referencia

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCINCIAS

MESTRADO EM ENGENHARIA BIOMDICA

DESENVOLVIMENTO DE IMUNOSSENSOR ELETROQUMICO

EMPREGANDO NANOHBRIDO PIRROL NANOTUBOS DE

HALOISITA PARA DETECO DA TROPONINA T CARDACA

HUMANA

VICENTE DE PAULO DOS ANJOS LANDIM

Recife, PE.

2014





HUMANA

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao Stricto sensu de Engenharia Biomdica,

da Universidade Federal de Pernambuco, como parte

dos requisitos exigidos para obteno do ttulo de

Mestre em Engenharia Biomdica.

Orientadora: Prof a.

Dra.

Rosa Amalia Fireman Dutra

Recife, PE.

2014

Catalogao na fonte

Bibliotecria Margareth Malta, CRB-4 / 1198

L257d Landim, Vicente de Paulo dos Anjos. Desenvolvimento de imunossensor eletroqumico empregando nanohbrido

Pirrol nanotubos de haloisita para deteco da troponina T cardaca humana / Vicente de Paulo dos Anjos Landim. - Recife: O Autor, 2014.

69 folhas, il., grfs., tabs.

Orientadora: Profa. Dra. Rosa Amalia Fireman Dutra.

Dissertao (Mestrado) Universidade Federal de Pernambuco. CTG. Programa de Ps-Graduao em Engenharia Biomdica, 2014.

Inclui Referncias e Apndice.

1. Engenharia Biomdica. 2. Pirrol-2-carboxlico. 3. Nanotubos de

haloisita. 4. Imunossensor eletroqumico. 5. Troponina T cardaca humana.

6. Infarto agudo do miocrdio. I. Dutra, Rosa Amalia Fireman.

(Orientadora). II. Ttulo.

UFPE

610.28 CDD (22. ed.) BCTG/2014-161





HUMANA

AVALIADORES:

____________________________________________

Profa. Dr

a. Rosa Amalia Fireman Dutra

(Depto. Engenharia Biomdica, Universidade Federal de Pernambuco) - Orientadora

____________________________________________

Profa. Dr

a. Adriana Fontes

(Depto. Biofsica, Universidade Federal de Pernambuco) 1 Examinadora

____________________________________________

Prof. Dr. Ricardo Yara

(Depto. Engenharia Biomdica, Universidade Federal de Pernambuco) - 2 Examinador:

____________________________________________

Dra. Alessandra Batista de Mattos,

(Centro de Tecnologias Estratgicas do Nordeste)- 3 Examinadora

Recife, PE.

2014

Dedico este trabalho a meu pai Antnio Landim (in

memrian) e a minha me Suelita que lutaram, sonharam e me

apoiaram de todas as formas para que eu estivesse alcanando

cada objetivo. A tia Chiquinha, que dedicou sua vida a cuidar de

mim, me abraando como filho e acreditando nos meus sonhos.

Aos meus irmos pelo apoio em todos os momentos. Aos meus

sobrinhos, por fazerem de mim o tio mais feliz do mundo.

AGRADECIMENTOS

Em especial a Deus por estar me dando a chance de desfrutar de todos os meus

sonhos, por me iluminar a cada dia para seguir nessa caminhada, por me fortalecer e

amparar sempre em seus braos de amor.

professora e orientadora Rosa Fireman Dutra, pela orientao, amizade,

pacincia nesta fase de aprendizado, dedicao e principalmente pela oportunidade que

tem me dado de conhecer esse novo mundo chamado nanotecnologia e por ter me

acolhido to bem em seu laboratrio.

minha co-orientadora, colega de trabalho e amiga Brbara Virgnia, pela

dedicao, amizade, pacincia, momentos de descontrao tornando o laboratrio um

ambiente ainda melhor e acima de tudo por aceitar esse desafio de estar comigo nesse

projeto. No tenho como agradecer tamanho apoio e dedicao. Muito Obrigado!

Aos meus pais, Antnio Landim e Suelita Landim, pelo carinho, amor,

dedicao e por estarem sempre comigo lutando e acreditando nos meus sonhos,

obrigado pelas oportunidades a mim oferecidas, para minha formao pessoal e

profissional. De um modo especial quero agradecer a minha me por abrir mo da

convivncia diria comigo para que eu estivesse hoje aqui realizando um dos meus

sonhos e aprender que amar tambm abrir mo de quem amamos.

A minha tia Chiquinha da Glria, por ser sempre uma segunda me, me

acolhendo, amando e investindo em minha educao. Te amo!

Aos meus irmos Yskara, Antnio Filho e Luciano pelo amor, suporte, apoio e

fortaleza.

Aos meus sobrinhos Antnio Neto, Isabelly e Ana Jlia por me fazerem me

sentir o tio mais amado e feliz do mundo. Amo vocs!

Aos familiares de um modo geral, tios, primos, cunhados e av pelos momentos

bons e ate mesmo por aqueles que na dor me fizeram aprender que nada acontece por

acaso e que famlia isso.

Ao amigo Bruno Nunes, no tenho como esquecer tanto que fizestes por mim, o

apoio incondicional, a amizade, os ensinamentos nessa nova vida de muitas mudanas e

principalmente por acreditar que tudo iria dar certo, te amo amigo!

Aos amigos de Recife, Heberth Macedo, Micaias Jnior, Henrique Costa,

Rosana Marinho, Eri Dias, Diego Leonardo, Fernanda e Edgard Santos por terem me

dado todo apoio no s profissional quanto pessoal, pelos momentos de descontrao e

amizade e por me tornarem no s amigo, mas parte da famlia de vocs. Muito

Obrigado!

Aos amigos do Cear, representados por Vivi, Tatiana, Mariana e Tbada pelo

apoio desde os tempos da graduao e por continuarem comigo nessa jornada.

Aos amigos Rogrio, Carol Dias, Tatianny Freitas, Erika Lima, Alessandra

Mattos, Igor Teixeira e Luciana Melo, pela amizade, momentos de descontrao,

apoio e pela contribuio para a realizao deste trabalho.

senhora Maria Helena por ter cedido carinhosamente o perclorato de ltio

utilizado nos experimentos, muito obrigado!

Aos amigos do LAPED, com os quais foram divididos os ltimos anos de

aprendizado, pela contribuio no decorrer desta trajetria e pelos muitos momentos de

descontrao tornando o laboratrio um ambiente mais prazeroso.

Aos professores e funcionrios do Programa de Ps-Graduao em

Engenharia Biomdica que contriburam para a formao do meu carter e conduta

cientfica.

Aos colegas de turma Natlia Onofre, Cayo Leal e Rodrigo Gomes, por termos

alcanado o que desejamos e conseguido vencer cada obstculo.

Fundao de Amparo a Cincia e Tecnologia de Pernambuco (FACEPE) pelo

apoio financeiro.

Muito Obrigado!

No fundo, apenas os pensamentos prprios so verdadeiros e tm vida, pois somente

eles so entendidos de modo autntico e completo. Pensamentos alheios, lidos, so

como sobras da refeio de outra pessoa, ou como as roupas deixadas por um hspede

na casa.

Schopenhauer

RESUMO

Diversos imunoensaios vem sendo empregados na rotina laboratorial para dosagem das

troponinas cardacas, devido a sua alta sensibilidade e especificidade no diagnstico do

infarto agudo do miocrdio. Entretanto, estes mtodos apresentam significativas

limitaes para diagnstico beira do leito de pacientes infartados de modo prtico,

rpido e seguro. Dessa forma, os imunossensores eletroqumicos surgem como uma

importante ferramenta analtica. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um

imunossensor eletroqumico baseado em um filme nanoestruturado de pirrol-2-

carboxlico e nanotubos de haloisita para deteco de nveis clnicos da troponina T

cardaca humana. O eletrodo de carbono vtreo foi submetido eletropolimerizao do

pirrol-2-carboxlico (0,01 M). Os grupos carboxlicos derivados do filme de pirrol na

superfcie sensora foram ativados e em seguida incubados com uma soluo de

nanotubos de haloisita funcionalizados com grupos amina (5 mg/mL). Para

imobilizao dos anticorpos anti-troponina T, o eletrodo de carbono foi previamente

incubado com uma soluo de glutaraldedo (5%). Os stios ativos remanescentes do

eletrodo foram bloqueados com uma soluo de glicina. A caracterizao do

imunossensor foi realizada usando as tcnicas de voltametria cclica e de pulso

diferencial. A eletrossntese do pirrol-2-carboxlico foi otimizada utilizando o perclorato

de ltio como contra-on na eletrossntese do polmero, sob a velocidade de

polimerizao de 20 mV/s. O filme nanoestruturado de pirrol-2-carboxlico (0,01 M) e

nanotubos de haloisita (5 mg/mL) apresentou uma estabilidade cinco vezes maior

quando comparado ao estudo controle (sem pirrol-2-carboxlico). Ensaios para

padronizao da concentrao do anticorpo anti-troponina T imobilizado e tempo de

interao antgeno-anticorpo foram realizados e otimizados na concentrao de 5 g/mL

e 60 min, respectivamente. Uma curva de calibrao foi obtida para as diferentes

concentraes de cTnT utilizando a tcnica de voltametria de onda quadrada. O

imunossensor proposto apresentou uma boa linearidade com r=0,996 (p

ABSTRACT

Several immunoassays have been employed in laboratorial routine for measurement of

the cardiac troponins due to their high sensitivity and specificity in the diagnosis of

acute myocardial infarction. However, these methods have significant limitations for

diagnosis at bedside of infarcted patients of a practical, rapid and secure way. Thus,

electrochemical immunosensors emerge as an important analytical tool. The aim of this

work was to develop an electrochemical immunosensor based on a nanostructured film

of pyrrole-2-carboxylic acid and halloysite nanotubes for detection of clinical levels of

human cardiac troponin T. Glassy carbon electrode was submitted to

electropolymerization of pyrrole-2-carboxilic acid (0.01M). The carboxylic groups

derivate of the pyrrole film on the sensor surface were activated and then incubated with

a solution of halloysite nanotubes functionalized with amine groups (5 mg/mL). To

immobilization of anti-troponin T antibodies, the carbon electrode was previously

incubated with a solution of glutaraldehyde (5%). The remaining active sites of the

electrode were blocked with a solution of glycine. The characterization of the

immunosensor was performed using the cyclic voltammetry and differential pulse

techniques. The electrosynthesis of pyrrole-2-carboxilic acid was optimized using

lithium perchlorate as counter-ion in the electrosynthesis of the polymer, at scan rate of

20 mV/s. The nanostructured film of pyrrole-2-carboxilic acid (0.01 M) and halloysite

nanotubes (5 mg/mL) showed a five-fold greater stability when compared to control

study (without pyrrole-2-carboxylic acid). Assays for standardization of concentration

of immobilized anti-troponin T antibody and antigen-antibody interaction time were

carried out and optimized at the concentration of 5 g/mL and 60 min, respectively. A

calibration curve was obtained to different concentrations of cTnT using square wave

voltammetry technique. The proposed immunosensor showed a good linearity with

r=0,996 (p

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 Esquema do processo fisiolgico, que levam ao IAM, nas artrias coronarianas. .................... 16

