Universidade Nova de Lisboa

Faculdade de Cincias e Tecnologia

Mestrado em Tecnologia e Segurana Alimentar 1Ano -1Semestre

Indicadores Biolgicos na Qualidade Agro-Industrial Docente Ana Lcia Monteiro Duro Leito

Mdulo 2

ANLISE MICROBIOLGICA A UMA FARINHA PARA USO

DOMSTICO

Elaborado por:

Ana Jlia Benites

Marlene Fernandes

Rubina Iquebal

Turma Ps-Laboral

Monte da Caparica, 03 de Dezembro de 2014

1. INTRODUO

A farinha um alimento rico em glcidos e fibras e a tecnologia do seu

fabrico simples, porm exige alguns cuidados fundamentais durante o seu

desenvolvimento para garantir um produto de qualidade, tais como a seleo

de matria-prima adequada, higiene e cuidados durante todo o processo de

fabrico at a obteno do produto final. A qualidade pode ser delimitada

atravs do controlo de qualidade analtico com a execuo de testes fsico-

qumicos e microbiolgicos, este ltimo serve para avaliar o nvel de

contaminao microbiolgica do produto (Ferreira et al., 2004; Lima et al.,

2007).

As contaminaes microbiolgicas podem ocorrer em todas as etapas

pelas quais passam os produtos agrcolas, desde a colheita at o

processamento, embalagem, transporte e armazenamento, sendo inmeros os

fatores que podem interferir no crescimento microbiano, como o teor de

humidade, o contedo de oxignio, as caractersticas higinicas da matria-

prima, a temperatura, o tempo de armazenamento, entre outros (Marcia e

Lazzari, 1998; Souza et al., 2004).

Segundo a Portaria n 254/2003 de 19 de Maro de 2003 consideram-

se no conformes as farinhas que tenham sido atacadas por quaisquer fungos

ou bactrias ou apresentem outros microrganismos em nveis que apresentem

um risco para a sade e que cuja presena seja evidenciada pela alterao do

aspeto fsico, exame microscpico e pela anlise qumica ou microbiolgica. J

a Resoluo brasileira n 12, de 02 de Janeiro de 2001 afirma que amidos,

farinhas, fculas e fub, em p ou flocados devem estar ausentes de

Salmonella em 25g de produto e apresentar no mximo 3x103 UFC de B.

cereus/g e 1x102 UFC de coliformes fecais/g.

Devido sua baixa atividade da gua a farinha considerada um

produto microbiologicamente estvel, embora isto no signifique que

necessariamente haja inativao e/ou destruio dos microrganismos

possivelmente presentes neste substrato, como no caso de fungos, que

somente nestas condies podem ocorrer o crescimento de xerfilos ou

xerotolerantes como Eurotium, Aspergillus e Penicillium, que possuem elevada

capacidade de esporulao. No entanto, ambas as legislaes portuguesa e

brasileira no determinam um limite de contaminao por fungos, mas apesar

disso quase todas empresas fabricantes de farinha possuem esta exigncia,

sendo mais rigososos que a legislao em vigor, como no caso da empresa X e

Y (que so denominadas desta forma devido a confidencialidade) que

determinam contagem mxima de bolores e leveduras

A E. coli um microrganismo do grupo dos coliformes fecais,

patognico, Gram-positivo, anaerbio facultativo, possui a capacidade de

fermentar acares e no produz esporos, no entanto, responsvel pela

produo de toxinas. Apesar de estar presente nas fezes e guas residuais

domsticas, constitui um dos indicadores de poluio no ambiente, podendo

ser encontrada no ar de forma acidental, nos locais pblicos e nos alimentos

(Alves, 2012; Mendes e Oliveira, 2004).

A ingesto deste microrganismo atravs de gua ou de alimentos

contaminados pode causar doenas gastrointestinais que variam a intensidade

dependendo da estirpe do microrganismo, podendo apresentar sintomas desde

diarreias at ao desenvolvimento de doenas que causam insuficincia renal

aguda e trombose (Alves, 2012).

