RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: agosto/2016 a ... · Determinação de carotenoides...
Transcript of RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período: agosto/2016 a ... · Determinação de carotenoides...
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC: CNPq,
CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, PIBIT E FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período: agosto/2016 a fevereiro/2017.
(X) PARCIAL
( ) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: Oxidação de carotenoides por espécies reativas de
oxigênio e de nitrogênio: análise química e atividade biológica (Portaria 035.2016-ITEC-
UFPA).
Nome do Orientador: Renan Campos Chisté.
Titulação do Orientador: Professor Adjunto.
Faculdade: Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA).
Instituto/Núcleo: Instituto de Tecnologia (ITEC).
Laboratório: Laboratório de Tecnologia de Alimentos (LTA).
Título do Plano de Trabalho: Obtenção de cristais de -caroteno com elevado grau de
pureza a partir da polpa e da casca de pupunha (Bactris gasipaes).
Nome do Bolsista: DANIELLE PRAIA LIMA.
Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/ CNPq ( ) PIBIC/CNPq – AF ( ) PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador (X) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA – AF ( ) PIBIC/ INTERIOR ( ) PIBIC/PRODOUTOR ( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/PIBIT
2
1. INTRODUÇÃO
Os carotenoides são pigmentos naturais responsáveis pela coloração amarela ao
laranja ou vermelho de muitas frutas, hortaliças, gema de ovo, crustáceos cozidos e em
alguns peixes. São micronutrientes presentes em níveis muito baixos (micrograma por
grama) que possuem uma ampla distribuição na natureza, estruturas químicas diversas e
variadas funções e estão entre os constituintes alimentícios mais importantes para os
seres vivos (RODRIGUES-AMAYA et al., 2008).
Além disso, os carotenoides, como o β-caroteno, α-caroteno e a β-criptoxantina,
são substâncias bioativas benéficas a saúde por apresentar atividade pró-vitamina A que
pode ser convertido em retinol pelo corpo humano, composto importante para o
crescimento ósseo, visão ao reduzir riscos de contrair catarata e também na prevenção
contra o câncer, doenças cardiovasculares e degeneração macular relacionada à idade
(PEREIRA et al., 2017; RODRIGUES-AMAYA et al., 2008).
O β-caroteno possui uma maior potência de atividade de vitamina A e pode ser
obtido na matéria prima que será estudada neste plano de trabalho, o fruto da pupunha. A
pupunheira (Bactris gasipaes) é muito consumida diretamente após o seu cozimento com
sal e água e é considerada fundamental em algumas regiões, como a do Norte. Seus
cachos de frutos grandes comestíveis apresentam um sabor agradável com alto valor
nutritivo; é essencialmente energética e contém em sua composição nutricional pequenas
quantidades de proteínas, óleo, vitamina B, vitamina C e ferro. Os frutos da pupunha
também são utilizados para a extração de óleo, produção de farinha e na alimentação
humana e animal (NOGUEIRA et al., 1995).
Os frutos pertencem à família Aracaceae e seu peso total é representado em maior
proporção pela polpa (72%), seguido das sementes (21%) e casca (6%) (Ferreira & Pena,
2003). Sua polpa é carnosa de coloração que varia do amarelo ao laranja, devido a grande
presença de teores de carotenoides (β-caroteno como carotenoides majoritário), com
elevado teor de atividade de vitamina A (DE ROSSO & MERCADANTE, 2007).
