UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC – CCNH

FELIPE SILVA DE ALCÂNTARA FERNANDO HENRIQUE GOMES ZUCATELLI

GUSTAVO PASSOS MEDROS LEANDRO PEREIRA DOS SANTOS

THIAGO RODRIGUES BRITO

RELATÓRIO DE TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS – TURMA A1 EXPERIÊNCIA 6 – CINÉTICA ENZIMÁTICA

SANTO ANDRÉ

ABRIL / 2010

Sumário

1. OBJETIVOS.......................................................................................................................2 2. METODOLOGIA...............................................................................................................2

2.1. Materiais .....................................................................................................................2 2.2. Métodos ......................................................................................................................2

2.2.1. Parte 1: Avaliação da Atividade Enzimática ......................................................2 2.2.2. Parte 2: Efeito da Concentração de Substrato ....................................................3 2.2.3. Parte 3: Efeito da Temperatura...........................................................................3 2.2.4. Parte 4: Efeito do pH ..........................................................................................4

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................4 3.1. Parte 1: Avaliação da Atividade Enzimática ..............................................................4 3.2. Parte 2: Efeito da Concentração de Substrato ............................................................4 3.3. Parte 3: Efeito da Temperatura...................................................................................6 3.4. Parte 4: Efeito do pH ..................................................................................................9

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................11

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1. OBJETIVOS

O objetivo deste experimento é estudar a influência de fatores como

temperatura, .pH e concentração de substrato na atividade enzimática, no caso da

amilas salivar atuando sobre na quebra do amido.

2. METODOLOGIA

2.1. Materiais

• Erlenmeyer 150 ml.

• Gaze.

• Tubos de ensaio e estante.

• Banho-maria (~37°C)

• Banho de aquecimento fervente (~ 100ºC).

• Banho de gelo (~4°C);

• Pipetas.

• Conta-gotas.

• Lugol.

• Solução de amido 1,0 % (m/v).

• Água destilada.

• Soluções de tampão fosfato 1,0 mol/L com diferentes pH’s

2.2. Métodos

Um voluntário mastigou um pedaço de filme plástico de laboratório (Parafilm)

por aproximadamente 1 minuto e sua saliva foi coletada em um recipiente.

A amostra de saliva foi filtrada em gaze e mantida no gelo.

2.2.1. Parte 1: Avaliação da Atividade Enzimática

Foram adicionados 20 mL de solução de amido 1% fervida em um erlenmeyer

de 125 mL, a amostra foi incubada a 37ºC por 3 minutos. Em seguida, adicionou-se

0,3 mL da saliva filtrada e a solução foi homogeneizada gentilmente.

Retirou-se 1,0 mL da solução e o adicionou a um tubo de ensaio (Tubo 0), o

tubo foi colocado no banho fervente e em seguida resfriado no gelo. Este processo

foi repetido para os tubos de 1 a 7 em intervalos regulares de 3 minutos.

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Para controle, foram feitos um tubo B (“branco”) com 1,0 mL de água destilada

no lugar do amido e um tubo de controle negativo com amido sem adição de saliva.

Adicionou-se uma gota de lugol em todos os tubos e observadas as diferenças

nas intensidades de coloração obtidas.

2.2.2. Parte 2: Efeito da Concentração de Substrato

Sete tubos de ensaio foram numerados e adicionou-se neles a solução de

amido 1% fervida e a água destilada sendo os volumes adicionados a cada tubo

conforme Tabela 1.

Os tubos foram colocados em banho-maria 37ºC por 3 minutos. Em seguida,

adicionou-se 0,05 mL de saliva filtrada em cada tubo em intervalos regulares de

tempo de 15 segundos. Após 3 minutos da adição de saliva a cada tubo, o

respectivo tubo foi retirado do banho-maria e mergulhado em banho de água

fervente e resfriado logo em seguida.

Após a retirada de todos os tubos, adicionou-se uma gota de lugol em cada

tubo. Para a leitura, adicionou-se 0,9 mL de água destilada na cubeta e 0,1 mL da

amostra, e foram determinadas as absorbâncias no comprimento de onde de 660

nm.

Tabela 1 – Volume de amido e água nos tubos para teste de concentração de substrato.

Tubo Amido 1% (mL) H2O (mL) 1 0,0 3,2 2 0,2 3,0 3 0,4 2,8 4 0,6 2,6 5 1,0 2,2 6 2,0 1,2 7 3,2 0,0

2.2.3. Parte 3: Efeito da Temperatura

Em três tubos de ensaio foram adicionados 1,0 mL de solução de amido 1,0%

Um primeiro tubo foi colocado a 37ºC, o segundo no gelo e o terceiro em água

fervente por três minutos para atingirem o equilíbrio térmico.

