relatório - microbiologia alimentar

UNIVERSIDADE DO MINHO

Microbiologia Alimentar Análise Microbiológica

Guimarães, Maura, 53823

21-01-2010

1.Introdução A microbiologia alimentar tem vindo a tornar-se numa das áreas científicas de maior relevo nas sociedades actuais. Com a descoberta da existência de seres microscópicos e o consequente aparecimento da microbiologia por volta do século XIX, veio também a noção dos alimentos como excelentes meios de cultura. Para além da patogenicidade associada a muitos destes microrganismos, existem outros, que hoje em dia são muito utilizados em diferentes áreas da Biotecnologia: na produção de vacinas, antibióticos, ácidos orgânicos (acético, láctico e cítrico), enzimas, aminoácidos (como a lisina ou o ácido glutâmico) ou de alimentos por fermentação láctica (picles, azeitona, queijo, iogurte). [1] O desenvolvimento microbiano em qualquer meio de cultura, especialmente alimentar, é condicionado por diversos factores. Estes podem ser intrínsecos: -a actividade de água (aw) é uma medição da disponibilidade hídrica, a razão entre a humidade relativa do ar e uma amostra de controlo preparada com água destilada. Por exemplo, a adição de sal a uma solução, tornando-a hipertónica, leva à desidratação de alguns microrganismos e inibe o seu crescimento;

MICRORGANISMO Valor mínimo de

aw

Maioria de bactérias 0,91

Maioria de leveduras 0,88

Figura 1: valor mínimo de aw para diferentes microrganismos [2]

Resumo:

Microbiologia Alimentar é uma das áreas científicas que mais se reflectem no dia-a-dia de um consumidor. Intimamente ligada ao estudo da microbiologia geral, centra-se nos alimentos como meios de cultura de diversos microrganismos. Por vezes este actuam como agentes patogénicos, outras, são cruciais na produção alimentar. Tudo isto levou ao desenvolver de técnicas laboratoriais que permitam assegurar uma alimentação segura ao consumidor comum, sendo estas, o centro do nosso estudo, com conclusões interessantes. Para o efeito, analisaremos amostras de água, de derivados de carne, vinhos e mostos e produtos lácteos.

Palavras-chave: Microbiologia Alimentar, Microrganismos, Patogenicidade.

Laboratórios Integrados de Biologia

o pH, uma vez que os níveis ácidos de pH são favoráveis ao crescimento de leveduras e bolores, enquanto, em valores mais básicos, ou neutros a decomposição é dominada pelas bactérias. A presença destes agentes leva à proteólise e a quebra anaeróbica das proteínas – geralmente denominada putrefacção – levando à libertação de compostos aminados; -o potencial de oxi-redução influencia a decomposição, uma vez que os produtos cozinhados têm um baixo potencial de oxi-redução; -a composição nutricional de um alimento é uma condicionante do crescimento microbiano, uma vez que cada microrganismo tem uma dieta muito característica, o que leva a que um alimento rico em proteínas possa ter uma flora microbiana diferente de um alimento que seja rico em lípidos por exemplo. [3] E extrínsecos como: -a temperatura porque cada grupo de microrganismos tem a sua temperatura óptima de crescimento, isto é a temperatura a que o seu crescimento é máximo; é nesta base que a temperatura se torna numa condicionante no crescimento microbiano. Por exemplo, em temperaturas compreendidas entre os 55 e os

75οC o crescimento de microrganismos termófilos é favorecido, no que se refere ao intervalo dos 30 aos

45οC, os organismos mesófilos encontram a sua temperatura óptima de crescimento, a temperaturas entre

os 25 e 30οC podemos encontrar microrganismos psicotrófilos e entre os 12 e os 15οC será provável encontrar os psicrófilos [4]; e -a humidade relativa do ambiente, uma vez que os altos níveis de humidade favorecem o crescimento microbiano de determinados microrganismos enquanto os baixos níveis favorecem outros. Outro factor condicionante do crescimento microbiano é a capacidade “anti-microbiana” de alguns alimentos. Esta capacidade é determinada pela presença de alguma substâncias, como enzimas e complexos químicos inibidores, tais como as curaminas, a lisozima – que lisa as paredes celulares das

bactérias gram-positivas −, os compostos aldeídicos e fenólicos, a alicina, o eugenol, os polifenóis. [3] Teremos 8 amostras, de quatro tipos de alimento, em análise: água, com uma amostra conhecida e considerada potável e outra desconhecida, vinho, embalado em caixa de cartão “tetrapack” e engarrafado, duas amostra de carne picada, que serão tratadas em circunstâncias diferentes e, por fim, produtos lácteos, representados por um iogurte probiótico e por queijo fresco. Cada amostra que será alvo das nossas experiências têm um “grupo-alvo” de microrganismos, isto é um grupo de microrganismo que mais facilmente se encontra na sua análise pela afinidade conseguida através da combinação dos factores anteriormente descritos. 1.1 Microrganismos possíveis de encontrar nos meios de cultura em estudo:

Alguns dos microrganismos passíveis de serem encontrados nas nossas amostras constam da seguinte lista:

MICRORGA'ISMO DESCRIÇÃO

AMOSTRA O'DE É

E'CO'TRADO

Campylobacter jejuni

Em forma de pequeno bastonete é uma bactéria Gram-negativa, que tem uma

temperatura óptima de crescimento de cerca de 42ºC.

Derivados de carne

Listeria

monocytogenes

Em forma de bacilo, é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbia facultativa, mesófila, com um pH óptimo de crescimento entre o valor 6 e 8, resiste a valores elevados de salinidade,

sobrevivendo à desidratação. É destruída com pasteurização.

Produtos de origem láctea

MICRORGA'ISMO DESCRIÇÃO AMOSTRA

O'DE É E'CO'TRADO

Vibrio

São bactérias Gram-negativas, em forma de bastonete, anaeróbicas facultativas, tem um

intervalo de temperatura de crescimento muito grande (entre os 8 e os 44ºC, sendo o

ideal 37ºC), tendo preferência por meios alcalinos, com pH de cerca de 9.0. nem todas

as suas estirpes são patogénicas.

Água

Yersinia enterolytica

É uma bactéria de pequenas dimensões em forma de bastonete, Gram-negativas. Muitas das estirpes produzem uma enterotoxima, a

baixas temperaturas (cerca de 5ºC)

Derivados de carne

Shigella

É conhecida como o "bacilo da disenteria", idêntica à Salmonella, produz gás através dos

hidratos de carbono. Água

Staphylococcus

aureus

São cocos, Gram-positivos, geralmente dispostos em cachos, e anaeróbios

facultativos, mesófilos, sensíveis a altas temperaturas. Produz uma enterotoxina

resistente a temperaturas de cerca de 100ºC por um período de 30 minutos. O pH óptimo

ao seu crescimento é de cerca de 6.

Produtos de origem láctea

Salmonella

Em forma de bacilo, é uma bactéria Gram-negativa, anaeróbia facultativa, fermentadora

da glicose com produção de gás, com temperatura óptima de crescimento de 37ºC,

sensível à pasteurização. A doença mais grave provocada por este microrganismo é a febre

tifóide.

Produtos de origem láctea; derivados de

carne; água

Figura 3: Alguns microrganismos passíveis de serem encontrados nas amostras em estudo [3, 8]

Figura 4: Da esquerda para a direita: 1. Escherichia coli, 2. Staphylococcus aureus, 3. Salmonella [5]

Com isto, veio a necessidade de desenvolver técnicas de eliminação desses seres enquanto

agentes patogénicos do processo de produção alimentar industrial, e a beneficiação do crescimento dos seres cruciais a esse mesmo processo. Estas técnicas são estudadas e realizadas a nível laboratorial, tendo em vista a conjugação de técnicas laboratoriais gerais com técnicas laboratoriais de microbiologia. As conclusões retiradas

dividem-se em dois tipos de análise: qualitativa, referente a nomeação de microrganismos específicos encontrados, e quantitativa, contagem de número de colónias e cálculo da densidade celular inicial. [6] 1.2 Esterilização:

Para que todos estes métodos tenham resultados reais e satisfatórios é necessário reunir

condições de ambiente estéril, de modo a que as nossas amostras não sejam contaminadas com microrganismos possivelmente encontrados no material laboratorial ou até mesmo no ar: as condições de assepsia. Estas condições podem ser asseguradas através de vários métodos, comuns a todas as práticas laboratoriais de Microbiologia. Embora todos tenham o mesmo fim, em determinadas circunstâncias, uns tornam-se mais viáveis ou aconselháveis. Assim, neste trabalho laboratorial, as condições de assepsia foram garantidas através da Esterilização. Esta pode ser assegurada por agentes químicos ou físicos. Usamos preferencialmente os físicos, como:

• o Autoclave − conduz à desnaturação de proteínas;

• a Flamejação − passagem do material a esterilizar por uma chama;

• a Filtração − utilização favorável quando estamos perante soluções com

compostos químicos termo-sensíveis, como as vitaminas; e,

• a Estufa de ar quente − atinge temperaturas de cerca de 180ºC, o que conduz

à oxidação e desnaturação de proteínas, destruindo células vegetativas e esporos.