3
2. JUSTIFICATIVA
A proposta cientifica e o impacto do projeto está baseado na utilização da pupunha,
fruto de origem amazônica, para a obtenção de cristais de β-caroteno de alto grau de
pureza. A obtenção do β-caroteno com elevado grau de pureza é importante, pois consiste
em diversas finalidades como, na utilização para estudos de aplicação do β-caroteno como
corante alimentício natural, a possibilidade de obtenção de um padrão analítico de baixo
custo, caso comparado ás alternativas comerciais (síntese química) e para a utilização
como padrão analítico para as diversas metodologia cientificas usada na área da ciência e
tecnologia de alimentos (quantificação de carotenoides e avaliação do potencial
antioxidante de frutas e vegetais) no Programa de Pós-Graduação em Ciência e
Tecnologia de Alimentos (PPGCTA) da UFPA. Com isso, este projeto possui aplicação em
pesquisas futuras e uma possível criação de patentes através do desenvolvimento de
ingredientes e produtos com alegação funcional.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
O objetivo principal do trabalho a ser executado é a otimização das condições de
extração de carotenoides a partir da polpa e da casca da pupunha para a obtenção de
cristais de β-caroteno com grau de pureza elevado (> 95%).
3.2. Objetivos específicos
Para que este objetivo seja realizado, é importante que algumas metas sejam
seguidas, como:
- Determinar o teor de carotenoides totais na polpa e na casca; (realizado)
- Identificar e quantificar os carotenoides da polpa e casca da pupunha por cromatografia
liquida de alta eficiência acoplada ao detector de arranjo de diodos; (parcialmente
realizado)
- Selecionar a parte do fruto (polpa e casca) com maior rendimento de carotenoides e
avaliar a eficiência da extração dos carotenoides observando diferentes parâmetros para
otimização da extração, como, o tipo de solvente, razão massa de amostra/volume
solvente e tempo de extração aplicada no processo; (realizado)
-Obter extratos de pupunha (polpa/casca) com elevados teores de carotenoides para
isolamento e cristalização do β-caroteno; (realizado)
- Determinar o grau de pureza dos cristais de β-caroteno obtidos e se necessário realizar
uma segunda cristalização; (a ser realizado)
-Avaliar a estabilidade dos cristais de β-caroteno armazenados sob condições de
congelamento à 20°C negativo. (a ser realizado)
4
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Equipamentos e vidrarias utilizadas
Béquer; Balança analítica; Erlenmeyer; Papel de filtro; Espátulas; Funil de
porcelana; Pera; Pipeta volumétrica e graduada; Pisseta; Cadinho; Balão de fundo
redondo; Proveta graduada; Kitassato; Funil de separação; Funil de buchner; Anel para
funil; Espectrofotometro; Rota evaporador; Agitador magnético; Bomba a vácuo; suporte
universal.
4.2. Reagentes utilizados
Celite; Água Destilada Acetona; Éter etílico; Éter de petróleo; Acetato de etila,
Sulfato de sódio anidro; Hidróxido de potássio; metanol.
4.3. Obtenção das amostras
As frutas de cascas vermelhas (Figura 1a) e sem sementes utilizadas neste
trabalho foram adquiridas na feira do Ver-o-Peso (Belém, PA) e lavadas com água corrente
até que toda sujidade fosse removida. Logo em seguida, as pupunhas foram imersas em
água clorada a 100 ppm/10 min para a completa sanitização.
Feito isso, as partes do fruto (polpa e casca) foram separadas manualmente (Figura 1b
e 1c) para que ambas as partes individualmente fossem trituradas, liofilizadas, embaladas
a vácuo e armazenadas a -20°C até o momento de realização das análises.
Figura 1. (a) Frutos de pupunha utilizados neste estudo, (b) frutos com a polpa e casca
separados e (c) partes do frutos prontos para embalagem e armazenamento.
4.4. Determinação do teor de carotenoides totais
Para a determinação do teor de carotenoides, foram pesados 1 g de amostra tanto
da polpa quanto da casca da pupunha em um Becker (com seu peso tarado) e colocado
em um almofariz juntamente com um pouco de celite e acetona macerando com um pistilo
até que todo o carotenoides fosse extraído. Após este processo, fez-se a filtragem da
amostra extraída com um papel filtro e um funil de büchner até que todos os carotenoides
(a) (b) (c)
5
fossem removidos do papel e nada fosse perdido. Em seguida, foi realizada a partição
líquido-líquido em um funil de separação contendo um pouco de água seguido de éter de
petróleo e éter etílico (1:1, v/v).
