Relatório T1

Universidade do Minho

Mestrado Integrado em Engenharia Biológica

Laboratórios de Tecnologia Alimentar

Trabalho realizado por: Ana Teixeira nº 52488

João Sousa nº 52489

Marina Oliveira nº 55520

Teresa Conde nº 55511

Índice

1. Introdução ........................................................................................................................ 3

2. Materiais e métodos ......................................................................................................... 5

2.1. Materiais e reagentes ..................................................................................................... 5

2.2. Procedimento ............................................................................................................ 5

2.2.1. Extracção da catalase ......................................................................................... 5

2.2.2. Curva de calibração do substrato ....................................................................... 6

2.2.3. Concentração de proteína pelo método de Bradford .......................................... 6

2.2.3. Determinação da actividade enzimática ............................................................. 7

2.2.4. Efeito da temperatura na actividade enzimática................................................. 7

2.2.5. Efeito da concentração de substrato na actividade enzimática ........................... 8

2.2.6. Efeito da concentração da catalase na actividade enzimática ............................. 8

3. Resultados ........................................................................................................................ 9

4. Discussão de resultados .................................................................................................. 12

5. Conclusões ...................................................................................................................... 14

6. Bibliografia ...................................................................................................................... 15

7. Anexos ............................................................................................................................ 16

7.1. Método de Bradford ..................................................................................................... 16

7.2. Espectrofotometria ...................................................................................................... 16

7.3. Michaelis-Menten ........................................................................................................ 17

7.4. Exemplos de cálculo ..................................................................................................... 18

7.5. Curva de calibração do substrato .................................................................................. 19

7.6. Curva de calibração do Método de Bradford................................................................. 20

Sumário

Esta actividade experimental tem como principais objectivos a identificação da actividade

enzimática da catalase e o efeito da temperatura, pH, concentração de substrato (peróxido de

hidrogénio) e concentração de catalase nesta e, ainda, a identificação da cinética de Michaelis-

Menten.

Na determinação da actividade enzimática recorre-se à espectrofotometria e na

quantificação da catalase utiliza-se o método de Bradford.

Os principais resultados desta actividade indicam uma concentração de catalase próxima

de 0,219g/L para a diluição de 1:2 e 0,257g/L para a diluição de 1:3; para uma temperatura de

4oC a concentração de peróxido de hidrogénio varia entre 0,046 e 0,004 g/L, já para a

temperatura ambiente a variação situa-se entre os 0,024 e os 0,002 g/L; no meio em que se

adicionaram 4 mL de peróxido de hidrogénio os valores variam entre os 0,036 e os 0,003 g/L e

no meio em que se adicionaram 10 mL de peróxido de hidrogénio obtém-se valores entre os

0,019 e os 0,005 g/L e, tanto no meio sem diluição como no meio com diluição de 1:2, os

valores da concentração de peróxido de hidrogénio variam entre 0,024 e 0,003 g/L.

As conclusões mais relevantes desta actividade são que a temperatura e a concentração

de peróxido de hidrogénio (substrato) afectam a actividade enzimática. Já a concentração de

catalase, desde que o substrato esteja presente em excesso, não afecta a actividade

enzimática. Verifica-se também que a actividade enzimática é maior à temperatura ambiente,

pois esta é mais próxima da temperatura óptima. No caso da solução em que são adicionados

10 mL de peróxido de hidrogénio obtém-se uma maior actividade enzimática, sendo que a

partir de um determinado momento diminui, pois os locais activos da catalase estão todos

ocupados.




3

1. Introdução

A acumulação de oxigénio na atmosfera terrestre marcou um ponto de viragem na

evolução. A formação da camada de ozono na estratosfera veio a favorecer a evolução dos

seres vivos para o meio terrestre e a utilização deste gás no metabolismo como aceitador final

dos electrões da cadeia respiratória mitocondrial marcou um melhoramento substancial no

rendimento energético, tornando-o imprescindível para a maioria das espécies actuais [1].

Contudo, e apesar dos extraordinários melhoramentos em termos de evolução do

metabolismo, viver com o oxigénio é perigoso, uma vez que este é um gás tóxico, mutagénico

e, por conseguinte, altamente prejudicial para os seres vivos que dele se servem [1][3]. A sua

toxicidade está, actualmente, relacionada com a produção de espécies reactivas de oxigénio

(ROS), cuja formação ocorre maioritariamente na mitocôndria [1]. O termo ROS implica uma

produção intracelular de intermediários de oxigénio que ameaçam a integridade de várias

biomoléculas incluindo proteínas, lípidos e DNA [1]. Para reagir à formação de ROS, a

mitocôndria possui várias defesas antioxidantes destinadas à eliminação tanto do anião

superóxido (O2•⁻) como do peróxido de hidrogénio (H2O2) [1].