Estes conduzem à rápida destruição dos microrganismos, muitas vezes por desnaturação das proteínas. [7] 1.3 Homogeneização das amostras:

As amostras de alimentos, quer sejam líquidos, pastosos ou sólidos, têm de sofrer um processo de homogeneização que permita o isolamento e contagem dos microrganismos existentes. Este processo de homogeneização implica a passagem de qualquer amostra para uma fase líquida, na qual estão contidos os microrganismos. Quando estamos perante uma amostra sólida é necessário proceder à sua trituração, na presença de um meio de diluição, sendo esta efectuada por um triturador eléctrico com pás giratórias. De modo a garantir integridade da amostra, a rotação destas pás é muito específica – entre as 8000 e as 45000 rotações por minuto. Isto previne o excesso de calor libertado pelo movimento das pás que pode interferir no bom mantimento da flora microbiana, e por outro lado, este movimento pode desintegrar estruturas filamentosas como hifas dos fungos ou o pseudomicélio das leveduras, levando ao erro, por excesso, na contagem de microrganismos presentes.

Este processo pode ser substituído por um mais suave que não assegura uma homogeneização tão eficaz. Este processo resume-se à colocação da amostra num saco esterilizado na presença do agente de diluição.

Também o agente de diluição escolhido é um ponto importante no estudo, por cada um pode representar como agente tóxico para determinados microrganismos. 1.4 Incorporação de meio sólido: É uma medida quantitativa directa do número de microrganismos capazes de se multiplicar num determinado volume. Para a realização desta técnica é necessário, duas horas antes do início, preparar e

autoclavar o meio R2A*1, deixando-o termostatizado a uma temperatura de 45οC até a sua utilização; de seguida, é necessária a agitação vigorosa para perfeita homogeneização. Posto isto, e em condições de assepsia, introduz-se 1 mL da amostra numa placa de Petri vazia, previamente identificada, na qual é

adicionado 10 mL de meio R2A a 45οC. Seguidamente, procede-se a uma agitação horizontal cuidadosa, em movimento rotacional, até à completa homogeneização do meio com a amostra, esperando a

solidificação do meio. Em término, incubar em posição invertida e à temperatura ambiente de 2 a 3 dias. [7] 1.5 Diluições decimais: Permitem a contagem com maior rigor de colónias perfeitamente isoladas, em meio YEPD*2, a partir de suspensões densas de microrganismos. Inicialmente preparam-se 6 tubos de ensaio com 9 mL de água peptonada*3 que serão esterilizados em autoclave durante cerca de 20 minutos a temperaturas na ordem dos 120ºC e a pressão de 1 atmosfera (≈101300Pa). Seguidamente, preparar a suspensão densa da amostra a analisar num tubo com água peptonada – suspensão-mãe*4, agitando no vórtex cerca de 5 segundos. Com uma pipeta esterilizada de 1 mL retirar, em condições de assepsia, 1 mL da suspensão, introduzindo-a no primeiro tubo de diluição (10-1) que contém 9 mL de água peptonada, homogeneizando a solução por vortexização, com uma nova pipeta estéril retirar 1 mL dessa diluição para outro tubo também com 9 mL de água peptonada, obtendo-se assim a diluição 10-2, assim sucessivamente até 10-6. [7]

Por fim, e com auxílio de um espalhador esterilizado em álcool e ao de leve passado na chama de uma lamparina, inocular o meio até sentir uma resistência que indica que já ocorreu a absorção pelo meio. – Inoculação por espalhamento em meio sólido. [6]

1.6. Filtração em membrana:

Previamente, é necessário proceder à esterilização da montagem de filtração, colocando-o de seguida num kitassato, ligado a uma bomba de vácuo. Seguidamente, colocar uma membrana estéril entre o funil e o suporte, agitar a amostra até completamente homogeneização. Introduzir o volume pretendido, filtrando-o de seguida. O processo conclui-se com a retirada da membrana com auxílio de uma pinça estéril, e colocando-a no meio de cultura desejado. Esta etapa é seguida de um período de incubação.