Além disso, é importante ressaltar que a quantidade dos dois reagentes (éter de
petróleo e éter etílico) deve ter a soma da quantidade total de amostra extraída na
filtragem, como por exemplo: 50 mL de amostra extraída para 25 mL de éter de petróleo e
25 mL de éter etílico.
Após a lavagem, a amostra de carotenoides foi transferida para um erlermayer e
juntamente adicionada um pouco de sulfato de sódio anidro, que tem capacidade de
capturar água na amostra. Logo em seguida, com uma pipeta graduada os carotenoides
presentes no erlenmayer foram transferidos para um balão de fundo redondo e levado ao
evaporador rotativo para evaporação do solvente orgânico. Depois desse processo de
evaporação, foi adicionado aos poucos o éter de petróleo para que os carotenoides fossem
desprendidos do balão. Após essa etapa, o liquido foi colocado em um balão volumétrico
(10 mL) e desse balão feito uma diluição de 1 mL para 10 mL (fator de diluição = 10) em
outro balão de volume igual sendo completado com éter de petróleo.
Com isso, os compostos foram quantificados por espectrofotometria utilizando o
coeficiente de absortividade molar do β-caroteno em éter de petróleo (2592 a 450 nm)
(MELÉNDEZ-MARTINEZ et al., 2007). Também, é importante ressaltar que as
determinações do teor de carotenoides foram feitos em triplicata e expresso em
micrograma de β-caroteno /g das partes do fruto, conforme a equação a seguir:
𝑪𝒂𝒓𝒐𝒕𝒆𝒏𝒐𝒊𝒅𝒆𝒔 𝑻𝒐𝒕𝒂𝒊𝒔 (𝝁𝒈
𝒈) =
𝑨𝒃𝒔𝒙 𝟏𝟎𝟒 𝒙 𝑭𝑫 𝒙 𝑽𝒃
𝟐𝟓𝟗𝟐 𝒙 𝒎𝒂
Abs: absorbância
FD: fator de diluição
Vb: volume total do extrato no balão volumétrico (mL)
ma: massa da amostra (g)
4.5. Identificação e quantificação dos carotenoides por HPLC-DAD-MS/MS:
Até o momento, foram realizadas apenas a confirmação da identidade dos
carotenoides das partes da pupunha com maior teor de carotenoides totais (casca) por
HPLC-DAD, com base no perfil de carotenoides reportado por De Rosso & Mercadante
(2007). A quantificação e a confirmação do perfil de carotenoides por espectrometria de
massas ainda serão realizadas.
6
Os carotenoides foram extraídos da casca da pupunha seguindo as mesmas
etapas da análise anterior (4.4. Determinação de carotenoides totais), até o momento da
etapa de partição líquido-líquido. Após a partição, foi realizada uma etapa de saponificação
do extrato de carotenoides. A saponificação foi realizada da seguinte maneira: foi
adicionada uma solução de KOH 10% em metanol no extrato (1:1, v/v) após a partição e
deixado em repouso por 16 horas. Após a etapa de saponificação, o extrato foi direcionado
para uma nova partição líquido-líquido em um funil de separação com éter de petróleo e
éter etílico na proporção de 1:1 (v/v) e dava-se início ao processo de lavagem com água
destilada acompanhando o pH da água que era removida do funil até a completa remoção
do álcali. Logo após, a água remanescente da etapa de lavagem foi removida com o
auxílio de sulfato de sódio anidro. Em seguida, com o auxílio de uma pipeta, o extrato foi
transferido para um balão de fundo redondo para que o solvente fosse removido em um
evaporador rotativo (T < 38 °C) e re-solubilizado em éter de petróleo. O extrato foi
transferido para um frasco de vidro aonde a amostra seria armazenada e a pequena
alíquota de solvente orgânico foi removida em fluxo de nitrogênio. O extrato seco de
carotenoides foi armazenado em um freezer a -18 ºC até o momento da injeção no sistema
cromatográfico (HPLC-DAD).
