Relatório Hibridização in Situ

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA Centro Tecnológico Programa de Pós Graduação em Engenharia Ambiental Biodinâmica Ambiental RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU (FISH) Gustavo Tonon Raphael Zanelato Barbosa 1

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

Centro Tecnológico

Programa de Pós Graduação em Engenharia Ambiental

Biodinâmica Ambiental

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – HIBRIDIZAÇÃO IN SITU (FISH)

Gustavo Tonon

Raphael Zanelato Barbosa

Florianópolis - SC

2015

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1 INTRODUÇÃOProblemas ambientais estão cada vez mais em destaque atualmente.

Desenvolvimento tecnológico aliado a crescimento populacional acarreta em

maior demanda em recursos naturais, que quando mal utilizados podem vir a

ocasionar impactos negativos. Nesse contexto, há a necessidade de que se

criem mecanismos de controle e minimização, como leis e normas ambientais,

e tecnologias sustentáveis.

Quando considerado manutenção da qualidade dos recursos hídricos

surgem os sistemas de tratamento de esgoto. Grande parte dos sistemas

instalados ao redor do mundo utilizam de processos biológicos, e dentre os

parâmetros operacionais comumente analisados para o controle de eficiência

em tratamento do efluente está a análise da microfauna envolvida.

Os principais tipos de microrganismos envolvidos no tratamento de

efluentes são bactérias, algas, protozoários e metazoários, sendo que a maior

porcentagem é de bactérias. Dentro do domínio das bactérias existem

diferentes gêneros que desempenham diferentes funções nos diversos tipos de

tratamento. Como exemplos podemos citar as nitrosomonas que

desempenham o papel de nitrificação em ambientes aeróbios.

Em questões de engenharia, muito se desenvolveu nos últimos anos,

porém em relação a estrutura e função das comunidades microbiológicas

pouco se sabe (Wagner e Amman,1997). Dessa forma, a aproximadamente 30

anos atrás surgiu a técnica fluorescence in situ hybridization (FISH). É uma

técnica de biologia molecular eficaz para identificação de microorganismos que

se tornou muito popular em tratamento de esgoto.

2 BIOLOGIA MOLECULAR A biologia molecular começou a ser estudada em meados dos anos

50. Ela apresenta preocupação peculiar com o estudo das características

genéticas passadas hereditariamente. A genética também estuda dessa forma,

mas em um nível celular, enquanto que a biologia molecular é um estudo em

nível molecular, com foco especial no estudo da estrutura e função do material

genético e seus produtos de expressão, as proteínas. Ela investiga as

interações entre os diversos sistemas celulares, incluindo a relação

entre DNA, RNA e síntese proteica. Podendo estudar mais a fundo essas

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características, a biologia molecular tem grande importância na fabricação de

remédios e outras soluções para saúde.

A biologia molecular tem sido amplamente utilizada como ferramenta

de caracterização microbiológica, utilizando técnicas qualitativas e quantitativas

para a identificação de espécies específicas ou grupos funcionais relacionados

à remoção de poluentes.

Algumas dessas técnicas são a PCR ou Polymerase Chain Reaction,

que é uma técnica de grande versatilidade que permite obter múltiplas cópias

de um segmento de DNA. O PCR também é usado para introduzir locais de

restrição e mutações pontuais ou para identificar um fragmento particular de

DNA numa biblioteca de cDNA;

A DGGE ou eletroforese em gel com gradiente desnaturante, no qual

DNA, RNA e proteínas são separados segundo o seu tamanho, numa matriz

usando um campo eléctrico aplicado. O DNA ou o RNA é separado, e faz com

que a amostra migre través de um gel de agarose. As proteínas são separadas

de acordo com o seu tamanho, usando electroforese em gel de acrilamida ou

podem ser separadas segundo a sua carga eléctrica usando focagem

isoeléctrica (MUYZER, 1999);

Segundo Carvalho (2010), o método de sequenciamento de DNA

consiste na adição de didesoxirribonucleotídeos. Didesoxirribonucleotídeos são

nucleotídeos modificados e que impedem o crescimento de um fragmento de

DNA em replicação pela DNA polimerase após sua adição. Já o

pirosequenciamento, consiste na captação da emissão de luz causada pela

adição de uma luciferase, acoplada à polimerização do DNA previamente

fragmentado e aderido a microesferas, com o uso de sequências adaptadoras;

O método de FISH ou hibridização in situ, que usa sondas

fluorescentes complementares de sequências específicas de RNA ribossômico

(RNAr) das células-alvo. Esse último é um método histoquímico que permite a

visualização, identificação, enumeração e localização simultânea de micro-

organismos in situ, sem a necessidade de cultivos celulares (NISHIO, 2010).

3 ASPECTOS GERAIS DO FISHA aplicação de métodos moleculares como o FISH, clonagem, DGGE

tem levado a um maior entendimento de processos microbiológicos que

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ocorrem em um reator biológico. Os métodos permitem a análise da dinâmica

populacional e a identificação de espécies responsáveis pela degradação do

sistema de tratamento de esgoto (AKARSUBASI et al., 2005).

As análises de identificação direta e estudo da diversidade microbiana

são normalmente realizadas no RNAr 16S. A análise do RNAr 16S é o método

mais utilizado para estudo filogenético de microrganismos pois este gene é

encontrado em todas as células vivas, ocorre em elevado número de cópias e é

muito estável (NEUFELD; MOHN, 2006).

FISH é um método histoquímico que permite a identificação de

microorganismos in situ . É um método que consiste na visualização direta em

microscópios ópticos fluorescentes. Também permite que sequências de

ácidos nucleicos sejam examinadas no interior de células sem alterar sua

morfologia ou integridade de seus compartimentos. Com isso, há a combinação

da precisão da genética molecular com a informação visual do microscópio

ótico (AMANN; FUCHS; BEHRENS, 2001).