Figura 2 Complexo troponina composto pelas subunidades T, C e I. ..................................................... 20

Figura 3 Representao esquemtica de um biossensor. ......................................................................... 22

Figura 4 Sistema eletroqumico constitudo por trs eletrodos: um eletrodo de trabalho, um eletrodo de referncia (Ag/AgCl) e um eletrodo auxiliar (fio de platina). ........................................................... 25

Figura 5 Representao grfica da tcnica de VC: (a) variao linear do potencial vs. tempo e (b) voltamograma cclico. ....................................................................................................................... 27

Figura 6 Estrutura qumica do (a) monmero de Pi-2-COOH, (b) dmero e (c) oligmeros com 16 anis conjugados aps a eletropolimerizao do Pi-2-COOH.................................................................... 30

Figura 7 Representaes esquemticas da (A) estrutura cristalina da haloisita (10 ) e da (B) estrutura de um NTH. ...................................................................................................................................... 31

Figura 8 Potenciostato modelo Ivium Compact Stat acoplado ao microcomputador. ............................. 35

Figura 9 Etapas de construo do imunossensor. .................................................................................... 37

Figura 10 Influncia dos contra-ons empregados no processo de eletropolimerizao do Pi-2-COOH: (a) ECV limpo, (b) ECV eletropolimerizado em H2SO4 (0,5 M), (c) ECV eletropolimerizado em

KCl (0,1 M) e (d) ECV eletropolimerizado em LiClO4 (0,1 M). VCs obtidos em K3[Fe(CN)6 /K4[Fe(CN)6] (0,005 M) preparado em KCl (0,1 M) a velocidade de varredura de 100 mV/s. ....... 41

Figura 11 Influncia da taxa de velocidade de varredura no processo de eletropolimerizao e construo do filme de Pi-2-COOH: (a) ECV limpo, (b) ECV eletropolimerizado a 10 mV/s, (c)

ECV eletropolimerizado a 20 mV/s, (d) ECV eletropolimerizado a 40 mV/s, (e) ECV

eletropolimerizado a 80 mV/s e (f) ECV eletropolimerizado a 100 mV/s. Inset: Relao entre os

valores de Ep e velocidade de varredura de eletropolimerizao. VCs realizados em K3[Fe(CN)6 /K4[Fe(CN)6] (0,005 M) preparado em KCl (0,1 M), sob velocidade de varredura de 100 mV/s. ... 42

Figura 12 Perfil eletroqumico do processo de eletropolimerizao do Pi-2-COOH (0,01 M) durante 20 ciclos voltamtricos em soluo de 0,1 M de LiClO4 preparada em ACN, sob velocidade de

varredura de 20 mV/s. ....................................................................................................................... 43

Figura 13 VCs do ECVs modificado com diferentes concentraes de Pi-2-COOH: (a) ECV limpo, (b) ECV/Pi-2-COOH 0,001 M, (c) ECV/Pi-2-COOH 0,01 M, (d) ECV/Pi-2-COOH 0,02 M e (e)

ECV/Pi-2-COOH 0,03 M. VCs realizados em soluo de K3[Fe(CN)6 /K4[Fe(CN)6] (0,005 M)

preparada em KCl (0,1 M), sob velocidade de varredura de 100 mV/s. ........................................... 44

Figura 14 VCs da influncia do filme de NTHs-NH2 em clorofrmio sobre o perfil eletroqumico do ECV: (a) ECV limpo, (b) ECV modificado com clorofrmio e (c) ECV modificado um filme de

NTH-NH2 (5 mg/mL) preparado em clorofrmio. Medidas realizadas em soluo de 0,005 M de

K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 preparada em 0,1 M de KCl. ........................................................................ 45

Figura 15 Influncia das diferentes concentraes de NTHs-NH2 sobre ECV previamente eletropolimerizado com o Pi-2-COOH: (a) 1 mg/mL, (b) 2,5 mg/mL; (c) 5 mg/mL, (d) 7,5 mg/mL e

(e) 10 mg/mL. Medidas realizadas em soluo de 0,005 M de K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 preparada em

0,1 M de KCl. ................................................................................................................................... 46

Figura 16 Estabilidade eletroqumica do ECV modificado com (a) NTHs-NH2 e (b) Pi-2-COOH/NTHs-NH2 quando submetidos a 20 sucessivos ciclos voltamtricos. Medidas realizadas em soluo de

0,005 M de K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 preparada em 0,1 M de KCl...................................................... 47

Figura 17 VCs do ECV/Pi-2-COOH/HNT-NH2 sob diferentes velocidades de varredura (a h: 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 e 300 mV/s). VCs realizados em K3[Fe(CN)6 /K4[Fe(CN)6] (0,005 M) preparado em KCl (0,1 M). ...................................................................... 49

Figura 18 (I) VCs e (II) VPD das etapas de construo da plataforma sensora: (a) ECV limpo, (b) ECV/Pi-2-COOH; (c) ECV/Pi-2-COOH/NTH-NH2; (d) ECV/Pi-2-COOH/NTH-NH2/GLUT; (e)

ECV/Pi-2-COOH/NTH-NH2/GLUT/anti-cTnT e (f) ECV/Pi-2-COOH/NTH-NH2/GLUT/Anti-

cTnT/Glicina. Medidas realizadas em soluo de 0,005 M de K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 preparada em

0,1 M de KCl. ................................................................................................................................... 50

Figura 19 Influncia das diferentes concentraes de anti-cTnT imobilizado sobre o ECV/Pi-2-COOH/NTHs-NH2/GLUT. Medidas obtidas atravs de anlises por VC em soluo de 0,005 M de

K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 preparada em 0,1 M de KCl. ........................................................................ 51

Figura 20 Influncia do tempo de imunorreao para cTnT (0,05 ng/mL) em relao ao ECV/Pi-2-COOH/NTHs-NH2/GLUT/Anti-cTnT/Glicina. Medidas obtidas atravs de anlises por VC em

soluo de 0,005 M de K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 preparada em 0,1 M de KCl. ................................... 52

Figura 21 Curva de calibrao do imunossensor, obtida atravs da variao das concentraes de cTnT. Varreduras realizadas em soluo de 0,005 M de K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 preparada em 0,1 M de

KCl. ................................................................................................................................................... 53

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

ACN

CK

-

-

Acetonitrila

Chreatine kinase- Creatinoquinase

CK-MB - Chreatine kinase-myocardial band Isoforma crdica da

creatinoquinase

cTnI - Troponina I cardaca humana

cTnT - Troponina T cardaca humana

E - Potencial

ECV - Eletrodo de carbono vtreo

EDC - N-etil-N-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida

EGC - Eletrocardiograma

EUA - Estados Unidos da Amrica

HRP - Enzima peroxidase

I - Corrente

IAM - Infarto Agudo do Miocrdio

IL - Lquidos inicos

Ipa - Corrente de pico andico

Ipc - Corrente de pico catdico

IUPAC - International Union of Pure and Applied Chemistry- Unio

Internacional de Qumica Pura e Aplicada

NTHs - Nanotubos de Haloisita

NHS - N-hidroxi succinimida

NTC - Nanotubos de Carbono

OMS - Organizao Mundial de Sade

PBS - Tampo fosfato salino

VC - Voltametria Cclica

VPD - Voltametria de Pulso Diferencial

v1/2

- Raiz quadrada da velocidade de varredura

vs. - Versus

I - Variaes de corrente de pico

SUMRIO

1. INTRODUO ........................................................................................................ 14

2. REVISO DA LITERATURA ............................................................................... 16

2.1 INFARTO AGUDO DO MIOCRDIO (IAM) ............................................................... 16

2.1.1 Marcadores cardacos ................................................................................... 17

2.1.2 Troponinas ..................................................................................................... 19

2.2 BIOSSENSORES ....................................................................................................... 21

2.2.1 Imunossensores .............................................................................................. 23

2.3 TRANSDUTORES ..................................................................................................... 24

2.3.1 Transdutores Eletroqumicos ........................................................................ 24

2.3.2 Tcnicas Eletroqumicas................................................................................ 26

2.3.3 Voltametria Cclica ....................................................................................... 26

2.4 MODIFICAO ELETRDICA .................................................................................. 27

2.4.1 Polmeros ....................................................................................................... 28

2.4.1 Polipirrol ....................................................................................................... 29

2.4.2 Nanotubos de Haloisita ................................................................................. 30

3. OBJETIVOS ............................................................................................................. 33

3.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................................... 33

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ......................................................................................... 33

4. MATERIAIS E MTODOS .................................................................................... 34

4.1 REAGENTES ........................................................................................................... 34

4.2 EQUIPAMENTOS ..................................................................................................... 34

4.3 PREPARAO DO ELETRODO DE TRABALHO ........................................................... 35

4.4 ELETROPOLIMERIZAO DO PI-2-COOH .............................................................. 35

4.5 CONSTRUO DO FILME NANOHBRIDO DE PI-2-COOH/ NTHS-NH2 .................... 36

4.6 IMOBILIZAO DOS ANTICORPOS ANTI-CTNT ........................................................ 36

4.7 IMUNOENSAIO ELETROQUMICO ............................................................................. 37

4.8 OTIMIZAO DOS PARMETROS EXPERIMENTAIS ................................................... 38

4.8.1 Influncia da velocidade de varredura na eletropolimerizao do Pi-2-

COOH ..................................................................................................................... 38

4.8.2 Estudo de estabilidade do filme de Pi-2-COOH/NTH .................................. 38

4.8.3 Influncia da velocidade de varredura .......................................................... 38

4.8.4 Influncia da concentrao de anticorpo e tempo de imunorreao ............ 39

4.8.5 Curva de calibrao ...................................................................................... 39

5. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................. 40

5.1 CARACTERIZAO DA ELETROPOLIMERIZAO DO PI-2-COOH ........................... 40

5.2 CONSTRUO DO FILME NANOHBRIDO DE PI-2-COOH/NTH-NH2 ....................... 44

5.3 CARACTERIZAO ELETROQUMICA DO IMUNOSSENSOR ....................................... 49

5.4 OTIMIZAO DAS CONDIES EXPERIMENTAIS ...................................................... 51

5.5 CURVA DE CALIBRAO PARA CTNT ..................................................................... 52

6. CONSIDERAES FINAIS ................................................................................... 54

7. REFERNCIAS ...................................................................................................... 55

14

1. INTRODUO

A nanotecnologia um campo da cincia em rpida progresso, com grande

impacto nas reas de materiais, eletrnica e medicina (ZHANG et al., 2009).

Particularmente, a utilizao de nanomateriais, obtidos em escala de 1100 nm, tem

despertado grande interesse nos ltimos anos no desenvolvimento de nanossensores e

imunossensores (JIANRONG et al., 2004). Esses nanomateriais permitem o aumento da

rea reativa e da transferncia de eltrons na interface sensora, contribuindo,

consequentemente, para uma maior estabilidade do elemento biolgico e quantidade de

molculas imobilizadas (JUBETE et al., 2009; LUO, MORRIN & KILLARD, 2006).