O extrato de carotenoide foi solubilizado em metanol (MeOH)/éter metil-terc-butílico
(MTBE) na proporção 70:30 (v/v), filtrado (0,22 μm) e injetado no HPLC (Agilent
Technologies 1260 Infinity, USA) equipado com bomba quaternária, desgaseificador,
injetor Rheodyne com capacidade para 20 μL e um detector de arranjo de diodos (DAD).
Os carotenoides foram separados em uma coluna C30 YMC (5 μm, 4.6 x 250 mm, Waters,
USA) a 29 ºC, fluxo de 0,9 mL/min, com gradiente linear composto de MeOH/MTBE na
proporção de 95:5 para 70:30 em 30 min, seguido de 50:50 em 20 min (CHISTÉ &
MERCADANTE, 2012). O cromatograma foi processado a 450 nm e os espectros UV-
Visível foram adquiridos entre 200 e 600 nm. Os carotenoides foram identificados de
acordo com as seguintes informações combinadas: ordem de eluição em coluna C30,
características dos espectros UV-Vis [λmáx, estrutura fina (%III/II), intensidade do pico cis
(%AB/AII)] e dados disponíveis na literatura (DE ROSSO & MERCADANTE, 2007; CHISTÉ
& MERCADANTE, 2012).
4.6. Otimização da extração de carotenoides da casca de pupunha
Para a otimização da extração de carotenoides da casca da pupunha foi proposto
um Delineamento Composto Central (DCC) do tipo 2³, com dois níveis (+1 e -1) e 3
repetições no ponto central, totalizando 11 experimentos. Foram selecionadas 3 variáveis
independentes (proporção de acetato de etila em acetona, razão sólido-líquido e tempo de
agitação) (Tabela 1).
7
Tabela 1. Delineamento Composto Central (DCC): níveis das variáveis independentes
(originais e codificadas).
Variável independente
Nível
-1 0 +1
Proporção de acetato de etila em acetona
(Acetona: X) X1 30% 50% 70%
Razão sólido-líquido (1:X) X2 3 5 7
Tempo de agitação magnética (min) X3 40 60 80
A resposta do planejamento experimental foi o teor de carotenoides totais, os
coeficientes de regressão foram obtidos e os dados experimentais foram ajustados a um
modelo linear. A adequação ao modelo foi determinada pela avaliação da falta de ajuste ao
modelo proposto, pelo coeficiente de determinação (R2) e pelos valores do teste de Fisher
(F-value) obtida pela análise de variância (ANOVA) gerada pelo software Statistica. A
significância estatística dos resultados dos modelos e das variáveis foram determinadas a
5% (=0.05) e 10% (=0.10).
Para que este processo seja realizado, foi pesado 3 g de amostra e feito a medida
da proporção de acetato de etila em acetona, adicionando tudo junto em um Erlenmeyer
coberto com papel alumínio e selado com o papel filme. Feito isso, o Erlenmeyer foi posto
em um shaker para agitar a 114 rpm a temperatura ambiente durante o tempo estipulado
pelo planejamento (Tabela 1). Em seguida, foi feito a partição líquido-líquido do extrato de
carotenoide adicionando primeiramente em um funil de separação um pouco de agua
seguido de éter de petróleo, éter etílico e aos poucos o extrato da casca, até que a acetona
fosse removida. Após a lavagem, o extrato de carotenoides foi transferido para um
erlenmeyer e adicionado aos pouco sulfato de sódio anidro, para a captura da água na
amostra.
