Relatorio Mackpesquisa2013 -...

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MECANISMOS PLÁSTICOS NO MODELO DE AUTISMO INDUZIDO PELA

EXPOSIÇÃO PRÉ-NATAL AO ÁCIDO VALPRÓICO.

Roberta Monterazzo Cysneiros

Programa de Pós-graduação em Distúrbios do Desenvolvimento. Laboratório

de Neurobiologia. Universidade Presbiteriana Mackenzie (UPM), São Paulo,

Brasil

*Autor para correspondência.

Roberta Monterazzo Cysneiros

Rua da Consolação, 930. Prédio 38.

CEP 01302-907. São Paulo, SP, Brazil.

[email protected],

Telefone: 55-11 211482

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2

ABSTRACT

It is well established that exposure to valproic acid in utero increases the risk for

developing autism spectrum disorders. The valproic acid model of autism

reproduces the core and associated symptoms of the human condition. It is

hypothesized that autism is due to brain desynchronization of neural networks

as a consequence of changes in number of neurons or density of synaptic

contacts. Post mortem pathological studies have identified increased density of

neurons in the hippocampal formation. In the valproic acid (VPA) model of

autism in rodents we investigate the morphological changes in the hippocampal

formation and prefrontal cortex and hipocampal neurogenesis, Female Wistar

received a single dose of valproic acid (VPA, 800 mg / kg, po) on the ninth day

of gestation. The controls received saline. At 30 days old male offspring of both

groups were administrated with BrdU, (50 mg/kg, ip., twice a day) for 5 days. At

60 days old offspring of both groups were perfused and brains processed for

immunohistochemistry. Rats exposed to VPA in utero showed a greater number

of parvalbumin positive neurons in CA1 and CA3 subfields, and NeuN, in the

hippocampal formation and prefrontal cortex, was well an increased number of

BrdU positive neurons in subgranular zone of dentate gyrus. Our results

suggest that VPA increased hippocampal neurogenesis which justifies, in part,

the enhanced neuronal density observed in rats exposed to VPA in utero. The

higher neuronal density may contribute to a deficit in neural networks

synchronization.

Key-words

Autism, valproic acid, neurogenesis, calcium-binding protein

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Resumo

Está bem estabelecido que a exposição ao ácido valpróico in utero aumenta o

risco para o desenvolvimento dos transtornos do espectro autista. O modelo

experimental para estudo do autismo pela exposição valpróico (VPA) in utero

reproduz os sintomas centrais e associados da condição humana. Especula-se

que no autismo deve ocorrer déficit na sincronização de redes neurais devido a

alterações no número de neurônios e ou na densidade de contatos sinápticos.

Estudos patológicos post mortem têm identificado anormalidade celular em

várias estruturas do sistema límbico, incluindo a formação hipocampal, no qual

um aumento da densidade de neurônios tem sido relatado na camada piramidal

e no subiculum. O aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de

um aumento da neurogênese e ou redução no processo de apoptose. No

modelo animal pela exposição ao ácido válpróico (VPA) in utero, investigamos

as alterações morfológicas na formação hipocampal e no córtex pré-frontal

utilizando imunohistoquímica para a parvalbumina, para o marcador de

neurônios pós-mitóticos (NeuN) e a neurogênese hipocampal. Fêmeas Wistar

receberam VPA (800 mg/kg, p.o.) no nono dia da gestação, e os controles,

salina. Aos 30 dias pós-natal, filhotes machos receberam (50 mg/kg, ip., duas

vezes ao dia) for 5 dias. Aos 60 dias, foram perfundidos e os cérebros

submetidos à imunohistoquímica para a parvalbumina, NeuN e BrdU. Ratos

expostos ao VPA in utero apresentaram maior número de neurônios reativos

para parvalbumina nas regiões CA1 e CA3 e para NeuN, em toda a formação

hipocampal e córtex pré-frontal, e maior número de neurônios positivos para

BrdU na zona subgranular, granular e molecular do giro dentado

comparativamente aos controles. Nossos resultados demonstraram que a

exposição ao VPA in utero aumenta a neurogênese hipocampal o que justifica

o aumento da densidade neuronal observada na formação hipocampal e córtex

pré-frontal. Futuros estudos devem ser conduzidos para investigar se a

redução na apoptose está relacionada com o aumento no número de neurônios

4e se a manipulação deste processo pode não somente modificar as alterações

do número de neurônios como reverter as alterações comportamentais autism-

like observadas no modelo.

