Relatório Final do Projecto PIDDAC 840/2002horta.0catch.com/aemh/PIDDAC 840 RELATORIO FINAL.pdf ·...

30
Relatório Final do Projecto PIDDAC 840/2002 Modulação da composição lipídica de embriões bovinos produzidos in vitro e seus efeitos sobre a qualidade e resistência à congelação/descongelação. Responsável : Pereira, RM. Equipa : Marques, CC; Vasques, MI; Baptista, MC; Cunha, TP; Bessa, R; Horta, AEM. Departamento de Reprodução Animal Estação Zootécnica Nacional Instituto Nacional de Investigação Agrária e Pescas Vale de Santarém Março de 2005

Transcript of Relatório Final do Projecto PIDDAC 840/2002horta.0catch.com/aemh/PIDDAC 840 RELATORIO FINAL.pdf ·...

Relatório Final do Projecto PIDDAC 840/2002

Modulação da composição lipídica de embriões bovinos produzidos in vitro e seus efeitos sobre a qualidade e resistência à congelação/descongelação.

Responsável: Pereira, RM. Equipa: Marques, CC; Vasques, MI; Baptista, MC; Cunha, TP; Bessa, R; Horta, AEM.

Departamento de Reprodução Animal Estação Zootécnica Nacional

Instituto Nacional de Investigação Agrária e Pescas Vale de Santarém

Março de 2005

2

Relatório Final do Projecto PIDDAC 840/02

Título: Modulação da composição lipídica de embriões bovinos produzidos in vitro e seus efeitos sobre a qualidade e resistência à congelação/descongelação. Investigador Responsável: Rosa Maria Lino Neto Pereira. Equipa de Investigação

Código Nome Categoria ETI Total

73650 Rosa Maria Lino Neto Pereira Inv. Auxil. 0,90

77311 Rui José Branquinho Bessa Inv. Auxil. 0,30

8365 António Eduardo Monteiro Horta Inv. Coord. 0,60

14245 Carla Maria F.C.V. Marques Inv. Auxil. 0,60

73650 Maria Irene A.M.R. Vasques Inv. Auxil. 0,60

47310 Maria da Conceição C. Baptista Inv. Auxil. 0,60

75325 Teresa P.C. Cunha Téc. Sup. Princ. 0,45

Localização: Este projecto foi realizado nos Departamentos de Genética e Melhoramento Animal, Nutrição e Alimentação Animal e Reprodução Animal da Estação Zootécnica Nacional, localizados no Vale de Santarém. Cooperação com outras instituições: Algumas das técnicas desenvolvidas foram realizadas em colaboração com os Laboratórios GIE-Morfogénese e Affymetrix Score Facility do Instituto Gulbenkian da Ciência e o Laboratório de Anatomia Patológica dos Hospitais Universitários de Coimbra.

Início: Janeiro de 2002 Fim: Dezembro de 2004

3

1. OBJECTIVOS. Os embriões bovinos produzidos in vitro (IVP) apresentam uma menor

viabilidade após transferência para vacas receptoras e uma grande sensibilidade à criopreservação, quando comparados com os embriões in vivo. Esta susceptibilidade à congelação parece estar relacionada com as condições de cultura in vitro, nomeadamente a inclusão de soro nos meios de cultura, que originam uma blastulação prematura e acumulação de lípidos no citoplasma dos embriões. Estes embriões IVP contêm mais triglicéridos e menos lípidos das outras classes (fosfolípidos e esteres de colestrol) que os in vivo. Esta diferença, aliada a baixas concentrações de ácidos gordos polinsaturados nos fosfolípidos membranários dos oócitos e embriões, pode ser responsável pela grande susceptibilidade à congelação dos embriões IVP.

Neste projecto pretendeu-se estudar a composição lipídica de oócitos e embriões IVP para identificar e, se possível, manipular os mecanismos da acumulação quantitativa e qualitativa em ácidos gordos. Utilizaram-se duas estratégias para diminuir a deposição lipídica exagerada nos embriões. A 1ª através da inclusão de um isómero conjugado do ácido linoleico - CLA (C18:2 trans-10, cis-12) no sistema de cultura tradicional com células da granulosa e soro. Este isómero de CLA bloqueia a entrada de ácidos gordos nos adipócitos, podendo impedir deste modo a deposição excessiva de ácidos gordos nos embriões. A segunda estratégia foi a cultura dos embriões em meio definido (fluido sintético do oviducto modificado, mSOF) sem soro, diminuindo a fonte exógena de ácidos gordos.

Numa 2ª fase pretendeu-se manipular a composição em ácidos gordos dos lípidos dos embriões, sobretudo a nível dos fosfolípidos membranários, através da incorporação de ácidos gordos polinsaturados, o ácido araquidónico (C20:4 n-6) e o eicosapentaenóico (C20:5 n-3). Esta incorporação foi realizada nos meios de maturação dos oócitos ou nos meios de cultura dos embriões.

Constou igualmente como objectivo deste projecto a implementação de técnicas de biologia molecular para identificar a expressão dos enzimas ciclo-oxigenase 1 e 2, capazes de metabolizar os ácidos gordos referidos, nos diferentes estadios do desenvolvimento embrionário e de análise do perfil lípidico em oócitos e embriões.

Como objectivo final pretendeu-se melhorar a qualidade e resistência à congelação/descongelação dos embriões bovinos produzidos in vitro.

2. RESUMO.

Os embriões bovinos produzidos in vitro (IVP) com meios suplementados com soro caracterizam-se por uma acumulação excessiva de lípidos no citoplasma aliada a uma grande susceptibilidade à congelação. Neste projecto pretendeu-se estudar a composição lipídica de oócitos e embriões IVP para identificar e, se possível, manipular os mecanismos da acumulação quantitativa e qualitativa em ácidos gordos.

Blastócistos produzidos in vitro em co-cultura com células da granulosa e em meios com soro apresentam na sua composição significativamente mais ácidos gordos saturados do que os oócitos maturados (P=0,01) e imaturos (P=0,09). Estes embriões têm menos (P=0,07) ácidos gordos monoinsaturados que os oócitos maturados. A acumulação preferencial de ácidos gordos saturados nos embriões cultivados em meios com soro pode explicar a grande susceptibilidade destes embriões à congelação. Por

4

outro lado, o perfil em ácidos gordos dos embriões IVP difere do perfil em ácidos gordos do soro presente nos meios de cultura, verificando-se o mesmo nos oócitos maturados. Parece assim que os oócitos e embriões em cultura têm mecanismos capazes de seleccionar a acumulação de ácidos gordos, mostrando preferência pelos ácidos gordos “familiares” disponíveis nos meios de cultura.

Foram implementadas com sucesso duas estratégias para diminuir a deposição lipídica nos embriões IVP e melhorar a sua resistência à congelação / descongelação. A 1ª através da inclusão de um isómero conjugado do ácido linoleico - CLA (C18:2 trans-10, cis-12) no sistema de cultura tradicional com células da granulosa e soro. A segunda estratégia foi a cultura dos embriões em meio definido (mSOF) sem soro, diminuindo a fonte exógena de ácidos gordos. Os resultados mostram que o CLA melhora a sobrevivência após congelação de embriões cultivados com soro sem interferir nas taxas de produção de embriões. A cultura dos embriões em meios definidos, embora com melhores resultados na sobrevivência pós-descongelação do que a de embriões cultivados no sistema tradicional com soro, origina taxas de embriões D7/D8 menores (menos 10%). Embriões produzidos em mSOF acumulam menos gotículas lipídicas que os embriões produzidos com soro, mesmo na presença de CLA, não conseguindo, no entanto, igualar as taxas de integridade e re-expansão pós descongelação dos embriões cultivados com soro e CLA. Estes dados sugerem que o CLA, para além de reduzir a acumulação lipídica em embriões cultivados com soro, poderá actuar através de outros mecanismos na protecção dos embriões IVP durante a congelação/ descongelação.

Numa 2ª fase pretendeu-se manipular a composição em ácidos gordos dos lípidos dos embriões através da incorporação de ácidos gordos polinsaturados, o ácido araquidónico (C20:4n-6) e o eicosapentaenóico (C20:5 n-3). A suplementação dos meios de cultura de embriões com 3 doses (1, 10 e 100 µM) de C20:4n-6 aumentou significativamente (P=0,04) a taxa de clivagem, apenas na dose mais elevada, não interferindo nas taxas de embriões D7/D8 ou eclodidos. A qualidade dos embriões também melhorou com a dose de 100 µM de C20:4n-6. Pelo contrário, a suplementação dos meios de cultura de embriões com C20:5n-3 não interferiu na taxa de clivagem, mas também melhorou a qualidade dos embriões produzidos na dose de 10 µM. A suplementação do meio de maturação de oócitos com duas concentrações (10 e 100 µM) de C20:4n-6 ou de C20:5n-3 não afectou significativamente as taxas de maturação, mas interferiu no desenvolvimento embrionário posterior. A maturação dos oócitos com 100 µM de C20:4n-6 aumentou a taxa de embriões D7/D8 quando comparado com a dose de 100 µM de C20:5n-3 (P=0,02) ou com a testemunha (P=0,08). Estes ácidos gordos polinsaturados adicionados ao meio de maturação dos oócitos não interferiram na qualidade dos embriões produzidos nem na sua resistência à congelação/descongelação. Os presentes resultados e a demonstração inédita de que os embriões bovinos produzidos in vitro expressam a isoforma induzida da COX, a COX-2, apontam para a importância da via metabólica do ácido araquidónico no desenvolvimento embrionário preimplantatório. Recomenda-se a suplementação dos meios de cultura de oócitos e/ou embriões com glutatião peroxidase e os ácidos gordos polinsaturados C20:4n-6 e C20:5n-3, nas doses referidas, por contribuírem para uma melhoria significativa no número e qualidade dos embriões produzidos.

5

3. MATERIAL E MÉTODOS.

3.1. Delineamento experimental. O delineamento experimental e posterior apresentação dos resultados referentes

aos três anos do presente projecto estão divididos em três grandes experiências. Esta divisão foi realizada para melhor esquematização dos resultados, pois a numeração das experiências não respeita uma ordem cronológica e os temas apresentados estão interrelacionados.