O principio básico do FISH é o alinhamento básico da sonda com a

sequência alvo, para a posterior observação em microscopio epifluorescente.

Entende-se por sonda, uma sequência de oligonucleotídeos complementares e

específicos marcados com substâncias fluorescentes os quais se anelarão ao

alvo. Há duas possíveis marcações das sondas, a direta e a indireta. O

processo mais utilizado, por ser mais rápido e de fácil execução, é a marcação

direta. Um ou mais fluorocromos são diretamente conjugados às sondas que se

ligam nas regiões 5’ ou 3’ do alvo. A marcação indireta pode aumentar a

sensibilidade ligando uma molécula de digoxigenina à sonda (AMANN; FUCHS;

BEHRENS, 2001).

A técnica pode ser utilizada para identificar uma célula individualmente,

entretanto a identificação de somente uma célula não é comum. Amman,

Ludwig e Schleifer (1995) a visualização de menos de 103 células por cm2 pode

se tornar tendiosa mostrando a necessidade de concentrar a amostra para

análise. Abaixo está uma imagem representativa de como é a visualização das

colônias pelo microscópio.

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Figura 1-Células hibridizadas para análise de bactérias em um RBSG com as sondas

NSO190(Todas BOA beta) (A), NEU (Nitrossomonas sp.)(B) e PAO651(Accumulibacter)(C).

O FISH apresenta vantagem de ser uma técnica rápida, simples e

acurada de detecção de bactérias e archeas. Além disso, outra vantagem da

técnica é que o RNAr 16S contem informações da relação entre os

microrganismos epodem ser distinguidas de diferentes populações

independente da atividade. Porém, uma de suas limitações é a não

acessibilidade de todas as regiões alvos do RNAr 16S às sondas Amman,

Ludwig e Schleifer (1995), e também as sondas falham em emitir uma

intensidade detectável de fluorescência.

4 PROCEDIMENTO DE FISH O procedimento de hibridização in situ é relativamente simples. As

amostras contendo os micro-organismos são fixadas para proteger o RNA da

degradação de RNAses endógenas e permeabilizadas com etanol 70% para

permitir que as sondas penetrem na célula. A etapa de hibridização dura

aproximadamente 4 horas, à 37ºC e em um incubador comum. Após a

hibridização é feita a lavagem para remoção do excesso de sondas. A amostra

é então analisada, utilizando um microscópio de fluorescência comum.

Utilizando um número maior de sondas no ensaio, assegura-se um alto nível de

sensibilidade e especificidade, minimizando a possibilidade de falsos negativos.

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CONLCUSÃO A hibridização in situ, tem uma grande variedade de aplicações dentro

de diferentes campos de investigação, como mapeamento genético, toxicologia

molecular, ecologia microbiana, diagnóstico de doenças e em estações de

tratamento de água. Apesar da alta especificidade e sensibilidade dessa

técnica, podem ocorrer erros, como os falsos-positivos, levando a resultados

equivocados. Assim sendo, ela deve ser analisada minuciosamente, realizando

testes prévios com amostras-controle positivas e negativas.

REFERENCIASARKASUBASI, A.T.; INCE,O.; KIRDAR,B.;OZ,N.A.; ORHON, D.; CURTIS, T.

P.; HEAD, I.M.;INCE, B. K. Effect of wastewater composition on archael

population diversisty. Water research, v.39, p.1576-1584, 2005.

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Figura 2 - Principais etapas da hibridização fluorescente in situ.

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AMANN, R.; FUCHS, B. M.; BEHRENS, S. The identification of microorganisms

by fluorescence in situ hybridization. Current Opinion in Biotechnology, v. 12, p.

231-236, 2001.

AMANN, R. I.; LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K.-H. Phylogenetic identification and

in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiological

Reviews, v. 59, n. 1, p. 143-169, 1995.

ASTBURY, W. T., Molecular Biology or Ultrastructural Biology, Department of

Biomolecular Structure, University of Leeds. Disponível em

http://www.nature.com/nature/journal/v190/n4781/abs/1901124a0.html

CARVALHO, M. C. da C. G., SILVA, D. C. G., Sequenciamento de DNA de

nova geração e suas aplicações na genômica de plantas. Cienc. Rural [online].

2010, vol.40, n.3, pp. 735-744. ISSN 0103-8478. Disponível em

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-

84782010000300040&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt

NEUFELD, J. D.; MOHN, W.W. Assessment of microbial phylogenetic diversity

based on environmental nucleic acids. In: STACKERBRANDT, E. (Ed.).

Molecular identification, systematics, and population structure of prokaryotes.

Heidelberg: Springer-Verlag, 2006. p. 220-259.

NEVES, S.M.N., GUEDES, R.M.C., Hibridização in situ fluorescente: princípios

básicos e perspectivas para o diagnóstico de doenças infecciosas em medicina

veterinária. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.79, n.4, p.627-632, dez., 2012.

NISHIO, S. R., Avaliação da comunidade microbiana procarionte através de

técnicas moleculares – FISH, PCR/DGGE e sequenciamento em sistemas

artificiais de redução de cargas: ênfase ao estudo de lagoa de estabilização

facultativa. Dissertação de Doutorado. São Paulo, 2010.

MUYZER, G. DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural

ecosystems. Netherlands Institute for Sea Research, 1999.

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WAGNER, M. AND AMANN, R. Molecular Techniques for Determining

Microbial Community Structures in Activated Sludge. IAWQ Scientific and

Technical Report , 1997.

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