Palavras chave: ácido valpróico, neurogênese, proteínas ligantes de cálcio,

autismo

Introdução

De acordo com o DSM-IV (Diagnostic and Statistic Manual of Mental

Disorders, Fourth Edition) e a CID 10 (Classificação Internacional das Doenças,

10ª edição), o termo transtorno global do desenvolvimento (TGD) compreende

um amplo espectro de distúrbios caracterizados pela presença de alterações

comportamentais de início precoce com uma grande variabilidade de

apresentações clínicas e graus de acometimento. Esses distúrbios têm em

comum diminuição ou perda das habilidades sociais, da comunicação e a

presença de interesses e comportamentos restritos e estereotipados (APA,

1994 e OMS, 1992).

A categoria TGD inclui as seguintes condições: Síndrome de Rett, transtorno

desintegrativo da infância, Síndrome de Asperger, transtorno invasivo do

desenvolvimento sem outra especificação (TID-SOE) e autismo (APA, 1994).

Apesar da patogênese do autismo permanecer desconhecida, vários estudos

mostram evidências que indicam a importância de fatores genéticos (Folstein e

Piven, 1991; Folstein e Rosen-Sheidley, 2001), e de fatores ambientais, como a

exposição às substâncias teratogênicas como a talidomida (Strömland e col.,

1994), ácido valpróico (Christianson, Chesler et al., 1994; Williams e Hersh,

1997; Williams, King et al., 2001) e etanol (Nanson, 1992). Devido à

complexidade dos sintomas dos indivíduos com autismo, acredita-se que várias

regiões cerebrais tenham alterações morfofuncionais que justificam a

diversidade fenotípica dos pacientes com autismo (Mercadante, Cysneiros et

al., 2008). Neste sentido, estudos experimentais têm buscado desenvolver

5modelos em roedores na tentativa de reproduzir alguns dos sintomas centrais

do autismo (Crawley, 2007). Ainda que modelos em roedores não possam

replicar fielmente os transtornos do espectro autista em humanos, são úteis

para o entendimento das bases neurobiológicas e na investigação da interface

entre as bases bioquímicas, moleculares, anatômicas e genéticas da condição

humana.

O ácido valpróico (VPA) é reconhecido como um fator ambiental

envolvido com a etiologia do autismo (Christianson, Chesler et al., 1994;

Williams e Hersh, 1997; Williams, King et al., 2001; Dean, Hailey et al., 2002;

Rasalam, Hailey et al., 2005). Em ratos, uma única injeção intraperitoneal de

VPA durante a gestação em um período correspondente ao fechamento do

tubo neural produz nos filhotes um fenótipo comportamental e anatômico

similar à condição humana. Os filhotes exibem redução no número de células

de Purkinje no cerebelo, prejuízo na interação social, comportamentos

repetitivos e estereotipados, limiar aumentado para estímulos nociceptivos,

sensibilidade aumentada para estimulação sensorial, déficit cognitivo, aumento

da ansiedade e do medo (Rodier, Ingram et al., 1996; Rodier, Ingram et al.,

1997; Schneider e Przewlocki, 2005; Schneider, Turczak et al., 2006; Markram,

Rinaldi et al., 2008), todos os sintomas que são comuns no autismo. No

entanto, estudos histopatológicos são escassos neste modelo.