Experiência 1 A experiência 1 pode ser considerada uma experiência prévia onde se pretendeu

implementar técnicas de extracção lipídica e de análise de ácidos gordos por cromatografia gasosa e de extracção de RNA e “reverse transcription-polymerase chain reaction” (RT-PCR) em oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro. Estas técnicas nunca tinham sido realizadas nos nossos laboratórios da EZN nem no Instituto Gulbenkian da Ciência.

Para o estudo do perfil de ácidos gordos em oócitos e embriões IVP foram efectuados 4 ensaios. No 1º ensaio foram realizadas 6 sessões de produção in vitro de embriões, das quais foram recolhidas amostras de oócitos imaturos e maturados e embriões, no estadio de 2-4 células e blastócitos, para estabelecer o número de oócitos e embriões a utilizar por amostra e o método cromatográfico mais eficaz para a determinação do perfil de ácidos gordos. No 2º ensaio (4 sessões), foi melhorado o procedimento de extracção e de derivatização dos ácidos gordos, tendo-se para isso, tentado várias metodologias (metilação em meio ácido e em meio básico e extracção e metilação conjunta - Sukhija e Palmquist dos ácidos gordos extraídos das amostras). No 3º ensaio procedeu-se à comparação da extracção dos lípidos de amostras frescas e congeladas (2 sessões). Por fim realizou-se um último ensaio, o 4º ensaio, para caracterizar o perfil lipídico de oócitos e embriões produzidos in vitro no nosso sistema de cultura (12 sessões) onde foram analisados 5 amostras de oócitos imaturos (n=541), 5 amostras de oócitos maturados (n=514) e 5 amostras de blastócitos (n=92) pelo método entretanto implementado.

Para a identificação da expressão dos enzimas ciclo-oxigenase 1 e 2, capazes de metabolizar os ácidos gordos disponibilizados aos oócitos e embriões na experiência 3, foram realizados 3 ensaios. Em todos os ensaios, os oócitos maturados in vitro foram inseminados e, 22 horas depois, transferidos (n=2653) para o sistema tradicional de cultura de embriões com células da granulosa. Em qualquer dos ensaios (1º ensaio: 7 sessões; 2º ensaio: 9 sessões; 3º ensaio: 7 sessões), em cada sessão foram congelados embriões em diferentes estádios (2-4 células; 8-16 células; mórulas compactas, blastócistos expandidos; blastócistos eclodidos) para posterior extracção do RNA total e RT-PCR.

Experiência 2 Nesta experiência pretendeu-se diminuir a acumulação excessiva de lípidos nos

embriões IVP, caracterizar o perfil lipídico destes embriões e testar a sua resistência à congelação. Os oócitos foram maturados e fertilizados in vitro, de acordo com a técnica

6

descrita, e depois divididos e transferidos para diferentes sistemas de cultura. Foi utilizado, como testemunha, o sistema tradicional de co-cultura dos embriões e células da granulosa em meio de cultura com 10% de soro. Foram testadas duas estratégias numa tentativa de diminuir a deposição lipídica exagerada nos embriões: a primeira através da inclusão de um isómero conjugado do ácido linoleico - CLA (C18:2 trans-10, cis-12) no sistema de cultura tradicional com células da granulosa e soro. A segunda estratégia foi a utilização de meios definidos (mSOF) sem soro.

As taxas de produção de embriões e a sua capacidade de resistência à congelação/descongelação foram avaliadas, assim como a presença de gotículas lipídicas nos embriões. O perfil lipídico dos embriões obtidos nos diferentes sistemas de cultura foi caracterizado por análise dos ácidos gordos.

Experiência 3 Nesta experiência pretendeu-se manipular a composição em ácidos gordos dos

lípidos dos embriões, sobretudo a nível dos fosfolípidos membranários, através da incorporação de ácidos gordos polinsaturados. Procedeu-se à suplementação do meio de cultura de embriões com ácidos gordos polinsaturados, o ácido araquidónico (C20:4n-6) e o eicosapentaenóico (C20:5n-3).

Os zigotos, obtidos por maturação e fertilização in vitro dos oócitos, foram divididos em três grupos e cultivados com suplementação de 1, 10, e 100 µM de um ou outro dos ácidos gordos referidos ou sem suplementação. Foi também incluída no meio de cultura uma substância anti-oxidante, o glutatião peroxidase.

Num segundo ensaio, a suplementação com ácidos gordos polinsaturados foi realizada durante a maturação dos oócitos pela inclusão de 10 e 100 µM do ácido araquidónico (C20:4n-6) ou do eicosapentaenóico (C20:5n-3) no meio de maturação dos oócitos, mantendo uma testemunha sem suplementação. Foi igualmente incluída no meio maturação de oócitos, em todos os grupos, uma substância anti-oxidante, o glutatião peroxidase A cultura dos embriões foi realizada no sistema tradicional de co-cultura com células da granulosa e os blastócistos produzidos congelados por vitrificação.

Em ambos os ensaios da experiência 3 foram avaliadas as taxas de produção de embriões. No 2º ensaio foram também avaliadas as taxas de maturação após fixação e coloração dos oócitos maturados e a capacidade resistência à congelação/descongelação dos embriões.

3.2. Produção in vitro de embriões. A produção dos embriões bovinos foi realizada a partir de oócitos maturados e

fertilizados in vitro. Para tal, foram recolhidos ovários no matadouro de Santarém e transportados para o laboratório numa solução fosfatada tamponizada (PBS) suplementada com 0,15% de albumina sérica bovina (BSA; p/v) e kanamicina, a 37º C ou 4º C consoante fossem destinados, respectivamente, à produção de embriões ou formação de monocamadas (Marques et al., 1997).

7

3.2.1. Maturação e fertilização in vitro dos oócitos.

Para a produção dos embriões procedeu-se à recolha dos oócitos pela aspiração dos folículos com 2 a 6 mm de diâmetro de ovários transportados do matadouro a 37º C. Os complexos cumulus-oócitos aspirados, após selecção, foram colocados para maturação em meio de cultura (TCM199 + 10% de soro de vaca superovulada em cio (SOCS) + 10 µg mL-1 FSH +100 UI de penicilina, 100 µg ml-1 de estreptomicina) em estufa incubadora a 39º C, com 5% de CO2 e saturada de humidade durante 22 a 24 horas. Após este período, os oócitos maturados foram inseminados (D0=dia da inseminação) com sémen bovino descongelado e submetido a um processo de swim-up em meio Talp com cafeína (485,5 µg mL-1). A fertilização foi realizada em gotas de 40 µL de meio de fertilização (TALP com 30 µg mL-1 de heparina, 10 mM de penicilamina, 20 mM de hipotaurina e 0,25 mM de epinefrina) com 10 oócitos e 1×106 espermatozóides mL-1 por gota. Os oócitos e espermatozóides permaneceram 22 horas neste meio, após o que foram transferidos para os sistemas de cultura de embriões.

3.2.2. Cultura in vitro dos embriões. O sistema tradicional para a cultura in vitro dos embriões foi a co-cultura em

monocamadas de células da granulosa refrescados com TCM199, 10% de SOCS, 100 UI de penicilina e 100 µg mL-1 de estreptomicina. Para a preparação das monocamadas de células da granulosa foram utilizadas as células obtidas de folículos com 2 a 6 mm de diâmetro dos ovários transportados a 4º C. Estas células após coloração vital (azul tripan a 0,4%) e contagem, foram diluídas com meio de cultura (TCM199 + 10% de SOCS + 100 UI de penicilina e 100 µg mL-1 de estreptomicina), de forma a obter uma concentração de 1×106 células mL-1. A cultura das células foi realizada em placa, colocando-se 8 gotas de 100 µL submersas em óleo mineral, durante 2 semanas na estufa incubadora a 39º C, com 5% de CO2 e saturada de humidade, sendo refrescadas de 48 em 48 horas.

Como sistema alternativo e em consonância com os ensaios descritos no delineamento experimental, recorreu-se aos meios de cultura definidos. Nestes casos utilizou-se o fluido sintético do oviducto (SOF - synthetic oviduct fluid) suplementado com citrato de sódio, mioinositol, aminoácidos do meio básico de Eagle com glutamina e aminoácidos do meio mínimo essencial, procedendo-se ainda à substituição da BSA por álcool polivinílico (mSOF; Holm et al., 1999). Os embriões foram cultivados numa estufa incubadora a 39º C, saturada de humidade, com 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2 durante 8 dias.

3.3. Teste de resistência à congelação/descongelação.

Para a realização do teste de resistência à congelação/descongelação, os embriões D7/D8 seleccionados têm de ser congelados e descongelados para avaliação da sua capacidade de sobrevivência pós-descongelação.

3.3.1. Congelação dos embriões. A congelação dos embriões foi realizada segundo duas técnicas distintas:

inicialmente, a congelação lenta, sendo mais tarde implementada a vitrificação baseada

8

no protocolo francês de Mermillod et al. (1997). Apenas foram congelados embriões transferíveis ou seja classificados como excelentes, bons ou médios.

Na técnica de congelação lenta, os embriões seleccionados em cada sessão foram colocados inicialmente em PBS suplementado com 15% de FCS (v/v) e, depois, em PBS com 15% de FCS e 5% de glicerol (v/v) durante 10 minutos em cada meio. Finalmente, foram transferidos para PBS suplementado com 15% de FCS e 10% de glicerol e, após 10 minutos, aspirados para palhinhas de Cassou. Para a congelação, as palhinhas com os embriões foram colocadas num aparelho de congelação programável (Bio-cool III), dentro de um banho de metanol à temperatura ambiente. O “seeding” foi realizado a - 7º C, após uma descida a 1º C/ minuto. A congelação prosseguiu a 0,3º C/ minuto até aos - 30º C e, depois, a 0,1º C/ minuto até aos -35º C. As palhinhas foram então transferidas para contentores com azoto líquido.

Na vitrificação, os embriões IVP seleccionados foram lavados em dois banhos consecutivos de ovum culture medium (OCM, PBS suplementado com 20% FCS, v/v) e transferidos para OCM com 10% de glicerol. Após 5 minutos, os embriões foram colocados em OCM suplementado com 10 % glicerol e 20% de etilenoglicol durante mais 5 minutos e, posteriormente em PBS com 25% de glicerol e 25% de etilenoglicol. Os embriões foram aspirados para palhinhas de Cassou neste último meio, nas quais tinha sido previamente colocado 0,85M de galactose, separada com uma bolha de ar da solução de PBS com 25% de glicerol e 25% de etilenoglicol. Após a aspiração dos embriões, colocou-se novamente uma bolha de ar e galactose antes de fechar a palhinha com álcool polivinílico. As palhinhas foram então mergulhadas em azoto líquido.

