dos analitos da cela

extratora para o frasco coletor (TEO et al., 2010). Como em amostras compostas

0,66

1,32

1,55

1,30

0,82

4Z-LL

Teo

r d

e co

mp

ost

o n

a p

lan

ta

(mg

g-1)

0,050,20

0,250,21 0,16

4Z,8Z-ML

70

por material vegetal as etapas limitantes são aquelas que envolvem processos de

difusão e solubilização do composto (MUSTAFA; TURNER, 2011), espera-se que,

quanto maior o tempo da extração, maior a sua eficiência. Contudo, há de se

considerar que aquecimentos prolongados podem levar à degradação dos

compostos de interesse (TEO et al., 2010). Sendo assim, o tempo de ciclo é outro

fator decisivo na otimização da extração por PHWE.

Após a realização das extrações em diferentes tempos de ciclo, as massas

de extrato purificado seco foram determinadas e estão compiladas na Tabela 6,

juntamente com o rendimento de cada extração com relação à massa inicial de

planta (5,0 g).

Tabela 6 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes tempos de ciclo e rendimento global

da extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g).

Tempo (min) Replicata Massa (mg) Rendimento

1 1 65 1,3% 2 62 1,2%

5 1 65 1,3% 2 63 1,3%

10 1 75 1,5% 2 70 1,4%

20 1 86 1,7% 2 78 1,6%

30 1 80 1,6% 2 80 1,6%

Observou-se que o aumento do tempo de ciclo provocou um aumento na

massa dos extratos, confirmando que, de fato, a eficiência da técnica pode ser

incrementada com maiores tempos de extração. No entanto, novamente, massas

maiores não necessariamente indicam que os analitos de interesse foram extraídos

com maior rendimento.

No intuito de verificar se a extração dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML seria

afetada pelo tempo do ciclo de extração, os extratos purificados obtidos foram

analisados e os resultados estão apresentados na Figura 24.

71

Figura 24 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos extratos

purificados em cada um dos tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e 30 min). Teor dado em

miligramas de composto por grama de planta.

Como é possível observar, a extração utilizando ciclos de 1 minuto foi mais

eficiente para ambos os analitos. Aqui, novamente, pode-se levantar a hipótese de

que o aquecimento prolongado esteja degradando os analitos antes de sua eluição

da cela de extração, no entanto, produtos de degradação não foram encontrados

nos cromatogramas analisados de modo a confirmar esta hipótese.

IV.6.3. Número de ciclos

Quando a PHWE é empregada no modo estático, como foi o caso deste

trabalho, sua eficiência depende fortemente da constante de partição e da

solubilidade dos compostos naquela temperatura. Assim, algumas extrações em

modo estático podem ser incompletas, devido ao volume limitado de solvente

comportado pela cela de extração. Uma forma de minimizar este problema é

empregar um maior número de ciclos na extração (TEO et al., 2010).

Buscou-se investigar qual seria a parcela dos analitos de interesse extraída

em cada ciclo separadamente e quantos ciclos seriam necessários para extrair

quantidades significativas desses compostos sem que um grande volume de extrato

1,911,87

1,73

1,47

1,30

4Z-LL

Teo

r d

e co

mp

ost

o n

a p

lan

ta

(mg

g-1)

0,31 0,28 0,28 0,24 0,19

4Z,8Z-ML

72

fosse gerado. Assim, a composição de 4 ciclos de extração consecutivos foi

investigada e, ao contrário da quantificação dos analitos realizada na otimização da

temperatura e do tempo, optou-se pela simples comparação das áreas dos analitos

extraídos em cada um dos diferentes ciclos. Os gráficos das Figura 25 e Figura 26

mostram, para os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML, respectivamente, a porcentagem

de analito extraída em cada um dos ciclos, quando comparada com a soma das

áreas de cada ciclo.

É possível verificar que, para o composto 4Z-LL, o segundo ciclo apresenta

um maior rendimento, enquanto que o quarto e último ciclo é responsável por, em

média, apenas 6,8% da quantidade total da substância presente no extrato

purificado. Já para o composto 4Z,8Z-ML, o primeiro e o segundo ciclo possuem

rendimentos médios comparáveis (44,3% e 41,3%, respectivamente), enquanto que

o quarto ciclo é responsável por, em média, 3,2% da quantidade total da substância

presente no extrato purificado.