Tem sido proposto que o autismo é devido a déficit na sincronização de

redes neurais como resultado do desbalanço entre a sinalização excitatória e

inibitória, em conseqüência de alterações no número de neurônios e ou na

densidade de contatos sinápticos. Estudos patológicos post mortem têm

identificado anormalidade celular em várias estruturas do sistema límbico,

incluindo a formação hipocampal, no qual um aumento da densidade de

neurônios tem sido relatado na camada piramidal e no subiculum (Bauman e

Kemper, 1985). O aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de

um aumento da neurogênese e ou defeito no processo de apoptose.

(Mercadante, Cysneiros et al., 2008) postularam que alteração na neurogênese

pode um mecanismo neurobiológico relevante no autismo e (Snow, Hartle et

al., 2008) sugeriram que redução no mecanismo de poda pode igualmente

relevante.

6 Estudos de associação e citogenéticos revelam a presença de mutação

na região q11-13 do cromossomo 15 responsável pela expressão das três

subunidades do receptor GABAA, (Cook, Courchesne et al., 1998; Shao,

Cuccaro et al., 2003), realçando a importância do sistema GABAérgico na

neuropatologia do autismo. O ácido gama aminobutírico (GABA) é o principal

neurotransimissor inibitório do cérebro adulto, e excitatório no cérebro em

desenvolvimento. Durante o desenvolvimento, as sinapses gabaérgicas são

formadas mais precocemente que as sinapses glutamatérgicas (Deng, Yao et

al., 2007), o que confere ao GABA um papel central como um regulador que

capacita os novos ou imaturos neurônios a se integrarem dentro de um circuito

neural (Akerman e Cline, 2007). No período embrionário e peri-natal do

desenvolvimento, os receptores GABAA medeiam efeitos despolarizantes que

resultam na ativação de processos de sinalização sensíveis ao cálcio que são

importantes para diferenciação do cérebro (Deng, Yao et al., 2007;

Galanopoulou, 2008). A resposta despolarizante mediada pelo GABA exerce

um fator chave no desenvolvimento do circuito neural uma vez que a ativação

do receptor GABAA ativa canais de cálcio e sódio dependentes de voltagem e

reduz o bloqueio, mediado pelo magnésio, no receptor glutamatérgico do tipo

NMDA. Estes efeitos influenciam a atividade neuronal e também deflagram

processos de sinalização que controlam a proliferação, migração e

diferenciação neuronal (Ben-Ari, 2007; Ben-Ari, Gaiarsa et al., 2007;

Galanopoulou, 2008). Na formação hipocampal encontra-se uma população

heterogênea de interneurônios GABAérgicos que expressam diferentes tipos

de proteínas ligantes de cálcio, dentre estas, a parvalbumina. A expressão da

parvalbumina tem sido utilizada para avaliação da densidade de interneurônios

GABAérgicos, e sua expressão já foi bem caracterizada no cérebro de

roedores.

A proposta de trabalho foi investigar se a exposição ao VPA in utero

promove alterações morfológicas na formação hipocampal e no córtex pré-

frontal utilizando imunohistoquímica para a parvalbumina, para o marcador de

neurônios pós-mitóticos (NeuN) e neurogênese hipocampal.

MÉTODOS

7Os procedimentos experimentais utilizados neste trabalho foram aprovados

pelo Comitê de Ética da Universidade Presbiteriana Mackenzie.

Animais

Ratos adultos Wistar fêmeas, procedentes do biotério central da Universidade

Federal de São Paulo, pesando entre 200-250 g foram alojadas no Biotério da

Universidade Presbiteriana Mackenzie e mantidos em ciclo claro-escuro (12 h),

com temperatura controlada (22 OC) e com livre acesso à água e comida. No

nono dia da gestação o grupo experimental recebeu uma única dose de ácido

valpróico (800 mg/kg, p.o.), e o grupo controle, salina (1mL/250 g).