Diversos tipos de nanomateriais tm sido utilizados para o aperfeioamento dos

imunossensores, incluindo nanotubos de carbono, nanopartculas metlicas e

polimricas (LEE et al., 2007; LIU & LIN, 2007). Neste trabalho, nanomateriais

derivados de minerais, tais como nanotubos de haloisita, foram empregados para

construo da plataforma sensora, a haloisita um argilo mineral semicondutor que tem

sido amplamente utilizado em biossensores, podem ser facilmente funcionalizados com

grupos carboxlicos, aumentam a resposta cataltica (PRICE & GABER; PRICE et al.,

2001).

Um dos grandes desafios na construo dos imunossensores consiste na fixao

dos nanomateriais na interface sensora. Assim, filmes polimricos funcionalizados tm

sido uma alternativa para construo de plataformas mais estveis e reprodutveis, o que

ainda tem sido um fator limitante no desenvolvimento de imunossensores. Devido

fcil sntese de preparao e reatividade redox, o polmero polipirrol tem recebido

grande ateno, principalmente quando funcionalizado, permitindo a utilizao de

grupos reativos estratgicos na modificao da interface sensora (GRIESHABER, 2008;

AHUJA et al., 2007). Em meio aos derivados do pirrol funcionalizado, o pirrol-2-cido

carboxlico vem se destacando como material eletroativo para utilizao em

imunossensores.

O desenvolvimento de imunossensores para o diagnstico de doenas

cardiovasculares, tais como o infarto agudo do miocrdio (IAM), tem despertado o

interesse de pesquisadores. Dados da Organizao Mundial de Sade (OMS) indicam

que at 2020 o IAM pode se tornar a principal causa de morte nos pases em

desenvolvimento (OMS, 2013). O diagnstico rpido e prtico do infarto considerado

15

um fator fundamental para a reduo da mortalidade e das possveis sequelas para o

paciente (MANSUR et al., 2006). A demora na sua confirmao pode aumentar os

riscos de complicaes associadas condio e o atraso para descartar o infarto pode

contribuir para superlotao das emergncias hospitalares, resultando em maiores custos

para os sistemas de sade (MENDIS et al., 2011). Dentre os marcadores cardacos para

identificao do IAM, as troponinas cardacas so consideradas padro-ouro na

prtica clnica, devido a sua alta sensibilidade e cardioespecificidade (ACHAR,

KUNDU & NORCROSS, 2005).

Neste trabalho, um imunossensor empregando filme nanohbrido de pirrol-2-

carboxlico (Pi-2-COOH) e nanotubos de haloisita funcionalizados com grupamentos

amina (HNTs-NH2) foi desenvolvido para deteco eletroqumica da troponina T

cardaca humana, visando contribuir no diagnstico do IAM.

16

2. REVISO DA LITERATURA

2.1 Infarto Agudo do Miocrdio (IAM)

Sndrome coronariana aguda (SCA) o termo designado a um amplo espectro de

manifestaes clnicas causadas pela isquemia do msculo cardaco (BERTON &

PALATINI, 2003). Entre as diversas manifestaes clnicas que compreendem estas

sndromes, o IAM tem se destacado como principal causa de hospitalizao e

atendimento em emergncias cardiolgicas (ALPERT et al., 2000).

O IAM tambm pode ser provocado por uma ruptura sbita de uma placa

aterosclertica ou pela formao de um trombo arterial (Figura 1) (DAVIES, 2000). O

IAM ocorre focalmente em regies inespecficas do corao, porm existe uma maior

incidncia no ventrculo esquerdo e no septo interventricular (LOPES, 2006). Tambm

ocorre quando h morte do msculo cardaco, resultante da oferta inadequada de

oxignio para o corao. Geralmente isso decorre da interrupo abrupta do fluxo

sanguneo nas artrias coronrias, que so vasos sanguneos que transportam sangue

para o msculo cardaco (BASSAN et al., 2002).

Figura 1 Esquema do processo fisiolgico, que levam ao IAM, nas artrias coronarianas.

(Fonte: THYGESEN, 2012)

17

O sintoma mais importante e tpico do IAM a dor precordial ou desconforto

intenso retroesternal que muitas vezes referida como aperto, opresso, peso ou

queimao, podendo irradiar-se para pescoo, mandbula, membros superiores e dorso.

Frequentemente, esse sintoma vem acompanhado por nusea, vmito, sudorese, palidez

e sensao de morte iminente (PESARO, SERRANO JR. & NICOLAU, 2004).

O IAM tem seu desenvolvimento acelerado pelos chamados fatores de risco

cardiovasculares. Entre eles, os mais importantes so a idade (homens a partir dos 55

anos, mulheres aps os 60 anos), diabetes, tabagismo, hipertenso arterial, altos nveis

sanguneos de colesterol, histrico familiar, obesidade e sedentarismo (ANTMAN et al.,

2008).

O eletrocardiograma (ECG) um mtodo diagnstico bastante utilizado na

avaliao inicial de paciente com IAM. Uma anlise criteriosa do segmento ST e da

onda T, no traado eletrocardiogrfico, representa um caminho para a tomada de

deciso sobre como conduzir o raciocnio clnico. Adicionalmente o ECG, tambm

prove informaes relevantes para a melhor opo teraputica e a estratificao

prognstica do paciente (HOLMVANG & LUSCHER, 1998).

Para o diagnstico do IAM, os pacientes precisam apresentar pelo menos duas

das trs condies estabelecidas pela OMS: dor precordial forte, alteraes no registro

eletrocardiogrfico e elevao dos marcadores cardacos (YANG & ZHOU, 2006).

Embora a investigao do ECG tem sido mais usual para diagnstico do IAM,

crescente o percentual de pacientes infartados que no apresentam alteraes no traado

eletrocardiogrfico (SUPRUN et al., 2010; MENDIS et al., 2011). Tcnicas de imagem,

como a angiotomografia computadorizada, tambm vem sendo utilizadas para

diagnstico do IAM, porm encontram-se disponveis apenas em poucos os rgos

pblicos devido ao seu alto custo, dificultando, assim, o acesso da populao.

Atualmente, marcadores cardacos so considerados importantes indicadores do IAM,

pois possuem especificidade e sensibilidade para deteco de leses no miocrdio

(THYGESEN, 2012).

2.1.1 Marcadores cardacos

Marcadores cardacos so descritos como elementos proteicos da estrutura

celular que so detectados na circulao sangunea quando ocorrem leses no miocrdio

(ALPERT et al., 2000; APPLE & MURAKAMI, 2005). Quando combinados a outros

18

mtodos diagnsticos, como o ECG, os marcadores cardacos podem resultar na efetiva

determinao e triagem de pacientes infartados (ALPERT et al., 2000).

A concentrao plasmtica do marcador biolgico de injria cardaca pode variar

dependendo da cintica de sua liberao, tempo transcorrido desde o incio do processo

isqumico e do mtodo analtico utilizado para sua deteco (RAMASAMY, 2011).

Esses fatores justificam, assim, a medio seriada do marcador de necrose miocrdica

que pode variar de uma dosagem para outra, sendo negativo na primeira e,

posteriormente, ter um resultado positivo (SANTALO,GUINDO & ORDONEZ, 2003).

Os marcadores cardacos mais utilizados na clnica mdica incluem a

mioglobina, a frao miocrdica da isoenzima creatinoquinase (chreatine kinase

mioglobin- CK-MB) e as troponinas cardacas, com cardioespecificidade varivel entre

elas (ACHAR, KUNDU & NORCROS, 2005). Contudo, o uso de alguns desses

biomarcadores cardacos tem sido discutido, j que podem ser encontrados em outros

tecidos e estarem elevados em respostas a determinadas doenas ou condies,

consequentemente comprometendo a sua especificidade para o diagnstico do IAM

(GODOY et al., 2007).

A determinao da mioglobina no soro possui um elevado valor preditivo

negativo sendo til para descartar o diagnstico do IAM, devido seu baixo peso

molecular e distribuio citoplasmtica. A mioglobina liberada para a circulao

rapidamente aps leso isqumica da fibra miocrdica. Concentraes elevadas so

observadas 1 a 2 horas aps o incio da dor precordial, atingindo o pico em 12 horas e,

em geral, normalizando em 24 horas (ALPERT et al., 2000; MORROW et al., 2007).

A isoenzima CK-MB possui elevadas sensibilidade e especificidade para o

diagnstico de leso do msculo cardaco (ALPERT et al., 2000). Em geral, na rotina

clnica so realizadas trs dosagens seriadas da CK-MB num perodo de 9 a 12 horas

aps admisso do paciente infartado. Se as trs dosagens estiverem dentro dos

intervalos de referncia, o diagnstico de IAM pode ser excludo. Preferencialmente,

deve-se realizar a dosagem da massa de protena correspondente isoenzima (CK-MB

massa) e no da atividade enzimtica. A concentrao da CK-MB se eleva de 3 a 8

horas aps o processo lesivo, atinge um pico em 24 horas e normaliza em 72 a 96 horas

(KARRAS & KANE, 2001). O intervalo de referncia para confirmao do infarto

atravs da dosagem da CK-MB de at 5,0 ng mL-1

(ANTMAN et al., 2008).

Com a redefinio de IAM proposta por um comit formado em 2000 pela

European Society of Cardiology e pelo American College of Cardiology, as troponinas

19

cardacas T (cTnT) e I (cTnI), tem sido recomendadas como marcadores padro ouro

para o diagnstico de IAM (ALPERT et al., 2000).

As troponinas cardacas permitem cobrir uma parte importante das necessidades

clnicas para avaliao diagnstica e estratificao do risco de IAM em relao aos

demais marcadores cardacos. Visto que, na ausncia de necrose miocrdica aguda ou

subaguda, as concentraes das troponinas cardacas no plasma so indetectveis.

Consequentemente, sua medida absolutamente cardio-especfica, permitindo

reconhecer a necrose miocrdica de tamanho reduzido e a existncia de IAM at mesmo

em pacientes com angina instvel, que no seriam reconhecidos utilizando-se outros

marcadores (PLEBANI & ZANINOTTO, 1999; HERKNER et al., 2001).

2.1.2 Troponinas

As troponinas so um complexo de protenas regulatrias que agem no processo

de contrao muscular por meio da interao clcio-dependente da miosina com a

actina. So constitudas de trs diferentes subunidades protecas (troponina C, T e I)

existentes no msculo esqueltico e cardaco, sendo codificadas por diferentes genes

(Figura 2). A troponina C (TnC) co-expressa nas fibras musculares esquelticas de

contrao lenta e no considerada como um marcador especfico cardaco (NICOLAU

et al., 2007).

As cTnT e cTnI apresentam sequncias de aminocidos individuais e especficos

ao tecido cardaco (COLLINSON & GAZE, 2005), permitindo a confeco de ensaios

imunolgicos por meio de anticorpos monoclonais para deteco de necrose do msculo

cardaco com alta especificidade (ALPERT et al., 2000; ACHAR, KUNDU &

NORCROSS, 2005; CAMERON et al., 2007).

