RELATÓRIO TÉCNICO FINAL

DOUTORADO SANDUÍCHE NO EXTERIOR – PROGRAMA CAPES/PrInt

Processo - 88887.335852/2019-00

Edital nº 41/2017

Nanopartículas redox-responsivas de copolímero em bloco à base de açúcares para aplicação na terapia fotodinâmica

Bolsista: Patrícia Regina Ebani

Orientador no Brasil: Prof. Dr. Marcos Antonio Villetti

Orientador no exterior: Prof. Dr. Redouane Borsali

LOCAL DE EXECUÇÃO DO PROJETO: Université Grenoble Alpes - UGA

Centre de Recherches sur les Macromolécules Végétales - CERMAV

Gières – France

Santa Maria, 30 de julho de 2020

1. Introdução e Objetivos

A fototerapia, incluindo a terapia fotodinâmica (TFD) e a terapia

fototérmica (TFT), é uma abordagem minimamente invasiva e clinicamente

aprovada para a terapia do câncer devido à sua elevada eficiência terapêutica

e efeitos secundários mínimos (ZHU, CHENG, CHEN, & PU, 2018). Enquanto a

TFT converte a energia do fóton em calor para danificar células nocivas, a TFD

envolve a excitação de espécies químicas fotossensibilizadoras a partir de

radiação de na região do visível para produzir espécies reativas e citotóxicas

de oxigênio, como o oxigênio singleto (1O2), que têm um tempo de meia vida

curto em sistemas biológicos e, consequentemente, um raio de ação inferior a

0,02 µm (JOHANM & KRISTIAN, 1991). Entre os fotossensibilizadores mais

utilizados na TFD, a ftalocianina (Fc) e os seus derivados, como o

fotossensibilizador de segunda geração ftalocianina de zinco (II) (ZnFc),

atraíram a atenção porque apresentam uma forte absorção na região espectral

entre 600 e 800 nm, região suficientemente energética para gerar 1O2 e

frequentemente conhecida como janela ótica do tecido devido à elevada

penetração pela pele, podendo chegar à 10 mm de profundidade (AGOSTINIS

et al., 2011; LO, SALOME, PANDEY, & NG, 2019). As aplicações terapêuticas

das Fc's geralmente são limitadas pela agregação e biodisponibilidade

reduzida, decorrentes da baixa solubilidade em meios biológico-aquosos. Para

contornar estes problemas, novas estratégias, principalmente em sistemas de

administração medicamentosa, vêm sendo relatadas para melhorar a

solubilidade das Fc's (DUMOULIN, DURMUS, AHSEN, & NYOKONG, 2010).

Sistemas nanoestruturados como as nanopartículas poliméricas (NP’s) ou

nanocarreadores (NC’s) têm o potencial de aumentar solubilidade, a

biodisponibilidade e a estabilidade dos compostos porfirínicos em meios

biológicos. Além disso, promovem uma liberação controlada e seletiva nos

tecidos-alvos (JIA & JIA, 2012). Neste contexto, as nanoestruturas auto-

organizadas (tipicamente micelas esféricas e vesículas) de copolímeros em

bloco (CPB), constituídos de um bloco de polímero hidrofóbico sintético

covalentemente ligado a um bloco de oligossacarídeo hidrofílico (BORSALI &

HALILA, 2014; CALDAS et al., 2020; MAZZARINO et al., 2015; MODOLON,

OTSUKA, MINATTI, BORSALI, & HALILA, 2012) que respondem a estímulos

externos e apresentam uma estrutura linear simples e um design sintético

versátil, são uma classe atraente para o encapsulamento de fármacos como a

ZnFc para o tratamento do câncer (THAMBI & LEE, 2019). As NP’s de

copolímeros em bloco apresentam propriedades únicas tais como i) baixa

concentração crítica de agregação, que permite que estas NP’s sejam retidas

por mais tempo na corrente sanguínea; ii) promovem a encapsulação de

fármacos hidrofóbicos e/ou hidrofílicos; iii) apresentam morfologia e tamanho

controlados, dependentes da estrutura do CPB; iv) são redox-responsivos, pois

apresentam um controle espacial e temporal da ativação e liberação de droga,

a partir de estímulos exógenos ou endógenos, tais como, pH, temperatura, luz,

ambiente redox, enzimas, etc.