Grupos experimentais

Em P21, imediatamente após o desmame, os filhotes machos foram divididos

em dois grupos: Grupo controle (CTRL, 5 animais ) e ácido valpróico (VPA, 5

animais), aleatoriamente escolhidos de 3 ninhadas. Em PN30 todos os animais

receberam bromodeoxiuridina (BrdU) 50 mg/kg, 2 vezes ao dia, durante 5 dias.

MÉTODO

Animais

Ratos adultos Wistar fêmeas, procedentes do biotério central da Universidade

Federal de São Paulo, pesando entre 200-250 g foram alojadas no Biotério da

Universidade Presbiteriana Mackenzie e mantidos em ciclo claro-escuro (12 h),

com temperatura controlada (22 OC) e com livre acesso à água e comida.

Após controle do ciclo estral, as fêmeas foram acasaladas. No nono dia da

gestação o grupo experimental recebeu uma única dose de ácido valpróico

(800 mg/kg, p.o.), e o grupo controle, salina (1mL/250 g).

Grupos experimentais

Os filhotes machos foram divididos em dois grupos: Grupo controle (CTRL) e

ácido valpróico (VPA). Os grupos CTRL e VPA foram formados por 3 animais

aleatoriamente escolhidos de 3 ninhadas.

Imunohistoquímica

8

Em PN60, os animais foram perfundidos e os cérebros retirados para

posterior análise histológica. Para a perfusão, os animais foram anestesiados

com pentobarbital sódico 75 mg/kg (ip) e submetidos à perfusão transcardíaca

com tampão fosfato salina (PBS pH 7,4). A seguir, essa solução foi substituída

por Paraformaldeído 4%. Os cérebros foram removidos imediatamente e

deixados por 24 horas em solução fixadora de paraformaldeído 4% e, a seguir,

colocados em uma solução de sacarose 30%. Após 24 horas, os cérebros

foram cortados em vibrátomo em fatias de 50m. As fatias foram processadas

para marcação com BrdU, Parvalbumina e NeuN.

Para imunomarcação para BrDU, as fatias foram incubando-se com

formamida 50%, 280 mM NaCl e 30 mM de citrato de sódio a 65oC por 2 horas

e a seguir com HCl 2M em PBS a 37oC por 30 min e posteriormente lavadas

com ácido bórico 0.1M, pH 8,5 à temperatura ambiente por 10 min, para

neutralizar a reação anteriormente citada. Posteriormente, as fatias foram

incubadas com peróxido de hidrogênio 3% em PBS por 15 min, em seguida

pela solução bloqueadora (soro de cabra 2%, triton X-100 0,3% e BSA 0,1%

em PBS) por 2 horas a temperatura ambiente. A seguir as fatias foram

incubadas com 2 ug/mL anticorpo monoclonal camundongo a 4 0C �overnight�.

As fatias foram lavadas com PBS, incubadas com anticorpo secundário

biotinilado (1:200, Vector) por 2 horas a 25 0C, lavadas e incubadas com Kit

ABC por 1 hora, lavadas e reveladas com diaminobenzidina (DAB) (0.05%) em

Tri-HCl 0,05 M pH 7,6 e peróxido de hidrogênio (0.03%). Por fim, as fatias

foram montadas, desidratadas, diafanizadas e cobertas com lamínulas,

usando-se entelan, analisadas e fotografadas em microscópio óptico.

Para imunomarcação da parvalbumina e NeuN, as fatias foram

incubadas em solução contendo os anticorpos primários na concentração

adequada - Parvalbumina 1:5000 e NeuN 1:1000 por 24 horas e 48 horas à

40C, respectivamente. Após remoção do anticorpo primário, as fatias foram

lavadas 3 vezes com PB e incubadas com o anticorpo secundário por 2 horas à

temperatura ambiente. Após remoção do anticropo secundário e lavagem com

PB, as fatias foram incubadas com o Kit ABC por 90 minutos, lavadas e

reveladas com diaminobenzidina em Tri-HCl 0,05 M pH 7,6 e peróxido de

hidrogênio. Por fim, as fatias foram montadas, desidratadas, diafanizadas e

9cobertas com lamínulas, usando-se entellam. As lâminas foram analisadas em

microscópio óptico e fotografadas. Foram utilizadas 12 fatias por animal e 5

animais para cada grupo.