1.7 Contagem de Unidades Formadoras de Colónias (UFCs):

A contagem de UFCs é feita através do número de colónias contadas com o auxílio de um contador, ou das câmaras de contagem de Neubauer, e do índice de diluição. A título de exemplo,

consideremos que temos α número de colónias contadas, e que o nosso índice de diluição é 10-n. Num

volume de γ µL, temos α.10-n UFCs. Se quisermos fazer uma estimativa de número de UFCs por mL, podemos fazer uma razão simples:

α.10-n_________ γ µL UFCs/mL______________1000 µL

UFCs

mL=α . 10

� x 1000 µL

γ µL

Aos resultados obtidos estão associados erros de pipetagem, de diluição e até mesmo de

contagem. As placas consideradas de menor erro associado são aquelas que apresentam uma média de 30 a 300 UFCs.

*1 – Meio de cultura para a enumeração de bactérias heterotróficos em águas, rico em peptona (proteose) (0.5g), extracto de levedura (0.5g), casaminoácidos (0.5g), dextrose (0.5g), amido (0.5g), piruvato de sódio (0.3g), hidrogenofosfato de potássio (0.3g), sulfato de magnésio (0.05g) e agar (15g). [6] *2 – Meio de cultura para leveduras, rico em extracto de levedura (10g), peptona (2g), glicose (20g), agar (20g) – para meios de cultura sólidos -, água 1 L. [7]

*3 - Água contendo peptona, 0,1 %, p/v. Este reagente é mais apropriado para a diluição de suspensões celulares, uma vez que não exerce stress osmótico sobre as células, como se verifica para o caso da água. [6] *4- Suspensão inicial de alimentos. [6]

2. Materiais e Métodos O nosso estudo será faseado em quatro etapas, correspondentes aos quatro tipos amostras diferentes. 2.1 Análise microbiológica da água: 2.1.1 Recolha de amostras de água para análise microbiológica: Utilizando um frasco esterilizado de volume igual a 500 mL, realizar a recolha da amostra em condições de assepsia; no caso de a amostra provir da torneira, deixar previamente a água correr durante alguns minutos, depois fechar a torneira e desinfectá-la com algodão embebido em álcool, flamejando-a de seguida. Encher o frasco esterilizado. A amostra deve ser do mesmo dia da análise e em dias de calor deve ser transportada em sacos térmicos, para evitar os efeitos da diferença de temperatura na flora microbiana. [6]

2.1.2 Contagem de microrganismos totais pela técnica de incorporação em meio sólido: Seguir a descrição declarada anteriormente para a incorporação em meio sólido (1.4). Depois de

concluído o período de incubação, contar as colónias visíveis com acesso a um contador, calculando seguidamente as UFCs por cada 100 mL de amostra (1.6). [6]

2.1.3 Pesquisa e quantificação de Escherichia coli e outras bactérias coliformes pela técnica de

filtração em membrana: Iniciando o processo de filtração em membrana, é necessário proceder a todos os passos

descritos em 1.6. No caso da amostra da água de torneira, utilizaremos 100 mL, enquanto na amostra desconhecida colocamos apenas 10 mL, e perfazemos os 100 mL com água destilada.

Após a retirada da membrana, colocá-la no meio de cultura CCA*5 numa caixa de Petri, incubando-a em posição invertida por um período de 48 horas. [6]

2.2 Análise microbiológica de vinhos e de mostos:

O processo de produção de vinho é muito complexo e onde intervêm diferentes microrganismos, encontrados sequencialmente. O processo mais importante é a fermentação alcoólica, onde intervém activamente uma levedura: a Saccharomyces cerevisiae, cuja concentração nas amostras cresce gradualmente durante o processo acontecendo o seu exponencial nesta fase. Mas a flora microbiana do vinho tem de ser devidamente controlada, uma vez que embora existam microrganismos que ajudam e até mesmo indispensáveis a este processo, por outro lado, outros podem destruir o produto, azedando-o. [6]

2.2.1 Preparação e diluição de amostras: No que se refere às amostras de mosto ou de mosto em fermentação deve ser recolhida uma

amostra de cerca de 250 mL, já em relação ao vinho engarrafado deve se ter em conta uma garrafa, independentemente do volume. Se a amostra for relativa a mostos concentrados, leveduras secas activas ou outros produtos enológicos, a amostra deve ser de mais de 50g.