Figura 25 – Proporção, em porcentagem, do composto 4Z-LL em cada ciclo avaliado.

34,1%

47,0%

13,7%

5,2%

27,2%

42,3%

22,3%

8,3%

CICLO 1 CICLO 2 CICLO 3 CICLO 4

Eficiência dos ciclos de extração: 4Z-LL

Replicata 1 Replicata 2

73

Figura 26 - Proporção, em porcentagem, do composto 4Z,8Z-ML em cada ciclo avaliado.

Como a presença de ambos os compostos no quarto ciclo foi baixa, quando

comparada aos outros ciclos, o emprego de quatro ciclos de extração foi

considerado adequado e suficiente. Optou-se pela não inclusão de mais ciclos no

processo de extração para que o volume de extrato aquoso gerado não fosse

excessivo, exigindo maior quantidade de acetato de etila para a partição. Ademais,

a inclusão de mais ciclos, por aumentar o volume de solvente, acabaria por diluir os

compostos, reduzindo sua concentração no extrato aquoso.

Em geral, os resultados obtidos na quantificação dos compostos durante a

otimização da temperatura, do tempo e do número de ciclos, reforçam a viabilidade

e a eficiência da PHWE na extração de metabólitos secundários da C. canadensis.

As quantidades obtidas são compatíveis com o fato de que metabólitos secundários,

quando presentes, normalmente compõem menos de 1% da massa seca das

plantas (ZHONG, 2011).

Uma vez estabelecidos os parâmetros de operação do PHWE para a

extração dos bioativos da planta (temperatura de 100 °C, 4 ciclos de 1 min cada),

foi avaliada a repetitividade deste procedimento de extração. Para tanto, extrações

sucessivas (5 replicatas independentes) foram realizadas em um mesmo dia e mais

três replicatas foram feitas em um segundo dia. A dispersão dos resultados para

47,1%

41,9%

8,3% 2,7%

41,5% 40,8%

13,9%

3,7%

CICLO 1 CICLO 2 CICLO 3 CICLO 4

Eficiência dos ciclos de extração: 4Z,8Z-ML

Replicata 1 Replicata 2

74

esses dois ensaios, intra- e inter-dia, foi expressa como o coeficiente de variação.

A quantificação dos bioativos no extrato obtido foi realizada por GC-FID conforme

método descrito na sessão III.4.6.

O CV foi calculado em porcentagem pela razão entre a estimativa do desvio

padrão (s) e a média das concentrações experimentais (�̅�) conforme Equação 1.

𝐶𝑉(%) =𝑠

�̅�× 100 (𝑒𝑞𝑢𝑎çã𝑜 1)

Os valores de CV intra-dia e inter-dia para os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML

estão apresentados na Tabela 7. Todos os valores foram menores do que 7% e são

considerados aceitáveis para os objetivos propostos.

Tabela 7 - Valores de CV intra e inter-dia para 4Z-LL e 4Z,8Z-ML

CV (%)

Intra-ensaio (n=5) Inter-ensaio (n=8)

4Z-LL 6,3 5,7

4Z,8Z-ML 5,8 6,7

IV.7. Bioensaios

IV.7.1. Ensaio de difusão em disco

Os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML apresentaram atividades antifúngicas

semelhantes. Ambos inibiram o crescimento dos fungos Aspergillus niger (CMAA

1132) e Cladosporium sp (CMAA 1136). Para este último, no entanto, 4Z-LL foi mais

ativo que 4Z,8Z-ML. Adicionalmente, apenas 4Z-LL inibiu significativamente o

crescimento do fungo Penicillium digitatum (CMAA 1190) (Tabela 8).

75

Tabela 8 - Resumo das atividades dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML contra diferentes fungos

associados a doenças pós colheita em frutas.

Código Fungo Substâncias

4Z-LL 4Z,8Z-ML CCMA 1129 Colletotrichum gloeosporioides - - CCMA 1130 Alternaria alternata - - CCMA 1131 Lasiodiplodia theobromae - - CCMA 1133 Botryosphaeria dothidea - - CCMA 1132 Aspergillus niger + + CCMA 1135 Alternaria alternata - - CCMA 1136 Cladosporium spp. ++ + CCMA 1134 Fusarium pallidoroseum - - CCMA 1137 Alternaria alternata - - CCMA 1190 Penicillium digitatum + -

Score: (-) inativo, (+) ativo (halo ≤ 15 mm), (++) altamente ativo (halo > 15 mm).