Frequentemente para a síntese de CPB’s à base de açúcares utilizam-se

reações do tipo “click” com o emprego de cobre como catalisador. Contudo,

neste trabalho propomos uma nova rota de síntese do copolímero

maltoheptaose-b-poliestireno (MH-b-PS), sem resíduos metálicos, seguindo

recomendações de química verde. O CPB é composto de uma unidade de

maltoheptaose (MH), que é um glucano linear solúvel em água,

covalentemente ligada ao poliestireno (PS) através de um ligador redox-

responsivo clivável. O copolímero MH-b-PS permite a formação de

gliconanopartículas (GNP’s) micelares que respondem a estímulos oxidantes,

como a N-bromosuccinimida - NBS, ou redutores, como a Glutationa -

GSH,para a liberação do fármaco. As NP’s contendo um bloco de PS e um

bloco hidrofílico como polietilenoglicol ou açúcares, são conhecidas por serem

seguras e biocompatíveis (LOOS et al., 2014.; MOLUGU et al., 2006;

SUNASEE et al., 2014) mesmo tendo um dos blocos sintéticos.

2. Seção experimental

2.1 Procedimento geral da síntese do CPB à base de açúcares

A síntese descrita baseia-se em dois procedimentos essenciais, ou seja,

a funcionalização orgânica dos polímeros hidrofóbicos e hidrofílicos e o

acoplamento de ambos via reação “click”, Figura 1A e B.

2.3 Encapsulação do ZnPc

Figura 1. Esquema reacional de síntese do (A) blocos hidrofóbico (acima) e hidrofílico

(abaixo); (B) copolímero em bloco MH-b-PS e (C) Reação e produtos esperados após

clivagem com agente redutor ou oxidante.

Ácido3-eimil)propanóico

Rendimento: 85% (1) PS-bromomaleimida Poliestireno-OH

NaCNBH3, 65° 2 h

2-amino-N-(2-mercaptoetil) benzamida

(2) Maltoheptaose-SH Rendimento: 100%

Maltoheptaose

B

(1)

(2)

Rendimento: 90% (3) MH-b-PS

(1) + 2-amino-N-(2-mercaptoetil) benzamida

(1) + 2-amino-N-(2-mercaptoetil) benzamida

+ NBS (H2O, TFA 0,1%)

+ GSH (H2O, 37°C)

(3)

(4)Pentose

Maltoheptaose (1)-maleimida

A

MH-b-PS (sólido preto)

Thiol-Bromomaleimide Reação “Click”

C

DCC, DMAP em DCM, 25°C, 16h

Síntese do poliestireno com terminação bromaleimida (PS-Malei): 1 g (0,2

mmol) de (PS-OH, MW=5000) foi dissolvido em DCM (10 mL) seguido pela

adição de ácido 3-(bromaleimil)propanóico (2 mmol) e uma quantidade

catalítica de DMAP (0,1 mmol). A solução foi resfriada até 0oC e adicionou-se

DCC (2 mmol). A mistura foi agitada durante 1 h e depois aquecida e deixada à

25ºC durante 16 h. Após a remoção do precipitado branco, o filtrado foi

concentrado e o produto esperado (PS-Malei) foi obtido por precipitação em

metanol frio (rendimento=85%).

Síntese da maltoheptaose com terminação redutora de tiol-

funcionalizado(MH-SH): Maltoheptaose (115 mg, 0,1 mmol), (1 mmol) e

NaCNBH3 (188 mg, 3 mmol) foram dissolvidos em 3 mL de uma mistura de

DMSO/AcOH (7/3 v/v). Foi adicionado DL-dithiothreitol (1 mmol) para evitar a

oxidação. A mistura foi agitada a 65°C durante 1 h. A conversão foi verificada

por cromatografia em camada delgada (TLC) (ACN/H2O 3/1 v/v). Após reação

completa, o produto bruto foi obtido por precipitação em ACN, e centrifugado a

9500 rpm. Após 3 lavagens, o produto MH-SH foi obtido como um sólido

branco após liofilização.

Reação de acoplamento para a obtenção do copolímero em bloco à base

de açúcar (MH-b-PS): PS-Malei (0,13 mmol, 680 mg) e MH-SH (0,156 mmol,

208 mg) foram dissolvidos em 5 mL de DMF sob argônio (Ar). Depois de

adicionar N,N-diisopropililamina (0,13 mmol, 16,6 mg) à solução, a mistura foi

agitada à 25°C durante 3 h. A solução apresenta uma cor castanha escura

instantaneamente. O copolímero dibloco foi então obtido por precipitação com

MeOH/H2O (8/2 v/v), filtração e lavagem com a mesma mistura de solvente. O

sólido foi finalmente seco sob vácuo para produzir o correspondente MH-b-PS

como um sólido preto. Os produtos obtidos foram caracterizados por RMN 1H,

MS, MALDI-TOF MS, UV Vis, fluorescência e GPC e podem ser encontrados

no apêndice.