Depois dessa etapa, o extrato de carotenoides foi transferido para um balão de
fundo redondo e levado para o evaporador rotativo (T < 38 °C) para a remoção do solvente
orgânico. Depois, foi acrescentando aos poucos o éter de petróleo para que os
carotenoides fossem desprendidos do balão e colocado o liquido em um balão volumétrico
(10 mL) e desse balão feito uma diluição de 10 vezes (1 mL para 10 mL) em outro balão de
8
volume igual sendo completado com éter de petróleo. Para que por fim, os compostos
fossem quantificados por espectrofotometria, conforme procedimento descrito no item 4.4.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Determinação do teor de carotenoides totais
Com os dados obtidos (Tabela 2), foi possível verificar que a concentração de
carotenoides totais da casca da pupunha foi maior do que o teor encontrado na polpa.
Sendo assim, a casca da pupunha será a matéria-prima utilizada nas próximas etapas dos
experimentos.
Tabela 2. Teor de carotenoides totais na polpa e na casca da pupunha.
Partes da pupunha Teor de carotenoides totais (g/g)*
Polpa 31,8 4,6 (CV = 14,5%)
Casca 336,9 32,4 (CV = 9,6%)
*Base úmida
No presente estudo, o teor de carotenoides totais encontrado na casca do tucumã foi
superior ao reportado para a polpa da pupunha (197,66 µg/g), tucumã (62,65 µg/g) e para
o azeite de dendê (129,03 µg/g); no entanto, foi inferior ao encontrado no buriti (513,87
µg/g) (DE ROSSO & MERCADANTE, 2007). Além disso, o teor de carotenoides totais da
casca da pupunha (Tabela 4) foram superiores aos encontrados para a abóbora rasteira
(Cucurbita Moschata, variedade baianinha) (317,8 µg/g), o caruru (112 µg/g) e a cenoura
(81 µg/g) (VERONEZI, 2011).
Em um estudo realizado por Carvalho et al. (2013), a polpa da pupunha in natura
apresenta teor de carotenoides totais de 24,60 µg/g, teor inferior ao encontrado neste
trabalho, que pode ser explicado por diferentes fatores como a variedade do fruto, solo,
clima, cultivo, entre outros. Ademais, os teores de carotenoides totais presentes na polpa e
na casca da pupunha (Tabela 4) podem ser consideradas superiores aos teores reportados
para os frutos de murici (1,25 µg/g), maracujá doce (1,31 µg/g) e jenipapo (0,93 µg/g)
(OLIVEIRA, 2014).
5.2. Identificação e quantificação dos carotenoides por HPLC-DAD
Até o presente momento, apenas a identificação provisória dos carotenoides da
casca da pupunha foi realizada por comparação dos picos encontrados neste estudo com
9
os picos de carotenoides já identificados e reportados por De Rosso & Mercadante (2007)
em condições idênticas de separação cromatográfica. Além disso, as características
espectrais [λmáx, estrutura fina (%III/II), intensidade do pico cis (%AB/AII)] também foram
comparadas.
O cromatograma da casca de pupunha pode ser visualizado na Figura 2. O pico
correspondente ao β-caroteno elui a 36,8 min e o espectro UV-Vis apresentou absorbância
nas bandas 421, 452, 478 nm, com %III/II ≈ 25 e %AB/AII = 0, conforme reportado por De
Rosso & Mercadante (2007) e Chisté & Mercadante (2012).
Figura 2. Cromatograma da casca da pupunha obtido a 450 nm (HPLC-DAD) sem
saponificação (esquerda) e após a saponificação (direita).
A saponificação é uma etapa analítica que tem por objetivo a quebra da ligação
éster entre os carotenoides e os ácidos graxos presentes nas amostras vegetais, liberando
o carotenoide. Essa estratégia é útil quando há a necessidade de identificação e
isolamento de compostos em matrizes complexas. No caso da casca da pupunha, quanto
mais eficiente for a saponificação, mais livre estará o carotenoide para o processo de
cristalização, que depende de um grau de pureza mais elevado. Após análise dos
cromatogramas (Figura 2), foi possível verificar a presença de ésteres de carotenoides
mesmo após o processo de saponificação, o que indica que o processo não foi realizado
com eficiência. Este procedimento e a análise de HPLC-DAD do extrato saponificado será
repetido para que seja obtido o maior rendimento de β-caroteno para o processo de
cristalização.