A Figura 27 exemplifica um ensaio de difusão em disco no qual os compostos

não apresentaram bioatividade (Figura 27A) e um caso onde eles apresentaram-na

(Figura 27B), destacando-se o halo de inibição tipicamente obtido nesse teste para

compostos bioativos.

Figura 27 – Ensaios de difusão em disco mostrando um exemplo no qual o composto não

apresentou atividade antifúngica (fig. 27A) e um exemplo no qual o composto apresentou atividade

antifúngica (fig. 27B).

IV.7.2. Concentração Mínima Inibitória

A concentração mínima inibitória dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML foi

determinada a partir de ensaio de microdiluição em caldo proposto pela norma

A B

76

M38-A da CLSI. O intuito desse teste é avaliar qual a quantidade mínima de cada

composto que provoca a inibição do crescimento do fungo em questão. Tal

informação é relevante para que futuros testes envolvendo a aplicação do extrato

aquoso da planta C. canadensis em frutas possam ser realizados com

concentrações adequadas dos compostos.

Todos os três fungos avaliados tiveram seu crescimento inibido em alguma

das concentrações testadas dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. O composto 4Z-LL

apresentou maior atividade contra o fungo Penicillium digitatum (32 µg mL-1) e o

composto 4Z,8Z-ML apresentou maior atividade contra o fungo Aspergillus niger

(32 µg mL-1). Os resultados obtidos para o ensaio de MIC estão listados na

Tabela 9.

Tabela 9 - Atividade antifúngica (MIC) dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML obtida pelo método de

microdiluição em caldo.

Fungo MIC (µg mL-1)

4Z-LL 4Z,8Z-ML

Aspergillus niger (CMAA 1132) 64 32

Cladosporium spp. (CMAA 1136) 64 64

Penicillium digitatum (CMAA 1190) 32 64

Os resultados obtidos neste ensaio são promissores, uma vez que os fungos

que se mostraram susceptíveis ao tratamento são patógenos comuns no pós-

colheita de frutas e legumes (COATES; JOHNSON, 1997). O fungo Aspergillus niger

é causador da doença conhecida como mofo preto e de outras podridões em

cítricos, uvas, figos, pêssegos, mangas, maçãs e morangos. Além disso, é um dos

responsáveis no Brasil pela contaminação de uvas e vinhos com ocratoxina A

(VARGA et al., 2008), uma micotoxina com efeitos nefrotóxicos, teratogênicos,

hepatotóxicos e imunotóxicos em animais e possivelmente em humanos, sendo

classificada ainda como uma possível substância carcinogênica (IARC, 1993;

POZO-BAYÓN et al., 2012). Os fungos do gênero Cladosporium são causadores de

podridões em melões, berries, tomates e berinjelas (COATES; JOHNSON, 1997;

TERAO et al., 2008). O fungo Penicillium digitatum é o agente causador do bolor

verde em frutas cítricas, sendo o principal responsável pelas suas perdas na pós-

77

colheita. Estudos indicam que 60 a 80% das perdas de citros durante a

armazenagem sejam causadas pela podridão associada a esse fungo (BALLESTER

et al., 2011).

79

V. CONCLUSÕES E

PERSPECTIVAS

FUTURAS

81

V.1. Conclusões

Em linhas gerais, este trabalho apresentou um estudo da composição de

extratos da planta Conyza canadensis com relação a compostos de ação antifúngica

reportados na literatura (MEEPAGALA et al., 2002; QUEIROZ et al., 2012). Mais

especificamente, o foco do trabalho foi a busca dos compostos 4Z-lachnophyllum

lactona, 4Z,8Z-matricaria lactona e 2Z,8Z-matricaria ester em espécimes brasileiros

da planta C. canadensis, uma vez que estes compostos haviam sido reportados por

Queiroz et al. (2012) em plantas da mesma espécie coletadas nos EUA.