2.2 Preparação das nanopartículas

Inicialmente, uma quantidade bem definida de MH-b-PS (1 ou 3 mg) foi

dissolvida em 1,0 g de uma mistura de solventes [THF/água 4,5:1 (m/m)] e

agitados durante 2 h a 500 rpm. Em seguida, as NP’s foram preparadas

seguindo dois métodos diferentes. Método A (nanoprecipitação padrão): 1 g da

solução de CPB foi lentamente adicionada gota a gota a 40 g de água destilada

usando uma pipeta de Pasteur durante 15 s sob agitação magnética (500 rpm).

Método B (nanoprecipitação inversa): 40 g de água destilada foram lentamente

adicionadas a 1 g de solução de CPB usando uma pipeta de Pasteur durante

10 min sob agitação. Subsequentemente, as suspensões obtidas pelos dois

métodos, A e B, foram agitadas durante 1,5 h em temperatura ambiente. Os

filtrados foram concentrados até 4 g por evaporação sob pressão reduzida à

35ºC. O esquema simplificado de preparação das GNP@ZnFc está

apresentado na Figura 2.

Figura 2. Ilustração esquemática do procedimento de auto-organização do MH-b-PS

pelos métodos A e B.

A encapsulação do fármaco foi realizada através da nanoprecipitação do MH-b-

PS (método B) na presença da ZnFc. Primeiramente, 1 ou 3 mg de MH-b-PS

foram dissolvidos em 1 g de uma mistura de solventes [THF/água 4,5:1 (m/m)]

e deixados em agitação magnética durante 2 h à 500 rpm. Após, 1 g de

solução de ZnFc 0,025 mM (em THF) foi adicionado a um frasco contendo a

solução copolimérica e a mistura foi agitada por 30 min. Após, 40 g de água

destilada foram lentamente adicionadas à esta solução e a suspensão foi

Suspensão Coloidal

Poliestireno Maltoheptaose Solução de MH-b-PS

agitada durante 2 h e filtrada através de um filtro de politetrafluoretileno (PTFE)

hidrofílico com tamanho de poro 0,45 μm. O filtrado foi concentrados até 4 g

por evaporação sob pressão reduzida à 35ºC.

2.3 Caracterização físico-química das nanopartículas

As NP’s sintetizadas foram caracterizadas por espalhamento de luz

dinâmico (DLS), nanotracking analysis (NTA), microscopias eletrônicas de

varredura (MEV) e de transmissão (MET), e espectroscopia na região do visível

(UV Vis).

2.4 Quantificação do conteúdo de fármaco encapsulado

A eficiência de encapsulamento (EE) e o conteúdo total do fármaco (CT)

foram estimados após a determinação da concentração de ZnFc nas

suspensões de NP’s por cromatografia líquida de alta performance (HPLC), de

acordo com o método descrito por Teixeira e colaboradores (TEIXEIRA et al.,

2011). Foi utilizando um instrumento Ultimate 3000 (Thermofischer) com uma

temperatura controlada de 30ºC. A coluna analítica utilizada foi a Nucleodur

100-5 C18 (Macherey-Nagel) com uma pré-coluna. A fase móvel consiste numa

mistura de metanol/acetona/dimetilformamida (90:5:15, v/v/v) bombeada a 1

mL.min-1. As concentração de ZnFc em THF utilizadas para a curva de

calibração foram de 0,001; 0,005; 0,01; 0,025; 0,04; 0,05; 0,075 e 0,1 mM e o

volume da injeção foi de 30 µL. O eluente da coluna foi monitorado com um

detector UV-Vis no comprimento de onda de 342, 602, 637 e 675 nm

(apêndice, Figs 19 e 20). A EE% foi estimada como sendo a diferença entre a

concentração total de ZnFC ([ZnFc]Total) encontrada nas suspensões de NP’s

após a sua completa dissolução em THF e a concentração de ZnFC

encontrada no filtrado ([ZnFc]Filtrado) (filtro PTFE, 0,45 µM) após secagem sob

vácuo e solubilizado em THF, Equação 1. O CT foi estimado comparando-se a

[ZnFc]Total encontrada nas suspensões coloidais com a [ZnFc] adicionada às

formulações no momento da síntese, Equação 2.