O peróxido de hidrogénio é uma das formas de ROS intracelulares mais comuns e, embora

não seja um radical livre, tem um papel muito importante devido à sua capacidade para

penetrar nas membranas biológicas. Este intervém na formação de radicais livres funcionando

como um intermediário na formação de ROS. Assim, o peróxido de hidrogénio é um

bioproduto tóxico, altamente reactivo, resultante de reacções metabólicas, que pode danificar

as células se não for removido, causando a oxidação de constituintes celulares, principalmente

lípidos e, em última instância provocar a morte celular [1][2][3].

Para manter as concentrações de ROS dentro dos níveis fisiológicos, o organismo produz

catalase (EC 1.11.1.6) [1][2]. A catalase “patrulha” as células de forma a neutralizar a produção

constante de peróxido de hidrogénio e mantê-lo a um nível seguro [1][2][3]. Esta está presente

nos peroxissomas de praticamente todas as células aeróbias e protege a célula dos efeitos

tóxicos do peróxido de hidrogénio, catalisando a sua decomposição em oxigénio molecular e

água, inofensivos ao organismo, sem a produção de radicais livres [1][2][3]. A catalase é uma

molécula tetramérica, constituída por quatro cadeias polipeptídicas com quatro grupos

prostéticos hema com Fe(III) nos locais activos da enzima que se oxida a Fe(IV) [2]. O

mecanismo de catálise não está totalmente elucidado, mas a reacção geral é dada pela

equação 1 e é ilustrada pela figura 1 [2]:

2 H2O2 → 2 H2O + O2 equação 1




4

Figura 1. Mecanismo de catálise da catalase [1].

Como foi dito anteriormente, a química de catálise da catalase não foi completamente

esclarecida mas pensa-se que esta ocorre em duas etapas, ilustradas pelas equações 2 e 3:

H2O2 + Fe (III)-E → H2O + O = Fe (IV)-E equação 2

H2O2 + O = Fe (IV)-E → H2O + Fe (III)-E equação 3

onde Fe-E representa o centro de ferro do heme ligado ao resto da enzima (E) [2].

O objectivo deste trabalho experimental visa a avaliação da influência de parâmetros

físicos (temperatura) e químicos (concentração do substrato, concentração da enzima e pH) na

actividade enzimática e estabilidade desta enzima de defesa anti-oxidante – a catalase (figura

2). A sua actividade varia significativamente de uma fonte para outra [1] e algumas fontes

desta enzima são: cebolas, cenouras, espinafres, rebentos, nabos, rabanetes, damascos,

brócolos, bananas, sangue, fígado e leite cru. Os frutos têm geralmente menor actividade da

catalase talvez devido à sua maior acidez [1]. Neste trabalho utilizar-se-á o extracto da

beterraba crua como fonte de catalase que, segundo a literatura, possui cerca de 3 g de

proteínas por cada 100 g de beterraba [4].

Figura 2. Estrutura de tetrâmero da catalase [3].

http://www.pdb.org/pdb/education_discussion/molecule_of_the_month/images/catalases.gif




5

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais e reagentes

Balões volumétricos;

Banhos termostatizados;

Tubos de ensaio;

Pipetas volumétricas;

Varetas de vidro;

Balança analítica;

Faca;

Suporte de tubos de ensaio;

Coador;

Gaze;

Furador de papéis;

Cronómetro;

Papel de alumínio;

Ralador;

Goblés;

Pompete;

Micropipeta;

Espectrofotómetro;

Cuvete de quartzo;

Vórtex;

Beterraba;

Peróxido de hidrogénio;

Água destilada;

Reagente de Bradford;

Solução de BSA;

Solução tampão fosfato

(pH=7).

2.2. Procedimento

2.2.1. Extracção da catalase

Descascar, cortar e pesar cerca de 100g de beterraba (anotar o valor da massa

pesada);

Rapidamente colocar a amostra num recipiente de plástico com 100 mL de tampão

fosfato a 4oC. Colocar o recipiente num banho frio (arrefecido com gelo) e

homogeneizar a amostra durante 30s a 1min;

Colocar um balão de Erlenmeyer num banho frio e filtrar o extracto de beterraba com

gaze. Transferir o filtrado para um balão volumétrico e acertar o volume a 200 mL com

tampão fosfato a 4oC. Preservar o extracto no banho frio até ser utilizado. Este

extracto irá conter a catalase e será designado por “extracto-mãe”.