A partir de extratos obtidos por maceração com agitação empregando

diclorometano como solvente extrator, foi possível isolar dois dos três bioativos

identificados nas plantas norte-americanas. Os compostos 4Z-lachnophyllum

lactona e 4Z,8Z-matricaria lactona foram isolados com o auxílio de cromatografia

flash preparativa e caracterizados mediante análises de GC-MS,

GC-MS/MS e NMR de 1H e 13C, além dos experimentos de NMR 2D de 1H-1H COSY

e 1H-13C HSQC. Os dados obtidos estão em conformidade com a literatura existente

sobre esses compostos, no entanto, os experimentos de NMR 2D acrescentaram

novidades à atribuição de dois carbonos do composto 4Z-LL. Os referidos carbonos

(C-8 e C-9) compunham, juntamente com C-10, um radical propila próximo à uma

tripla ligação. Contudo, a atribuição de seus deslocamentos estava invertida, de

modo que o valor outrora atribuído ao C-8 deveria ser atribuído ao C-9 e vice-versa.

Foi também demonstrada a capacidade da técnica PHWE de gerar extratos

contendo os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. A utilização desta técnica, em

detrimento da técnica convencional de maceração com agitação empregada por

Queiroz et al. (2012), gera menos impactos ao ambiente e abre portas para uma

possível aplicação segura dos extratos em frutos pós-colheita. De modo a se

otimizar o método de extração por PHWE, foi realizado um estudo do efeito da

temperatura, do tempo de ciclo e do número de ciclos no rendimento da extração,

bem como uma avaliação da repetitividade do método em ensaios intra e inter-dia.

Dentre as cinco temperaturas testadas (70, 90, 100, 110 e 130 °C), aquela que se

mostrou mais eficiente na obtenção dos bioativos de interesse foi a de 100 °C.

82

Dentre os tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e 30 min), aquele que se mostrou

mais eficiente foi o de 1 minuto. Nessas condições (100 °C e 1 minuto de ciclo), a

composição de 4 ciclos consecutivos foi avaliada separadamente e conclui-se que

o quarto ciclo apresentou, em média, apenas 6,8 % do composto 4Z-LL e 3,2% do

composto 4Z,8Z-ML, quando as concentrações neste ciclo foram comparadas a

quantidade total extraída. Desse modo, a condição ótima de extração foi definida

como sendo 4 ciclos de 1 minuto cada a 100 °C. Nessas condições, o CV obtido

para cinco replicatas independentes da extração realizadas em um dia e três

realizadas em um dia diferente ficou abaixo de 7,0%, valor considerado aceitável

para a aplicação desejada.

Com relação aos bioensaios, os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML apresentaram

atividade contra três dos dez fungos avaliados nos ensaios de difusão em disco. Os

fungos susceptíveis foram Aspergillus niger, Cladosporium spp., e Penicillium

digitatum e o ensaio de MIC revelou que as concentrações mínimas inibitórias dos

compostos para esses fungos variaram entre 32 e 64 µg mL-1. Tal resultado é

promissor, pois os fungos afetados são patógenos comuns na pós-colheita de frutas

e legumes (BALLESTER et al., 2011; COATES; JOHNSON, 1997; POZO-BAYÓN

et al., 2012; TERAO et al., 2008; VARGA et al., 2008).

V.2. Perspectivas Futuras

Este trabalho está inserido em um projeto da Embrapa Meio Ambiente

(Jaguariúna/SP) coordenado pela Dr.ª Sonia Queiroz e financiado pelo CNPq, que

se intitula “Avaliação de atividade antimicrobiana, ecotoxicológica e uso na pós-

colheita de frutas de extratos e substâncias isoladas de Conyza canadensis”. Sendo

assim, será dada continuidade aos estudos aqui desenvolvidos para que,

eventualmente, um biopesticida viável para aplicação na pós-colheita de frutas

possa ser obtido. As próximas etapas compreendem a aplicação dos extratos

aquosos brutos obtidos por PHWE em frutas colhidas, a avaliação da estabilidade

dos compostos nesses extratos e o desenvolvimento e validação de um método de

quantificação dos analitos de interesse nos extratos por GC-MS/MS. Também serão

83

realizados ensaios ecotoxicológicos a fim de averiguar a toxicidade dos extratos

aquosos brutos e das substâncias puras para microrganismos fitoplanctônicos e

microcrustáceos. Mais estudos são necessários, ainda, com relação à composição

dos extratos da planta ao longo do ano e nos diferentes estágios de crescimento da

C. canandensis.

85

VI. REFERÊNCIAS

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