Eficiência de Encapsulamento (EE%): 100 − ((ZnFcTotal − ZnFcFiltrado

ZnFcTotal) ∗ 100)

Conteúdo Total do fármaco (CT%) = 100 − ((ZnFcadicionado − ZnFcTotal

ZnFcAdicionado) ∗ 100)

3. Resultados

3.1 Obtenção e caracterização do copolímero em bloco

A partir dos resultados de RMN 1H, espectrometria de massas, GPC e

outras técnicas, a síntese dos intermediários e do CPB foi alcançada com

sucesso. O gráfico de RMN DE 1H do CPB está mostrado na Figura 3A, onde

podemos identificar os dois blocos presentes (MH e PS). Pela análise do RMN

1H do bloco hidrofílico funcionalizado, MH-SH (Figura 2 do apêndice), podemos

constatar a presença dos picos característicos da maltoheptaose (entre 3,5 e

4,5 ppm), bem como os picos que surgem após a funcionalização com a

benzamida (entre 6,5 e 7,5 ppm para hidrogênios presentes no anel aromático

e entre 2,5 e 3,5 ppm para os hidrogênios metilênicos vizinhos ao grupamento

tiol final).

Figura 3. (A) RMN 1H do CPB e (B) espectro de fluorescência (emissão) dos blocos

funcionalizados e do CPB sobrepostos.

(1)

(2)

A) B)

Em relação ao bloco hidrofóbico, os espectros de RMN 1H (Figura 3 do

Apêndice) indicam os picos característicos do PS-Malei (entre 1 e 2,5 ppm os

hidrogênios metínicos e metilenicos da cadeia linear terminal do PS e entre 6,5

e 7 os hidrogênios do anel aromático), bem como os picos originários da

funcionalização com a bromomaleimida (entre 3,5 e 4 pm). Dados da RMN 1H

do CPB apresenta características dos blocos constituintes e do acoplamento

realizado pela reação “click”. No espectro de massas do bloco hidrofílico MH-

SH (Figura 1 do Apêndice) verifica-se o pico de 1333 m/z o qual concordam

com análises de GPC. Em relação ao bloco hidrofóbico, PS-Malei, análises de

MALDI-TOF mostram um pico de 5500 m/z, sugerindo uma massa de 5 KDa

dessa unidade, concordando com análises de GPC (Figura 8 do apêndice). O

espectro de fluorescência dos produtos obtidos, Figura 3B, evidencia que

houve a reação de acoplamento devido ao aparecimento de picos em 419 nm

inexistentes no bloco hidrofóbico e um outro em 496 devido a presença do PS

no copolímero em bloco.