Para a deteo de microrganismos nos alimentos, como no caso de

fungos e Escherichia coli, pode-se utilizar o mtodo de contagem padro em

placas, que permite conhecer o nmero exato de microrganismos presentes no

produto que se est a analisar. A sementeira deste mtodo pode ser por

incorporao, quando adicionado placa primeiramente o inculo com

posterior adio do meio de cultura ou por espalhamento, no qual a placa

contm o meio solidificado onde lhe adicionado um certo volume da diluio

que espalhado com uma ansa. No mtodo por incorporao as colnias

crescem entre o gar e no mtodo de espalhamento o crescimento d-se

superfcie do gar (Lightfoot e Maier, 2003).

O objetivo deste trabalho foi pesquisar a presena de fungos e

Escherichia coli numa farinha para uso domstico e comparar com os limites

aceitveis descritos na legislao e literatura para verificar se esta se encontra

em condies para consumo.

2. MATERIAIS E MTODOS

2.1 Amostra

A amostra analisada foi farinha de trigo para uso domstico.

2.2 Material

Cmara de fluxo laminar horizontal modelo Steril-Helios;

Estufa (Memmert);

Agitador Vortex;

Placas de Petri;

Tubos de ensaio;

Pipetas (2,0 mL e 20,0 mL).

Bico de Bunsen.

Espalhador

2.3 Reagentes

Diluente (Triptona 1,0 g/L; NaCl 8,5 g/L);

Meio de cultura para crescimento de fungos (Peptona de soja 5,0 g/L;

Glucose 10,0 g/L; KH2PO4 1,0 g/L; MgSO4. 7H2O 0,5 g/L; Rose Bengal

0,05 g/L; Cloranfenicol 0,1 g/L; Agar 13,0 g/L);

Meio de cultura para crescimento de E. coli (Triptona 20,0 g/L; Sais de

Bilis n31,5 g/L; acido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil--D-glucornico (BCIG)

75,0 mg/L; Agar 9,0g/L).

2.4 Mtodo de pesquisa de crescimento de fungos

Em primeiro lugar, realizou-se a preparao da suspenso me

pesando-se assepticamente 0,104 g de amostra e adicionando-a num frasco

com posterior adio de 9 mL do diluente, seguido de agitao. Realizou-se

este procedimento com a finalidade de se obter uma diluio 1/10.

A partir da suspenso me retirou-se 1 mL para o tubo de ensaio

contendo 9 mL do diluente com o objetivo de obter uma diluio 1/100 e desse

tubo foi retirado tambm 1 mL para outro tubo de ensaio contendo 9 mL de

diluente para obter uma diluio 1/1000, sendo ambos os tubos seguidamente

agitados no vortex para homogeneizar.

Para a pesquisa de fungos realizou-se um controlo negativo que neste

caso foi o prprio diluente.

Posteriormente, realizou-se sementeira por espalhamento ou

superfcie das diluies 10-2 e 10-3 e do controlo negativo distribuindo 1 mL

pelas placas de petri identificadas contendo o meio de cultura (Peptona de soja

5,0 g/L; Glucose 10,0 g/L; KH2PO4 1,0 g/L; MgSO4.7H2O 0,5 g/L; Rose Bengal

0,05 g/L; Cloranfenicol 0,1 g/L; Agar 13,0 g/L) sendo espalhada logo em

seguida o inculo com um espalhador em forma de L.

As placas foram ento incubadas a 251C durante 1202 horas. Aps o

tempo de incubao as placas foram retiradas da estufa e acondicionadas sob

refrigerao at o momento da contagem das colnias.

2.5 Mtodo de pesquisa e contagem de Escherichia coli

A soluo me para pesquisa de E. coli foi a mesma utilizada para a

pesquisa de fungos (Item 2.4).

Para a pesquisa de E.coli utilizou-se diluies 10-1 e 10-2, sendo a

soluo me considerada a diluio 10-1. Para a preparao da diluio 10-2

retirou-se 1 mL da soluo me e adicionou-se no tubo de ensaio contendo 9

mL de diluente com posterior agitao no vortex.