*5 - Meio de cultura utilizado para a identificação de bactérias coliformes. A ß-D-galactosidase é uma enzima específica destas

bactérias e hidrolisa um dos constituintes do meio. Este meio é constituído por peptona (3.0g), cloreto de sódio (5.0g), dihidrogenofosfato de sódio (2.2g), hidrogenofosfato de sódio (2.7g), piruvato de sódio (1.0g), triptofana (1.0g), tergitol (0.15g), sorbit (1.0g), mistura cromogénica (0.2g) e agar (12g). [6]

Para realizar a diluição faz amostras, deve ser preparada uma séria de diluições decimais (1.5) tendo em conta o tipo de amostra a analisar. Assim:

-para mostos não fermentados: efectuar 4 diluições decimais; -para mosto em fermentação: efectuar sete diluições decimais; -para vinhos não filtrados em período de envelhecimento:

−Contagem de leveduras: efectuar 2 diluições decimais;

−Contagem de bactérias lácticas: efectuar 6 diluições decimais; -para vinhos filtrados ou acondicionados: sem diluição; -para mostos concentrados: diluir 10 mL em 100 de água peptonada; -os vinhos engarrafados ou filtrados, bem como os mostos diluídos são analisados pela técnica de

filtração em membrana (1.6). Neste caso, o volume de amostra será de 100 mL, e após o processo a membrana será colocada no meio de cultura YEPD, incubando de seguida, em posição invertida, a 25ºC durante 48 horas.

Por fim, contar UFCs (1.7). [6]

2.3 Análise microbiológica de derivados de carne: A análise microbiológica da carne permite-nos identificar dois tipos de flora microbiana, aquela que se aloja a superfície e aquela que é encontrada em profundidade. Esta última resulta da passagem destes microrganismos pelo sistema linfático e sanguíneos dos animais em questão. Nesta secção do trabalho será feita distinção de microrganismos, psicrófilos, mesófilos e termófilos segundo os parâmetros de temperatura e período de incubação.

2.3.1 Preparação e diluição das amostras: Utilizando salsichas frescas, pesar em condições de assepsia 10g, transferindo-as para um homogeneizador (1.3), sendo o agente de diluição a água peptonada (90 mL) – suspensão-mãe. Seguidamente, preparar uma série de diluições decimais (1.5)em tubos de Eppendorf, cada um com 900 µL de água peptonada. Para a contagem do número total de microrganismos, usar placas de meio PCA*6, dividindo cada em 6 secções. Transferindo 5 µL cada diluição para cada secção – devidamente identificada – e esperar que as gotas sejam absorvidas pelo meio. Incubar as 3 placas em posição invertida a três valores de temperatura e períodos de tempo diferentes: 6ºC - 1 semana - 25 ºC - 5 dias - 37ºC - 3 dias. Em simultâneo, inocular também uma placa de Petri contendo meio CCA para a análise de Escherichia coli e outras bactérias coliformes (2.1.3). [6] 2.4 Análise microbiológica de produtos lácteos: Nos produtos resultantes da fermentação do leite, como por exemplo os iogurtes, a presença de microrganismos é imprescindível, são eles que realizam os processos fermentativos. Estes processos em sim funcionam como um factor de conservação, uma vez que diminuindo o pH, diminui a contaminação por bactérias patogénicas. Nestes compostos podemos encontrar microrganismos mesófilos e termófilos. 2.4.1 Preparação de amostras:

• Requeijão:

Em condições de assepsia, pesar 10g de requeijão, transferindo-os para um homogeneizador (1.3), sendo o agente de diluição a água peptonada (90 mL) – suspensão mãe.

*6 - Meio de cultura utilizado para a enumeração de microrganismos heterotróficos. A sua composição é dada por peptona de caseína (5.0g), extracto de levedura (2.5g), glicose (1.0g) e agar (14.0g). [6]

• Iogurte:

A suspensão-mãe será feita através da homogeneização da amostra de iogurte com o apoio de uma pipeta estéril. Assim, pipetam-se 20 mL da amostra inicial para um balão de Erlenmayer adicionando 90 mL de água peptonada. [6]

2.4.2 Diluição de amostras: O procedimento será equivalente em amas as amostras. Preparam-se uma série de diluições decimais, usando tubos de Eppendorf previamente enchidos com 900 µL de água peptonada. De modo a determinar o número total de microrganismos é necessário utilizar um meio de cultura PCA, dividindo-a em 6 secções. Em cada secção colocar 5µL de cada diluição, esperando até que sejam absorvidas pelo meio. De seguida, incubar por um período de 3 dias, em posição invertida a 25ºC. Em simultâneo, inocular também uma caixa de Petri com meio de cultura CCA para a análise de bactérias coliformes como a Escherichia coli (2.1.6). [6]