3.2 Auto-organização do copolímero redox-responsivo

Mesmo em soluções diluídas, ao dissolver um copolímero anfifílico

haverá uma associação organizada espontânea das cadeias poliméricas em

estruturas com forma, simetria e composição bem definidas. Está bem

estabelecido que os copolímeros em bloco são considerados surfactantes

macromoleculares devido especificamente à esta propriedade, pois após

estarem auto-organizados formam partículas sólidas com uma morfologia

persistente e com isso podem ser analisadas ex situ após secagem por

técnicas de microscopia como, AFM, MEV, MET, etc. No processo de formação

das micelas poliméricas em água, o bloco hidrofílico (MH) é orientado para a

formação do revestimento das NP’s (camada externa) enquanto que o bloco

hidrofóbico, PS, é protegido do ambiente externo formando o núcleo micelar,

que serve como um microambiente ideal para o encapsulamento de agentes

ativos de caráter hidrofóbico, como o ZnFc. O bloco em contato com o

solvente, maltoheptaose, serve como interface estabilizadora entre o núcleo

hidrofóbico e o ambiente externo, aquoso. Para formar estas nanoestruturas foi

utilizado o Método Fessi (Fessi, Puisieux, Devissaguet, Ammoury, & Benita,

1989), que consiste em uma nanoprecipitação (padrão e inversa) do CPB em

NP’s micelares. É importante ressaltar que encontrar uma mistura de solventes

polares e apolares é essencial para a completa dissolução dos CPB’s, pois

para a utilização do método de Fessi é necessário inicialmente a dissolução

completa do copolímero na mistura de solvente, obtendo-se moléculas de

cadeias únicas antes da precipitação no solvente seletivo, por isso análises de

intensidades de luz espalhada de amostras com a mesma quantidade de

polímero em diferentes frações de THF e H2O foram realizadas e os gráficos

referentes podem ser visualizados no apêndice (Figuras 12 e 13). Os

resultados deste experimento revelam que para as duas concentração de

copolímeros utilizadas (1 e 3 mg g-1) a menor intensidade de luz espalhada

ocorreu para a mistura de THF/H2O de 4,5:0,5 (m/m), indicando que nesta

mistura de solvente temos cadeias únicas de copolímeros, ou seja, a melhor

mistura para a completa dissolução do copolímero. Sendo assim, o CPB MH-b-

PS foi inicialmente dissolvido na mistura de THF/H2O (4,5:0,5 (m/m)), e logo

após as NP’s foram formadas a partir da adição de H2O (não-solvente do bloco

PS) ao CPB (Método B) ou do CPB em água (método A). Finalmente, o THF e

o excesso de H2O são removidos durante a concentração da suspensão por

rotoevaporação sob vácuo à 35ºC.

3.3 Caracterização das nanopartículas sem fármaco por

espalhamento de luz

As NP’s formadas em suspensão foram inicialmente caracterizadas por

DLS para verificar a polidispersidade, homogenidade, mas principalmente para

análise do tamanho dos raios hidrodinâmicos em diferentes ângulos de

espalhamento de luz. A Figura 4 mostra a função de autocorrelação (g(2) - 1) e

a distribuição do tempo de relaxamento obtido por nanoprecipitação padrão

(Método A) e nanoprecipitação inversa (Método B), utilizando em ambos a

mesma concentração de copolímero (1 mg.g-1) na fase orgânica.

Figura 4. Função de autocorrelação DLS (g(2) - 1) medida a 30 - 120° e distribuição do tempo de relaxamento das suspensões aquosas de MH-b-PS obtidas pelo (A) método A e (B) método B.

A distribuição do tempo de relaxamento do sistema obtida pelo método A

mostrou um pico ligeiramente alargado com um pequeno pico em tempos de

relaxamento mais elevados para alguns ângulos de espalhamento, enquanto

que a obtida pelo método B mostrou um único pico estreito para todos os

ângulos de espalhamento. Os raios hidrodinâmicos médios (Rh) das NP’s

formadas pelos dois métodos foram calculados a partir do coeficiente de

difusão (D) (utilizando a relação Stokes-Einstein), os quais foram determinados

a partir da inclinação do gráfico das frequência de relaxamento (1/τ) versus o

quadrado do módulo vetorial de onda (q2) (Figura 5). As freqüências de

relaxação foram obtidas pelo “fit” das curvas de autocorrelação utilizando-se o

método CONTIN. Os resultados obtidos indicam que o método mais eficiente

de síntese é o de nanoprecipitação inversa, método B, pois apresenta maior

linearidade entre a frequência de relaxação e o ângulo de espalhamento

medido. Os valores são de Rh obtidos foram 20,4 e 90,8 nm para as

nanopartículas obtidas pelos métodos A e B, respectivamente.

Figura 5. Dependência da frequência de relaxação (1/τ) no módulo vetorial de onda quadrada (q2) das suspensões aquosas de MH-b-PS obtidas pelos métodos (A) A e (B) B.

3.4 Análise de tamanho das nanopartículas sem fármaco a partir

de nanotracking

A distribuição de tamanho analisada utilizando o NTA revelou um amplo

pico entre 5 a 12 nm em relação ao Rh para as NP’s obtidas pelo método A,

Figura 6A, enquanto que para as nanopartículas obtidas pelo método B o

gráfico de distribuição do raio hidrodinâmico das NP’s mostra um pico mais

estreito em 85 nm, Figura 6B. Avaliando os valores obtidos pelo NTA, os raios

médios obtidos foram ligeiramente inferiores aos obtidos pelo DLS, nos dois

métodos de síntese. De acordo com Filipe e colaboradores (FILIPE, HAWE, &

JISKOOT, 2010) esta alteração pode ser explicada porque as distribuições de

tamanho obtidas por DLS consistem em distribuições de massa, enquanto que

as obtidas por NTA são distribuições numéricas.

Figura 6. Distribuição dimensional determinada por medições de NTA das suspensões aquosas de MH-b-PS obtidas pelo (A) método A e (B) método B.

Além disso, as distribuições de tamanho obtidas pelo NTA são de tamanhos

maiores em relação à DLS, devido à elevada contribuição de algumas

partículas de grandes dimensões para a dispersão global.