6

2.2.2. Curva de calibração do substrato

Num balão volumétrico de 100 mL adicionar 10 mL de peróxido de hidrogénio a 30% e

perfazer com água destilada de forma a obter peróxido de hidrogénio a 3%;

Num balão volumétrico de 50 mL, preparar uma solução contendo 0,5 mL de peróxido

de hidrogénio (3% v/v);

Perfazer a solução com tampão fosfato (pH 7);

A partir desta solução realizar várias diluições;

Ajustar o espetrofótometro para 240 nm e ler as absorvâncias de todas as soluções.

Nota: Realizar todas as leituras em triplicado.

2.2.3. Concentração de proteína pelo método de Bradford

2.2.3.1. Curva de calibração

Preparar as soluções indicadas na Tabela 1:

Tabela 1. Quantidades necessárias para a preparação das soluções para a curva de calibração

de Bradford.

[BSA] (mg/L) BSA (mL) Tampão fosfato (mL)

0 (branco) 0,0 10,0

400 0,4 9,6

800 0,8 9,2

1200 1,2 8,8

1600 1,6 8,4

2000 2,0 8,0

Em seguida, adicionam-se 3 mL de solução de Bradford a 100 L de amostra, em tubos de

ensaio;

Colocar as soluções no escuro e aguardar 10 minutos para que ocorra a reacção;

Retirar 200 L de cada solução para uma placa ELISA, em triplicado;

Ler a absorvância a 240 nm.




7

2.2.3.2. Quantificação da catalase

Preparar uma diluição de 1:2 e de 1:3 do “extracto-mãe”;

Em seguida, adicionam-se 3 mL de solução de Bradford a 100 L de amostra, em tubos

de ensaio;

Colocar as soluções no escuro e aguardar 10 minutos para que ocorra a reacção;

Retirar 200 L de cada solução para uma placa ELISA, em triplicado;

Ler a absorvância a 240 nm.

2.2.3. Determinação da actividade enzimática

Proceder a diluições do “extracto-mãe” de catalase de 1:2 e mantê-las à temperatura

ambiente;

Adicionam-se 6 mL de peróxido de hidrogénio (H2O2);

Utiliza-se como branco uma solução contendo 2 mL de extracto e 2 mL de tampão

fosfato (pH=7);

Ler absorvância a 240 nm;

Repetir a leitura de 1 em 1 minutos até a absorvância estabilizar.

2.2.4. Efeito da temperatura na actividade enzimática

Proceder a diluições do “extracto-mãe” de catalase de 1:2 e mantê-las a duas

temperaturas distintas, uma à temperatura ambiente e outra em gelo;


Preparar uma solução contendo 2 mL de extracto e 2 mL de tampão, que foi utilizada

como branco;



Nota: A temperatura óptima da catalase situa-se entre 20oC e os 50 oC, daí as temperaturas escolhidas estarem

dentro deste intervalo [5].




8

2.2.5. Efeito da concentração de substrato na actividade enzimática

Proceder a diluições do “extracto-mãe” de catalase de 1: 2 à temperatura ambiente;

Adicionam-se 4 mL e 10 mL de peróxido de hidrogénio (H2O2);


como branco;



2.2.6. Efeito da concentração da catalase na actividade enzimática

Proceder a diluições do “extracto-mãe” de catalase de 1: 2 e de 1:5, à temperatura

ambiente;



como branco;






9

3. Resultados

Na tabela 2 podem observar-se os valores obtidos de concentração de catalase para uma

diluição de 1:2 e de 1:3, que são aproximadamente iguais.

Na figura 3 nota-se um decréscimo da concentração de peróxido de hidrogénio (H2O2) ao

longo do tempo, tanto no ensaio à temperatura ambiente como no realizado a 4oC,

verificando-se que à temperatura ambiente a concentração de peróxido de hidrogénio é

menor do que à temperatura de 4oC.