3.3.2. Descongelação e avaliação da viabilidade dos embriões. Para a descongelação dos embriões após o processo de congelação lenta, as

palhinhas foram retiradas do azoto líquido, mantidas no ar durante 10 segundos e, posteriormente, colocadas em água a 37º C durante 20 segundos. Os blastócistos foram aquecidos durante 5 minutos em PBS com 15% FCS, 0,25 M de sucrose e 5% glicerol à temperatura ambiente, sendo depois transferidos para PBS com 15% FCS e 0,25 M de sucrose. Após 5 minutos neste último meio, os embriões foram colocados em PBS com 15 % FCS durante 20 minutos. No fim deste período, foram avaliadas a integridade e re-expansão dos embriões pós-descongelação.

Para a descongelação após a vitrificação, as palhinhas foram retiradas do contentor de azoto líquido, mantidas no ar durante 5 segundos, e depois colocadas dentro de água a 22º C durante 15 segundos. O conteúdo da palhinha foi vertido para uma placa e, após 5 minutos, os embriões foram transferidos para OCM à temperatura ambiente e, finalmente, para OCM a 38,5º C. Após avaliação da integridade e expansão dos embriões, procedeu-se à sua transferência para monocamadas de células da granulosa. A viabilidade dos embriões descongelados foi avaliada pela expansão dos embriões às 24 e 48 horas de cultura e pela taxa de eclosão às 72 horas.

3.4. Avaliação do conteúdo lipídico de oócitos e embriões bovinos.

3.4.1. Avaliação das gotículas lipídicas nos embriões IVP. O exame dos embriões D7/D8 no microscópio equipado com sistema Nomarski

permite a observação de gotículas lipídicas no citoplasma embrionário. Blastócistos produzidos in vitro em diferentes sistemas de cultura (ver delineamento experimental)

9

foram avaliados em fresco com o auxílio de um microscópio Olympus BX51 munido de sistema Nomarski (Nomarski differential interference contrast microscope). Este microscópio, acoplado a uma camera Olympus permitiu fotografar os embriões, em vários planos. As fotografias foram posteriormente analisadas usando o ImageJ software (version 1.19q, National Institutes of Health, USA) e os embriões classificados, em três categorias, de acordo com as dimensões e a área ocupada pelas gotículas lipídicas (GL). 1. Gordo - predominância de GL ≥ 4µm e a taxa da área ocupada por GL / área total ≥ 35%; 2. Médio – intermédio; 3. Magro - predominância de GL ≤ 2µm e a taxa da área ocupada por LG / área total do embrião ≤ 25%.

3.4.2. Análise lipídica. As análises dos lípidos de oócitos e embriões foram realizadas no Departamento

de Nutrição Animal, no Laboratório de metabolismo lipídico. A implementação desta técnica foi realizada com auxílio dos Investigadores Ana Paula Portugal e Rui Bessa deste Departamento e da Estagiária do Curso de Biotecnologia da Universidade do Algarve Marisa Lapa. A colaboração da Alexandra Reis da Universidade de Aberdeen, que nos disponibilizou o protocolo de análise de ácidos gordos utilizado no seu doutoramento, foi muito importante para a obtenção de resultados.

3.4.2.1. Selecção e congelação dos oócitos ou embriões para análise lipídica. Para as análises dos lípidos nas diferentes fases da produção in vitro de

embriões, procedeu-se à congelação de óocitos (imaturos e maturados) e embriões (estadio de 2-4 células, mórulas e blastócistos). Durante todos os procedimentos analíticos foram utilizados apenas materiais de vidro de modo a evitar contaminações provenientes dos plásticos do material descartável. Inicialmente foram testadas amostras de 500, 250, 200, 100 e 80 oócitos maturados e imaturos, e amostras de 50, 25, 10 e 8 embriões, concluindo-se que o número mínimo de oócitos e embriões a utilizar por amostra seria aproximadamente 100 e 25 a 15, respectivamente.

Para a realização da análise do perfil dos ácidos gordos foram retirados ao longo das 13 sessões de produção de embriões in vitro, oócitos imaturos, maturados e embriões, constituindo assim uma amostragem representativa das várias fases do processo de maturação e do desenvolvimento embrionário (experiência 1). De igual modo, foi também constituída, ao longo de 18 sessões de cultura (experiência 2), uma amostragem de embriões provenientes dos diferentes tratamentos (TCM199, soro e células; TCM199, soro, células e CLA; mSOF) para comparação da composição em ácidos gordos de embriões com 7 e 8 dias de cultura nos sistemas referidos.

As amostras, à excepção do ensaio 3 da experiência 1 onde foi testada a extracção em fresco, foram congeladas a – 80º C, após um processo de recolha e selecção. Os oócitos imaturos aspirados dos ovários provenientes do matadouro a 37º C foram seleccionados pela presença de células compactas do cumulus, citoplasma uniforme e finamente granulado. Os oócitos maturados foram seleccionados, após 22 a 24 horas de maturação in vitro, pela expansão das células do cumulus e citoplasma uniforme. Todas as células do cumulus dos oócitos imaturos ou maturados foram removidas com auxílio de um vórtex. Após o vórtex, os oócitos denudados foram re-seleccionados e, apenas aqueles com a zona pelúcida intacta, livre de células do cumulus e citoplasma uniforme, foram congelados em PBS com 0,1% de BSA livre de ácidos gordos (Sigma) a – 80º C em viais de vidro com tampa PTFE. Como referido,

10

num dos ensaios foram utilizados oócitos denudados que após selecção seguiram directamente para a extracção.

Os embriões IVP foram seleccionados pelo estadio (2-4 células e blastócitos) e pela qualidade (muito bons, bons e médios). Os embriões foram lavados em PBS com 0,1% de BSA livre de ácidos gordos (Sigma) e retiradas, por pipetagem, as células exteriores à zona pelúcida. A congelação a – 80º C foi realizada como nos oócitos. De igual modo, foram também congelados os soros utilizados nos meios de cultura e o meio de congelação de oócitos e embriões.

3.4.2. Análise lipídica. 3.4.2.1. Extracção lipídica e metilação dos ácidos gordos. Para e extracção da fracção lípidica de oócitos e embriões foi utilizado o método

de Folch et al. (1957). As amostras foram descongeladas à temperatura ambiente e adicionado 15 ml de clorofórmio: metanol (2:1) e 200 µl de padrão interno (C21:0, ácido heneicosanóico - Sigma, 4 µg) a cada. A extracção decorreu num banho-maria com ultra-sons durante 15 minutos a 37º C, sendo então adicionado 3,6 ml de solução salina de cloreto de potássio a 0,8%. Posteriormente, a fracção orgânica foi transferida para um novo tubo e colocado a evaporar numa corrente de azoto a 45º C, obtendo-se o extracto lipídico que seguiu para a fase de derivatização.

Em simultâneo foi realizado o mesmo protocolo de extracção em 200 µl de meio de congelação (solução de PBS com 0,1% de BSA livre de ácidos gordos) e em 200 µl de soro de vaca superovulada em cio usado nos meios de cultura.

No decorrer deste projecto foram testadas três metodologias diferentes, para a metilação dos ácidos gordos extraídos das amostras: metilação em meio ácido e em meio básico (Christie, 1994), e um método proposto por Sukhija e Palmquist (1988) que utiliza a extracção e metilação conjunta. A metilação em meio ácido foi a metodologia escolhida dado ser mais eficiente que a básica e, a extracção e metilação conjunta, sendo uma técnica com maior risco, não ter revelado um valor acrescido.

A metilação ácida dos ácidos gordos foi realizada com uma solução de ácido sulfúrico a 1% em metanol no banho-maria a 50ºC durante 2 horas. Para parar a reacção foi adicionada uma solução de cloreto de sódio a 5% e os ésteres metílicos dos ácidos gordos (FAME) foram posteriormente extraídos com hexano. O hexano foi lavado com uma solução de bicarbonato de potássio a 2% e a fracção orgânica, após eliminação da água por contacto com sulfato de sódio anidro, levada a evaporar até à secura em corrente de azoto a 40ºC. O volume de cada amostra foi reposto com 150 µl de hexano, levado ao vórtex e transferido para viais onde foi novamente a evaporar até à secura. Por fim, adicionaram-se 100 µl de hexano a cada vial que seguiram para cromatografia gasosa.

3.4.2.2. Cromatografia gasosa. A composição em ácidos gordos de cada amostra foi determinada por

cromatografia gasosa (Hewlett Packard HP 6890 Series GC System) utilizando uma coluna capilar, SP 2560 (60m x 0,25 mm x 0,20mm; Supelco) e o hélio como gás de arraste. Os FAME de cada amostra foram injectados no cromatógrafo. O volume de injecção foi de 2 µl, em duplicado e em modo splitless. O método utilizou diferentes rampas de temperatura, com o injector a 250ºC e o detector a 280ºC (Reis, 2003).

11

Para o cálculo da área dos picos dos ácidos gordos presentes nas amostras, utilizou-se o software da HP GC chemStation (versão A. 06. 03) e os ácidos gordos foram quantificados utilizando como referência o padrão interno (C21:0). Os picos dos cromatogramas foram identificados de acordo com o seu tempo de retenção e por comparação com padrões de ácidos gordos (Sigma, Matreya e Supelco 37 componet Mix) injectados com o mesmo método e também por coeluições das amostras com ácidos gordos conhecidos.

3.5. Identificação da expressão dos enzimas ciclo-oxigenase 1 e 2 em embriões bovinos produzidos in vitro.

3.5.1. Extracção do RNA e RT-PCR. Foram ensaiadas várias metodologias para implementação da técnica de

extracção do RNA de embriões IVP, em diferentes estadios de desenvolvimento. A implementação desta técnica foi realizada com colaboração dos Investigadores do Instituto Gulbenkian da Ciência, Ana e Pedro João Coutinho e Jorg Becker, e do Servicio de Investigacion Agroalimentaria de Zaragoza, na pessoa de Juana Maria Garbajo, aos quais gostaríamos de agradecer toda a dedicação demonstrada. A colaboração do Dr. Jorge Pimenta do Departamento de Genética e Melhoramento da EZN foi essencial na implementação destas metodologias.