20

Figura 2 Complexo troponina composto pelas subunidades T, C e I.

(Fonte: http://www.icb.ufmg.br/labs/lbcd/prodabi4/grupos/grupo1/outras.htm)

Estruturalmente, as troponinas cardacas encontram-se vinculadas ao aparato

contrtil miofibrilar, entretanto, aproximadamente 7% da cTnT e 3 a 5% da cTnI esto

livres no citoplasma (WU & FENG, 1998). Aps o dano e rompimento da membrana

celular dos cardiomicitos em eventos de necrose, h um aumento bifsico das

concentraes de troponinas no soro que correspondem liberao inicial das protenas

livres no citoplasma, seguido da gradual disperso das troponinas ligadas ao complexo

miofribilar. Assim, de acordo com a cintica de liberao, os nveis sricos das cTnT e

cTnI podem ser mensurados aps 2 a 4 horas do incio dos sintomas clnicos do infarto e

manter-se elevados por cerca de 4 a 7 dias para a cTnI, e 10 a 14 dias para a cTnT

(JAFFE, BABUIN & APPLE, 2006; MORROW et al., 2007).

Alguns autores atribuem cTnI e cTnT a mesma especificidade e importncia na

avaliao dos danos cardacos (PENTTIL et al., 1999; PLEBANI & ZANINOTTO,

1999). Entretanto, para avaliar a extenso da leso e tamanho do infarto, os valores de

cTnT, quando quantificados entre 72 e 92 horas aps o evento isqumico, fornecem

informaes mais fidedignas do que a cTnI (LICKA et al., 2002; STEEN et al., 2006).

A cTnT uma protena de baixo peso molecular, aproximadamente 36 kDa, e

produzida pelo gene TNNT2 (26875 bp). A sequncia produzida por esse gene

compreende 288 aminocidos contendo regies ricas em resduos de cido glutmico e

lisina (LWBER, 2007).

Diversos imunoensaios tm sido atualmente disponibilizados no mercado para

dosagem da cTnT, utilizando anticorpos monoclonais dirigidos contra stios antignicos

especficos. Imunoensaios enzimticos (ELISA, do ingls, Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay), tipo "sanduche", foram inicialmente descritos por KATUS e

21

colaboradores (1989) para deteco da cTnT, o Cardiac T Enzymun- Test (Boehringer

Mannheim GmbH, Alemanha). Anticorpos monoclonais anti-cTnT conjugados enzima

peroxidase so utilizados nestes ensaios para deteco quantitativa da interao

antgeno-anticorpo. Outros imunoensaios empregam reaes de

eletroquimioluminescncia (ECLIA, do ingls, Electrochemiluminescence Immunossay)

para dosagem da cTnT, como o teste Elecsys Troponin T STAT (Roche Diagnostics

Mannheim, Alemanha). O princpio da tcnica consiste na determinao de

imunocomplexos, atravs da luminescncia produzida por anticorpos monoclonais anti-

cTnT conjugados ao rutnio, composto fotomultiplicador, quando aplicada uma

determinada voltagem (TATE & PANTEGHINI, 2008). Estes mtodos convencionais

para diagnstico da cTnT envolvem procedimentos complicados, diversas etapas

bioqumicas e equipamentos relativamente caros (GILL, BEAVEN & COOK, 2006).

Sistemas mais prticos e portteis, baseados no princpio dos testes

imunocromatogrficos, para determinao da cTnT tem sido aplicados na prtica

clnica, tais como o Cardiac Reader (Roche Diagnostics Mannheim, Alemanha). Este

mtodo baseia-se na interao da cTnT circulante na amostra do paciente com

anticorpos anti-cTnT conjugados a partculas de ouro coloidal em uma membrana de

nitrocelulose (CHRISTENSON & AZZAZY, 2009). Entretanto, os ensaios

imunocromatogrficos apresentam apenas informaes qualitativas, impossibilitando

inferir sobre o dano e a extenso da leso cardaca. Portanto, faz-se necessrio o

incentivo ao desenvolvimento de novas tecnologias mais praticas e rpidas para o

diagnstico do IAM, com o objetivo de diminuir o tempo de execuo e os custos do

ensaio, sem perda da especificidade e sensibilidade dos mtodos convencionais.

Diferentes molculas biolgicas podem ser empregadas como elementos de

biorreconhecimento em biossensor, tais como enzimas, receptores celulares, cidos

nuclicos e micro-organismos para reconhecer diferentes analitos em suas respectivas

amostras (GRIESHABER et al., 2008).

2.2 Biossensores

Biossensores, por definio, so dispositivos que tm a propriedade de detectar

uma espcie qumica ou biolgica (analito), qualitativamente ou quantitativamente

(ROSATTO et al., 2001), sendo composto por um elemento biolgico e um transdutor

22

(Figura 3). O elemento biolgico tem a propriedade de reconhecer seletivamente e

interagir com o analito. A resposta bioqumica desta interao, ento, convertida pelo

transdutor num sinal eltrico passvel de ser quantificado (LOUZADA, LUCCAS &

MAGALHES, 2004; FERREIRA & YAMANAKA, 2006).

Figura 3 Representao esquemtica de um biossensor.

CLARK & LYONS (1962) demonstraram o primeiro biossensor desenvolvido

para determinao da glicose. A tecnologia desse trabalho foi transferida e

industrializada pela Yelow Spring Instrument Company levando ao lanamento

comercial do primeiro biossensor de glicose em 1975. A partir da, diversas formas de

biossensores para glicose foram desenvolvidas (RICCI & PALLESCHI, 2005), assim

como muitas outras tecnologias de dispositivos (ARYA, DATTA & MALHOTRA,

2008).

Os biossensores continuam se destacando como uma rea atrativa e bastante

promissora no mercado. Investimentos de aproximadamente 13 bilhes de dlares

foram contabilizados em 2009, e at 2016 os investimentos esto projetados para

ultrapassarem os 14 bilhes de dlares (TANG, 2010; THUSU, 2010). Na rea

acadmica, em 2009, as publicaes envolvendo biossensores ultrapassaram os 6.000

artigos. As previses at 2016 sugerem que esta tendncia de crescimento ir continuar

com destaque para os biossensores do tipo pronto-atendimento (point-of-care) (THUSU,

2010). A tecnologia dos biossensores vem sendo desenvolvida para deteco de

importantes biomolculas com o objetivo de transmitir informaes rpidas e precisas

sobre amostras de interesse no campo da medicina, agricultura, segurana alimentar,

bioprocessamento, monitoramento industrial e ambiental. A classificao dos

23

biossensores pode variar de acordo com o elemento biolgico de reconhecimento e o

tipo de transdutor empregado (LUONG, MALE & GLENNON, 2008). De acordo com

o princpio de energia envolvida na transduo, os transdutores podem ser classificados

em: eletroqumicos (amperomtricos, condutimtricos, potenciomtricos e

impedimtricos) (WU, YAN & JU, 2007), eletromagnticos (acsticos ou piezoeltricos

- microbalana de cristal de quartzo, QCM, do ingls Quartz Crystal Microbalance)

(PAVEY, HUNTER & PAUL, 2003), pticos (por fluorescncia ou luminescncia

ressonncia de plsmon de superfcie, SPR, do ingls Surface Plasmon Resonance)

(TANG et. al., 2006) e os calorimtricos (CHAUBEY & MALHOTRA, 2002) (Figura

3). O transdutor a ser utilizado juntamente com o material biolgico, deve detectar

apenas um reagente ou produto especfico, no respondendo a outras substncias

presentes na amostra a ser analisada. A escolha de um determinado transdutor no

depende apenas do tipo elemento de reconhecimento selecionado, j que este determina

quais variaes das propriedades fsico- qumicas ocorreriam em funo da interao,

mas depende tambm de outros fatores como tempo de resposta, seletividade e

sensibilidade (RICCARDI, COSTA & YAMANAKA, 2002).

2.2.1 Imunossensores

Os biossensores so denominados imunossensores quando anticorpos ou antgenos

so utilizados como elementos de bioreconhecimento para seus analitos especficos

(CONROY et al., 2009). Os imunossensores podem monitorar as reaes imunolgicas

na superfcie sensora com alta confiabilidade devido especificidade e seletividade da

interao anticorpo-antgeno, sendo uma importante ferramenta analtica (CHEN et al.,

2009).

De acordo com o envolvimento de marcadores conjugados aos imunorreagentes,

os imunossensores podem ser classificados como marcados e no-marcados (label-free).

A maioria dos imunossensores marcados, descritos na literatura, exploram o princpio

dos imunoensaios tipo competitivo e sanduche utilizando enzimas, fluorforos e

nanopartculas metlicas e magnticas como marcadores. Apesar de seletivos, os

imunossensores marcados implicam em elevados custos operacionais, incluindo

aumento das etapas de processamento da amostra. J nos ensaios no marcados, a

resposta do imunossensor obtida diretamente aps o evento de biorreconhecimento

(RAPP, GRUHL & LNGE, 2010; QIU et al., 2009; ZHANG et al., 2009). Para

24

construo do imunossensor, essencial a incorporao estvel do elemento de

reconhecimento biolgico. Anticorpos ou antgenos, quando imobilizados, precisam

reter a maior parte de sua atividade biolgica, para que o imunossensor possa apresentar

sensibilidade significativa para o analito alvo (CHEN & DONG, 2003). Uma

caracterstica desejvel do mtodo de imobilizao escolhido que ele resulte em um

anticorpo imobilizado orientadamente, ou seja, com o mnimo de impedimento estreo,

para interagir favoravelmente com seu antgeno alvo. Evidentemente, esta caracterstica

tem uma influncia direta sobre o nvel de sensibilidade do imunossensor (FOWLER et

al., 2008). Vrias substncias tm sido utilizadas como materiais para matriz de

imobilizao, tais como: polmeros, sol-gel, nanopartculas e nanotubos (SHI et al.,

2007).

2.3 Transdutores em imunossensores

De acordo com o princpio de energia envolvida na transduo, os transdutores

em imunossensores podem ser classificados em: eletroqumicos (amperomtricos,

condutimtricos, potenciomtricos e impedimtricos) (WU, YAN & JU, 2007),

eletromagnticos (microbalana de cristal de quartzo, QCM, do ingls Quartz Crystal

Microbalance) (PAVEY, HUNTER & PAUL, 2003) e pticos (ressonncia de plasmon

de superfcie, SPR, do ingls Surface Plasmon Resonance) (TANG et. al. 2006)

(CHAUBEY & MALHOTRA, 2002). O transdutor a ser utilizado, juntamente com o

material biolgico, deve detectar apenas um analito ou produto especfico, no

respondendo a outras substncias presentes na amostra a ser analisada. A escolha de um

determinado transdutor no depende apenas do elemento de reconhecimento

selecionado, j que este determina quais variaes das propriedades fsico-qumicas

ocorreriam em funo da interao, mas tambm de outros fatores como tempo de

resposta, seletividade e sensibilidade (RICCARDI, COSTA & YAMANAKA, 2002).