Na figura 4 verifica-se uma diminuição da concentração de peróxido de hidrogénio ao

longo do tempo, sendo que, até aos 5 minutos, observa-se que a curva respectiva à adição de

10 mL de peróxido de hidrogénio tem concentrações inferiores de peróxido de hidrogénio, em

relação à curva na qual foram adicionados apenas 4 mL de peróxido de hidrogénio. Entre os 5

e os 7 minutos nota-se uma concentração aproximadamente igual e a partir dos 7 minutos

observa-se um aumento da concentração de peróxido de hidrogénio na solução com 10 mL de

peróxido de hidrogénio.

Na figura 5 também é observada uma diminuição da concentração de peróxido de

hidrogénio ao longo do tempo, sendo que a concentração de peróxido de hidrogénio é

próxima no meio com diluição de 1:2 e no meio com o extracto sem qualquer diluição.

Tabela 2. Valores de concentração obtidos para a catalase.

Amostra Diluição [catalase] (g/L)

1 1:2 0,219

2 1:3 0,257




10

Figura 3. Representação gráfica do efeito da temperatura na actividade enzimática da catalase.

Figura 4. Representação gráfica do efeito da concentração de peróxido de hidrogénio

(substrato) na actividade enzimática da catalase.

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

0,045

0,050

0 2 4 6 8

[H2O

2] (g

.L-1

)

tempo (min)

Ambiente (25 ºC)

Frio (4 ºC)

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

0 2 4 6 8 10

[H2O

2] (g

.L-1

)

tempo (min)

4 mL de peróxido de hidrogénio

10 mL de peróxido de hidrogénio




11

Figura 5. Representação gráfica do efeito da concentração de catalase (proteína) na actividade

enzimática.

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0 2 4 6 8 10

[H2O

2] (g

.L-1

)

tempo (min)

sem diluição

Diluição 1:2




12

4. Discussão de resultados

Na determinação da concentração de catalase pelo método de Bradford verifica-se que a

concentração de catalase é aproximadamente a mesma para as duas diluições efectuadas, isto

é, na diluição 1:2 obteve-se uma concentração de 0,219 g/L e na diluição 1:3 obteve-se uma

concentração de 0,257 g/L. Tal era esperado pois as amostras foram retiradas do mesmo

“extracto-mãe”, logo apresentam a mesma concentração de catalase.

Com base na análise gráfica da figura 3 pode-se concluir que a concentração de peróxido

de hidrogénio é maior à temperatura de 4oC, onde os valores variam entre 0,045 e 0,004 g/L,

quando comparado com a temperatura ambiente, onde os valores variam entre 0,024 e 0,002

g/L, uma vez que, a esta temperatura a actividade da catalase vai ser menor, não convertendo

tanto substrato em produto e, por conseguinte existe maior concentração de peróxido de

hidrogénio na amostra. Dado que a temperatura óptima encontrada na literatura se situa

entre os 20oC e os 50oC, era de esperar que à temperatura ambiente se obtivesse maior

actividade enzimática, dado o facto de a catalase estar num meio a uma temperatura mais

próxima da sua temperatura óptima [5][6].

Analisando a figura 4 verifica-se que para o meio onde foram adicionados 4 mL de

peróxido de hidrogénio os valores situam-se entre os 0,036 e os 0,003 g/L, enquanto no meio

onde se adicionaram 10 mL de peróxido de hidrogénio os valores variam entre 0,019 e 0,005

g/L, regista-se inicialmente uma menor concentração de peróxido de hidrogénio na solução à

qual foram adicionados 10 mL de peróxido de hidrogénio até aos 5 minutos de reacção.

Seguidamente, entre os 5 e os 7 minutos de reacção, ambas as curvas se encontram, sendo

que a partir dos 7 minutos, a curva ilustrativa da amostra à qual foram adicionados 4 mL de

peróxido de hidrogénio apresenta menor concentração de peróxido de hidrogénio. Assim, a

actividade enzimática foi maior primeiramente para a amostra onde existia maior

concentração de substrato e, a partir dos 7 minutos, para a amostra contendo menor

concentração de substrato. Tal pode ser explicado pelo facto de a velocidade da reacção

aumentar mais rapidamente quando a concentração de substrato é maior, mas somente até

um valor máximo, em que todas as enzimas disponíveis estão saturadas, isto é, recrutadas

para a formação do complexo enzima-substrato [7].