Resultados e Discussão

Imunorreatividade para PV foi observada no soma e na arborização

axonal e dentrítica dos interneurônios (Fig1). A maioria dos neurônios

imunomarcados com parvalbumina (PV+) foram encontrados no stratum

piramidale e oriens das regiões CA1, CA2 e CA3 e adjacente do stratum

granulosum do giro dentado. A inspeção visual sugeriu aumento dos PV+ nas

regiões CA1 e CA3 da formação hipocampal dos animais do grupo VPA

comparativamente ao grupo controle (Fig 1). Nossos dados são corroborados

por (Lawrence, Kemper et al., 2010) que relataram aumento da imunomarcação

para parvalbumina nas regiões CA1 e CA3 da formação hipocampal de

indivíduos com autismo quando comparados com controles. Nossos dados

reforçam a observação de (Bauman e Kemper, 1985) que relataram uma maior

densidade neuronal no hipocampo de indivíduos com autismo, e realçam o

papel do sistema GABAérgico no autismo e em particular no hipocampo.

_ Fig 1. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para PV.

Observa-se aumento no número de neurônios PV+ nas regiões CA1 e CA3 da

formação hipocampal do grupo VPA

Em roedores, a densidade de neurônios imunorreativos para as

proteínas ligantes de cálcio é maior nos estágios precoces do desenvolvimento,

reduzindo na vida adulta (Jiang e Swann, 1997)

que o ácido valpróico, por mecanismos epigenéticos, estimulou uma maior

proliferação neuronal e ou interferiu com os mecanismos de poda.

contexto, (Snow, Hartle et al.

de ratos adultos expostos ao VPA

dendritos apicais das células piramidais do córtex motor em comparação aos

controles. Os dados sugeriram que o processo de poda está comprometido

neste modelo sendo consistente com as teorias de desenvolvimento anormal

Fig 1. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para PV.

no número de neurônios PV+ nas regiões CA1 e CA3 da

formação hipocampal do grupo VPA



(Jiang e Swann, 1997). Nossos dados permitem supor


proliferação neuronal e ou interferiu com os mecanismos de poda.

et al., 2008) avaliando a arborização dendrítica cortical

de ratos adultos expostos ao VPA in utero observaram maior complexidade nos




10

Fig 1. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para PV.

no número de neurônios PV+ nas regiões CA1 e CA3 da



. Nossos dados permitem supor


proliferação neuronal e ou interferiu com os mecanismos de poda. Neste

avaliando a arborização dendrítica cortical

ervaram maior complexidade nos




11no autismo. Adicionalmente, (Fukuchi, Nii et al., 2009) demonstraram em

cultura de neurônios corticais que o VPA de forma dose-dependente inibe a

histona deacetilase associada com a regulação epigenética da expressão

gênica. Os autores demonstraram que o VPA aumentou a expressão do RNAm

do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em neurônios cultivados.

Tem sido mostrado que os níveis de BDNF afetam a transmissão GABAérgica.

A imunorreatividade para parvalbumina é aumentada pelo BDNF em muitas

estruturas cerebrais e células em cultivo (Berghuis, Agerman et al., 2006;

Arango-Gonzalez, Cellerino et al., 2009). Por outro lado, camundongos BDNF�

/� apresentam redução da imunomarcação para parvalbumina e calbindina nos

neurônios do neocórtex e do hipocampo (Jones, Farfiias et al., 1994).