3.5 Caracterização das nanopartículas sem fármaco a partir de

microscopia

As análises por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de

transmissão (MET) das NP’s sem fármaco (NP em branco) Figura 7 foram

realizadas com o objetivo de confirmar o tamanho médio destas, tal como o

relatado pelas técnicas de DLS e NTA, uma vez que de acordo com a literatura

é aconselhável utilizar diferentes tipos de metodologias para este fim, bem

como analisar a morfologia das NP’s de MH-b-PS. Os resultados indicam

valores médios de diâmetros de 25 e 180 nm para as NP’s sintetizadas a partir

dos métodos A e B, respectivamente. As microscopias foram também

realizadas para verificar a presença de agregados ou outras formas de

instabilidade nas soluções coloidais, como podemos verificar na Figura 7B,

onde as partículas começam a se agregar. A análise foi realizada considerando

um aumento de até 20.000x (método B) e os resultados foram comparados

com os dados obtidos por DLS e NTA. Em ambos os sistemas estudados,

foram obtidas NP’s esféricas, comportamento semelhante foi apresentado por

OTSUKA e colaboradores (OTSUKA et al., 2013) que obtiveram suspensões

esféricas em meios aquosos, a partir de MH-b-PS. NP’s de quitosana e poli-ε-

caprolactona de mesma morfologia também foram obtidas no encapsulamento

da ZnFc (DEPRÁ et al., 2016).

Figura 7. Imagens microscópicas dos sistemas constituídos de CPB’s (nanopartículas

sem o fármaco); (A) e (B) MEV das NPs obtidas pelo método A; (C) e (D) MEV de NPs

obtidas pelo método B; (E) e (F) MET das NPs obtidas pelo método B.

3.6 Caracterização e quantificação de fármaco presente nas

GNP@ZnFc

Os ensaios de encapsulação do fármaco hidrofóbico, ZnFc, também

foram avaliados em duas concentrações de copolímero na fase orgânica (1 e 3

mg.g-1), e evidentemente, foram realizados pelo método B, que apresentou-se

como sendo o melhor para a síntese de NPs sem a inserção do fármaco, como

5µM 30 µM

4µM

5 µM

200 nm

500 nm

A B

C D

E F

já mencionado. A suspensão aquosa resultante foi caracterizada por

espectroscopia UV-Vis, DLS, NTA, e microscopias MEV e MET. De acordo com

os dados extraídos do DLS, Figura 8, e do NTA (Figura 17 do apêndice), a

distribuição de tamanho das partículas apresenta populações com raios

relativamente maiores do que as NP’s obtidas de forma idêntica, entretanto

sem o ZnFc, com valores médios de Rh de 101 nm (Figura 8C).

Figura 8. Função de autocorrelação DLS (g(2)-1) e distribuição do tempo de

relaxamento medidos de 30 - 130° para as GNP@ZnFc constituídas de (A) 1 mg.g-1 de

MH-b-PS (B) 3 mg.g-1 de MH-b-PS;e gráfico da dependência da frequência de

relaxamento (1/τ) no módulo vetorial de onda quadrada (q2) das GNP@ZnFc de (C) 1

mg.g-1 de MH-b-PS (D) 3 mg.g-1 de MH-b-PS.

Para a NP mais concentrada, ou seja, 3 mg.g-1 os valores de Rh’s encontrados

são de 124 e 125 nm para DLS e NTA, respectivamente, (Apêndice, Figura 18)

e com a inserção do ZnFc tornam-se 139 nm (Figura 8D) e 130 nm para NTA,

respectivamente. Os resultados obtidos pelas microscopias, à semelhança dos

resultados de DLS e NTA, também mostram um aumento no Rh médio das

A

B

C D

NP’s quando o fármaco ativo, ZnFc, é encapsulado. As microscopias das

GNP@ZnFc estão apresentadas na Figura 9, e mostram diâmetros médios de

200 e 300 nm (Rh de 100 e 150 nm) para as NP’s obtidas pelo método B nas

duas concentrações de CPB avaliadas.

Figura 9. Imagens microscópicas dos sistemas CPB@ZnFc obtidos pelo

método B; (A) MET CPB 1 mg.g-1 e (B) MEV CPB 1 mg.g-1; (C) MET CPB 3

mg.g-1 e (D) MEV CPB 3 mg.g-1.

