Catarina Costa 11ºBBiologia 2014/2015

Índice:

Introdução: P. 2Descrição das atividades realizadas: P. 3 Resultados obtidos/Conclusões: P. 5Discussão: P. 5Bibliografia/Webgrafia: P. 5

Introdução:

O objetivo desta atividade foi fazer com que os alunos compreendam a importância da análise do ADN na investigação de crimes.

Para tal, foram introduzidos os métodos de eletroforese e o conceito de enzima de restrição.

Aprendemos a trabalhar com micropipetas (instrumentos de medição para escalas do mililitro), o que nos permitiu um melhor manuseamento dos materiais na parte experimental.

A técnica de eletroforese permite dividir componentes de algo (neste caso do sangue) de acordo com a sua carga elétrica e o seu tamanho, fazendo com que as cargas negativas se desloquem para o polo positivo e vice-versa e que os componentes maiores eram os que migravam menos.

Assim sendo, este método permite separar os componentes do ADN e como tal elaborar um perfil, o qual, sendo único a cada indivíduo, permite identificar alguém com uma amostra de ADN, de acordo com a posição das riscas dos componentes.

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Descrição das atividades realizadas:

A primeira atividade que fizemos foi aprender a trabalhar com as micropipetas (Fig.1), instrumento anteriormente desconhecido aos alunos, que permite a medição de valores na ordem do mililitro (0.001 litros). Para trabalhar com este instrumento, primeiro é necessário escolher uma micropipeta cujo intervalo de medição esteja adequado à medição pretendida e ajustar o valor. Seguidamente, devemos colocar uma ponta esterilizada de plástico (Fig. 2) que vai permitir o transporte do líquido. Depois carregamos no botão até à primeira posição, mergulhamos no líquido e largamos lentamente, transportamos para o local onde queremos por o líquido e carregamos no

botão até à segunda posição, de forma a largar o líquido. O último passo é colocar a ponta de plástico utilizada e descartá-la.

A segunda atividade já foi para nos preparar para a atividade principal. Nesta atividade fizemos a separação de corantes por eletroforese. Para tal começamos por fazer um gel de agarose, feita com TBE e agarose. Colocamos este gel num tabuleiro vedado com fita-cola e inserimos um “pente” no gel e deixámos que este solidificasse, tirando,

seguidamente, o pente. Isto formou uns orifícios no gel (poços), local onde colocamos as soluções que estudámos através da técnica da micropipeta. Mas antes de colocarmos as soluções, despejamos nas câmaras laterais da tina 250ml de TBE.

Depois de colocados as soluções de cor nos orifícios ligámos a corrente e passado 15 minutos, quando voltamos a observar o gel já estavam separados vários componentes das soluções (Fig. 3).

Nesta atividade tínhamos, para além dos corantes, uma substância desconhecida, e o nosso objetivo era descobrir de que corantes era feita essa substância.

Sem o processo de eletroforese, não seria possível encontrar resposta porque não teríamos maneira de descobrir quais os componentes, e assim, de acordo com a posição dos componentes relativamente às outras amostras, é-nos possível comparar e concluir quais os constituintes da substância desconhecida.

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Fig. 1- Micropipetas

Fig. 2 - Pontas esterilizadas de plástico

Fig. 3 - Gel de Agarose com os componentes dos corantes separados

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A segunda atividade foi a atividade principal, intitulada “Identificação de um criminoso por perfil de ADN”.

Nesta atividade, o que fizemos foi comparar o perfil de ADN de vários suspeitos de um crime com o perfil de ADN encontrado na cena do crime.

Para começar, adicionamos 7,5 µl de enzimas de restrição (Hind III e EcoRI) a cada amostra de ADN, as quais tinham também 7,5 µl de conteúdo. As enzimas de restrição fazem com que a ligação açúcar-fosfato seja hidrolisada e assim quebra.

Depois de feita esta adição devemos agitar a solução para misturar melhor os componentes. Após tal, colocamo-las em banho-maria durante 30 minutos a 37°C.

Enquanto esperamos pelas amostras repetimos o processo de preparar a Agarose, tal como quando a preparamos para a eletroforese de corantes, mas com uma ligeira diferença: depois de 10 minutos para a Agarose arrefecer adicionamos um corante azul “500x Fast Blast DNA stain”, o que nos vai possibilitar uma melhor distinção das bandas do DNA.

Após a solidificação do gel e da formação dos orifícios por parte do pente, preparamos novamente uma solução de TBE e do corante azul, a qual é despejada nas câmaras laterais da tina (Fig.4).

Neste momento colocou-se 15 µl de cada amostra em cada poço, ligando-se de seguida a corrente elétrica, o que começou o processo de eletroforese. Este processo leva 30 minutos, tempo a partir do qual desligamos a corrente e conseguimos observar a separação dos constituintes de cada amostra, verificando assim que havia uma correspondência entre um dos suspeitos e a amostra do local do crime.

Resultados obtidos/Conclusões:

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Fig. 4 - Tina com gel de Agarose e solução de TBE e corante azul

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Na eletroforese de corantes, podemos concluir que a substância desconhecida era composta pelo Azul de Bromofenol (AB), pelo Laranja G (LG) e pela Safranina (S). Isto devido à posição das bandas dos componentes da substancia desconhecida corresponderem à posição das bandas dos corantes acima referidos.

No caso da eletroforese do ADN, o ADN do suspeito 2 correspondia com o ADN encontrado na cena do crime (Fig.5). O que significa que as bandas do ADN da cena do crime se encontravam na mesma posição do ADN do suspeito, ou seja, o tamanho e o número dos fragmentos cortados pelas enzimas é igual. Graças a estas observações, podemos concluir que ambas as amostras tiveram a mesma origem e que o Suspeito 2 é a pessoa que deixou o seu ADN no local do crime.

Discussão:Uma parte essencial para obter resultados corretos neste tipo de técnicas é o

correto manuseamento das micropipetas, razão pela qual a nossa primeira atividade foi com o objetivo de nos ensinar a fazer tal. O incorreto manuseamento das micropipetas poderia originar um erro de resultados devido à entrada de ar junto com o liquido, e como são medidas muito pequenas faz uma grande diferença.

Para além disto, outra parte importante é a solução tampão TBE, que protege os ácidos nucleicos da ação das enzimas de restrição, os quais são essenciais para a eletroforese.

Os resultados obtidos vão também depender da concentração do gel de Agarose, que possui uma malha de poros, pela qual passam os componentes dos ácidos nucleicos. Caso esta malha fosse mais estreita (maior concentração do gel) ia haver mais dificuldade na dispersão dos componentes pelo gel.

Bibliografia/Webgrafia:

http://pt.wikipedia.org/wiki/Tamp%C3%A3o_TBE

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Fig. 5 - Gel de Agarose com eletroforese de ADN (nota: risca verde não conta)