Pela análise da figura 5 verifica-se que não há grande variação entre as duas curvas

correspondentes à não diluição e à diluição de 1:2 do extracto de catalase. Assim, tanto na

curva do meio sem diluição como na curva do meio com diluição de 1:2 os valores de

concentração de peróxido de hidrogénio variam entre os 0,024 e os 0,003 g/L. Ora, tal facto




13

indica que a concentração de catalase não influencia a sua actividade enzimática, isto é,

variando a concentração de catalase, desde de que exista uma concentração de substrato

suficiente, este liga-se à enzima formando o complexo enzima-substrato indiscriminadamente

[7].

Devido ao atraso da actividade prática e ao esgotar do tampão não foi possível realizar a

actividade prática referente ao efeito do pH na actividade enzimática e o estudo da cinética de

Michaelis-Menten. Contudo, esperava-se que a actividade enzimática fosse maior a um pH

próximo do pH óptimo da catalase que se situava entre o 7,0 e os 9,0 [5]. Quanto à cinética de

Michaelis-Menten a literatura refere um Km da catalase igual a 1,1 M, pelo que se esperava

encontrar uma constante cinética de Michaelis-Menten próxima deste valor [8].




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5. Conclusões

As conclusões mais relevantes que podem ser retiradas deste trabalho são que a

actividade enzimática é afectada pela temperatura e pela concentração de peróxido de

hidrogénio (substrato), mas não pela concentração de catalase desde que o substrato esteja

presente na solução em excesso.

A actividade enzimática foi maior para uma temperatura mais próxima da temperatura

óptima, ou seja, foi mais alta à temperatura ambiente. Para uma concentração de substrato

mais elevada foi obtida uma maior actividade enzimática, sendo que a partir de um

determinado momento diminui, uma vez que os locais activos da catalase estavam todos

ocupados a formar o complexo enzima-substrato.




15

6. Bibliografia

[1] DOURADO, F.; ABRUNHOSA, L.; 2010/2011, Laboratórios de Tecnologias Alimentares,

Trabalhos Práticos;

[2]http://www.callutheran.edu/Academic_Programs/Departments/BioDev/omm/catalase/cat

1.htm, consultado em 30/09/11;

[3] BRITO, A.; 2006; O Oxigénio no Mundo Vivo: dos melhoramentos extraordinários aos

efeitos deletérios, Adequação de protocolos para aplicação aos Ensinos Básico e Secundário;

[4] http://www.vidadequalidade.com.br/saude/beneficios-da-beterraba.html;

[5] Medeiros, I.;Bainy, A.; 2000, Otimização da metodologia de análise da enzimas catalase e

glutationa s-transferase para a glândula digestiva do mexilhão Perna perna;

[6] BARTOSZEK, M.; KŚCIUCZYK, M.; 2005, Study of the temperature influence on catalase

using spin labelling method, Journal of Molecular Structure, pp. 733-736;

[7] Schuller, D.; Bjӧrn, J.; 2009/2010, Laboratórios Integrados de Biologia, Guia de Laboratório;

[8] QUINTAS, A.; FREIRE, A.; HALPERN, M.; Bioquímica, Organização Molecular da Vida, 2008,

1ª edição, LIDEL, págs. 257, 274;

[9] SOUSA, D.; 2009/2010; Protocolos de Laboratórios de Bioprocessos;

[10]http://pt.scribd.com/doc/19825031/Analise-pelo-espectrofotometro-e-curva-

padrao, consultado em 7/10/11;

[11] http://c2o.pro.br/automacao/x1669.html, consultado em 7/10/11;

[12] http://cheirosdaterra.hd1.com.br/controle_qualidade_03.htm, consultado em 7/10/11

[13] http://gmein.uib.es/otros/enzimas/Jmoldesarrollo/textos/enzima5.html, consultado em

30/09/11;

[capa] http://csmres.jmu.edu/biology/bio380/web12/discussion%20proj2.htm, consultado em

20/10/11.




16

7. Anexos

7.1. Método de Bradford

A quantificação da proteína solúvel presente nos extractos celulares foi efectuada pelo

método desenvolvido por Bradford (1976). Este método baseia-se na propriedade que o

corante azul de Coomassie tem em estabelecer ligações a proteínas pela sua parte cromófora.

Ao ligar-se à proteína, o corante muda de vermelho para azul. Assim, as soluções deste corante

apresentam um máximo de absorvência a 465 nm e 595 nm, na ausência e na presença,

respectivamente, de proteína em solução [9].

