Reações de Aglutinação

• Agregação AG-AC •Observado visualmente• Teste rápido

Tipos de Aglutinação

• Direta• Indireta ou Passiva• Reversa (Inibição da Aglutinação)

Exemplos de Aplicação da Técnica• Teste de gravidez (gonadotrofina coriônica = HCG): urina• Rotavírus: fezes• Diagnóstico de trombose• Crises de anemia hemolítica (ex. falciforme)• Eritroblastose fetal (doença hemolítica do recém nascido)• Diagnóstico de hepatite B: soro• Diagnóstico de Toxoplasmose: hemaglutinação (soro)• Teste de tipagem sanguínea (ABO e Rh): banco de sangue

Aglutinação Direta

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

• Detecção AG ou AC específicos• Quantificação

Aglutinação bacterianaPresença de infecçãoDiferenciação de espécies

Aglutinação passivaAg solúveis associados a outras superfícies(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

+

+

Reversa (Inibição da Aglutinação)

Aglutinante

DIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISADIAGNÓSTICO “IN VITRO” - RADIOIMUNOENSAIO E ELISA

TIREÓIDETSHAnti-receptor TSHT3 e T4 livresTBGCalcitonina TSH neonatal

FERTILIDADE Estradiol UltrasensívelProgesterona HCG Estradiol

MARCADORES TUMORAIS

PSA total

PSA livre

ENDOCRINOLOGIA ACTHAldosteronaRenina

DIABETESInsulinaPeptídio C

TOXICOLOGIA

FARMACOLOGIAALÉRGENOS

AC DE ALERGIAS

DOENÇAS VIRAIS E BACTERIANAS

Radioimunoensaio (RIA)

Vantagens • Sensível, rápido e preciso• Análise quantitativa de reação Ag-AC• Limiar detecção: nanogramas (10-9 g) e picogramas (10-12g)

Limitações• Alto Custo• Vida média dos reagentes (radioisótopos)• Risco operacional

Radioisótopos mais usados• 125I - vida média de 57,5 dias e 131I – vida média de 8 dias

Etapas do teste• Cuva de calibração: diluições de substâncias com concentrações conhecidas (padrões/calibradores)• Ensaio • Contagem da radiação: ou (contador de cintilação) ou γ (contador de radiação gama)

• Hormônio• proteínas séricas• drogas• vitaminas• Ac

Moléculas marcadas com isótopos

Radioimunoensaio

Radioimunoensaio

Princípio: • Ac que reconhece especificamente o analisado

Soro com quantidadedesconhecida de analisado

eSoro com analisado

marcado I125

ACACACACAC

+ =

Precipitado com baixas contagensSoro tem muito analisado circulante

Precipitado comaltas contagensSoro tem pouco analisado circulante

interesse

Imunofluorescência

Direto e indireto:• Usado para pesquisa de AC em células (imunocitoquímica) e tecidos (imunohistoquímica)• Ex da aplicabilidade: biópsia de doenças imunológicas (pele, rins, sífilis, herpes simples, varicela-zoster) Sistema Avidina-Biotina:• Técnica de amplificação• Avidina+Biotina = complexo• Avidina pode ser saturada com fluoresceína (verde),ficoeritina (vermelha), peroxidase (M. óptica), ferritina (M.eletrônica).• Várias biotinas podem se ligar ao AC = amplificação dafluorescência

Enzimaimunoensaio

• Quantitativo = reação AG-AC monitorado através de atividade enzimática

Vantagens:• Alta sensibilidade• Reagentes estáveis e seguros• Rapidez

Exigências para a enzima ser usada no teste:• Alta atividade específica• Produto formado estável• Fácil quantificação• Ser estável, de preço acessível e de fácil obtenção• Ex: peroxidase, fosfatase alcalina, glicose oxidase, -galactosidase, anidrase carbônica,acetilcolinesterase, glucoamilase, lisozima, malato desidrogenase, glicose-6-P-desidrogenase,ribonuclease

Métodos:ELISA (Ensaio Imunosorbente Ligado a Enzima)Imunoblotting

ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima

1. Imobilização do AC ou AG em um meio sólido (agarose, poliacrilamida, placas poliestireno,etc)2. Bloqueio dos sítios reativos da placa com proteína (leite desnatado, soroalbumina bovina,gelatina, caseína, etc).3. Diluição da amostra4. Lavagens entre os períodos de incubação5. Para revelação da reação usar substrato cromogênico da reação enzimática(ex. H2O2, ortotoluidina).

ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima ELISA – Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima

Objetivo:• Quantificar um antígeno pelo uso de um AC específico ligado à enzima• Quantificar um AC pelo uso de um AG específico ligado à enzima

BloqueioLeite desnatado

ou Tween 20+

LavagemAmostra

+Lavagem

membrananitrocelulose

+ Ag ( )

Adição deAnti-Ig** = Enzima(peroxidase,fosfatase ou

glicose oxidase)+

Lavagem

Adição dosubstratoda enzima

COROu

conjugados marcados com radioisótopos

(bandas e radiografia)

ELISA: dot-ELISA (Immuno-dot ou dot-blot ELISA)

• Simples, rápida e sensível• proteínas, ácidos nucléicos, membranas, fungos, vírus, bactérias

ELFA: Enzyme Linked Fluorescent AssayEnsaio Fluorescente Ligado à Enzima –Enzima catalisa reação fluorescente e nãocolorimétrica