3. Resultados 3.1 Análise microbiológica da água:

Contagem total

Detecção de E.coli e outras bactérias coliformes

Tipo de amostra Temperatura UFCs UFCs: E.coli

(azuis) / 100 mL

UFCs: outras bactérias coliformes

(vermelhas) / 100 mL

Torneira (amostra 1)

22ºC

4 0 0

8 0 0

1 0 0

37ºC

1 0 0

0 0 0

0 0 0

Desconhecida (amostra 2)

22ºC

cerca de 1000 > 300 > 300

> 300 > 2000 > 2000

62 > 1000 > 1000

37ºC

> 300 0 0

> 300 > 300 > 300

> 700 > 300 > 300

Figura 5: Resultados experimentais dos três turnos na análise microbiológica da água – turno 1; turno2; turno3.

3.2. Análise microbiológica de vinhos e mostos:

Tipo de amostra Números de leveduras / 700 mL

(1 garrafa)

Vinho engarrafado (amostra 3)

21 leveduras

6 fungos; 133 bactérias

0

14 fungos

490

840

Vinho "tetrapack" (amostra 4)

21 fungos; 21 bactérias

0

0

14 leveduras

fungo não quantificável

fungo não quantificável

Figura 6: Resultados experimentais dos três turnos na análise microbiológica de vinhos e mostos – turno 1; turno2; turno3.

3.3. Análise microbiológica de derivados de carne:

Meio de

cultura

Temperatura (ºC)

UFCs / g Temperatura

(ºC) UFCs / g

Temperatura (ºC)

UFCs / g

PCA

6 6 x 107 25 2,2 x 105 37 -

6 6 x 105 25 1,2 x 105 37 2 x 104

6 2,6 x 108 25 1 x 107 37 4 x 1010

6 1,2 x 105 25 1,44 x 104 37 6 x 103

6 3,2 x 107 25 6,1 x 108 37 5,7 x 106

6 3,4 x 108 25 3,7 x 109 37 3,5 x 108

6 2,1 x 109 25 1,6 x 108 37 2,5 x 107

6 4 x 108 25 7 x 108 37 6 x 108

6 1,8 x 109 25 6 x 108 37 1,8 x 108

6 3,2 x 1011 25 5 x 1010 37 5 x 109

6 2 x 1010 25 3,4 x 1010 37 3,2 x 1010

6 6 x 108 25 1,6 x 109 37 2 x 108

Figura 7.1: Resultados experimentais dos três turnos na análise microbiológica de derivados de carne em meio PCA

turno 1; turno2; turno3.

Meio de

cultura

Temperatura (ºC)

UFCs / g

CCA

37 -

37 -

37

37

37 -

37 -

37 -

37

37 E.coli: 1,4 x 106; coliformes: 1,8 x 107

37 E.coli: 2 x 105; coliformes: 1 x 106

37 E.coli: 1,2 x 106; coliformes: 2 x 109

37 E.coli: 6 x 106; coliformes: 4 x 107

Figura 7.2: Resultados experimentais dos três turnos na análise microbiológica de derivados de carne em meio CCA

turno 1; turno2; turno3

3.4 Análise microbiológica de produtos lácteos:

Tipo de amostra Meio de cultura

Temperatura (ºC)

UFCs /g Meio de cultura

Temperatura (ºC)

UFCs /g

Queijo Fresco (amostra 5)

PCA

22 8x103

CCA

37

22 4,2x106 37

22 5,3x105 37 E. coli =0; b. coliformes =2,2x105

37 3,4x105 37

22 1.8x108 37 1,0x107

22 4x109 37

Iogurte (amostra 6)

22 37

22 37

22 2,0x107 37 0

37 4,0x106 37 0

22 2x109 37

22 3,8x105 37

Figura 8: Resultados experimentais dos três turnos na análise microbiológica de produtos lácteos em meio CCA e PCA – turno 1; turno2; turno3.

4. Discussão de Resultados

4.1 Análise microbiológica da água:

A água considerada própria para consumo não deverá apresentar mais de 100 UFCs por cada mililitro a uma temperatura de incubação de 22 ºC, e de 20 UFCs por mililitro a uma temperatura de

incubação de 37ºC [6], facto que é confirmado pelos dados dos três turnos. Assim, por este parâmetro conclui-se que a água da torneira é própria para consumo.