2.3.1 Transdutores Eletroqumicos

Recentemente, os imunossensores eletroqumicos vm ganhando crescente

ateno, uma vez que combinam a alta especificidade dos tradicionais mtodos de

imunoensaio, com os limites de deteco baixos e custo reduzido do sistema de medio

25

eletroqumica (HE et al., 2009). Os transdutores eletroqumicos oferecerem vantagens

como: simplicidade, rapidez na resposta, menor custo, alta sensibilidade e

compatibilidade com as tecnologias de micro fabricao de sensores portteis (JIN et

al., 2006).

Os imunossensores eletroqumicos tm como princpio bsico a deteco de

espcies eletroativas consumidas e/ou geradas durante o processo de interao do

elemento biolgico com seu substrato especfico (MEHRVAR & ABDI, 2004). Esses

sensores so projetados atravs do acoplamento de molculas biolgicas superfcie

eletrdica (por exemplo, eletrodos de platina, ouro, prata, base de carbono, grafite ou

outros materiais condutores), que respondem ao aplicar impulsos eltricos (SADIK,

ALUOCH & ZHOU, 2009).

Em geral, os sistemas eletroqumicos so constitudos por um eletrodo de

referncia, um eletrodo auxiliar e um eletrodo de trabalho (Figura 4). Esses eletrodos

so conectados a um potenciostato e imersos em uma clula contendo a soluo da

espcie eletroativa de interesse com um excesso de um eletrlito inerte (eletrlito

suporte), responsvel por garantir o controle difusional das espcies (GANDRA et al.,

2004). O eletrodo de referncia, normalmente de prata/cloreto de prata (Ag/AgCl),

mantm o potencial de trabalho estvel. O eletrodo de trabalho funciona como elemento

transdutor da reao bioqumica, enquanto o eletrodo auxiliar estabelece uma conexo

com a soluo eletroltica (GRIESHABER et al., 2008).

Figura 4 Sistema eletroqumico constitudo por trs eletrodos: um eletrodo de trabalho, um eletrodo de

referncia (Ag/AgCl) e um eletrodo auxiliar (fio de platina).

(Fonte: http://web.mit.edu/kjhuang/www/Literature/Templates/PAA/NonJournal%20References/cell-

types.pdf)

26

2.3.2 Tcnicas Eletroqumicas

A eletroqumica refere-se a fenmenos qumicos associados transferncia de

eltrons, que podem ocorrer homogeneamente em soluo, ou heterogeneamente na

superfcie do eletrodo. A eletroqumica pode favorecer opes viveis para mediar

problemas na construo de novos mtodos para o diagnstico clnico. Uma das vantagens

a no utilizao de grandes quantidades de reagentes nas anlises eletroqumicas, alm do

fcil controle de variveis que combinadas de formas diversas levam a tcnicas

eletroqumicas particulares, tais como: voltametria cclica (VC), voltametria de onda

quadrada (SWV), voltametria de pulso diferencial (VPD) (BRETT et al., 1996). Dentre

estas, a voltametria cclica teve destaque neste trabalho.

2.3.3 Voltametria Cclica

A VC um grupo de mtodos eletroanalticos nos quais as informaes sobre o

analito so mensuradas atravs de variaes de corrente resultantes de reaes de

reduo e oxidao durante a aplicao de uma diferena de potencial sobre o eletrodo

de trabalho. Nesse processo, uma corrente capacitiva gerada, relacionada a alteraes

na dupla camada do eletrodo aps aplicao do potencial, que decai rapidamente.

Adicionalmente, correntes fardicas podem ser mensuradas atravs da transferncia de

carga de reaes redox de espcies eletroativas (BARD & FAULKNER, 2006; BRETT

& BRETT, 1993). Este processo obedece lei de Faraday, a qual determina que a

quantidade de reagentes formados ou consumidos na interface do eletrodo

proporcional corrente (LOWINSOHN & BERTOTTI, 2006).

A VC uma das tcnicas mais utilizadas para adquirir informaes qualitativas

sobre processos eletroqumicos. A resposta em corrente, neste mtodo, pode ser obtida

quando o eletrodo de trabalho submetido a uma onda triangular de potencial, no qual o

mesmo linearmente variado com o tempo, partindo de um valor inicial at um final.

Como resultado, gerado um grfico de corrente em funo da variao do potencial,

denominado voltamograma cclico (Figura 5). Os principais parmetros analisados no

voltamograma cclico so: os potenciais de pico catdico (Epc) e andico (Epa), e as

correntes de pico catdico (Ipc) e andico (Ipa) (HOLLER, SKOOG & CROUCH,

27

2009). Esses dados oferecem informaes importantes quanto reversibilidade da

transferncia de eltrons. Para uma reao reversvel, as Ipa e Ipc so aproximadamente

iguais em valor absoluto, a diferena entre os Ep aproximadamente 59 mV e Ep

independente da velocidade de varredura. J nos sistemas irreversveis observa-se uma

completa ausncia de picos de oxidao e reduo reversos e deslocamentos do Ep em

relao velocidade de varredura (BRETT & BRETT, 1993; BARD & FAULKNER,

2006).

A VC pode ser utilizada para caracterizao de estudos de modificao da

superfcie sensora, detalhando importantes informaes do sistema, tais como potencial

de oxidao e reduo da espcie, nmero de eltrons transferidos, reversibilidade da

reao, coeficiente de difuso, etc (BRETT & BRETT, 1993).

Figura 5 Representao grfica da tcnica de VC: (a) variao linear do potencial vs. tempo e (b)

voltamograma cclico.

(Fonte: BRETT & BRETT, 1993; BARD & FAULKNER, 2006)

2.4 Modificao Eletrdica

O desenvolvimento de tcnicas de modificao da superfcie eletrdica tem sido

importante por aumentar a estabilidade e reprodutibilidade do imunossensor (FREIRE,

DURAN & KUBOTA, 2001; WANG et al., 2002). As modificaes superficiais de

eletrodos visam pr-estabelecer e controlar a reatividade da interface para imobilizao

de antgenos ou anticorpos, originando frequentemente respostas mais confiveis do que

28

na ausncia do modificador (VENDRAME, 2004). Na modificao eletrdica, a

superfcie do eletrodo pode ser propositadamente alterada por adsoro irreversvel

direta, por ligao covalente a stios especficos da superfcie do eletrodo, por

recobrimento com filmes polimricos e nanomateriais (PEREIRA, SANTOS &

KUBOTA, 2002).

2.4.1 Polmeros

Polmeros so compostos que possuem alta massa molar formado pela repetio

de muitas unidades qumicas. Os polmeros podem ser orgnicos ou inorgnicos, mas os

mais estudados e importantes comercialmente so os orgnicos. Existe uma diferena

entre macromolcula e polmero que consiste no fato de que a alta molaridade dos

polmeros devido repetio de unidades estruturais simples (poli muitos, meros

partes) e na macromolcula consequncia da complexidade molecular, como as

macromolculas presentes nos organismos vivos. Os monmeros so substncias que

do origem aos polmeros por meio de reao qumica (AKCELRUD, 2007).

Os polmeros tem atrado muito interesse como matriz para imobilizao de

biomolculas. Estes podem servir como intermedirios na interao entre o bioreceptor

e o eletrodo, bem como auxiliar na transduo do sinal eltrico com o objetivo de

melhorar o tempo de resposta, a sensibilidade e o limite de deteco de biossensores em

diversas reas, desde o diagnstico de doenas at determinao de contaminantes em

gua. Dessa forma, muitas revises j foram publicadas sobre o uso de polmeros na

construo de biossensores (GERARD, 2002; VIDAL, 2003; BOROLE, 2006;

ARREDONDO, 2012; PAROLO, 2013).

Alm disso, os grupos funcionalizados dos polmeros permitem que essa

imobilizao seja feita de forma simples e especfica na superfcie do eletrodo

(COSNIER, 2003). Dessa forma, possvel controlar a distribuio espacial das

espcies imobilizadas, assim como a espessura do filme, pela modificao nas

propriedades do polmero (GERARD, 2002; DEEPSHIKHA, 2011). Portanto, o

desenvolvimento de tecnologias nesse campo de conhecimento depende da

compreenso das interaes a nvel molecular entre a matriz polimrica e a espcie

biolgica (OLIVEIRA, 2013).

29

2.4.1 Polipirrol

Sintetizado pela primeira vez por A. ANGELI e L. ALESSANDRO (1996), o

polipirrol (PPi) foi fruto da oxidao qumica do pirrol (Pi). Porm, o primeiro artigo

publicado que descreveu sua sntese e as propriedades condutoras desse polmero foi no

ano de 1968. O PPi um dos polmeros mais conhecidos, alm de ser tema de diversos

estudos, devido sua alta condutividade eltrica, boa estabilidade qumica, devido ao seu

baixo potencial de oxidao e versatilidade de sntese. Adicionalmente o PPI um dos

polmeros mais utilizados em aplicaes industriais devido sua longa estabilidade e sua

condutividade, e a possibilidade de formao de compsitos com propriedades

mecnicas excelentes (SAUNDERS, 1995).

O PPi pode ser obtido em soluo pelo uso de um oxidante qumico, atravs da

polimerizao qumica, ou por oxidao em um substrato condutor, na polimerizao

eletroqumica (NALWA, 1997). Na sntese eletroqumica, conhecida tambm como

eletropolimerizao, pode se ter um maior controle dos parmetros de produo dos

polmeros, podendo depositar filmes finos com espessuras na faixa entre 5 a 5000 nm.

Nessa tcnica, ocorre inicialmente oxidao do monmero Pi, o que leva a formao

de um intermedirio ction-radical, pela aplicao de uma diferena de potencial. Nesta

etapa, contra-ons so incorporados ao ction-radical para neutralizar a carga do sistema

(GUIMARD, 2007; SADKI, 2000). Em seguida, ocorre o acoplamento de dois ctions-

radicais, e atravs de uma transferncia de carga, acontece eliminao de dois prtons

com a formao de um dmero neutro. Essa propagao ocorre na mesma sequencia:

oxidao, acoplamento e liberao de prtons (WALLACE, 1985). Desse modo, as

cadeias de oligmeros vo sendo formadas e posteriormente as cadeias polimricas, de

forma que estas cheguem ao ponto de se tornarem pesadas demais e insolveis no

meio do eletrlito, precipitando sobre a superfcie do eletrodo (SADKI, 2000).

Muitos autores buscam funcionalizar a estrutura do anel heterocclico do pirrol,

usando seus derivados e copolmeros, na inteno de usar esses grupos qumicos na

imobilizao do biorreceptor na matriz polimrica. Em meio aos derivados do Pi

funcionalizados, encontra-se o Pi-2-cido carboxlico (Pi-2-COOH) que vem se

destacando como material eletroativo com interessantes propriedades para utilizao em

biossensores (Figura 6). FOSCHINI e colaboradores (2013), desenvolveram estudos

demonstrando experimentalmente a influncia do solvente empregado na soluo dos

monmeros de Pi-2-COOH, sobre as propriedades dos filmes produzidos por

30

voltametria cclica. Entretanto, temas como o mecanismo de eletropolimerizao,

propriedades eletrnicas e estruturais, graus de conjugao de espcies intermedirias

formadas aps a oxidao do Pi-2-COOH at esse momento, no foram abordadas.