5.3. Otimização da extração de carotenoides da casca de pupunha
Com a obtenção dos dados da massa da casca do fruto, volume de acetato e
acetona e da absorbância de cada experimento do planejamento, foi possível realizar os
cálculos das concentrações para a obtenção de teores de carotenoides totais no extrato,
com o objetivo de determinar as condições mais eficientes para uma melhor extração.
Logo abaixo na Tabela 3 do Delineamento Composto Central (DCC), está apresentado os
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
mA
U
0
100
200
300
mA
U
0
100
200
300DAD: Sinal A, 450,0 nm/Lb:4,0 nm Ref 600,0 nm/Lb:20,0 nm
Casca da pupunha (sem saponificação)
-caroteno(36,8 min)
Ésteres de carotenoide
Minutes
10 20 30 40 50 60
mA
U
0
50
100
150
200
mA
U
0
50
100
150
200DAD: Sinal A, 450,0 nm/Lb:4,0 nm Ref 600,0 nm/Lb:20,0 nm
-caroteno(36,8 min)
Ésteres de carotenoide
Casca da pupunha (após saponificação)
10
teores de carotenoides totais quantificados em cada experimento do planejamento
realizado.
Tabela 3. Teor de carotenoides totais obtidos pelo Delineamento Composto Central (DCC).
Experimento
Níveis das variáveis
independentes Teor de
carotenoides totais
(g/g) X1 X2 X3
1 30 3 40 33,73
2 70 3 40 42,56
3 30 7 40 39,07
4 70 7 40 33,16
5 30 3 80 56,02
6 70 3 80 25,57
7 30 7 80 41,79
8 70 7 80 45,95
9 (PC) 50 5 60 72,78
10 (PC) 50 5 60 81,15
11 (PC) 50 5 60 79,25
X1 = acetato de etila em acetona (%), X2 = razão sólido-líquido, X3 = tempo de agitação magnética
(min). PC: ponto central.
Como podemos observar na tabela 6, foram obtidos resultados variados e próximos
de teor de carotenoides totais entre os experimentos de 1 a 11. Em que, na triplicata
apresentada pelos pontos centrais foi a que obteve um melhor resultado em sua extração
(72,78 g/g; 81,15 g/g e 79,25 g/g). No entanto, após a avaliação dos coeficientes de
regressão (Tabela 4) com o objetivo de propor um modelo matemático para predizer a
extração de carotenoides totais da casca de pupunha, foi verificado que nenhuma das
variáveis foram significativas nem a 5% (=0.05) e nem a 10% (=0.10). Logo, não foi
possível obter respostas para a otimização.
11
Tabela 4. Coeficientes de regressão do modelo linear predito para a extração de
carotenoides da casca de pupunha.
Carotenoides totais
Média 50,09*
X1 (L) -2,92
X2 (L) 0,26
X3 (L) 2,60
X1X2 2,48
X1X3 -3,65
X2X3 1,27
X1 = acetato de etila em acetona (%), X2 = razão
sólido-líquido, X3 = tempo de agitação magnética
(min). X1X2, X1X3, e X2X3 são interações entre as três
variáveis. (L): linear. *Estatisticamente significante
(p<0.05).
Tal fato pode ser atribuído a erros experimentais durante a realização do
procedimento de extração e/ou a falta de homogeneidade detectada na casca utilizada no
planejamento. Os supostos erros serão corrigidos e o planejamento experimental será
repetido para garantir maior precisão dos resultados.
6. PUBLICAÇÕES
Durante o período de realização do estágio de iniciação científica, o discente
participou na elaboração de dois capítulos de livro, que se encontram em fase final de
correção, e serão publicados pelo Ministério do Meio Ambiente (MMA) na série de
publicações intituladas “Espécies Nativas da Flora Brasileira de Valor Econômico Atual ou
Potencial – Plantas para o futuro – região Norte”. Os dois capítulos são:
Brenda de Nazaré Do Carmo Brito, Mayara Galvão Martins, Kevin Albert Noronha
Matos, Danielle Praia Lima, Renan Campos Chisté. Mauritia flexuosa – Buriti.