Outro parâmetro foi muito importante na análise da qualidade da água foi estudado: a presença de bactérias coliformes, e especificamente a Escherichia coli. Este parâmetro foi estudado através do meio de cultura CCA, constituído por uma mistura cromogénica (*5). Esta mistura tem, entre outros constituintes, a enzima ß-D-galactosidase, específica das bactérias coliformes, que hidrolisa o composto “Salmon-GAL” e no caso da E.coli, hidrolisa também o composto “X-glucuronide”. Desta hidrólise resulta um composto corado vermelho, no caso das bactérias coliformes, e no caso específico da E.coli um composto azul, resultante das duas hidrólises. [6] Nos três turnos, tanto o resultados das bactérias coliformes como da E.coli em particular deram nulo, o que reforça a conclusão dos primeiros resultados: a amostra 1 é mesmo própria para consumo.

No caso da amostra desconhecida outro resultados foram obtidos. Como é descrito 2.1.3, no caso desta amostra, só retiramos 10 mL que perfizemos até aos 100

mL com água destilada. Isto deve-se ao facto de, sendo uma amostra desconhecida, não sabemos o seu grau de contaminação bacteriano. Usando um volume muito grande de amostra, correríamos o risco de a placa de Petri ficar com tantas UFCs que se tornariam indistinguíveis, e consequentemente seria impossível contá-las.

No que se refere a resultados propriamente ditos, temos que o valor de UFCs, nos três turnos e para as duas temperaturas de incubação é muito mais elevado do que o aconselhado em água para consumo. No entanto, e tal como descrito em 1.7, as placas têm um grande erro estatístico associado – não pertencentes ao intervalo 30-300 UFCs, provavelmente proveniente de erros acumulados nas pipetagem, diluições e/ou contagens. No que se refere ao estudo da presença de bactérias coliformes temos que os valores obtidos são muito elevados, sublinhado a conclusão da impropriedade desta água para consumo. A presença deste tipo de bactérias indica a contaminação da água por dejectos humanos e/ou animais, visto serem constituintes da flora intestinal. [6]

4.2 Análise microbiológica de vinhos e mostos: A presença de leveduras no produto vinícola final deve ser reduzida, de forma a garantir a estabilidade microbiológica do mesmo. Apesar de não existir um limite legislado, e as empresas se cingirem ao seu próprio limite, por convenção considera-se que 10 leveduras / garrafa garante a qualidade do produto. [6] Assim, segundo os resultados do turno 1 no que se refere ao vinho engarrafado, e do turno 2 em relação ao vinho “tetrapack” temos que apesar de terem um número relativamente reduzido de leveduras, este ultrapassa o convencionado. No caso dos resultados do turno 3 sobre o vinho engarrafado, estes são demasiadamente elevados. Isto pode ser justificável com erros de diluições, de contagem ou outros associados aos métodos laboratoriais, pode ser consequência de uma alta rotação do homogeneizador que levou à ruptura do pseudomicélio das leveduras (1.3); outra justificação possível é o excesso de açúcar contido em alguns vinhos, que serve de “alimento” as leveduras – que realizam a fermentação alcoólica – levando ao crescimento da população. No entanto, este crescimento teria de ser exponencial para justificar os resultados obtidos.

A presença de fungos e bactérias nas amostras justifica-se com o facto do meio YEPD ser favorável ao crescimento destes microrganismos. Estes provêm da contaminação das amostras pelos esporos existentes no ar e pelos erros de esterilização e das condições de assepsia, o que levou à sua proliferação.

O facto de existirem resultados nulos é impossível, uma vez que é inviável o desaparecimento das leveduras no fim do processo de produção vinícola, apesar da centrifugação e pasteurização a cerca de 80 ºC que se realiza no fim do processo. Estes resultados são então justificáveis com erros crassos na manipulação laboratorial das amostras.

4.3 Análise microbiológica de derivados de carne:

Neste ponto, e com meio de cultura PCA, lidaremos com três valores de temperatura de incubação diferentes. Como foi referido anteriormente, a temperatura funciona como um factor