Diferente da pesquisa de fungos, neste caso utilizou-se um controlo

positivo que consistia numa suspenso de E. coli -glucuronidase positiva.

A sementeira foi realizada por incorporao. Com uma pipeta

esterilizada retirou-se 1 mL de cada uma das diluies e do controlo positivo,

ambos recm-agitados para homogeneizao adequada, adicionando-os em

placas de Petri identificadas. Aps isto foi adicionado 15mL de meio de cultura

(Triptona 20,0 g/L; Sais de Bilis n31,5 g/L; acido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil--D-

glucornico (BCIG) 75,0 mg/L; Agar 9,0g/L) arrefecido a cerca de 47C em

cada placa, sendo ento levemente agitado para haver mistura entre o inculo

e o meio de cultura.

Aps a solidificao do meio as placas foram invertidas e incubadas em

estufa a uma temperatura de 441C durante 18 a 24 horas. Transcorrido o

tempo de incubao as placas foram retiradas da estufa e acondicionadas sob

refrigerao at o momento de verificao e contagem das colnias.

3. RESULTADOS

3.1 Fungos

Aps o perodo de incubao a 251C por 120 horas verificou-se que

no houve crescimento de colnias nas diluies 10-2, 10-3 e no controlo

negativo, como pode se pode ver na Figura 1.

Neste caso o controlo negativo foi o prprio diluente, o que significa que

a experincia foi vlida. Como no houve crescimento de colnias no foi

necessrio realizar os clculos necessrios para determinar o teor total de

fungos por grama de produto, visto que este resultado zero.

Figura 1: Da esquerda para direita placa de Petri contendo diluio 10-3, 10-2 e

controlo negativo.

3.2 Escherichia coli

Aps as 24 horas de incubao a 441C verificou-se que no houve

crescimento de colnias azuis caractersticas de Escherichia coli--

glucuronidase nas placas com diluies 10-1 e 10-2, ao contrrio do controlo

positivo, que apresentou 33 UFC/mL como se pode ver na Figura 2.

Se a amostra estivesse contaminada com Escherichia coli deveria haver

nas placas de petris colnias brancas ou azuis. O aparecimento da colorao

azul deve-se presena da enzima -glucuronidase produzida por este

microrganismo, que reage com alguns constituintes do meio. No entanto,

segundo Ramos e Simes (2006) cerca de 6% a 3% das estirpes de E. coli no

possuem esta enzima, ento neste caso as colnias deveriam apresentar uma

colorao branca.

Figura 2: Da esquerda para direita placa de petri contendo diluio 10-2, 10-1 e

controlo positivo.

4. DISCUSSO/CONCLUSO

Os controlos so utilizados para indicar se uma anlise vlida, neste

caso atravs dos resultados dos controlos obtidos pode afirmar-se que a

anlise efetuada farinha foi vlida, isto porque como esperado no controlo

negativo no houve crescimento de colnias ao contrrio do positivo. Sendo

assim, a partir dos resultados obtidos conclui-se que a amostra de farinha est

apta para consumo, visto no se ter verificado o crescimento dos

microrganismos analisados.

De acordo com a Resoluo brasileira n12 de 2001 caso a farinha

obtivesse valores maiores que 1x102 para Escherichia coli a mesma estaria

inapta para consumo e, em relao aos fungos, no h limites determinados

pela legislao, porm algumas empresas fabricantes de farinha utilizam como

parmetro permitindo que haja contagem mximo de bolores e leveduras

Neste presente trabalho o resultado adquirido do controlo positivo de E.

coli -glucuronidase foi 33 UFC/mL, nmero inferior em relao aos outros

grupos que, em alguns casos, chegaram a verificar o crescimento de 51

UFC/mL. Este valor inferior pode ter sido causado por uma agitao

insuficiente do tubo de ensaio contendo o controlo positivo antes de adicionar o

volume necessrio placa de Petri, causando assim uma m homogeneizao

da soluo e/ou tambm devido a possibilidade do meio de cultura estar mais

quente do que deveria quando adicionado placa, destruindo assim alguns

microrganismos presentes no controlo.