Figura 6 Estrutura qumica do (a) monmero de Pi-2-COOH, (b) dmero e (c) oligmeros com 16 anis

conjugados aps a eletropolimerizao do Pi-2-COOH.

(Fonte: FOSCHINI et al., 2013)

2.4.2 Nanotubos de Haloisita

Nanomateriais diversos, tais como nanopartculas, nanofios, nanotubos, e

nanoesferas, tm sido utilizados para confeco de biossensores e imunossensores. Os

dispositivos baseados em nanomateriais apresentam bom desempenho, pois podem

oferecer uma nova oportunidade para amplificar o sinal da interao antgeno-anticorpo

em imunossensores, mediante incorporao de molculas imunorreativas aos

nanomateriais (FENG et al., 2003).

Um ramo da nanotecnologia que se encontra em desenvolvimento

principalmente focada em nanomateriais base de carbono e inorgnicos, como

nanotubos de carbono, grafeno e nanofios de metal (IIJIMA, 1991; TENNE et al.,

1992;. ENDO et al., 1996;. DRESSELHAUS et al. , 2001). Porm, outros sistemas que

nanoestruturados derivados de aluminossilicatos esto sendo investigados. Essas

estruturas tem ganhado destaque na literatura e surgem como um campo emergente na

pesquisa, podendo ser usadas como nanorreator de catalisadores seletivos, adsorvente,

encapsulamento, condutor inico e suporte para imobilizao (NAKAGAKI &

WYPYCH, 2007; KUC & HEINE, 2009).

Haloisita (halloysite), um argilomineral do grupo da caulinita, um

nanomaterial economicamente vivel, que ocorre amplamente em solos de regies

tropicais e subtropicais e rochas desgastadas, sendo formado pelo intemperismo de

muitos tipos de rochas. As partculas de haloisita podem adotar uma variedade de

31

morfologias (ex.: tubular, esfrica, pseudo-esfrica, prismtica, etc.), conforme as

condies de cristalizao e ocorrncias geolgicas, dentre as quais a forma tubular

denominada de nanotubo de haloisita (halloysite nanotube NTH) a mais encontrada

(NAKAGAKI & WYPYCH, 2007; LVOV et al., 2008; SANTOS et al., 2009). Apenas

se conhece a ocorrncia natural dos NTHs, sendo que este nanomaterial ainda no foi

sintetizado em laboratrio (WHITE et al., 2012). Atualmente, o maior pas exportador

de NTH a Nova Zelndia, mas existem depsitos expressivos tambm em outros

pases, como por exemplo: Austrlia, Frana, Marrocos, Filipinas, Coria do Sul, China,

Japo, USA, Guiana, Mxico e Brasil (JOUSSEIN et al., 2005; COELHO et al., 2007).

Os NTHs apresentam na configurao de folha octadrica gibsite (Al(OH)3),

modificado por grupos siloxano na superfcie externa. Os tubos de haloisita possuem

tamanho que varia de 500-1000 nm de comprimento, e dimetro interno de 15-100 nm

dependendo do substrato. Os NTHs possuem duas faces diferentes, sendo uma

composta por uma superfcie de silicato tetradrico Si-O-Si, enquanto a outra superfcie

tem uma camada octadrica gibsite Al(OH)3 (Figura 7). As cargas que os NTHs

possuem dentro e fora, esto relacionadas com sua estrutura e propriedades de adsoro

(GUIMARES et al., 2010), sendo a carga da parede interna do tubo carregada

positivamente, enquanto que a superfcie exterior tem uma carga negativa (LVOV et al.,

2008).

Figura 7 Representaes esquemticas da (A) estrutura cristalina da haloisita (10 ) e da (B) estrutura

de um NTH.

(Fonte: YUAN et al., 2008)

32

Em virtude do expressivo progresso alcanado atravs da nanotecnologia, os

NTHS, recentemente, tm recebido ateno de pesquisadores, sendo investigados como

materiais promissores para aplicaes em diversas reas, tais como na formao de

nanocompsitos com matrizes polimricas (YANG et al., 2010), imobilizao de

enzimas (SUN et al., 2010; ZHANG et al., 2011) e complexos metlicos (NAKAGAKI

e WYPYCH, 2007), liberao controlada de frmacos (LVOV et al., 2008), remoo de

metais (WANG et al., 2010), suporte para nanopartculas metlicas (LIU e ZHAO,

2009;) e construo de sensores e biossensores (SUN et al., 2010; ZHANG et al., 2011).

33

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Desenvolver uma plataforma sensora nanoestruturada empregando pirrol carboxlico

e nanotubos de haloista para deteco de nveis clnicos da cTnT, um importante

marcador do IAM.

3.2 Objetivos especficos

- Caracterizar e otimizar o mtodo de eletropolimerizao eletroqumica do Pi-2-

COOH;

- Desenvolver uma plataforma sensora empregando Pi-2-COOH e NTHs-NH2,

visando a aplicao em imunoensaios eletroqumicos;

- Realizar testes de imobilizao dos anticorpos anti-cTnT, para a avaliao da

funcionalidade do filme formado;

- Estabelecer as respostas do imunossensor para determinao eletroqumica da

cTnT, empregando as tcnicas de voltametria cclica e voltametria de onda quadrada ;

- Caracterizar o imunossensor proposto para cTnT quanto sensibilidade,

especificidade, reprodutibilidade e estabilidade operacional;

34

4. MATERIAIS E MTODOS

4.1 Reagentes

Troponina cardaca humana (cTnT) e anticorpos monoclonais anti-troponina T

cardaca humana (anti-cTnT) foram adquiridos da Calbiochem (EUA). Ferricianeto de

potssio (K3[Fe(CN)6]), ferrocianeto de potssio (K4[Fe(CN)6]), acetonitrilina (ACN),

glutaraldedo (50 % v/v) (Glut), N-hidroxi succinimida (NHS), N-etil-N-(3-

dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e glicina foram adquiridos da Sigma-Aldrich

(EUA). Pirrol-2-cido carboxlico (Pi-2-COOH) e nanotubos de haloisita (NTHs-NH2)

modificados com aminopropiltrietoxisilano (0,5-5% wt) e octadecilamina (15-35% wt)

tambm foram adquiridos da Sigma-Aldrich (EUA). Perclorato de ltio (LiClO4) e

clorofrmio foram obtidos da VETEC (Brasil).

O tampo fosfato salino (PBS) (0,01 M; pH 7,4) foi utilizado em todos os

experimentos para diluio das amostras biolgicas. Este foi preparado dissolvendo-se

0,2 g de cloreto de potssio (KCl), 8 g de cloreto de sdio (NaCl), 0,24 g de fosfato de

potssio monobsico anidro (KH2PO4) e 1,44 g de fosfato de sdio dibsico anidro

(Na2HPO4), todos obtidos da VETEC (Brasil), em 1000 mL de gua deionizada.

Todas as solues foram preparadas utilizando gua deionizada ultra pura obtida

atravs de sistema Millipore Milli-Q (EUA) com resistividade maior que 18 M/cm.

Os reagentes qumicos utilizados em todos os experimentos foram de grau analtico.

4.2 Equipamentos

As anlises eletroqumicas foram realizadas em um potenciostato modelo Ivium

Compact Stat (Ivium Technologies, Holanda) conectado a um microcomputador

utilizando o software Ivium Soft, para controle de potencial, aquisio e tratamento de

dados (Figura 8). Para tais experimentos, foi empregada uma clula eletroqumica

convencional de vidro, sem compartimento divisrio, com capacidade de 20 mL e

tampa de policloreto de vinila. O sistema eletroqumico foi composto por: um eletrodo

de carbono vtreo (ECV) com rea de 0,7 mm2

como eletrodo de trabalho; um eletrodo

helicoidal de fio de platina como auxiliar e um eletrodo de Ag/AgCl, com soluo

35

interna de KCl saturado (3,0 M) como referncia, sendo todos adquiridos da

Microqumica (Brasil).

Figura 8 Potenciostato modelo Ivium Compact Stat acoplado ao microcomputador.

4.3 Preparao do eletrodo de trabalho

Previamente a sua utilizao em ensaios eletroqumicos, o ECV foi submetido a um

procedimento mecnico de limpeza. Esta etapa consistiu no polimento da superfcie do

ECV com um tecido aveludado embebido em alumina de granulometria de 0,5 m

durante 3 minutos. Para remoo de partculas de alumina e outros contaminantes, o

ECV foi submetido a duas agitaes, em banho ultrassnico por 1 minuto, em gua

ultrapura e etanol. Anlises por VC em K3[Fe(CN)6 /K4[Fe(CN)6] (0,005 M) preparado

em KCl (0,1M) foram realizadas aps o procedimento de polimento do ECV para

caracterizao do perfil dos picos redox do eletrodo. Esses voltamogramas foram ento

utilizados como linha de base para as leituras subsequentes, verificando assim as

modificaes da interface sensora atravs das variaes das correntes de oxidao e

reduo.

4.4 Eletropolimerizao do Pi-2-COOH

Para eletropolimerizao do Pi-2-COOH a tcnica de VC foi selecionada. Em

uma clula eletroqumica contendo a soluo de monmeros de Pi-2-COOH, o ECV

36

previamente limpo, foi submetido a 20 ciclos voltamtricos na faixa de potencial de -0,1

a 1,0 V vs. Ag/AgCl (KCl Sat.), sob velocidade de varredura de 20 mV/s para eletrossntese

do polmero. A soluo monomrica de Pi-2-COOH (0,01M) foi preparada em ACN

contendo 0,1 M de LiClO4.

Outras metodologias de eletropolimerizao tambm foram realizadas:

a) Eletropolimerizao do Pi-2-COOH (0,01 M) em uma soluo aquosa de H2SO4

(0,5 M) durante 20 ciclos voltamtricos na faixa de potencial de 0 a 1 V vs.

Ag/AgCl (KCl Sat.), a taxa de varredura de 20 mV/s (JANMANEE, 2012);

b) Eletropolimerizao do Pi-2-COOH (0,01 M) em uma soluo aquosa de KCl (0,1

M) durante 20 ciclos voltamtricos na faixa de potencial de -0,8 a 0,8 V vs.

Ag/AgCl (KCl Sat.) a velocidade de varredura de 20 mV/s (TRUONG, 2011).

4.5 Construo do filme de Pi-2-COOH/ NTHs-NH2

O ECV eletropolimerizado com PPi-2-COOH foi modificado com filme de

NTHs-NH2 preparado em clorofrmio. Os grupamentos carboxlicos terminais do filme

de Pi-2-COOH foram previamente ativados com uma soluo de EDC (0,002 M) e NHS

(0,005 M) preparada em gua deionizada durante 60 minutos a temperatura ambiente.