Curiosamente, alguns estudos relatam hiperatividade do BDNF em indivíduos

com autismo (Tsai, 2005). No entanto, não há uma evidência direta que o

mesmo de aplica in vivo no modelo animal de autismo pela exposição ao ácido

valpróico in utero.

O papel fisiológico das proteínas ligantes de cálcio não é claro, porém

estudos conduzidos em camundongos deficientes em parvalbumina mostram

que baixo nível de parvalbumina nos axônios terminais resulta em aumento da

liberação de GABA, sugerindo que esta modula a liberação de GABA

dependente de cálcio (Vreugdenhil, Jefferys et al., 2003). As proteínas de

ligantes de cálcio tamponam o cálcio livre intracelular. A redução do sistema de

tamponamento de cálcio dentro das células pode refletir um prejuízo funcional

dos interneurônios GABAérgicos tornando-os mais vulneráveis aos estímulos

excitatórios provenientes das fibras musgosas e assim, o aumento da liberação

de GABA seria um mecanismo compensatório. Por outro lado, o aumento da

expressão destas proteínas, pode aumentar o sistema de tamponamento ao

cálcio e consequentemente a viabilidade dos interneurônios GABAérgicos e

assim facilitando o controle inibitório sobre os estímulos excitatórios

provenientes do giro dentado em direção as células piramidais da região CA3.

A facilitação da transmissão GABAérgica pode contribuir para o desequilíbrio

entre a transmissão excitatória e inibitória a qual vem sendo especulado como

um mecanismo neurobiológico importante do autismo e adicionalmente

contribuir para disfunção no processo de aprendizagem. Neste sentido,

(Dumas, Powers et al., 2004) demonstraram que a superexpressão de

proteínas ligantes de cálcio na formação hipocampal contribui para

deficiência na memória espacial de roedores. Corroborando com estas

informações, Cavalcanti (2007) demonstrou que ratos expostos ao VPA

apresentaram déficit na memória viso

Mackenzie et al., 2009) demonstraram que camundongos expostos ao VPA

utero apresentaram redução expressiva do RNAm da neuroligina 3 (NLGN3)

na região CA1 e giro dentado da formação hipocampal e no córtex

somatossensorial. Esta proteína faz parte de uma importante classe de

moléculas de adesão que interage com outras moléculas de adesão sináp

chamadas neurexinas no terminal sináptico. Estas desempenham um papel

fundamental para a formação, maturação e estabilidade das sinapses

excitatórias glutamatérgicas

nesta proteína reduz e a conectividade e a eficiência das sinapses excitatórias

resultando em um desequilíbrio na integração dos impulsos sinápticos.

Recentemente, estudos genéticos em indivíduos com au

mutação nos genes das neuroliginas, levando a hipótese que prejuízos na

função sináptica causada por essas mutações estão relacionados à

fisiopatologia do autismo (Jamain, Quach

Para verificar se o aumento de número de neurônios era restrito aos

interneurônios GABAérgicos, realizo

da maioria dos neurônios pós

aumento da densidade neuronal na região cortical e em toda a formação

hipocampal do grupo VPA em comparação com o grupo controle (Fig 2). Esse

dados corroboram com os resultados de Bauman e Kemper (1985) que

relataram uma maior densidade neuronal no hipocampo de indivíduos com

autismo.

proteínas ligantes de cálcio na formação hipocampal contribui para


ações, Cavalcanti (2007) demonstrou que ratos expostos ao VPA

apresentaram déficit na memória viso-espacial. Nesta linha,

demonstraram que camundongos expostos ao VPA

redução expressiva do RNAm da neuroligina 3 (NLGN3)



moléculas de adesão que interage com outras moléculas de adesão sináp



excitatórias glutamatérgicas (Cline, 2005). Consequentemente, deficiência



Recentemente, estudos genéticos em indivíduos com autismo identificaram



(Jamain, Quach et al., 2003).