Adicionou-se 0,05 mL de saliva filtrada em cada tubo e aguardados 3 minutos.

Em seguida foi feito o teste da hidrólise do amido pela adição de uma gota de lugol.

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2.2.4. Parte 4: Efeito do pH

Foram adicionados 2,0 mL de solução de amido 1,0 % fervida em três tubos de

ensaio, em seguida adicionou-se 1,0 mL de tampão fosfato 1,0 mol/L com diferentes

pH’s conforme Tabela 2.

Tabela 2 – pH da solução tampão de fosfato 1,0 mol/L em cada um dos tubos testados.

Tubo pH do tampão 1 2,0 2 7,0 3 12,0

Os tubos foram colocados no banho a 37°C por 3 minutos. Em seguida

adicionou-se 0,05 mL de saliva filtrada em cada tubo. Após 3 minutos, os tubos

foram colocados em banho fervente, resfriados, e adicionou-se uma gota de lugol

para analisar os resultados.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Parte 1: Avaliação da Atividade Enzimática

Não realizado por escassez temporal.

3.2. Parte 2: Efeito da Concentração de Substrato

Observa-se que apartir do primeiro tubo à esquerda até o último tubo há um

degrade da coloração, isto é, partindo do primeiro tubo, que contém apenas água,

tem-se uma solução transparente e no último tubo, que contém solução 1% de

amido um tom mais intenso de azul.

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Figura 1 – Tubos do estudo do efeito da concentração de substrato após aquecer e imediatamente

após adição de lugol , da esquerda para a direita (Tubo 1 � ... � 6) O tubo 7 (não visível na foto)

encontra-se atrás do 6.

Como o tubo número 7 ficou encoberto, pode-se analisar a figura 2:

Figura 2 – Tubos do estudo do efeito da concentração de substrato com adição do lugol sem aquecer,

da esquerda para a direita (Tubo 7 � ... � 1).

Tal fato se deve à reação que ocorre entre o amido e o lugol, do qual obtêm-

se uma solução de coloração azul. Deste modo, conclui-se que durante o

experimento não houve reação entre o amido e a saliva, nessa reação esperava-se

que houvesse a degradação do amido formando, entre outros monossacarídeos, a

glicose, o que mudaria a coloração da solução, que passaria para um degrade em

tons de vermelho e violeta, o qual dependeria do grau de hidrólise ocorrido.

Essa reação pode não ter ocorrido pela desnaturação das enzimas presentes

na saliva, que ocorre quando a amostra é submetida a altas temperaturas. Outro

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problema que pode ter afetado o bom andamento do experimento é o tempo em que

as amostras foram submetidas à temperatura ótima, tendo em vista que a amostra

de saliva foi armazenada em uma temperatura próxima de 4°C e que sua atividade

ocorre enquanto está submetida à uma temperatura próxima a 37°C, temos que se a

amostra for resfriada antes que sua atividade enzimática seja retomada, não se têm

a degradação do amido e, portanto, têm-se apenas a reação entre amido e lugol

ocorridas nos tubos. É importante notar que a coloração não foi tão fácil de

distinguir, o que pode ter sido causado por estes pequenos erros, mas, teórica e

intuitivamente pode-se observar a tendência na coloração.

Foram retiradas amostras de cada tubo de ensaio e estas foram analisadas

no espectrofotômetro, o qual registrou valores contidos na Tabela 3:

Tabela 3 – Absorbância no teste de concentração de substrato.

Tubo Sem aquecer A 660nm Aquecido A 660nm 1 Branco (referência) Branco (referência) 2 0,40 0,01 3 0,34 0,00 4 0,69 0,11 5 0,44 0,09 6 1,20 0,03 7 0,91 0,18

A absorbância, registrada na tabela, é, basicamente, a taxa de absorção das

partículas existentes na solução, ou seja, o quanto a amostra absorve de luz.

Olhando para a tabela é difícil de distinguir um tendência lógica de

comportamento das amostras, entretanto, olhando de uma maneira grosseira e geral

nota-se que a absorbância tende a aumentar, em ambas as amostras, de acordo

com cada tubo

.

3.3. Parte 3: Efeito da Temperatura

A figura 3 mostra as diferentes colorações das soluções, todas com um aspecto

amarelado, entretanto isso não era o esperado.

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Figura 1 – Tubos para estudo do efeito da temperatura (Tubo 3 � Tubo 2 � Tubo 1), após serem

aquecido e com a gota de lugol.

O esperado seria uma coloração azul para os tubos 2 e 3, e uma coloração

avermelhada, para o tubo 1. Tais mudanças nas colorações justificam-se devido às

enzimas serem proteínas globulares, sendo sensíveis ao calor e podendo

desnaturar-se se a temperatura é elevada além da temperatura ótima, ou perderem

sua capacidade catalítica se a temperatura é baixa.