3.5.1.1. Extracção do RNA total dos embriões.

3.5.1.1.1. Extracção do RNA total com TRIZOL.

A recolha e conservação das amostras para extracção do RNA com TRIZOL foi

realizada ao longo de várias sessões de produção de embriões e testada em dois ensaios. No 1º ensaio, as amostras (embriões 2-4 células, n=61; embriões 8-16 células, n=60; mórulas, n=32; blastócistos expandidos, n=32; blastócistos eclodidos, n=62) provenientes de 7 sessões de produção in vitro de embriões foram congelados (- 196ºC) em palhinhas de Cassou em PBS com 0,1% de PVA. Posteriormente, foram descongelados em água tépida durante alguns segundos e o conteúdo das palhinhas despejado para tubos Eppendorf colocados em gelo aos quais se adicionou 1 ml de Trizol reagent.

Face aos fracos resultados da técnica utilizada no 1º ensaio, os embriões provenientes de outras 9 sessões foram congelados (- 196ºC) em Tri-reagent frio (500 µl) dentro de tubos Eppendorf para posterior extracção do RNA total (embriões 2-4 células, n=60; embriões 8-16 células, n=60; mórulas, n=30; blastócistos expandidos, n=32; blastócistos eclodidos, n=14). Esta técnica foi gentilmente cedida pela Investigadora Juana Maria Garbayo do Servicio de Investigacion Agroalimentaria, Zaragoza, Espanha. Os tubos foram deixados a descongelar à temperatura ambiente e colocados 5 minutos em gelo e, posteriormente, centrifugados para eliminar o material insolúvel.

A separação das fases foi realizada com 250 µl de clorofórmio e, à fase aquosa, foi adicionado o glucogénio (concentração final de 0,2-0,4 µg/µl). Para precipitação do RNA utilizou-se 225 µl de isopropanol. Após centrifugação, o sobrenadante ficou a precipitar o RNA OVERNIGHT a -80ºC. No dia seguinte, o pellet de RNA obtido foi

12

lavado com 500 µl de etanol a 75º e, após centrifugação e secagem, foi ressuspenso em água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC).

A concentração de RNA total para cada estadio de desenvolvimento embrionário foi avaliada no espectofotómetro (Nanodrop ND-1000), assim como a integridade das suas unidades ribossomais 18 S e 28 S usando o RNA 6000 Nano Assay do Agilent 2100 Bioanalyzer.

3.5.1.1.2. Extracção do RNA total com o “Mini RNA Isolation Kit”. As amostras (embriões 2-4 células, n=60; embriões 8-16 células, n=60; mórulas,

n=30; blastócistos expandidos, n=30; blastócistos eclodidos, n=34) provenientes de 7 sessões de produção in vitro de embriões foram congeladas (- 196ºC) em palhinhas de Cassou em PBS com 0,1% de PVA.

Os embriões foram descongelados, procedendo-se à extracção do RNA total, segundo o protocolo estabelecido no Mini RNA Isolation Kit (Zymo Research, ref. R1006). Ao RNA eluído foi adicionada 1 U de um inibidor de RNases (Ambion RNase Inhibitor) e, posteriormente, avaliada a sua concentração com auxílio de um espectrofotómetro (Nanodrop, ND-1000), assim como a integridade das suas unidades ribossomais 18 S e 28 S usando o RNA 6000 Nano Assay do Agilent 2100 Bioanalyzer.

Para a remoção do DNA genómico utilizaram-se 2 U de DNase I seguindo as normas do fabricante (para incubação e inactivação do enzima). A precipitação do RNA total foi posteriormente realizada com 25 µl de NH4OAc a 7,5 M, 125 µl de etanol e 0,5 µl de glicogénio (5 mg/ml) a -20ºC durante 2 horas. Após centrifugação e lavagem, o pellet obtido foi dissolvido em água tratada com DEPC e avaliada a concentração do RNA total precipitado obtido em cada estadio do desenvolvimento embrionário (Nanodrop ND-1000).

3.5.1.2. RT-PCR. A produção da 1ª cadeia de DNA complementar (cDNA) foi realizada partindo

de 8 ul de RNA total extraído e com recurso à enzima Superscript II (Superscript first strand synthesis for RT PCR, Invitrogen) e a hexâmeros aleatórios fornecidos no Kit.

A expressão dos genes da COX-1 e da COX-2 foi determinada, respectivamente, pela amplificação por PCR de uma região do cDNA da COX-1, com 777 pb (Genebank, AF004943) e da COX-2, com 449 pb (Genebank, AF004944). Para tal utilizaram-se iniciadores específicos: COX-1, sense com a sequência 5’-CAT GGC GAT GCG GTT GC-3’ e o antisense com a sequência 5’-TCC AAC CTT ATC CCC AGC C-3’; COX-2 sense com a sequência 5’-TCT TTG ACT GTG GGA GGA TAC A-3’ e o antisense com a sequência 5’-TCC AGA TCA CAT TTG ATT GAC A-3’, partindo de um volume de 2 µl de cDNA (em cadeia simples) e seguindo as restantes condições descritas por Anselin et al. (1997) para a reacção de PCR. As mesmas condições foram também usadas para a amplificação da sequência da β-actina bovina que constituiu o controlo positivo. Os iniciadores utilizados foram todos adquiridos à BioPortugal, sendo a sequência dos da β-actina 5’-CAA CTG GGA CGA CAT GGA GAA GAT CTG GCA-3’ para o sense, e 5’-GAG GAT CTT CAT GAG GTA GTC TGT CAG GTC-3’ para o antisense. Os produtos amplificados (1 µL de cada) foram avaliados num Agilent 2100 Bioanalyzer usando o DNA 7500 Assay.

13

3.5.2. Imunocitoquímica. Face à dificuldade na extracção de RNA para identificar a expressão das COX

nos estadios embrionários mais precoces, recorreu-se às técnicas de imunocitoquímica com o mesmo objectivo. O método escolhido foi o da streptavidina – biotina / HRP, implementado no serviço de Anatomia Patológica dos Hospitais da Universidade de Coimbra com a colaboração do Sr. Dr. Pedro Pessa. Esta técnica teve de ser adaptada para detectar a COX-2 na espécie bovina recorrendo-se a um tecido bovino, o endómetrio, onde já estivesse confirmada a expressão da COX-2 (controlo positivo).

Úteros bovinos foram transportados do matadouro em PBS a 4º C e dissecados no laboratório. O endométrio foi cortado em pedaços (1 cm2), fixado em formol neutro a 10% e parafinado para corte. Posteriormente, foi necessário desparafinar e hidratar o tecido para inibir a peroxidase endógena com H2O2 a 3%. A recuperação antigénica foi realizada em tampão de citrato de sódio (10 mM). Após lavagem em Tris-Buffered Saline (TBS), o endómetrio foi colocado a incubar inicialmente com soro normal de cabra (Ultra V Block - Labvision) e, posteriormente, com o soro primário (COX-2-sp21, NeoMakers, a diluição foi de 1/100 em TBS). De seguida e após nova lavagem com TBS, procedeu-se à incubação, primeiro com o soro secundário biotinilado (cabra anti-polivalente - Labvision ) e, depois com streptavidina com peroxidase (Labvision).

A marcação do antigénio-anticorpo foi revelada com diaminobenzidina e contrastada com Hematoxilina de Gill. Esta técnica está correntemente a ser adaptada para utilização em embriões bovinos.

3.6. Avaliação dos resultados e análise estatística.

Todos os resultados são expresso como a média ± erro padrão (EP) das sessões ou repetições realizadas em cada ensaio, à excepção da taxa de maturação pós coloração dos oócitos e da classificação dos embriões pela distribuição das gotículas lipídicas.

Em todas as experiências, foi avaliada a taxa de clivagem (embriões clivados / oócitos inseminados X 100), 24 horas após a transferência dos zigotos para os sistemas de cultura de embriões e, as taxas de embriões (mórulas e blastócitos/embriões clivados X 100) em D7 e D8. A qualidade dos embriões produzidos foi avaliada através duma escala de 1 - Muito bom a 4 - Mau. A taxa de embriões eclodidos (embriões eclodidos/ embriões D8 X 100), apenas foi calculada em alguns ensaios das experiências 1 e 3. Os dados obtidos em todas as sessões de produção de embriões realizadas, em cada ensaio, foram comparados entre grupos por análise de variância e “least square differences” (LSD, StatSoft, Inc, 1995). Apenas no 1º ensaio da experiência 3 foi aplicado o teste do qui-quadrado em tabelas de contingência 2x2, através da comparação dos valores obtidos em cada grupo na globalidade das sessões (StatSoft, Inc, 1995).

A resistência à congelação/descongelação dos embriões foi avaliada pela sobrevivência dos embriões à descongelação calculada pelas taxas de integridade e expansão pós descongelação (embriões íntegros ou expandidos após descongelação / embriões descongelados X 100) e, após a cultura, pelas taxas de expansão (embriões expandidos / embriões descongelados X 100) às 24 e 48 horas e de embriões eclodidos (embriões eclodidos/ embriões descongelados X 100) às 72 horas de cultura. O tratamento estatístico destes dados, obtidos nas várias sessões de descongelação, foi realizado por análise de variância e LSD (StatSoft, Inc., 1995).

14

O tratamento estatístico para comparação entre grupos da composição lipídica das amostras de oócitos ou embriões foi também realizado por análise de variância e LSD (StatSoft, Inc., 1995). O teste de Mann-Whitney foi usado para comparar as classificações dos embriões avaliados pela distribuição das gotículas lipídicas após observação ao microscópio.

4. RESULTADOS E CONCLUSÕES.

4.1. Composição em ácidos gordos de oócitos e embriões produzidos in vitro

em co-cultura com células da granulosa (sistema tradicional) (Experiência 1).

Para o estudo da composição em ácidos gordos de oócitos e embriões produzidos in vitro foram recolhidos 882 ovários no matadouro de Santarém. Destes ovários, 47 foram transportados a 4ºC para a obtenção das células da granulosa utilizadas para a co-cultura dos embriões com uma viabilidade média de 19,98 ± 1,74%. Dos restantes ovários (n=835), transportados a 37ºC, foram recolhidos 5626 oócitos que, após selecção, foram congelados para análise lipídica no estadio de oócitos imaturos ou, prosseguiram para maturação in vitro (tabela 1). A taxa média de aspiração foi de 6,7 ± 0,3 oócitos por ovário.