interneurônios GABAérgicos, realizou-se imunohistoquímica para um marcador

da maioria dos neurônios pós-mitóticos (NeuN) . A inspeção visual revelou


hipocampal do grupo VPA em comparação com o grupo controle (Fig 2). Esse



12proteínas ligantes de cálcio na formação hipocampal contribui para


ações, Cavalcanti (2007) demonstrou que ratos expostos ao VPA in utero

(Kolozsi,

demonstraram que camundongos expostos ao VPA in

redução expressiva do RNAm da neuroligina 3 (NLGN3)



moléculas de adesão que interage com outras moléculas de adesão sinápticas



. Consequentemente, deficiência



tismo identificaram




se imunohistoquímica para um marcador

mitóticos (NeuN) . A inspeção visual revelou


hipocampal do grupo VPA em comparação com o grupo controle (Fig 2). Esses



Fig 2. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para

NeuN. Observa-se aumento no número d

CA3 da formação hipocampal do grupo VPA

No entanto, aumento da densidade neuronal não se restringiu às estruturas do

sistema límbico, como o hipocampo, aumento da densidade neuronal foi

também verificado em diversas regiõ

límbico(PrL), infra límbico (IL), cingulado (Cg1), órbito

agranular ventral (AIV), insular agranular dorsal (AID), insular granular (GI),

somatossensorial primário (SiJ) e motor primário (M1) (Fig 3)

comparativamente ao grupo controle.

Fig 3. Fotomicrografia do córtex pré

Observa-se aumento no número de neurônios em todas as regiões corticais

(PrL=pré-límbico, Cgl= cingulado, LO=orbitol frontal, AIV= insular agr

ventral, AID= insular agranular dorsal, GI= insular agranular, SiJ= somatossensorial primário e M1= motor primário.

O aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de um excesso de

neurogênese e ou defeito no processo de apoptose.

al., 2008) postularam que alteração na neurogênese pode um mecanismo

neurobiológico relevante no autismo e

redução no mecanismo de poda igualmente relevante.

aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de um aumento da

neurogênese, avaliamos a neurogênese na formação hipocampal.

neurogênese, um dos mecanismos de plasticidade cerebral que ocorre durante

toda a vida, é claramente demonstrada no cérebro adulto na zona

Fig 2. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para

se aumento no número de neurônios PV+ nas regiões CA1 e

CA3 da formação hipocampal do grupo VPA



também verificado em diversas regiões pré-fontais, como córtex pré

límbico(PrL), infra límbico (IL), cingulado (Cg1), órbito-frontal (LO), insular



omparativamente ao grupo controle.

Fig 3. Fotomicrografia do córtex pré-frontal com imunomarcação para NeuN.

se aumento no número de neurônios em todas as regiões corticais

límbico, Cgl= cingulado, LO=orbitol frontal, AIV= insular agr

ventral, AID= insular agranular dorsal, GI= insular agranular, SiJ= somatossensorial primário e M1= motor primário.


neurogênese e ou defeito no processo de apoptose. (Mercadante, Cysneiros

m que alteração na neurogênese pode um mecanismo

neurobiológico relevante no autismo e (Snow, Hartle et al., 2008)

redução no mecanismo de poda igualmente relevante. Considerando que


neurogênese, avaliamos a neurogênese na formação hipocampal.

um dos mecanismos de plasticidade cerebral que ocorre durante


13Fig 2. Fotomicrografia da formação hipocampal com imunomarcação para

e neurônios PV+ nas regiões CA1 e



fontais, como córtex pré-

frontal (LO), insular



frontal com imunomarcação para NeuN.

se aumento no número de neurônios em todas as regiões corticais

límbico, Cgl= cingulado, LO=orbitol frontal, AIV= insular agranular ventral, AID= insular agranular dorsal, GI= insular agranular, SiJ=


(Mercadante, Cysneiros et

m que alteração na neurogênese pode um mecanismo

, 2008) sugerem

Considerando que


neurogênese, avaliamos a neurogênese na formação hipocampal. A

um dos mecanismos de plasticidade cerebral que ocorre durante


14subventricular dos ventrículos laterais (ZSV) e na zona subgranular (ZSG) do

giro dentado. Para a análise da formação de novos neurônios, a incorporação

da bromodeoxiuridina (BrdU) nas células em divisão, mais precisamente na

fase S do ciclo celular tem sido amplamente utilizada. (Fig4).