condicionante da actividade microbiana, uma vez que diferentes organismos podem ter diferentes temperaturas óptimas. Considerando a temperatura de 6ºC, as UFCs contabilizadas são referentes a microrganismos psicrófilos, que encontram nesta temperatura a sua temperatura óptima de crescimento. As diferenças de valores entre os turnos estarão relacionadas com erros sistemáticos, já nas outras etapas referenciados, como de pipetagem, e até mesmo de contagem. Quando analisamos os resultados a temperatura igual a 25ºC, observamos um aumento significativo nos resultados do turno 2 e 3. Apesar de este intervalo ser favorável ao crescimento de microrganismos psicotrófilos, não sendo totalmente desfavorável aos psicrófilos. É possível podermos encontrar já organismos mesófilos; assim, os valores apresentados de UFCs acabam por ser um reflexo do crescimento destes dois tipos de microrganismos, e do decréscimo gradual dos psicrófilos. No caso dos resultados do turno 1, o decréscimo apresentado não é muito justificável, sendo possível estar associado a erros de manipulação laboratorial. Analisando os resultados obtidos a temperaturas de 37ºC, temos um decréscimo de UFCs comparativamente aos 25ºC. Este facto, conclusão dos resultados do turno 2 e 3, está relacionado como facto desta temperatura ser completamente incompatível com o crescimento de microrganismos psicrófilos, não ser a temperatura óptima dos psicotrófilos, e ainda serem escassos os organismos termófilos encontrados. Assim, o valor obtido de UFCs está relacionado directamente com o número de organismos mesófilos e com o gradual aparecimento de microrganismos termófilos. Numa segunda fase da análise da carne picada, temos a cultura em meio CCA, que nos permite a identificação de bactérias coliformes com a E.coli. esta fase foi realizada a uma temperatura de incubação igual a 37ºC, e só tendo os resultados do turno 3, conclui-se que existe uma grande quantidade de UFCs de bactérias coliformes, e especificamente de E.coli. a diferenciação foi feita através da coloração, tal como foi explicada em 4.1. É de realçar que a foi utilizada a “técnica de gotas” substituindo-se a técnica de espalhamento em placa que exigia muitas placas de Petri. Em estudos de controlo alimentar a técnica de gotas é automaticamente excluída dos protocolos experimentais visto não apresentar o rigor necessário. No caso da análise de microrganismos em alimentos devem ser seguidas as normas legisladas,, que determinam técnicas e meios de cultura mais adequados. [6] 4.4 Análise microbiológica de produtos lácteos:

Por fim, nesta análise, foram tidos em conta dois meios de cultura diferentes, PCA e CCA, e no caso do PCA, duas temperaturas diferentes. No caso do meio PCA, e em relação à análise do queijo fresco, a diferença de valores dos turnos não é significativa, uma vez que traduzem todos a mesma conclusão à excepção do primeiro resultado do turno 1. Ignorando este por ser discrepante com os outros, tem-se que o menor valor observado de UFCs é feito à temperatura de 37ºC o que indicia que esta não pertença ao intervalo de temperatura óptima para os microrganismos encontrados na amostra. A mesma reflexão é feita quando se observa os dois resultados referentes ao iogurte. No caso do meio de cultura CCA, e no caso do queijo fresco, só o turno 2 obteve resultados, que indicam a presença de bactérias coliformes, mas excluem a presença de Escherichia coli. Esta presença é nula na amostra de iogurte segundo os resultados obtidos. A presença de bactérias no queijo fresco era esperada uma vez que é um produto cuja produção é feita à base do recurso a microrganismos.

5. Bibliografia [1]http://biomedicinacomangelica.blogspot.com/2009/06/biomedicina-e-microbiologia-alimentar.html [2] Schuller, D. (1998), Desenvolvimento de um meio de cultura selectiva/diferencial para a levedura de contaminação alimentar – Zygosaccharomyces bailii, http://repositorium.sdum.uminho.pt/, Departamento

de Biologia, Universidade do Minho, Braga − pág. 4. [3]http://www.segurancalimentar.com/conteudos.php?id=23

[4] Valsechi, O. (2006), Microbiologia dos Alimentos, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Tecnologia Agro-Industrial e Socioeconomia Rural, Araras, São Paulo – pág. 7. [5]http://www.medioscultivo.com/por/microbiologia-de-alimentos.htm [6] Schuller, D.(2009), Guia de Laboratório – Laboratórios Integrados de Biologia, Universidade do

Minho, Departamento de Biologia, Braga − pág. 53-54, 57-59, 62-63, 80-91. [7] Casal, M., Schuller, D., Rodrigues, G., Pais, C., Unidade I - Métodos Convencionais em Microbiologia, http://repositorium.sdum.uminho.pt/, Departamento de Biologia, Universidade do Minho,

Braga − pág. 6-8, 15, 28-20. [8] Fernandes, A., (2007), Estimativa da Flora Microbiana e Potenciais Patogénicos em fórmulas

alimentares para lactentes, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa, Lisboa − pág.45-46.

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