Bioquímica Experimental II

Reação de Hill e Extração de Pigmentos

Dayane Faviero

Matheus Francischini

Octavio Lomonaco

Tamara Poletti

Profª : Maria Eleonora Andrade de Carvalho

Fotossíntese

Anteriormente o processo de fotossíntese era conhecido como:

CO2 + H2O CH2O + O2

Nos meados da década 30 descobriu-se que algumas bactérias quando alimentadas com substrato apropriado eram capazes de em presença de luz reduzir o CO2 sem produção de O2, passando a equação à:

CO2 + H2 A CH2O + H2O + 2A-

Reação de HillO reagente de Hill fisiológico é o NADP+, onde ele é o aceptor artificial de elétrons.

2NADP+ + 2H2O 2NADPH+H+ + O2

Fig. 1- Absorção de luz e transporte de elétrons pelos fotossistemas II e I

DCPIP – 2,6-diclorofenolindofenol• É um indicador redox, sendo considerado um reagente de Hill.• Quando o extrato de folhas contendo cloroplasto é iluminado, em

presença do corante, o corante azul se torna incolor e O2 é produzido.•

Pigmentos

Pigmentos

Antocianinas:Presentes nas flores e frutos, conferindo as cores laranja, rosa, vermelho, violeta, são pigmentos polares e portanto hidrossolúveis, essas substancias ainda geram a atração de insetos e animais polinizadores, e causam a inibição de larvas.

ANTOCIANINASCLOROFILAS

Pigmentos

Carotenóides:São substâncias apolares e lipossolúveis, responsáveis pela coloração do amarelo ao laranja, presente em algumas frutas e vegetais, damasco, cenoura, abóbora, beterraba, e em menor quantia nos vegetais folhosos como couve, repolho, espinafre, agrião e brócolis entre outros, tem poder antioxidante (inibe radicais livres, prevenindo o envelhecimento)

Pigmentos

Metodologia

Materiais utilizados:• Espinafre• Acetona• Tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0 com sacarose 0,3

M• 2,6-diclorofenolindofenol• Homogeneizador• Gaze• Banho de gelo• Papel alumínio

MetodologiaReação de Hill• Picar 15 g de folha de espinafre sem nervuras• Colocar em um homogeneizador com 50 mL de tampão fosfato com sacarose• Homogeneizar por 30 s a 70% da capacidade do homogeneizador• Filtrar imediatamente em 6 • camadas de gaze

Metodologia

Em cada tubo tinhamos:• 4,5 mL de Tampão Fosfato com sacarose• 2 gotas de DCPIP• 0,2 mL do homogeneizado

1-Tubo coberto com papel alumínio2-Tubo exposto a luz solar

Metodologia

Extração de pigmentos

- 5 folhas de espinafre/pétalas de rosa

- 15 mLs de acetona

- Descansar por 30 min

Metodologia

Cromatografia:

- Concentrar a solução (7x) no papel- Colocar o papel na mistura- Esperar 1 hora

Metodologia

Éter de petróleo /isopropanol4:1

ResultadosReação de Hill

No tubo 1, o corante DCPIP se manteve azul (não foi reduzido).

No tubo 2, o corante DCPIP foi reduzido, se tornando incolor, prevalecendo a coloração esverdeada da clorofila.

1 2

Teste de cromatografia em papel de pigmentos de espinafre e pétalas de rosa

O princípio que permite a análise usa a adsorção seletiva, na qual os componentes se separam em uma fase móvel (Éter de petróleo e isopropanol na proporção de 1:4)Éter de petróleo é um solvente apolar, o Isopropanol por sua vez é um solvente polar. E uma fase estacionária é desempenhada pelo Papel Whatman polar.

76mm

17 mm

Pigmentos

Clorofila do extrato de espinafre arrastada pela fração de solvente apolar (éter de petróleo). d = 74 mm e Rf = 0,97

Antocianinas como a pelargonidina e a cianidina de cores vermelha e carmim respectivamente, não se moveram muito, demonstrando afinidade com o papel polar. d = 17mm Rf = 0,22

Pequena quantidade de pigmento apolar no caso imaginamos serem carotenoides, eluídos em éter de petróleo apolar.d = 71mm Rf =0,94

Perguntas

Reação de Hill• Qual a diferença entre os tubos?• Por que ocorreu diferença na coloração? Esse

resultado era o esperado?• Qual o papel do DCPIP?• Por que durante a homogeneização foi necessário

o uso do tampão?• E por que as vidrarias estavam em banho de gelo?

Perguntas

• Extração de pigmentos:• Por que utilizamos acetona na extração?• Por que utilizamos eter de petróleo e isopropanol

na proporção 4:1?• Qual a polaridade do papel de Whatman?• Porque observamos duas marcas na amostra da

pétala?• Porque ambas as amostras apresentam uma marcana mesma altura?