A partir de análises de HPLC foi possível quantificar o fármaco presente

nas suspensões e também a eficiência de encapsulamento, ou seja, o quanto

do fármaco inicialmente adicionado na fase de síntese das nanopartículas está

ocupando o núcleo micelar, os resultados estão apresentados na Tabela 1 e

mostram que a nanopartícula mais concentrada tem um percentual de 74% de

CT e 97% de EE, valores considerados relativamente elevados, indicando que

a quantidade de ZnFc carreada pela nanopartículas é suficiente alta para gerar

oxigênio singleto e com isso ser utilizada como fotossensibilizador na terapia

fotodinâmica.

A C

B D

NP – 1 mg.g-1 MH-b-PS

Conteúdo Total de ZnFc (CT) Eficiência de Encapsulação (EE)

I 0,5504 55,04 % I 81,54

II 64,08% II 70,49%

Média 59,92% Média 76,02%

NP – 3 mg.g-1 MH-b-PS

I 70,48% I 97,16%

II 77,56% II 96,13%

Média 74,02% Média 96,64%

4. Conclusão

Nanopartículas copoliméricas redox-responsivas inéditas, com morfologia

esférica, com baixos índices de polidispersão, e sem a utilização de metal

como catalisador na síntese de acoplamento entre os blocos constituintes,

foram preparadas com sucesso através da metodologia de nanoprecipitação

inversa. A auto-organização em água foi um método versátil para encapsular o

fármaco hidrofóbico ZnFc pois a eficiência de encapsulamento nas NP’s foi

suficientemente alta para ser aplicada como fotosensibilizador na TFD. Os

diâmetros dos NP’s carregadas com ZnFc foram aumentados na presença do

fármaco. Análises de DLS indicam NP’s de Rh entre 20,4 e 139 nm,

dependendo do método e da concentração do copolímero utilizada. MEV e

MET forneceram informações sobre morfologia e o NTA foi utilizado como

técnica complementar. Este trabalho teve como proposta utilizar procedimentos

de química verde, baseando-se em NP’s para liberação de fármaco hidrofóbico

em células nocivas, ultrapassando os problemas relacionadas a baixa

solubilidade da ZnFc e da distribuição do fármaco nos organismos. As NP’s

desenvolvidas podem servir como ferramentas auspiciosas para aplicação em

células alvo cancerígenas.

Tabela 1. Valores de EE (%) e de CT (%) das NP’s

calculados a partir de HPLC.

É importante ressaltar que análises de clivagem (oxidativa e redutiva)

mencionadas não foram demonstradas nos resultados, pois devido à pandemia

ocasionada pelo Covid-19, o trabalho não pode ser concluído. Entretanto,

análises preliminares foram realizadas para identificar fatores como

concentração, temperatura, tempo e serão feitas por mim conforme a

disposição do equipamento (DLS) na UFSM, ou no caso contrário, pelos

técnicos do CERMAV, na UGA. Análises de liberação do fármaco e ensaios de

fototerapia serão igualmente feitas na UFSM no laboratório onde trabalho na

UFSM, o laboratório de espectroscopia e polímeros (LEPOL).

5. Referências bibliográficas

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6. Trabalhos Futuros

6.1 Clivagem REDOX – MH-b-PS

A ruptura das ligações que unem os dois blocos no CPB será avaliada

através da adição de agentes oxidantes (NBS) e redutores (GSH) em ambiente

de temperatura controlada e em concentrações intra e extracelular, no caso da

clivagem redutiva.

Clivagem redutiva: Solução aquosa de GSH reduzida (10 µM - 20 mM) será

adicionada à 0,1 mL da suspensão coloidal para dar uma concentração final de

0,1 mg.mL-1 de NP’s. Para verificar a clivagem do CPB utilizando GSH, os

tamanhos das NP’s em função do tempo serão analisados por DLS na

temperatura de 37°C.

Clivagem oxidativa: Uma solução de NBS 15 mM (THF/H2O (4,5:1 (m/m) +

0,1% ácido trifluoroacético) em H2O, será adicionada à 1 mL de dispersão de

NP’s para dar uma concentração final de 2 mg.mL-1. Para verificar a clivagem

do CPB utilizando NBS, os tamanhos das NP’s em função do tempo serão

medidos por DLS na temperatura de 37°C.

6.2 Avaliação da atividade fotodinâmica

Numa experiência típica da fotodegradação DPBF, 1,75 mL de 80 µM de

DPBF em DMSO será misturado com 1,45 mL de DMSO e 0,3 mL de NP’s

contendo ZnFc. Na presença de um fotossensibilizador de substância e

irradiação com laser em 660 nm, o DPBF reage com 1O2, formando um

peróxido instável que se decompõe em 1,2-dibenzoílbenzeno (DBB), Esquema

1. A captura de 1O2 baseia-se na diminuição da absorção no comprimento de

onda máximo do DPBF, especificamente 417 nm, uma vez que o produto final

da reação fotoquímica é uma dicetona incolor que não absorve nesta região do

espectro.