Tabela 1. Oócitos (totais e média por sessão) processados durante o estudo do perfil lipídico de oócitos e embriões produzidos in vitro (24 sessões).

n Média por sessão ± EP

Oócitos recolhidos 5626 234,4 ± 37,0

Oócitos cultivados 3465 216,3 ± 33,8

Oócitos maturados 3027 188,5 ± 28,6

A taxa de maturação aparente dos oócitos foi de 87,8 ± 1,3%. Dos oócitos

maturados, apenas 1893 seguiram para a fertilização, sendo os restantes congelados para posterior análise. As taxas de produção de embriões encontram-se descritas na tabela 2.

Tabela 2. Taxas de produção in vitro de embriões bovinos obtidas em 13 sessões de cultura para estudo do perfil lipídico de oócitos e embriões.

n Média (%±EP)

Embriões clivados 1057 69,5 ± 2,9

Embriões D7/D8 284 25,8 ± 2,8

Embriões eclodidos 76 46,6 ± 5,3* * calculada com apenas 177 embriões D7/D8 que prosseguiram em cultura.

15

O estudo do perfil de ácidos gordos em oócitos e embriões IVP foi, como referido na metodologia, realizado em 4 ensaios. No 1º ensaio, optimizou-se o número de oócitos (n=100) e embriões (zigotos n=25 e blastócistos n=15) por análise e o método cromatográfico (split-ratio em Split-less) a utilizar. No 2º ensaio, após a experimentação de três metodologias diferentes, metilação em meio ácido e em meio básico (Christie, 1994), e um método proposto por Sukhija e Palmquist (1988) que utiliza a extracção e metilação conjunta, optou-se pela metilação em meio ácido. A escolha baseou-se no facto de este método ser mais eficiente que a metilação básica e dos resultados obtidos com a extracção e metilação conjunta não apresentarem um valor acrescido, aliado a ser uma técnica que apresenta um maior risco, nomeadamente no uso de tolueno, considerado cancerígeno, e de cloreto de acetilo que reage violentamente na presença de água.

A comparação dos resultados obtidos após análise de amostras de oócitos imaturos e maturados, congeladas ou frescas, realizadas no 3º ensaio não revelou vantagem na extracção a fresco. Assim, optou-se pela congelação das amostras, dada a maior facilidade de planificação das análises.

O teor em ácidos gordos de oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro referentes ao ensaio 4, estão representadas na tabela 3. Apesar de constarem no delineamento experimental deste ensaio e terem sido efectuadas 5 repetições nas análises de cada grupo, nos resultados apresentados apenas foram incluídas 3 repetições para os oócitos imaturos, 2 para os oócitos maturados e 4 para os embriões (blastócistos - BL). A exclusão de algumas repetições deve-se à ausência de extracção lipídica em uma e duas das repetições dos oócitos imaturos e maturados, respectivamente. Em cada grupo foi também excluída uma repetição por apresentar valores irreais, pressupondo-se a presença de contaminações durante o processamento das amostras.

A concentração dos ácidos gordos totais por oócito imaturo, oócito maturado e BL foi de 31,5±2,4 ng, 36,9±22,2 ng e 256,0±112,0 ng, respectivamente. Não foram, no entanto, encontradas diferenças significativas (p> 0,05) entre estes valores dada a enorme variabilidade observada. Estes resultados, aliados à dificuldade de extracção lipídica nos oócitos e à presença de várias contaminações ao longo de todo o processo analítico, apontam para a necessidade de continuar a aperfeiçoar o método implementado.

Tabela 3. Teor em ácidos gordos totais (ng por oócito ou embrião) e suas subclasses (% do total de ácidos gordos) dos lípidos extraídos de oócitos imaturos, oócitos maturados e embriões bovinos produzidos in vitro (Média ± EP). Oócitos

imaturos Oócitos

maturados Blastócistos

Nº de amostras 3 2 4

n por amostra 113, 3 ± 8,9 126,5 ±15,5 18,0 ± 1,2

Ac. Gordos Totais (ng/unidade) 31,5 ± 2,4 36,9 ± 22,2 256,0 ± 112,0

Ac. Gordos Saturados (%) 68,1 ± 1,5ab 64,2 ± 1,2a 72,1 ± 1,5b

Ac. Gordos Monoinsaturados (%) 18,65 ± 3,74 23,6 ± 1,4 14,7 ± 1,9

Ac. Gordos Polinsaturados (%) 13,3 ± 2,5 12,3 ± 0,2 13,3 ± 1,0 a,bSubclasses dos ácidos gordos cujos valores diferem significativamente na mesma linha (ANOVA).

16

Apesar das limitações da metodologia foi possível identificar diferenças

significativas (F=6,05; P=0,04) entre a composição em ácidos gordos saturados em oócitos e embriões, apresentando os BL significativamente mais ácidos gordos saturados que os oócitos maturados (P=0,01) e os oócitos imaturos (P=0,09). Por outro lado, os BL apresentam menos (P=0,07) ácidos gordos monoinsaturados que os oócitos maturados. Não foram encontradas diferenças significativas entre os ácidos gordos polinsaturados nos vários estadios (oócitos imaturos e maturados e BL). Esta acumulação preferencial de ácidos gordos saturados em embriões cultivados em meios com soro poderá explicar a grande susceptibilidade destes embriões à congelação.

Por outro lado, o perfil em ácidos gordos dos embriões IVP (tabela 4) difere do perfil em ácidos gordos do soro que entrou na constituição dos meios de cultura (tabela 5), o mesmo se verificando nos oócitos maturados. Parece assim que os oócitos e embriões bovinos em cultura têm mecanismos capazes de seleccionar a acumulação de ácidos gordos. De facto, foram detectados 9 ácidos gordos diferentes nos lípidos totais de oócitos imaturos e embriões bovinos e 8 ácidos gordos diferentes nos lípidos totais de oócitos maturados (tabela 5) não existindo diferenças significativas entre grupos. O C16:0 foi o ácido gordo mais abundante, seguindo-se o C18:1 cis9 e o C18:0. O 4º ácido gordo mais abundante foi o C18:2 n6. Tabela 4. Composição em ácidos gordos dos lípidos totais extraídos de oócitos imaturos e maturados e embriões produzidos in vitro.

Distribuição dos ácidos gordos (%, Média ± EP)

Ácidos gordos Oócitos

imaturos Oócitos

maturados Blastócistos

Ác. Caprilico (C8:0) 4,2 ± 0,4 3,8 ± 0,2 5,3 ± 1,0

Ác. Mirístico (C14:0) 6,8 ± 0,8 9,5 ± 0,4 8,2 ± 1,3

Ác. Palmítico (C16:0) 30,1 ± 2,5 30,8 ± 0,6 27,8 ± 1,2

Ác. Esteárico (C18:0) 18,4 ± 0,8 15,1 ± 0,6 17,6 ± 2,0

Ác. Oleico (C18:1cis9) 18,7 ± 3,7 23,6 ± 1,4 14,7 ± 1,9

Ác. Linoleico (C18:2n6) 7,0 ± 1,0 8,9 ± 0,5 7,4 ± 0,3

Ác. Araquídico (C20:0) 6,0 ± 1,6 5,0 ± 0,6 5,2 ± 1,1

Ác. Beénico (C 22:0) 2,6 ± 2,6 nd 8,0 ± 3,8

Ác. Docosahexaenóico (C22:6n3) 6,3 ± 3,0 3,4 ± 0,3 5,9 ± 0,9 nd= não detectável.

Quando comparado com os 4 ácidos gordos mais abundantes no soro (tabela 5),

estes foram por ordem decrescente, o C18:2n6, o C18:0, o C16:0 e, por fim, o C18:1cis9, apresentando uma distribuição diferente quer dos oócitos quer dos embriões. O C18:2n6 que é o mais abundante no soro (44,2%) é o 4º nos oócitos e embriões, variando entre 7,0 e 8,9%.

17

Tabela 5. Composição em ácidos gordos dos lípidos totais extraídos do soro sanguíneo de vaca em cio superovulada utilizada nos meios de cultura de oócitos e embriões. Ácidos gordos Distribuição dos ácidos gordos (%)

Ác. Mirístico (C14:0) 2,1

Ác. Palmítico (C16:0) 17,9

Ác. Esteárico (C18:0) 21,3

Ác. Oleico (C18:1cis9) 12,4

Ác. Linoleico (C18:2n6) 44,2

Ác. Docosahexaenóico (C22:6n3) 2,2

Os dados destes ensaios sugerem que os embriões bovinos produzidos in vitro

em meios com soro acumulam preferencialmente ácidos gordos saturados, o que pode explicar a grande susceptibilidade destes embriões à congelação. Estudos realizados em Israel mostram que desequilíbrios na composição em ácidos gordos nos oócitos e embriões, nomeadamente, na razão entre ácidos gordos saturados e insaturados afectam a sua resistência à congelação. O aumento dos ácidos gordos insaturados em relação aos saturados nos fosfolipidos de oócitos em ovelhas com dietas suplementadas com ácidos gordos polinsaturados, levou à diminuição da temperatura de transição da fase lipídica da membrana de oócitos durante o arrefecimento, melhorando significativamente a integridade destes. Esta diminuição da temperatura de transição da fase lipídica também se verifica na membrana de oócitos bovinos recolhidos no Inverno, quando comparada com a dos obtidos no Verão, devido à composição em ácidos gordos dos fosfolípidos dos oócitos apresentar uma maior percentagem de ácidos gordos saturados no Verão e uma maior percentagem dos mono e polinsaturados no Inverno (Zeron et al., 2001, 2002). O perfil dos ácidos gordos mais abundantes encontrados em oócitos e embriões produzidos in vitro está de acordo com a bibliografia. No entanto, Sata et al. (1999) referem que o perfil em ácidos gordos dos embriões IVP é semelhante ao do soro bovino fetal ao qual foram expostos durante a cultura in vitro, o que está em contradição com os nossos resultados e os de Reis et al. (2003), onde se verificou que oócitos e embriões tendem a acumular in vitro os ácidos gordos “familiares” disponíveis nos meios de cultura, mantendo o mesmo perfil em ácidos gordos ao longo do processo de produção in vitro de embriões (maturação e desenvolvimento embrionário).

4.2. Identificação da expressão dos enzimas ciclo-oxigenase 1 e 2 em

embriões bovinos produzidos in vitro em co-cultura com células da granulosa (Experiência 1).

As taxas de embriões produzidos para o estudo da expressão dos enzimas ciclo-

oxigenase 1 e 2 constam na tabela 6.