Aps este procedimento, 3L da soluo de NTHs- NH2 em clorofrmio foi depositado

sobre o ECV. O eletrodo foi mantido por 10 minutos em uma estufa ajustada para

temperatura de 40C para evaporao do solvente. Curvas de concentrao do Pi-2-

COOH e de NTHs-NH2 foram obtidas para otimizao da plataforma sensora.

4.6 Imobilizao dos anticorpos anti-cTnT

Para imobilizao do anti-cTnT a superfcie do ECV modificada com o Pi-2-COOH/

NTHs-NH2 foi incubada com uma soluo aquosa de GLUT (5 %) durante 60 minutos.

Em seguida, uma alquota de 5 L da soluo de anticorpos anti-cTnT foi pipetada

sobre o ECV e mantida durante 60 minutos em cmera mida temperatura ambiente.

Os stios livres no-especficos do anti-cTnT foram bloqueados utilizando uma soluo

de glicina (0,005M) durante 30 minutos. Aps esta etapa, os ECVs foram incubados

com solues de diferentes concentraes de cTnT diludas em PBS (pH 7,4; 0,01 M)

37

(Figura 9). Entre as etapas do imunoensaio a superfcie eletrdica foi lavada

cuidadosamente com tampo PBS (pH 7,4; 0,01 M).

Figura 9 Etapas de construo do imunossensor.

4.7 Imunoensaio eletroqumico

Para caracterizao das etapas de modificao do ECV anlises por VC foram

realizadas em K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (5 mM) preparado em KCl (100 mM). Os

voltamogramas do ECV foram obtidos na faixa de potencial de -0,2 a 0,7 V vs.

Ag/AgCl (KCl Sat.), a velocidade de varredura de 100 mV/s. A interao antgeno-

anticorpo na superfcie do eletrodo foi monitorada em tempo real, utilizando a tcnica

eletroqumica de voltametria de onda quadrada (SWV). O pulso diferencial foram

registrados de 0 V a 0,6 V vs. Ag/AgCl (KCl Sat.), com amplitude de pulso de 10 mV,

largura de 10 ms e potencial de 100 mV/s. A resposta analtica para cTnT foi obtida

pela diferena entre a altura dos picos de corrente (I) da VPD do ECV com a cTnT em

relao ao branco, ou seja, antes da incubao cTnT.

38

4.8 Otimizao dos parmetros experimentais

4.8.1 Influncia da velocidade de varredura na eletropolimerizao do Pi-2-COOH

A taxa de varredura do processo de eletropolimerizao do Pi-2-COOH foi

investigada para otimizar as condies de formao do filme polimrico em relao ao

consumo de monmeros na interface. O ECV limpo foi submetido a diferentes taxas de

eletropolimerizao e o perfil voltamtrico em K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (0,005 M)

preparado em KCl (0,1M) foi subsequentemente registrado para avaliao da

polimerizao do Pi-2-COOH.

4.8.2 Estudo de estabilidade do filme de Pi-2-COOH/NTH

A estabilidade do filme de Pi-2-COOH e NTHs-NH2 foi estudada, realizando-se

20 sucessivas varreduras do mesmo eletrodo, na janela de potencial -0,2 a 0,7 V vs.

Ag/AgCl (KCl Sat.), sob velocidade de varredura de 100 mV/s, em soluo de

K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 (0,005 M) preparada em KCl (0,1 M). A estabilidade do Pi-2-

COOH/NTH no ECV foi avaliado a partir do conhecimento do coeficiente de variao

(CV) obtido entre os experimentos. Como controle, foram usados ECV apenas com o

filme de NHT;.

4.8.3 Influncia da velocidade de varredura

Para investigar os mecanismos eletroqumicos envolvidos na resposta analtica

do imunossensor, o ECV/Pi-2-COOH/ NTHs-NH2 foi submetido anlises por VC a

diferentes velocidades de varredura (10; 25; 50; 75; 100; 125; 150; 175 e 200 mV/s), em

soluo de K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (0,005 M) preparada em KCl (0,1M). O

comportamento eletroqumico do filme nanoestruturado foi avaliado atravs da relao

dos Ipa e Ipc vs. a raiz quadrada da velocidade de varredura (v1/2

).

39

4.8.4 Influncia da concentrao de anticorpo e tempo de imunorreao

A influncia da concentrao dos anticorpos anti-cTnT sobre o desempenho do

imunossensor foi investigado. Neste estudo, o ECV/Pi-2-COOH/ NTHs-NH2/GLUT foi

incubados durante 60 minutos com anticorpos anti-cTnT a diferentes concentraes

(0,1; 0,5; 1; 2,5; 5, 7,5 e 10 g/mL). Os VCs foram registrados na mesma faixa de

potencial dos estudos anteriores e conduzido em K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (0,005 M)

preparado em KCl (0,1 M). Para analisar o efeito do tempo de interao antgeno-

anticorpo na interface sensora, o ECV/Pi-2-COOH/NTHs-NH2/Glut/Glicina foi

incubado com 0,5 ng/mL da cTnT durante 10, 20, 30, 40, 50, 60 min. Em seguida, os

eletrodos foram submetidos a anlises por VC.

4.8.5 Curva de calibrao

A curva de calibrao do imunossensor proposto para as diferentes

concentraes de cTnT foi verificada utilizando a tcnica de voltametria de onda

quadrada (SWV). Para tais experimentos, sucessivas adies de amostras de cTnT,

preparadas em tampo PBS (0,01M, pH 7,4), foram pipetadas sobre a superfcie do

ECV/Pi-2-COOH/ NTHs-NH2/GLUT/Glicina e mantidas durante o tempo timo de

incubao. As medidas de corrente do ECV/Pi-2-COOH/NTHs-NH2/GLUT/Glicina

foram consideradas como controle no estudo.

40

5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Caracterizao da eletropolimerizao do Pi-2-COOH

As propriedades dos filmes de Pi e seus derivados so dependentes de sua

microestrutura, as quais esto relacionadas ao grau de ordenao da cadeia. Estudos

desenvolvidos por LAKHDAR & MAYR (2011) sobre a sntese eletroqumica do PPi

demonstraram que a organizao da cadeia polimrica determinada principalmente

pela escolha do contra-on e condies de sntese. O contra-on atua para manter a

neutralidade de carga do sistema. No caso do Pi, cuja eletrossntese iniciada com a

oxidao dos monmeros gerando um composto catinico. necessrio a incorporao

de um contra-on aninico, equilibrando as cargas para o desencadeamento da

polimerizao (SADKI et al., 2000). De maneira geral, os contra-ons mais

estabelecidos na literatura para a sntese do Pi so os sais com anins fluoratos,

percloratos, sulfonatos e cloretos (TAMM et al., 2002). Entretanto, poucos estudos tm

investigado a ao destes contra-ons no processo de eletropolimerizao de derivados

do Pi.

Com o objetivo de padronizar o mtodo de eletropolimerizao do Pi-2-COOH,

diferentes metodologias de eletropolimerizao foram investigadas, nas quais os contra-

ons H2SO4, KCl e LiClO4 foram utilizados em condies experimentais especficas. O

grfico comparativo dos VCs em K3[Fe(CN)6 /K4[Fe(CN)6] (0,005 M) do ECV limpo e

eletropolimerizado com as diferentes metodologias pode ser analisado na Figura 10.

Na metodologia empregando o H2SO4 como contra-on, observa-se uma

irreversibilidade dos picos redox com a formao de um filme isolante (Figura 10 (b)).

O ECV quando eletropolimerizado em KCl apresentou um suave deslocamento de

potencial e uma reduo das correntes andica e catdica em relao ao eletrodo no

modificado (Figura 10 (c)). Estes dados provavelmente indicam a formao de um

filme fino de Pi-2-COOH, devido ao pouco consumo de monmeros durante a

polimerizao na interface sensora. O VC do estudo empregando o LiClO4 como

contra-on apresentou uma reduo maior dos valores de corrente quando comparado ao

contra-on KCl, exibindo picos redox definidos e reversveis (Figura 10 (d)). O perfil

eletroqumico obtido demonstra que o contra-on LiClO4 influenciou na resposta do

sensor, contribuindo para a formao de um filme isolante mais uniforme.

41

A influncia da velocidade de varredura sobre a eletropolimerizao do Pi-2-

COOH no ECV foi analisada para padronizao da construo do filme polimrico.

Para estes ensaios, o ECV limpo foi imerso em uma soluo de 0,01 M de Pi-2-COOH e

0,1 M de LiClO4, ambas preparadas em ACN, e submetido a 20 ciclos voltamtricos

sob diferentes velocidades de varredura (10, 20, 40, 80 e 100 mV/s). O perfil

eletroqumico dos Ipa e Ipc do ECV eletropolimerizado em relao s velocidades de

varredura de eletropolimerizao pode ser observado na Figura 11.

As variaes de corrente nos resultados obtidos demonstram que a quantidade de

Pi-2-COOH eletropolimerizado na superfcie do ECV foi inversamente proporcional

velocidade de varredura, ou seja, com o aumento da velocidade de varredura h uma

diminuio da taxa de eletropolimerizao do monmero. Esta relao pode ser

evidenciada comparando os voltamogramas do ECV limpo e eletropolimerizado sob os

Figura 10 Influncia dos contra-ons empregados no processo de eletropolimerizao do Pi-2-

COOH: (a) ECV limpo, (b) ECV eletropolimerizado em H2SO4 (0,5 M), (c) ECV eletropolimerizado

em KCl (0,1 M) e (d) ECV eletropolimerizado em LiClO4 (0,1 M). Voltamogramas obtidos em

K3[Fe(CN)6 /K4[Fe(CN)6] (0,005 M) preparado em KCl (0,1 M) a velocidade de varredura de 100

mV/s.

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

-30

-20

-10

0

10

20

30

I (

E (V) vs Ag/AgCl (KCl sat)

(a)

(b)

(c)

(d)

42

maiores valores de velocidade, nos quais houve pouca variao de corrente do eletrodo

eletropolimerizado em relao ao eletrodo no modificado. Reduzindo a taxa de

velocidade de varredura observa-se a formao de um filme eletroinativo, ou seja,

caracterstico de um polmero isolante sobre a superfcie do eletrodo. Assim, os

resultados indicam que o processo de eletropolimerizao do Pi-2-COOH controlado

pela difuso de eltrons durante o consumo de monmeros na interface sensora.

A diferena entre Epa e Epc oferece informaes importantes sobre a formao

do filme polimrico na superfcie sensora. Os valores de Ep (Ep= Epa - Epc)

geralmente aumentam com a quantidade de polmero eletropolimerizado, uma vez que,

nestas condies, h uma tendncia reduo da transferncia de eltrons, exibindo

uma maior separao dos picos andicos e catdicos (RIBEIRO et al., 2006). Os ECVs

apresentaram um valor mximo de E quando a taxa de varredura de

eletropolimerizao do Pi-2-COOH de 20 mV/s foi empregada (Figura 11, inset).