Espécies Nativas da Flora Brasileira de Valor Econômico Atual ou Potencial – Plantas
para o futuro – região Norte. (em fase final de correção)
12
Mayara Galvão Martins, Brenda de Nazaré Do Carmo Brito, Danielle Praia Lima,
Kevin Albert Noronha Matos, Renan Campos Chiste. Astrocaryum vulgare &
Astrocaryum aculeatum- Tucumã. Espécies Nativas da Flora Brasileira de Valor
Econômico Atual ou Potencial – Plantas para o futuro – região Norte. (em fase final
de correção)
7. ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES
Nos próximos meses, as atividades a serem desenvolvidas serão:
Otimização da extração de carotenoides da casca de pupunha: no decorrer da
etapa, após a avaliação dos coeficientes de regressão foi verificado que nenhuma das
variáveis foram significativas, por isso a otimização não obteve respostas. Por este motivo,
o planejamento experimental será repetido com intuito de corrigir os supostos erros
encontrados na otimização e assim ser obtida a validação da condição ótima.
Isolamento e cristalização do b-caroteno: o extrato rico em carotenoides será
dissolvido em diclorometano/etanol (1:4) a temperatura de 50-60 ºC, colocado em banho
de gelo para abaixamento gradual da temperatura e em seguida levado ao freezer por uma
noite para a formação dos cristais de b-caroteno. Os cristais serão filtrados (ou
centrifugados), lavados com etanol gelado, e secos em estufa a vácuo à temperatura
ambiente (NUNES & MERCADANTE, 2004). O procedimento de cristalização poderá ser
realizado mais de uma vez para obtenção de cristais com maior teor de pureza (> 95%). O
grau de pureza dos cristais será determinado por HPLC-DAD (CHISTÉ & MERCADANTE;
2012) e o rendimento total do processo será calculado.
Avaliação da estabilidade dos cristais sob condições de congelamento: o teor
de b-caroteno será monitorado durante o período de armazenamento sob congelamento (-
20 ºC) por HPLC-DAD (CHISTÉ & MERCADANTE; 2012), com a finalidade de avaliar a
cinética de degradação e o tempo de meia-vida dos cristais de b-caroteno obtido.
8. CONCLUSÃO PARCIAL
O fruto da pupunha é muito rico em óleo e nutrientes como, proteínas, vitaminas e
ferro. Nele, está presente uma grande quantidade de teor de carotenoides (β-caroteno)
com uma elevada atividade de vitamina A.
Contudo, podemos concluir que na realização da determinação de carotenoides
totais, a casca do fruto em relação a sua polpa foi a que obteve o maior teor de
13
carotenoides. Além disso, de acordo com a analise realizada no HPLC-DAD com o intuito
de confirmar a identidade do carotenoide presente na casca da pupunha, concluiu que o
seu carotenoide majoritário é o β- caroteno.
É importante ressaltar que no procedimento de otimização, após a avaliação dos
coeficientes de regressão não foi possível obter nenhuma variável significativa tanto no
ponto de significância de 5% (α=0,05) quanto no ponto de 10% (α=0,10), por apresentar
supostos erros detectados durante a realização das analises. Por tanto, por este motivo o
planejamento será repetido com o objetivo de corrigir determinados erros e assim alcançar
uma maior e melhor precisão entre os resultados.
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
CARVALHO, A. V.; BECKMAN, J. C.; DE MACIEL, R. A.; DE NETO, J. T. F. Caracteristicas Fisicas e Quimicas de frutos de pupunheira no estado do Pará. Ver. Bras. Frutic.35v, n.3, p. 763-768; Jaboticabal- SP, 2013.