Devido à presença de muitos grânulos (regiões de elevada concentração de

amido) na solução, os resultados obtidos nesta parte do experimento foram

distorcidos e os resultados esperados não foram obtidos uma vez que cada solução

pode ter sido medida com uma concentração de amido diferente na solução, devido

a quantidade de grânulos que pode ter sido colocada em cada tubo. A figura 4

mostra como é de fato um deposito de amido (regiões avermelhadas) e seus

grânulos (pontos pretos) na parte interna.

Figura 4 – Estrutura das Moléculas de Amido. [2]

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No tubo 2 à temperatura de 0°C a coloração azul que seria esperada esta

relacionada com a baixa temperatura imposta no sistema, tal temperatura impede a

atividade da enzima sobre o amido, assim o amido não é degradado e reage com a

solução de lugol gerando a cor azul . No tubo 1, a temperatura de 37°C favorece a

atividade enzimática tal temperatura, a coloração avermelhada é devido a reação do

lugol com componentes gerados pela degradação do amido, no caso a reação que

ocorre é a do lugol com a amilopectina que produz uma coloração vermelha.. No

tubo 3 a temperatura de 100° C, a coloração azul esperada é explicada devido a alta

temperatura acarretar na desnaturação da amilase salivar, diminuindo a sua

atividade catalítica, desse modo o amido não sofre degradação fato constatado pela

reação do amido com a solução de lugol, dando um complexo de cor azul.

Desconsiderando o problema com os grânulos de amido, os resultados

esperados para cada uma das três temperaturas utilizadas esta parte do

experimento são os seguintes: com temperaturas muito baixas, a enzima catalisa

reações usando uma energia menor que o necessário sem a enzima exercendo

suas funções de forma muito menos eficaz do que naturalmente, já em temperaturas

elevadas a taxa de uma reação catalisada pelas enzimas aumenta porem, sob

temperaturas mais altas as enzimas são inativadas, pois nestas condições as

moléculas enzimáticas vibram e se torcem tão rapidamente que algumas de suas

ligações se rompem. Quando a temperatura alta altera a estrutura terciária, as

enzimas se tornam desnaturadas e perdem sua função, enquanto na temperatura

ambiente as enzimas exibem atividade maior do que em ambos os casos. Muitas

vezes isso está relacionado com a manutenção das atividades do metabolismo. [2]

De fato cada enzima pode ter seu próprio ponto ótimo (temperatura de

atividade máxima de uma enzima) dependendo de suas funções, características e

meio onde atuam. [2]

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3.4. Parte 4: Efeito do pH

O pH das soluções pode fazer com que os grupos ionizáveis das enzimas

tenham carga eletrica positiva, negativa ou neutra em relação ao meio. Como a

conformação da molécula se deve parcialmente as suas cargas, em certo pH a

conformação é a melhor que a molécula pode admitir, sendo chamado o pH otimo,

que pode ser observado pelo pico de atividade enzimática na figura 5. Porém o

mesmo também pode ser causador de sua desnaturação dependendo da

conformação da molécula.

Figura 5: Fonte: http://www.danaquimica.com.br/dana_alfa.html

As amostras pode ser vistas na figura 6:

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Figura 6 – Tubos para estudo do efeito do pH (Tubo 3 � Tubo 2 � Tubo 1) após aquecidos, com

saliva, fervidos e com a gota de lugol.

Esperava-se na parte 4 do experimento que o tubo de ensaio mais escuro

fosse o numero 2, de pH = 7. por ser o pH ideal (Vilela, A. L.M . O SISTEMA

DIGESTÓRIO.[3]), a enzima reagiu mais com o amido e produziu menos complexo

com o lugol, por isso a cor arroxeada. Já no tubo 1, o pH não era tão favorável a

reação da enzima com o amido, fazendo com que o amido que não reagiu formasse

o complexo com o lugol formando uma cor azul escuro. O tubo 1 ficou transparente

pois o lugol não forma complexos com amido em meios de pH muito elevado.

O pH, bem como as análises de coloração para cada tubo estão expressas na

Tabela 4:

Tabela 4 – Resultado do teste de pH da solução tampão de fosfato 1,0 mol/L.

Tubo pH do tampão Resultado 1 2,0 Azul escuro 2 7,0 Azul escuro / roxo 3 12,0 Transparente

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4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica,

4.ed. New York: Worth Publishers, 2006.

[2] Sadava, David; Heller, H. Craig; Orians, Gordon H. - Vida - A Ciência da

Biologia - Vol I - Célula e Hereditariedade, 8ª Ed. Artmed

[3]Disponível em <http://www.afh.bio.br/digest/digest1.asp>. Acesso em 27/04/2010