18

Tabela 6. Produção in vitro de embriões em co-cultura com células da granulosa (22 sessões).

n Taxa (média±EP) %

Embriões clivados 2653 71,3 ± 1,8

Embriões D7/D8 605 28,3 ± 1,8

Embriões eclodidos 254 56,6 ± 5,5

O RNA total extraído com trizol das amostras congeladas em PBS com 0,1% de

PVA ou em Tri-reagent frio caracterizou-se por uma baixa concentração e integridade insuficiente para prosseguir para RT-PCR, independentemente do estadio dos embriões presentes.

A extracção do RNA total com o “Mini RNA Isolation Kit” permitiu resolver este problema para os estadios de blastócisto expandido e eclodido (figura 1), obtendo-

Figura 1. Integridade das unidades ribossomais 18 S e 28 S do RNA total extraído de embriões bovinos produzidos in vitro, nos estadios de 2-4 células, mórulas, blastócistos expandidos (BL) e eclodidos (EBL), usando o RNA 6000 Nano Assay do Agilent 2100 Bioanalyzer.

19

-se 85,6 ng/µl de RNA total dos BL expandidos e 23,4 ng/µl de RNA total dos BL eclodidos com a integridade necessária para prosseguir para o RT-PCR. No entanto, o RNA extraído nos estadios de 2-4 células, 8-16 células e mórulas, embora em concentrações de 84,1, 21,9 e 68,5 ng/µl respectivamente, não tinha integridade suficiente nas suas unidades ribossomais 18 S e 28 S (figura 1).

Assim, apenas o RNA de embriões nos estadios de blastócisto expandido (n=30) e eclodido (n=16) prosseguiram para RT-PCR utilizando-se iniciadores específicos para o COX-1 e COX-2, assim como para a β-actina bovina, que constituiu o controlo positivo. Os produtos amplificados, avaliados no Bioanalyzer, mostraram existir expressão da COX-2 (figura 2), mas não da COX-1 nos embriões no estadio de BL eclodido. No estadio de BL expandido não foi identificada a expressão da COX-1 nem da COX-2. A β-actina foi expressa em ambos os estadios de BL expandido e eclodido.

GelGel

Pico Tempo (s)

Área Tamanho (pb)

Concentração (ng/µl)

M1 (marcador) 34,20 43,20 50 8,3

COX-2 51,95 24,19 441 2,1

M2 (marcador) 78,75 56,18 10380 4,2

Figura 2. Identificação da expressão do mRNA para o enzima ciclo-oxigenase-2 (COX-2) em embriões bovinos produzidos in vitro, no estadio de blastócito eclodido (n=16), por análise no Bioanalyzer. A avaliação da expressão génica foi realizada por amplificação do cDNA do gene da COX-2 obtido do RNA total extraído dos embriões.

A técnica da streptavidina-biotina já implementada permitiu identificar a expressão da COX-2 em células do endométrio bovino (figura 3).

20

Figura 3. Identificação do enzima ciclo-oxigenase 2 no epitélio e glândulas secretoras do endométrio bovino pelo método da streptavidina – biotina / HRP.

Os resultados deste projecto demonstraram pela primeira vez que os embriões

bovinos produzidos in vitro expressam a isoforma induzida da COX, a COX-2, durante a eclosão, apontando para a importância da via metabólica do ácido araquidónico no desenvolvimento embrionário preimplantatório.

4.3. Efeito da presença de C18:2 trans-10, cis-12 (CLA) em meios com soro ou de meios definidos sem soro, no conteúdo lipídico e na criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro (Experiência 2).

Produção in vitro de embriões

Durante a experiência 2 foram realizadas 18 sessões de produção in vitro de embriões testando como referido na metodologia, três sistemas diferentes de cultura: grupo I) monocamadas de células da granulosa cultivadas com TCM199, 10% SOCS e 100 µM GSH; grupo II) monocamadas de células da granulosa cultivadas com TCM199, 10% SOCS, 100 µM GSH e 100 µM CLA; grupo III) mSOF e 100 µM GSH. Nestas 18 sessões de produção in vitro de embriões foram inseminados 3390 oócitos, que após 22 horas no meio de fertilização, foram divididos e transferidos para os 3 sistemas referidos. As taxas de clivagem avaliadas às 48 horas pós inseminação não diferiram entre sistemas (tabela 7), assim como a qualidade dos embriões produzidos.

Tabela 7. Efeito da presença do isómero conjugado do ácido linoleico trans10 cis12 (CLA) em meios com soro ou de meios definidos sem soro (fluido sintético do oviducto modificado –mSOF) na produção in vitro de embriões bovinos (18 sessões).

Óocitos insemin. (n)

Clivagem (média ± EP) %

Embriões D7/D8 (média ±EP) %

TCM+soro+células 947 68,01 ± 1,85 29,78 ± 2,52a

TCM+soro+células+CLA 990 68,16 ± 1,96 27,75 ± 2,03a

mSOF 1453 69,69 ± 2,20 17,92 ± 1,56b Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (ANOVA)

21

No entanto, a taxa de embriões D7/D8 foi significativamente menor (P<0,001) quando os embriões foram cultivados em mSOF do que nos sistemas de co-cultura, independentemente da presença de CLA.

Teste de resistência à congelação/descongelação.

O teste de resistência à congelação/descongelação foi realizado em embriões

transferíveis, com qualidade de muito bom a médio, congelados pelo método de congelação lenta (tabela 8). As taxas de integridade e re-expansão dos embriões IVP pós descongelação foram superiores nos embriões cultivados em TCM199, soro e células na presença de CLA do que na sua ausência (P<0,001 e P<0,001, respectivamente) ou em meios definidos (P=0,03 e P=0,04, respectivamente). Os embriões cultivados em mSOF resistiram melhor à congelação/descongelação do que os embriões cultivados com soro mas na ausência de CLA, apresentando uma taxa de re-expansão pós descongelação superior (P=0,05). Tabela 8. Efeito da presença do isómero conjugado do ácido linoleico trans10 cis12 (CLA) em meios com soro ou de meios definidos (mSOF) sem soro na resistência à congelação / descongelação dos embriões produzidos (5 sessões). Embriões

descongelados (n)Integridade

(média±EP) % Re-expansão

(média±EP) %

TCM+soro+células 92 50,25 ± 4,78a 34,67 ± 3,66a

TCM+soro+células+CLA 80 84,70 ± 4,09b 63,69 ± 5,23b

mSOF 83 65,28 ± 6,93a 49,00 ± 4,58c Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (ANOVA)

Avaliação das gotículas lípidicas nos embriões IVP.

Embriões produzidos nos três sistemas de cultura foram fotografados em fresco no microscópio com sistema Nomarski para contabilização das gotículas lipídicas presentes no citoplasma. Após análise das fotografias verificou-se que embriões produzidos em mSOF apresentavam menos e menores gotículas lipídicas no citoplasma que embriões produzidos em co-cultura em meios com soro, sendo classificados na totalidade como magros (Figura 4). Embriões cultivados em meios com soro e na ausência de CLA apresentavam as maiores gotículas lipídicas e a maior área ocupada pelas gotículas, sendo maioritariamente classificados como gordos. Na presença de CLA, os embriões caracterizavam-se por uma situação intermédia, ou seja gotículas de menores dimensões e a ocuparem menos área que na testemunha, mas mais que nos embriões cultivados em mSOF.

22

Mann-Whitney U Test p<0,009

Figura 4. Classificação dos embriões produzidos em co-cultura com células da granulosa, TCM 199 e soro (grupo I), co-cultura com células da granulosa, TCM 199, soro e CLA (Grupo II) e em meio definido, fluido do oviducto modificado (grupo III), de acordo com a distribuição e tamanho das gotículas lipídicas observadas no citoplasma embrionário, com auxilio de um microscópio munido de sistema Nomarski.

Composição em ácidos gordos.

A concentração em ácidos gordos totais e sua distribuição em subclasses dos embriões bovinos produzidos in vitro nos três sistemas de cultura estão representadas na tabela 3. Estes resultados incluem 4 repetições no grupo mSOF e apenas 3 nos outros dois grupos, por exclusão de uma amostra em cada grupo dado apresentarem valores irreais, pressupondo-se a presença de contaminação durante o seu processamento. A concentração dos ácidos gordos totais por BL foi de 370,7 ± 163,7 ng no sistema de cultura com TCM199, 10% de soro e células, 336,1 ± 118,2 ng com TCM199, 10% de soro, células e CLA e 242,6±75,5 ng em mSOF. Não foram, no entanto, encontradas diferenças significativas (P>0,05) entre estes valores nem nas subclasses de ácidos gordos dada a enorme variabilidade observada.

Grupo I (n=5) 80 20 0 a Grupo II (n=6) 0 100 0 b Grupo III (n=5) 0 0 100 c

Distribuição das gotículas citoplasmáticas em embriões (%) Gordo Intermédio Magro

23

Tabela 9. Concentração em ácidos gordos totais (ng por embrião) e suas subclasses (% do total de ácidos gordos) dos lípidos extraídos de embriões produzidos in vitro em diferentes condições de cultura (TCM199, 10% de soro e células da granulosa; TCM199, 10% de soro, células da granulosa e CLA; Fluido do oviducto modificado –mSOF). TCM+soro+

células TCM+soro+

células+ CLA mSOF

Nº de amostras 3 3 4

n por amostra 15 15 15

AG Totais (ng/unidade) 370,7 ± 163,7 336,1 ± 118,2 242,6 ± 75,5

AG Saturados (%) 51,3 ± 7,6 58,6 ± 1,6 65,2 ± 2,1

AG Monoinsaturados (%) 31,6 ± 0,2 33,1 ± 11,4 28,4 ± 4,4

AG Polinsaturados (%) 17,1 ± 1,6 8,3 ± 0,8 6,4 ± 2,6

AG=ácidos gordos De igual modo, não foram encontradas diferenças significativas na composição

em ácidos gordos dos lípidos extraídos dos embriões produzidos in vitro nas diferentes condições de cultura testadas (tabela 10).

Tabela 10. Composição em ácidos gordos de embriões produzidos in vitro em diferentes condições de cultura (TCM199, 10% de soro e células da granulosa; TCM199, 10% de soro, células da granulosa e isómero conjugado do ácido linoleico trans10 cis12 (CLA); Fluido sintético do oviducto modificado – mSOF).