Figura 11 Influncia da taxa de velocidade de varredura no processo de eletropolimerizao e

construo do filme de Pi-2-COOH: (a) ECV limpo, (b) ECV eletropolimerizado a 10 mV/s, (c) ECV

eletropolimerizado a 20 mV/s, (d) ECV eletropolimerizado a 40 mV/s, (e) ECV eletropolimerizado a 80

mV/s e (f) ECV eletropolimerizado a 100 mV/s. Inset: Relao entre os valores de Ep e velocidade de

varredura de eletropolimerizao. VCs realizados em K3[Fe(CN)6 /K4[Fe(CN)6] (0,005 M) preparado em

KCl (0,1 M), sob velocidade de varredura de 100 mV/s.

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-200

-100

0

100

200

0 20 40 60 80 1000.10

0.15

0.20

0.25

0.30

E

(V

)

Velocidade de varredura (mV/s)

(e)(d)

(b)

I (

A)

E (V) vs. Ag/AgCl (KCl sat)

(a)(f)

(c)

43

Os VCs na Figura 12 apresentam o perfil eletroqumico da eletropolimerizao

do Pi-2-COOH (0,01 M) em perclorato de ltio (0,1M) preparado em ACN durante 20

ciclos, sob velocidade de varredura de 20 mV/s. Durante as sucessivas varreduras

observa-se uma reduo dos valores de corrente dos voltamogramas do ECV, indicando

uma queda na concentrao do Pi-2-COOH devido ao consumo de monmeros na

interface sensora e formao de dmeros e espcies oligomricas at atingirem um

tamanho crtico.

Aps a caracterizao eletroqumica da eletropolimerizao do filme de Pi-2-

COOH, um estudo de concentrao do monmero foi realizado. Diferentes solues de

Pi-2-COOH nas concentraes de 0,001, 0,01, 0,02 e 0,03 M foram eletropolimerizadas

sobre o ECV limpo. Os VCs dos ECVs nas concentraes especficas dos monmeros

em relao ao eletrodo limpo podem ser visualizados na Figura 13. Os valores em Ipa e

Ipc exibiram uma resposta mxima na concentrao de 0,01 M. O eletrodo

eletropolimerizado em concentraes acima de 0,01 M apresentou uma reduo da taxa

Figura 12 Perfil eletroqumico do processo de eletropolimerizao do Pi-2-COOH (0,01 M) durante

20 ciclos voltamtricos em soluo de 0,1 M de LiClO4 preparada em ACN, sob velocidade de

varredura de 20 mV/s.

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

20

I (

E (V) vs. Ag/AgCl(KCl sat)

1

44

de monmero eletropolimerizado, indicando uma saturao do sistema para formao

do filme de Pi-2-COOH. Assim, a concentrao de 0,01 M foi adotada como tima para

os estudos subsequentes.

5.2 Construo do filme de Pi-2-COOH/NTH-NH2

Os nanomateriais derivados da haloisita podem ser facilmente intercalados em

sua estrutura cristalina com molculas de gua, bem como outros compostos orgnicos e

inorgnicos, tais como formamida, etilenoglicol, dentre outros (DEEPAK &

AGRAWAL, 2012). Estudos desenvolvidos por HAROOSH e colaboradores (2011)

demonstram que a intercalao desses solventes pode influenciar no espaamento entre

os tubos, no dimetro do nanomineral e na condutividade do mesmo. Neste trabalho, o

clorofrmio foi escolhido para disperso do NTH-NH2 e obteno de filmes

Figura 13 VCs do ECVs modificado com diferentes concentraes de Pi-2-COOH: (a) ECV limpo,

(b) ECV/Pi-2-COOH 0,001 M, (c) ECV/Pi-2-COOH 0,01 M, (d) ECV/Pi-2-COOH 0,02 M e (e)

ECV/Pi-2-COOH 0,03 M. VCs realizados em soluo de K3[Fe(CN)6 /K4[Fe(CN)6] (0,005 M)

preparada em KCl (0,1 M), sob velocidade de varredura de 100 mV/s.

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-200

-100

0

100

200

I (

A)


(a)

(b)

(c)(d)

(e)

45

nanoestruturados sobre a superfcie de ECVs. O perfil eletroqumico do estudo de

preparo da haloisita em funo do seu dispersante pode ser observado na Figura 14. Os

VCs do ECV limpo (Figura 14 (a)) e modificado apenas com clorofrmio (Figura 14

(b)) foram utilizados como controles para analisar a influncia do filme de NTHs-NH2

sobre o ECV.

A influncia do filme de NTHs-NH2 em clorofrmio (5 mg/mL) sobre a resposta

eletroqumica do ECV (Figura 14 (c)) revelou uma reduo acentuada dos valores dos

picos redox quando comparada aos voltamogramas anteriores. Estes dados esto

relacionados formao de um filme resistivo na interface sensora associado natureza

semicondutora do nanomaterial, como descrito por CAO et al. (2012) no

desenvolvimento de nanocompsitos de NTH conjugados a nanopartculas metlicas.

Assim, o solvente escolhido como dispersante dos NTHs-NH2 para o preparo do filme

teve pouca interferncia na obteno do perfil eletroqumico caracterstico do

nanomaterial.

Figura 14 VCs da influncia do filme de NTHs-NH2 em clorofrmio sobre o perfil eletroqumico do

ECV: (a) ECV limpo, (b) ECV modificado com clorofrmio e (c) ECV modificado um filme de NTH-

NH2 (5 mg/mL) preparado em clorofrmio. Medidas realizadas em soluo de 0,005 M de

K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 preparada em 0,1 M de KCl.

-0.50 -0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00-150

-100

-50

0

50

100

150

I (

A)

E (V) vs. Ag/AgCl(KCl sat)

(a)(b)

(c)

46

Para otimizao da construo da plataforma sensora, a concentrao dos NTHs-

NH2 em relao ao filme de Pi-2-COOH foi avaliada. Neste ensaio, o ECV previamente

eletropolimerizado com Pi-2-COOH (0,01 M) e ativado com EDC/NHS foi incubado

durante 10 minutos com diferentes concentraes dos nanotubos (1 a 10 mg/mL). Os

valores de Ipa do ECV modificado com concentraes especficas dos NTHs-NH2

podem ser visualizados na Figura 15. Os dados obtidos exibiram uma resposta mxima

de corrente na concentrao de 5 mg/mL de NHT-NH2, indicando assim, que nesta

concentrao h uma proporcionalidade entre a quantidade dos grupos do reativos do

polmero e do nanotubo na interface sensora.

Figura 15 Influncia das diferentes concentraes de NTHs-NH2 sobre ECV previamente

eletropolimerizado com o Pi-2-COOH: (a) 1 mg/mL, (b) 2,5 mg/mL; (c) 5 mg/mL, (d) 7,5 mg/mL e (e)

10 mg/mL. Medidas realizadas em soluo de 0,005 M de K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 preparada em 0,1 M de

KCl.

0 2 4 6 8 10

40

50

60

70

80

90

100

110

I (

)

HNT-NH2 (mg/mL)

Posteriormente, a estabilidade do filme de Pi-2-COOH/NTHs-NH2 foi

investigada submetendo o ECV modificado a 20 sucessivos ciclos voltamtricos em

uma soluo de K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] (0,005 M). Paralelamente, um estudo

controle foi realizado adsorvendo os NTHs-NH2 diretamente sobre a superfcie do ECV

limpo com objetivo de comparar a estabilidade da interao do Pi-2-COOH com a

haloisita. Os VCs do ECV modificado apenas com HNTs-NH2 (5 mg/mL) na Figura 16

(a) apresentaram um CV de 3,2% e 2,9% para os valores de Ipa e Ipc, respectivamente.

47

Comparando com os VCs do eletrodo com Pi-2-COOH e NTH-NH2, Figura 16 (b), as

sucessivas voltametrias exibiram uma maior estabilidade e um decrscimo significativo

das variaes de corrente. O CV calculado para as correntes de Ipa e Ipc do ECV/Pi-2-

COOH /NTH-NH2 foram de 0,61% e 0,44%, respectivamente. Os dados obtidos

demonstam um aumento de cinco vezes da estabilidade do filme. Os grupos

carboxlicos ativados com EDC/NHS do Pi-2-COOH eletropolimerizado reage com os

grupamentos amina da haloisita possibilitando uma maior estabilidade do filme, em

relao ao seu estudo controle. O EDC/NHS viabiliza a converso dos grupos

carboxlicos em steres NHS amino-reativos (PEI et al., 2010). Estes grupos so

susceptveis ao ataque nucleoflico a partir de grupamentos amina da HNT

funcionalizada, resultando na formao de um ligao covalente e estvel entre os

materiais.

Figura 16 Estabilidade eletroqumica do ECV modificado com (a) NTHs-NH2 e (b) Pi-2-COOH/NTHs-

NH2 quando submetidos a 20 sucessivos ciclos voltamtricos. Medidas realizadas em soluo de 0,005 M

de K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 preparada em 0,1 M de KCl.

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-200

-150

-100

-50

0

50

100

150

200

I (

A)


(a)

48

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-200

-150

-100

-50

0

50

100

150

200

I (

A)


(b)

A transferncia de eltrons na interface sensora modificada com o filme de Pi-2-

COOH/NTHs-NH2 foi avaliada submetendo o ECV a leituras em diferentes velocidades

de varredura (10 a 200 mV/s). De acordo com os VCs obtidos na Figura 17, os

potenciais dos Ipa e Ipc no variaram em funo da velocidade de varredura selecionada

para o estudo. Estes resultados demonstram que o filme apresentou uma boa

reversibilidade eletroqumica. Os valores em corrente dos picos redox em relao raiz

quadrada das velocidades de varredura, apresentados no inset da Figura 17, variaram

proporcionalmente, sugerindo um processo controlado por difuso (BARD &

FAULKNER, 2006).

49

Figura 17 VCs do ECV/Pi-2-COOH/HNT-NH2 sob diferentes velocidades de varredura (a h: 10, 25,

50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 e 300 mV/s). VCs realizados em K3[Fe(CN)6 /K4[Fe(CN)6]

(0,005 M) preparado em KCl (0,1 M).

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

-200

-150

-100

-50

0

50

100

150

200

2 4 6 8 10 12 14 16 18-150

-100

-50

0

50

100

150

Ipa

Ipc

I (

A)

Velovidade de varredura1/2

(mV/s)

I (


(a)

(h)

5.3 Caracterizao eletroqumica do imunossensor

A caracterizao eletroqumica da imobilizao dos anticorpos anti-cTnT na

superfcie do eletrodo foi realizada utilizando as tcnicas de VC e VPD, Figura 18,

respectivamente. Comparando os voltamogramas do estudo, observa-se uma reduo

proporcional dos picos redox do ECV/Pi-2-COOH (Figura 18 (b)) e ECV/Pi-2-

COOH/NTHs-NH2 (Figura 18 (c)) em relao ao ECV limpo (Figura 18 (a)). Esse

perfil demonstra a contribuio resistiva do filme de Pi-2-COOH e haloisita. As pores

terminais aldedo do GLUT foram empregadas para imobilizao covalente dos

anticorpos anti-cTnT na superfcie sensora (Figura 18 (d)). Os grupos dialdedos

reagem com as aminas livres tanto da haloisita como do anticorpo, resultando na

formao de uma ligao c

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