7.2. Espectrofotometria

Neste trabalho experimental recorre-se a uma técnica analítica que avalia a capacidade

que os solutos têm de absorver a luz em comprimentos de onda específicos – a

espectrofotometria. A medida da luz absorvida, isto é, a absorvância, possibilita a dedução da

concentração do soluto nas soluções [10]. Deste modo, pelo uso da espectrofotometria é

possível determinar a quantidade de luz absorvida por uma substância em solução, permitindo

assim calcular a sua concentração. Quando a luz com um determinado comprimento de onda

incide numa solução uma parte dessa luz é absorvida pelas moléculas em solução. Esta

absorvância segue a Lei de Beer-Lambert e é directamente proporcional à:

Concentração do soluto

Capacidade que a substância dissolvida tem de absorver a luz de um determinado

comprimento de onda

A distância percorrida pela luz através da solução (geralmente 1 cm)

Após a passagem pela solução, a energia luminosa detectada pelo fotodetector é expressa em

absorvância (A), calculada pela equação 4 e ilustrada pela Figura 2:

A (absorvância) = log(I0/It) equação 4

Onde I0 representa a intensidade da luz na fonte, antes de passar pela amostra (substância

dissolvida) e It representa a luz que passa através da amostra (substância dissolvida) [7].




17

Figura 6. Esquema ilustrativo do funcionamento do espetrofótometro [11].

Pela medição da absorvância é possível determinar a concentração de molécula em

solução que absorve luz de um determinado comprimento de onda. Todavia, as leituras das

absorvâncias apenas indicam concentrações relativas – uma absorvância mais elevada resulta

de uma concentração mais elevada. Nestes casos, a concentração pode ser estimada

recorrendo a uma curva de calibração.

A espectrofotometria possui como vantagem principal uma grande sensibilidade, uma vez

que, ao contrário dos métodos volumétricos onde é necessário uma concentração mínima de

0,1mg/ml da substância a ser analisada, enquanto na espectrofotometria, se pode analisar

soluções com concentrações até 0,001mg/ml, ou seja, o método é cerca de 100 vezes mais

sensível. As análises espectrofotométricas são ainda seguras, de fácil execução, rápidas e de

baixo custo. Contudo, esta técnica possui algumas desvantagens como: a falta de

especificidade, por ser baseado na quantidade de energia absorvida por uma substância num

comprimento de onda específico, tornando difícil a distinção da substância a ser analisada;

algumas substâncias não seguem a Lei de Beer-Lambert, não sendo possível determinar a sua

concentração em determinadas soluções [12].

7.3. Michaelis-Menten [13]

A cinética enzimática é o estudo do caminho mais provável para a definição da equação da

taxa da reacção de um sistema reaccional catalisado por enzimas. Medindo-se a concentração

do substrato com o decorrer do tempo, estas medições permitem a construção da curva da




18

Figura 2, a qual traduz a variação da velocidade de reacção com o consumo de substrato

(formação do produto) com o tempo.

Um dos objectivos deste trabalho experimental prende-se com a utilização da cinética de

Michaelis-Menten para a determinação das constantes cinéticas Vmáx, Km e K2 da catalase:

][

][

0

0

0SKm

SVV máx

][ 02 EKVmáx

Onde, V0 é a velocidade inicial da reacção, [S0] é a concentração de substrato, [E0] é a

concentração de enzima inicial e Vmáx, Km e K2 são as constantes cinéticas.

Recorrendo ao ajuste não linear da representação gráfica da equação acima é possível

determinar as constantes cinéticas como mostra a figura 2:

Figura 7. Gráfico ilustrativo da cinética de Michaelis-Menten [13].

7.4. Exemplos de cálculo

Concentração de Peróxido de Hidrogénio:

equação 5

equação 6

2503,38

0198,022

absmédia

OH




19

lg

OH 024,02503,38

0198,02

445,0421,0

][ 22

Concentração de Proteína:

l

g219,02

437,0

755,02

812,0763,0

Proteina

7.5. Curva de calibração do substrato

Figura 8. Curva de calibração do substrato (peróxido de hidrogénio – H2O2).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030

Ab

sorv

ânci

a

Concentração (g.L-1)

y = 38,503 ± 10,031 x - 0,0198 ± 0,170 R² = 0,9803

2437,0

755,0Proteina

absmédia




20

7.6. Curva de calibração do Método de Bradford

Figura 9. Curva de calibração do método de Bradford.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Ab

sorv

ânci

a

Concentração (g.L-1)

y = 0,437 ± 0,125 x + 0,7555 ± 0,151 R² = 0,9637

Relatório T1

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