5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Alves, A. R. F. (2012) Doenas alimentares de origem bacteriana. Dissertao

(Mestrado em Cincias Farmacuticas). Faculdade de Cincias da Sade,

Universidade Fernando Pessoa, Porto. p. 87.

Blood, R. M.; Curtis, G. D.W. (1995) Media for total Enterobacteriaceae,

coliforms and Escherichia coli. Int J Food Microbiol., v.26, p.93-115.

Duarte, M. P. (2014) Acetatos das aulas tericas de Indicadores Biolgicos da

Qualidade Alimentar. Mestrado em tecnologia e Segurana Alimentar

Universidade Nova de Lisboa, Monte da Caparica.

Ferreira Neto, C.; Nascimento, E. M.; Figueiredo, R. M.; Queiroz, A. J. M.

(2004) Microbiology of cassava flour (Manihot esculenta Crantz) during the

storage. Cin. Rural, v.34, p.551-555.

Ferreira, W. F. C.; Sousa, J. C. F. (2000) Microbiologia. Lidel Edies

tcnicas, Lda (Ed.), Vol. 02, Lisboa, p. 291-294.

Lightfoot, N. F.; Maier, E. A. (2003) Anlise microbiolgica de alimentos e gua,

Fundao Calouste Gulbenkian, p. 128-129.

Lima, C.; Serrano, N.; Sousa, C. (2007) Presena de microrganismos

indicadores de qualidade em farinha e goma de mandioca. Revista APS, v.10,

n.1, p. 14-19.

Lopes, E. A. (2002) Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle

(APPCC/HACCP) na produo de farinha de trigo: estudo microbiolgico da

etapa de molhagem do trigo. Dissertao para obteno do grau de mestre.

USP Universidade de So Paulo, So Paulo.

Marcia, B. A.; Lazzari, F. A. (1998) Monitorament of fungi in corn, frits and corn

meal. Cin. Tecnol. Alimen., v.18, p.363-367.

Mendes, B.; Oliveira, J. F. S. (2004) Qualidade da gua para Consumo

Humano. Lidel-Edies tcnicas, Lda (Ed.), Lisboa, Porto, Coimbra; p. 579.

Oliveira, A. (2010) Sebenta de apoio s aulas tericas e prticas de Anlise de

guas e Alimentos, 3 ano do curso de Anlises Clnicas e de Sade Pblica -

Escola Superior de Sade Egas Moniz, Monte da Caparica.

Portaria n 254/2003 de 19 de Maro de 2003, dos Ministrios da Economia, da

Agricultura, Desenvolvimento Rural e Pescas, da Sade e das Cidades,

Ordenamento do Territrio e Ambiente. Dirio da Repblica I SRIE-B. N

66 p.1861-1865.

Ramos, C. G.; Simes, S. (2006) Mtodos para a identificao de Escherichia

coli na Indstria Alimentar. Rev. Portuguesa de Ciencias Veterinrias 101 (557-

558) p. 131-132.

Resoluo RDC n 12, de 2 de Janeiro de 2001. Regulamento tcnico sobre os

padres microbiolgicos para alimentos. Disponvel em:

. Acesso em 26 de Novembro de

2014.

Siqueira, R.S. (1995) Manual de microbiologia dos alimentos. Brasilia:

Embrapa, SPI; Rio de Janeiro: Embrapa, CTAA, p. 159.

Souza, E.L.; Silva, C. A.; Sousa, C. P. (2004) Qualidade Sanitria de

Equipamentos, Superfcies, gua e Mos de Manipuladores de Alguns

Estabelecimentos que Comercializam Alimentos na Cidade de Joo Pessoa,

PB. Rev. Hig. Aliment, v. 18, p. 98-102.

Ukhun, M. E.; Dibie, E. N. (1989) Cyanide content of cassava mash and grain

flour and influence of water activity (aw) during storage. Bull. Environm. Cont.

Toxicol., v. 42, p. 548-552.