CHISTÉ, R.C.; MERCADANTE, A.Z. Identification and Quantification, by HPLC-DAD-MS/MS, of Carotenoids and Phenolic Compounds from the Amazonian Fruit Caryocar villosum. J. Agric. Food Chem. 60, 5884−5892, 2012.
DE ROSSO, V. V.; MERCADANTE, A. Z. Identification and quantification of carotenoids, by HPLC-PDA-MS/MS, from Amazonian Fruits. J. Agric. Food Chem. 55, 5062- 5072, 2007.
FERREIRA, C. D.; PENA, R. S. Comportamento Higroscópico da Farinha de Pupunha (Bactris gasipaes). Cienc. Tecnol. Aliment.- Campinas; 23(2): 251-255, maio- agosto; 2003.
MELÉNDEZ-MARTINEZ, A.J.; BRITTON, G.; VICARIO, I.M.; HEREDIA, F.J. Relationship between the colour and the chemical structure of carotenoid pigments. Food Chemistry, 101, 1145-1150, 2007.
NOGUEIRA, O. L.; CALZAVARA, B. B. G.; MÜLLER, C. H.; CARVALHO, C. J. R.; GALVÃO, E. U. P.; SILVA, H. M.; RODRIGUES, J. E. L. F.; CARVALHO, J. E.; OLIVEIRA, M. S. P.; NETO, O. G. R.; NASCIMENTO, W. M. O. et. al. A cultura da pupunha/Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro de Pesquisa Agroflorestal da Amazônia Oriental. Brasília: EMBRAPA- SPI, 50p. (coleção plantar, 25.), 1995.
OLIVEIRA, J. B. Perfil de carotenoides em frutos nativos do cerrado. 2014. Trabalho de Conclusão de Curso (TCC); Universidade Federal de São João del-Rei; Sete Lagoas, 2014.
PEREIRA, F. K. D.; FACCIO, M. T.; DUTRA, L. M. G.; LINHARES, N. P.; SILVA, P. S. G. et. al. Extração líquido-líquido do β-caroteno e licopeno da polpa do tomate e analise por CCD (cromatografia de camada delgada). Encontro Nacional de Educação, Ciência e Tecnologia/ UEPB, Paraíba; 10p., 2017.
RAMOS, M. I. L. Polpa de Bocaiúva [ Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd.]: composição química e biodisponibilidade de carotenoides. 2007. Tese (Pós- graduação); Universidade Federal de Goiás e Universidade Federal do Mato Grosso do Sul; Distrito Federal, 2007.
RODRIGUES-AMAYA, D. B.; KIMURA M.; AMAYA-FARFAN, J. et. al. Fontes brasileiras de carotenoides: tabela brasileira de composição de carotenoides em alimentos. Brasília: MMA/SBF, 100 p., 2008.
14
VERONEZI, C. M. Carotenoides em Aboboras. 2011. 29v. dissertação (Mestrado); Universidade Estadual Paulista (UNESP); São José do Rio Preto- SP, 2011.
10. DIFICULDADES ENCONTRADAS
As dificuldades encontradas durante a realização do projeto neste primeiro período
foram relacionadas ao atraso na entrega dos reagentes necessários para a extração de
carotenoides, a recorrente falta de energia no prédio do Laboratório de Ciência e
Tecnologia de Alimentos da UFPA, e a indisponibilidade de equipamentos para uso no
laboratório devido ao grande fluxo de utilização dos equipamentos existentes.
11. PARECER DO ORIENTADOR: A discente vem apresentando um bom
amadurecimento técnico-científico durante a execução do trabalho experimental, e também
na redação dos dados obtidos, além de apresentar excelentes características de
convivência e trabalho em equipe. Além disso, demonstra preocupação e responsabilidade
com o andamento e finalização do projeto. Dessa forma, meu parecer é favorável à
continuidade da bolsista até o final do prazo.
DATA: 24/02/2017
_________________________________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR
____________________________________________ ASSINATURA DO ALUNO