Distribuição dos ácidos gordos (%, Média ± EP)

Ácidos gordos TCM+soro+ Células

TCM+soro+ células+CLA

mSOF

Ác. Laurico (C12:0) 9,6 ± 7,0 8,3 ± 4,7 12,3 ± 7,5

Ác. Mirístico (C14:0) 7,3 ± 1,6 10,8 ± 3,52 5,0 ± 1,1

Ác. Palmítico (C16:0) 23,0 ± 3,5 25,1 ± 2,7 28,4 ± 3,9

Ác. Esteárico (C18:0) 11,5 ± 6,5 14,4 ± 4,5 19,6 ± 6,1

Ác. trans Octadecenoatos (C18:1trans) nd 3,4 ± 3,4 3,0 ± 3,0

Ác. Oleico (C18:1 cis9) 26,5 ± 2,4 23,5 ± 7,0 24,6 ± 5,2

Ác. cis12 Octadecenois (C18:1cis12) 5,1 ± 2,5 6,2 ± 3,2 0,9 ± 0,9

Ác. Linoleico (C18:2 n6) 17,1 ± 7,5 8,3 ± 0,8 6,4 ± 2,6 nd= não detectável.

Os resultados deste estudo mostram que o isómero conjugado do ácido linoleico trans10 cis12 (CLA) melhora a sobrevivência após congelação de embriões cultivados

24

com soro sem interferir nas taxas de produção de embriões. A cultura dos embriões em meios definidos sem soro (fluido sintético do oviducto modificado), embora com melhores resultados na sobrevivência pós-descongelação do que a de embriões cultivados no sistema tradicional com soro, origina taxas de embriões piores, não conseguindo igualar os bons resultados obtidos na sobrevivência pós descongelação dos embriões cultivados com soro e CLA. O mecanismo fisiológico pelo qual o CLA actua nos embriões em cultura não é conhecido, podendo como sugerido pela observação das gotículas lipídicas no citoplasma do embriões, diminuir o conteúdo lipidico dos mesmo, de forma semelhante ao que ocorre nos adipócitos. No entanto, estes resultados não foram confirmados pelas análises dos ácidos gordos, provavelmente pela necessidade de aperfeiçoamento da técnica implementada, cuja fiabilidade e sensibilidade ainda não é a desejável.

5.3. Efeito da suplementação dos meios de cultura com ácidos gordos

polinsaturados (ácido araquidónico e eicosapentaenóico) na maturação dos oócitos e no desenvolvimento embrionário (Experiência 3).

A suplementação dos meios de cultura com os ácidos gordos polinsaturados, o

ácido araquidónico e o ácido eicosapentaenóico, foi realizada inicialmente durante o desenvolvimento embrionário e, posteriormente, durante a maturação dos oócitos.

5.3.1. Efeito do ácido araquidónico (C20:4n-6) e do ácido eicosapentaenóico

(C20:5n-3) no desenvolvimento embrionário.

O estudo do efeito da suplementação do meio de cultura de embriões com o C20:4n-6 e com o C20:5n-3 no desenvolvimento embrionário foi realizado em dois ensaios. No 1º ensaio foi testado o efeito de três doses de C20:4n-6 (1, 10 e 100 µM) no desenvolvimento embrionário durante 9 sessões. Apenas a dose mais elevada aumentou significativamente (P<0,04) a taxa de clivagem. Não foram encontradas diferenças significativas nas taxas de embriões D7/D8 nem de embriões eclodidos (tabela 11).

Tabela 11. Efeito da suplementação do meio de cultura de embriões com o ácido araquidónico (C20:4n-6) em diferentes concentrações (1, 10 e 100 µM) sobre a produção de embriões (9 sessões).

Oócitos insem. (n)

Clivagem (média± EP) %

Embriões D7/8 (média±EP) %

Embriões eclodidos(média±EP) %

Testemunha 386 62,9 ± 3,1 a 18,2 ± 0,9 49,4 ± 3,1 1 µM C20:4n-6 397 65,5 ± 3,4 ab 16,8 ± 2,5 44,8 ± 9,4 10 µM C20:4n-6 415 67,3 ± 2,2 ab 15,2 ± 2,0 34,5 ± 6,1 100 µM C20:4n-6 408 69,6 ± 1,9 b 17,8 ± 2,5 50,1 ± 5,3 Valor de P (χ2) a≠b, P<0,04 P>0,05 P>0,05

25

De igual modo, a suplementação do meio de cultura dos embriões com 100 µM de C20:4n-6 melhorou a qualidade dos embriões produzidos, aumentando significativamente (P<0,03) os embriões de grau 2 (tabela 12) quando comparado com a testemunha, não tendo sido identificado qualquer efeito significativo nas outras doses.

Tabela 12. Efeito da suplementação do meio de cultura de embriões com o ácido araquidónico (C20:4n-6) em diferentes concentrações (1, 10 e 100 µM) sobre a qualidade dos embriões (grau 1=muito bom....grau 4=mau; 9 sessões).

Qualidade dos embriões D7/D8 (média±EP) %

n Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Testemunha 68 0 9,3 ± 4,0 a 42,4 ± 4,3 48,3 ± 5,1

1 µM C20:4n-6 64 1,1 ± 1,1 16,9 ± 4,7 ab 34,2 ± 7,7 47,8 ± 9,1

10 µM C20:4n-6 64 1,7 ± 2,4 6,4 ± 3,8 ab 57,7 ± 7,6 53,8 ± 8,9

100 µM C20:4n-6 71 3,8 ± 2,6 20,0 ± 7,3 b 34,7 ± 6,6 41,5 ± 5,3 Valor de P (χ2) P>0,05 a≠b, P<0,03 P>0,05 P>0,05

No 2º ensaio, a suplementação do meio de cultura de embriões com 1, 10 e 100 µM de C20:5 n-3 não interferiu na taxa de clivagem (tabela 13). A presença de 10 µM de C20:5n3 induziu tendencialmente (P=0,06) menos embriões D7/D8 do que na dose 1 µM de C20:5n3. Também, a taxa de eclosão é tendencialmente superior (P=0,06) na dose 100 µM C20:5n-3 do que na testemunha. Tabela 13. Efeito da suplementação do meio de cultura de embriões com o ácido eicosapentaenoico (C20:5 n-3) em diferentes concentrações (1, 10 e 100 µM) sobre a produção de embriões (5 sessões).

Oócitos insem. (n)

Clivagem (média±EP) %

Embriões D7/8 (média±EP) %

Embriões eclodidos(média±EP) %

Testemunha 312 70,1 ± 1,8 24,7 ± 1,8 52,8 ± 5,4

1 µM C20:5n-3 335 67,7 ± 3,3 30,1 ± 5,0 66,2 ± 8,2

10 µM C20:5n-3 314 68,3 ± 3,3 18,8 ± 4,8 58,3 ± 4,8

100 µM C20:5n-3 320 71,4 ± 4,0 23,8 ± 4,0 71,4 ± 6,0

A qualidade dos embriões produzidos foi influenciada pela suplementação do meio de cultura de embriões com C20:5 n-3 nas diferentes doses (tabela 14). A dose 10 µM induz significativamente mais embriões de grau 1 que a testemunha (P<0,05) e a dose de 100 µM C20:5n-3 (P=0,04). Já a dose de 100 µM C20:5 n-3 origina significativamente (P=0,04) mais embriões de grau 3 que a dose de 1 µM.

26

Tabela 14. Efeito da suplementação do meio de cultura de embriões com o ácido eicosapentaenoico (C20:5 n-3) em diferentes concentrações (1, 10 e 100 µM) sobre a qualidade dos embriões (grau 1=muito bom....grau 4=mau; 9 sessões).

Qualidade dos embriões D7/D8 (média ± EP) %

n Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Testemunha 54 4,3 ± 2,9a 11,9 ± 4,9 34,5 ± 3,5ab 49,3 ± 4,4

1 µM C20:5n-3 66 11,1 ± 3,4ab 23,4 ± 7,2 22,1 ± 7,7a 43,5 ± 11,0

10 µM C20:5n-3 41 19,4 ± 8,7b 13,2 ± 3,8 27,5 ± 8,6ab 40,0 ± 5,7

100 µM C20:5n-3 69 3,7 ± 2,3a 20,0 ± 6,4 46,1 ± 9,7b 30,2 ± 6,0 Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (ANOVA)

5.3.2. Efeito do ácido araquidónico (C20:4n-6) e do ácido eicosapentaenóico

(C20:5n-3) na maturação e posterior desenvolvimento embrionário.

A suplementação do meio de maturação de oócitos com duas concentrações (10 e 100 µM) de C20:4n-6 ou de C20:5n-3 não afectou significativamente a taxas de maturação aparente dos oócitos (tabela 15). Esta taxa foi calculada pela razão entre os oócitos classificados morfologicamente como maturados e o total de oócitos, seleccionados após a aspiração dos ovários e, colocados a maturar durante 22 a 24 horas

Tabela 15 Efeito da suplementação do meio de maturação de oócitos com ácido araquidónico (C20:4n-6) e ácido eicosapentaenóico (C20:5n-3) em diferentes concentrações (10 e 100 µM) sobre a taxa de maturação (5 sessões).

Oócitos (n)

Maturação aparente (média±EP)%

Oócitos (n)

Maturação pós coloração (%)

Testemunha 220 89,5 ± 2,4 54 81,5

10 µM C20:4n-6 217 94,2 ± 1,0 53 86,8

100 µM C20:4n-6 216 93,9 ± 2,8 49 81,6

10 µM C20:5n-3 214 92,4 ± 3,2 54 77,7

100 µM C20:5n-3 211 93,2 ± 2,4 57 78,9 na estufa incubadora. De igual modo, não existiram diferenças significativas entre as taxas de maturação dos oócitos após fixação e coloração com acetolacmóide a 1%. Os oócitos em metáfase II foram classificados como maturados (figura 5).

A suplementação do meio de maturação de oócitos com ácidos gordos polinsaturados influenciou significativamente a taxa de produção de embriões em D7/D8, apresentado o grupo suplementado com 100 µM de C20:4n-6 durante a maturação dos oócitos significativamente (P=0,02) mais embriões que o grupo

27

Figura 5. Oócitos classificados como maturado (esquerda) e imaturo (direita) após 22 a 24 horas de cultura em estufa incubadora (coloração com acetolacmóide a 1%).

suplementado com 100 µM de C20:5n-3 e, tendencialmente (P=0,08), mais que a testemunha (tabela 16).