Figura 4. Fotomicrografia do giro dentado de ratos. Imunohistoquímica para

BrdU. As setas indicam novos neurônios reativos para BrdU. Observe aumento

da imunorreatividade nos animais expostos ao VPA in utero

No grupo controle a imunorreatividade para BrdU foi praticamente

restrita à zona subgranular (ZSG, setas pretas) do giro dentado. Algumas

poucas células BrdU+ foram localizadas camada granular (GL, seta vermelha)

no grupo controle. No grupo VPA observa-se aumento no número de células

BrdU+ na ZSG comparativamente aos controles e extensa marcação nas

camadas granular (GL, seta vermelha) e molecular (ML, seta verde).

O aumento da densidade neuronal pode ser conseqüência de um aumento de

proliferação e ou redução no processo de apoptose. Laeng, Pittis et al. (2004)

estudando a neurogênese em culturas de células embrionárias corticais de

ratos demonstraram que o VPA aumentou a proliferação de células

progenitoras neurais derivadas de células tronco e que a maioria dos novos

neurônios eram do tipo Gabaérgicos. Está bem estabelecido, que no início da

neurogênese, ocorre morte celular maciça e que mais de 50% das células são

eliminadas por apoptose juntamente com a diferenciação neuronal. A apoptose

15ocorre não somente nos neurônios, mas também nas células progenitoras

neurais e nos neuroblastos. Sendo assim, redução no processo de apoptose

também poderia aumentar a imunorreatividade para o BrdU observada no

nosso estudo. Go, Seo et al. (2011) estudaram o efeito do VPA sobre a

apoptose em células progenitoras neurais cultivadas de cérebros embrionários

de ratos. O VPA protegeu as células progenitoras neurais da morte celular por

meio da degradação do Ikappa B alfa e da ativação do NF-kappa B que levou

ao aumento da expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-XL. Ambos os

estudos sugerem que o VPA aumenta a neurogênese em consequência da

redução no processo de apoptose das células progenitoras neurais. Estudos

posteriores neste modelo precisam confirmar se os mesmos mecanismos

ocorrem in vivo. A presença de células BrdU+ na camada molecular do grupo

VPA é sugestivo de migração aberrante. Estes novos neurônios podem

contribuir para a formação de circuitos neurais desorganizados e não seletivos

acarretando em perda do sincronismo intra-hipocampal e entre o hipocampo e

córtex comprometendo a função fundamental frontal de interpretar e integrar

informações e fornecer um feedback complexo, rico em contexto que seja

capaz de orientar ações apropriadas (Courchesne e Pierce, 2005). Até o

presente, não há uma única teoria para explicar como as alterações

neuroanatômicas estão relacionadas aos prejuízos comportamentais, em parte

porque os estudos no cérebro post mortem de autistas são escassos e, além

disso, não se tem encontrado anormalidades grosseiras. O modelo animal de

autismo pela exposição ao VPA in utero tem-se mostrado uma ferramenta útil

para explorar áreas cerebrais potenciais na neurobiologia do autismo e

avaliação de possíveis intervenções. Nossos resultados demonstraram que a

exposição ao VPA in utero aumenta a neurogênese hipocampal o que justifica

o aumento da densidade neuronal observada na formação hipocampal e córtex

pré-frontal. Futuros estudos devem ser conduzidos para investigar se a

redução na apoptose está relacionada com o aumento no número de neurônios

e se a manipulação deste processo pode não somente modificar as alterações

do número de neurônios como reverter as alterações comportamentais autism-

like observadas neste modelo.

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