Tabela 16. Efeito da suplementação do meio de maturação de oócitos com ácido araquidónico (C20:4n-6) e ácido eicosapentaenóico (C20:5n-3) em diferentes concentrações (10 e 100 µM) sobre a produção de embriões (5 sessões).

Óocitos insemin. (n)

Clivagem (média±EP) %

Embriões D7/D8 (média±EP) %

Testemunha 196 57,3 ± 6,3 16,2 ± 0,9ab

10 µM C20:4n-6 195 57,2 ± 9,6 20,1 ± 4,8ab

100 µM C20:4n-6 190 61,6 ± 5,0 25,8 ± 2,7a

10 µM C20:5n-3 187 56,9 ± 7,2 18,7 ± 4,7ab

100 µM C20:5n-3 190 49,7 ± 7,6 11,9 ± 4,3b Letras diferentes na mesma coluna indicam diferenças significativas (ANOVA)

A qualidade dos embriões produzidos consta na tabela 17. Não foram encontradas diferenças significativas na qualidade dos embriões em D7/D8 após Tabela 17. Efeito da suplementação do meio de maturação de oócitos com ácido araquidónico (C20:4n-6) e ácido eicosapentaenóico (C20:5n-3) em diferentes concentrações (10 e 100 µM) sobre a qualidade dos embriões (grau 1=muito bom....grau 4=mau; 5 sessões).

Qualidade dos embriões em D7/D8 (média ± EP) %

n Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Testemunha 18 0 8,3 ± 5,3 41,7 ± 5,3 50,0 ± 0,0

10 µM C20:4n-6 22 4,0 ± 4,0 21,3 ± 9,9 25,3 ±10,6 49,5 ± 21,1

100 µM C20:4n-6 30 0 6,9 ±4,5 57,7 ± 7,6 35,3 ± 4,9

10 µM C20:5n-3 23 0 4,3 ± 4,3 40,0 ± 10,0 55,7 ± 11,8

100 µM C20:5n-3 11 0 8,0 ± 8,0 30,7 ± 18,5 41,3 ± 19,4

28

suplementação do meio de maturação com os ácidos gordos polinsaturados referidos. Os embriões transferíveis (grau 1 a 3) com 7 ou 8 dias de idade foram

congelados por vitrificação e, depois, descongelados para avaliar a sua capacidade de resistência à congelação/descongelação (tabela 18). Estes resultados são ainda preliminares, pois apenas foram realizadas duas sessões de descongelação, dado o número reduzido de embriões congelados em cada grupo.

Tabela 18. Efeito da suplementação do meio de maturação de oócitos com ácido araquidónico (C20:4n-6) e ácido eicosapentaenóico (C20:5n-3) em diferentes concentrações (10 e 100 µM) sobre a sobrevivência dos embriões após congelação /descongelação (2 sessões).

Resistência à congelação /descongelação

Integridade pósdescongelação

Expansão 24 horas

Expansão 48 horas

Eclosão 72 horas

(média±EP) % (média±EP) % (média±EP) % (média±EP) %

Testemunha 83,3 ± 16,7 41,7 ± 8,3 41,7 ± 8,3 0

10 µM C20:4n-6 83,3 ±16,7 58,3 ± 41,7 50,0 ± 50,0 50,0 ± 50,0

100 µM C20:4n-6 83,3 ±16,7 16,7 ± 16,7 16,7 ± 16,7 0

10 µM C20:5n-3 83,3 ±16,7 50,0 ± 50,0 50,0 ± 50,0 12,5 ± 12,5

100 µM C20:5n-3 83,3 ±16,7 83,3 ±16,7 83,3 ±16,7 50,0 ± 50,0

Os resultados da experiência 3 demonstram que a suplementação dos meios de cultura de oócitos e/ou embriões com os ácidos gordos polinsaturados C20:4n-6 e C20:5n-3 melhoram o número e qualidade dos embriões produzidos. Recomenda-se a futura incorporação de 100 µM C20:4n-6 e 100 µM de GSH nos meios de cultura de oócitos e embriões. A suplementação com C20:5n-3 só deve ser utilizada no meio de cultura de embriões e na dose máxima de 10 µM. A incorporação conjunta de 100 µM C20:4n-6 e GSH, um anti-oxidante, permitiu anular o efeito negativo deste ácido gordo polinsaturado na eclosão dos embriões, identificado em trabalhos anteriores do nosso laboratório, mantendo o efeito positivo na clivagem e, ainda, na qualidade dos embriões.

5. PUBLICAÇÕES EMERGENTES DO PROJECTO.

Rosa M. Pereira, Carla C. Marques, Maria C. Baptista, Maria I. Vasques, António E.M. Horta. 2004. Influence of arachidonic acid, ciclooxygenase and lipoxygenase inhibition on the development of early bovine embryos. Revista Brasileira de Zootecnia (aceite para publicação).

Pereira, R.M.; Baptista, M.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M.; Portugal, P.V.; Bessa, R.J.B.; Marques, C.C. 2004. Post-thawing resistance of bovine embryos is improved by trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid (CLA). 15th

29

International Congress on Animal Reproduction (ICAR - 2004), Porto Seguro - Brazil. 8 a 12 Agosto. vol. 2, pp.538.

Pereira, R.M.; Pimenta, J.; Becker, J.D.; Baptista, M.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M.; Marques, C.C. 2004. Expressão da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) em embriões bovinos produzidos in vitro. Resultados preliminares. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias (submetido).

R.M. Pereira, C.C. Marques, M.C. Baptista, M.I. Vasques, A.E.M. Horta. Effect of prostaglandins on preimplantation bovine embryos. 2005. Reproduction in Domestic Animals (aceite para publicação).

M. Lapa, C.C. Marques, M.C. Baptista, M.I. Vasques, A.E.M. Horta, P.V. Portugal, R.J.B. Bessa, R.M. Pereira. Fatty acid profile of oocytes and blastocysts during in vitro bovine embryo production. 2005. Reproduction in Domestic Animals (aceite para publicação).

Carvalhais, Isabel. 2005. Sexagem de embriões bovinos cultivados in vitro. Implementação de técnicas para aumentar a sua viabilidade após sexagem, congelação e descongelação. Dissertação para provas de Mestrado em Produção Animal, Universidade dos Açores.

Lapa, Marisa. 2005. Produção in vitro de embriões bovinos em co-cultura com células da granulosa. Dissertação para obtenção da licenciatura em Engenharia Biotecnológica, Universidade do Algarve.

R.M. Pereira, M.C. Baptista, M.I. Vasques, A.E.M. Horta, P.V. Portugal, R.J.B.

Bessa, C.C. Marques. 2005. Cryo-survival of bovine blastocysts is enhanced by culture with trans-10 cis-12 conjugated linoleic acid (CLA). Anim. Reprod. Sci. (a submeter)

6. OBJECTIVOS vs. REALIZAÇÃO. Os objectivos propostos foram cumpridos. No entanto, o projecto esteve

suspenso entre Janeiro e Maio de 2004, por indisponibilidade de acesso às verbas referentes às rubricas das despesas correntes, implicando o atraso de algumas acções que ainda estão em curso. Algumas das técnicas implementadas, nomeadamente a análise de ácidos gordos em oócitos e embriões, terão de ser aperfeiçoadas, de forma a atingir um maior limiar de sensibilidade e fiabilidade nos resultados.

7. RELATÓRIO FINANCEIRO. O orçamento programado de 55132 euros foi concretizado com uma taxa de

execução de 93%, permitindo a realização das acções de investigação previstas. O relatório financeiro foi executado pela Repartição Financeira da EZN.

Vale de Santarém, 31 de Março de 2005.

30

Anexo I – Bibliografia .

Asselin, E., Drolet, P., Fortier, M.A. 1997. Cellular mechanisms involved during oxytocin-induced prostaglandin F2α production in endometrial epithelial cells in vitro: role of cyclooxygenase-2. Endocrinology, 138: 4798-4805.

Folch, J.; Lees, M.; Stanley, G.H.S. 1957. A simple method for the isolation and purification of totallipids from animal tissue. J. Biol. Chem., 226: 497.

Holm P, Booth PJ, Schmidt MH, Greve T, Callesen H. 1999. High bovine blastocyst development in a static in vitro production system using SOFaa medium supplemented with sodium citrate and myo-inositol with or without serum-proteins. Theriogenology, 52: 683-700.

Marques, C.C.; Pereira, R.M.; Vasques, M.I.; Baptista, M.C.; Horta, A.E.M. 1997. Influência da refrigeração de ovários dadores na produção de embriões bovinos e cultura de células da granulosa in vitro. 1º Congresso Ibérico de Reprodução Animal, Estoril - 3 a 6 de Julho , vol. II, pp. 136-141.

Mermillod, P.; Traldi, A.S.; Guérin, Y.; Poulin, N.; Massip, A.; Cognie, Y. 1997. Sucessful vitrification of in vitro produced ovine embryos. 13th AETE Meeting, Lyon.

Reis, A. 2003. Fatty acid and antioxidant effects on development in vitro of bovine and ovine embryos. PhD Thesis, University of Aberdeen, pp. 306.

Reis, A., Rooke, J.A., McCallum, G.J., Staines, M.E., Ewen, M., Lomax, M.A., McEvoy, T.G. 2003. Consequences of exposure to serum, with or without vitamin E supplementation, in terms of the fatty acid content and viability of bovine blastocysts produced in vitro. Reprod Fertil Dev., 15: 275-84.

Sata, R.; Tsujii, H.; Abe, H.; Yamashita, S.; Hosshi, H. 1999. Fatty acid composition of bovine embryo cultured in serum free and serum containing medium during early embryonic development. J. Reprod. Dev., 45: 97-103.

Sukhija, P.S.; Palmquist, D. L. 1988. Rapid method for determination of total fatty Acid Content and Composition of feedsttuffs and feces. J. Agric. Food Chem., 36: 1202.

Zeron, Y.; Ocheretny, A.; Kedar, O.; Borochov, A.; Sklan, D.; Arav, A. 2001. Seasonal changes in bovine fertility: relation to developmental competence of oocytes, membrane properties and fatty acid composition of follicles. Reproduction, 121: 447-454.

Zeron, Y.; Sklan, D.; Arav, A. 2002. Effect of polyunsaturated fatty acid supplementation on biophysical parameters and chilling sensivity of ewe oocytes. Mol. Rep. Dev., 61: 271-278.