Esquema 1. Captura de 1O2 por reação com DPBF

A constante cinética da fotodegradação de DPBF (k) será determinada pela

aplicação do modelo cinético do modelo pseudo-primeira ordem (Equação 3) e

o rendimento quântico de 1O2 (ΦΔ) foi calculado pela Equação 4.

ln (A0

At) = kt

onde A0 e At são a absorção DPBF em tempo zero e no tempo variável t,

respectivamente;

(3)

Φ∆ = Φ∆Std

k

kstd

Istd

I

onde

IStd

I=

1− 10−AStd

1− 10−A

E Φ∆Std (0,67) é o rendimento quântico de oxigênio padrão (ZnPc em DMSO) k

e kstd são constantes cinéticas de fotodegradação das nanopartículas

carregadas de ZnFc e ZnFc livre (padrão), respectivamente. O I e Istd são a

intensidade absorvida no comprimento de onda de irradiação para as

nanoparticulas carregadas de ZnFc e livre, respectivamente.

(4)

(5)

APÊNDICE

1. Caracterização dos blocos MH-SH e PS-Malei e do copolímero MH-b-PS.

Figura 1. Espectro de massa para o bloco hidrofílico MH-SH.

Figura 2. 1H RMN do bloco hidrofílico MH-SH.

600 800 1000 1200 1400

1333.5[M+H]+

686.32+

I (a

.u.)

m/z

1355.5[M+Na]+

Figura 3. 1H RMN do bloco hidrofóbico PS-Malei.

9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

7.3

8

142.6

1

1.9

9

4.0

0

202.1

0

1 2

3 5

4

1+2

4+5

3

aromático

CDCl3

Figura 4. 1H RMN do copolímero em bloco MH-b-PS.

Figura 5. MALDI-TOF MS do polímero hidrofóbico não funcionalizado.

Figura 6. MALDI-TOF MS do bloco PS-Maleimida.

Figura 7. MALDI-TOF MS do copolímero em bloco MH-b-PS.

[PS5KMalei +Na]+ 5582.83

[PS5KMalei-b-Mal +H]+ 6813.35

Figura 8. Caracterização por GPC (DMF) do bloco PS-Malei e do copolímero MH-b-PS.

Figura 9. Caracterização por UV-Vis (DMF) dos blocos PS-Malei, MH-SH e do copolímero MH-b-PS.

14,5 15,0 15,5 16,0 16,5 17,0 17,5 18,0 18,5

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0 Mn = 7516

PDI = 1.11

RI

inte

nsity (

a.u

.)

Retention time (min)

PSMalei

PS-b-Mal

Mn = 5803

PDI = 1.09

Figura 10. Caracterização por Fluorescência (emissão) dos blocos hidrofóbicos e hidrofílicos e do copolímero em bloco MH-b-PS.

Figura 11. Caracterização por GPC (DMF) dos blocos hidrofóbico PS-OH vermelho) e do copolímero em bloco MH-b-PS (Azul) com os seus devidos tempos de retenção.

PS-b-MH 20,12 min

PS-OH 23,41 min

2. Identificação da melhor mistura de solventes para o copolímero MH-b-PS.

Figura 12. Gráfico das intensidades reais obtidas por DLS (90º, 180s) para amostras de 1 mg de MH-b-PS em 1 g de THF ou mistura com H2O (100, 90 e 80% de THF). As amostras

com menos de 70% de THF mostraram-se pouco solúveis ou insolúveis.

Figura 13. Gráfico das intensidades reais obtidas por DLS (90º, 180s) para amostras de 3 mg de MH-b-PS em 1 g de THF ou mistura com H2O (100, 90 e 80% de THF). As amostras

com menos de 70% de THF mostraram-se pouco solúveis ou insolúveis.

3. Caracterização das nanopartículas formadas.

Figura 14. Espectro UV-Vis sobreposto do polímero MH-b-PS e da NP (B1) formada com os

o copolímero.

Figura 15. Microscopia MEB da nanopartícula branca formada pelo copolímero MH-b-

PS (1 mg).

1E-3 0,01 0,1 1 10 100 1000 100000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

116 - 129 nm

18 - 29 nm

Time (ms)

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

B3 - [PS - b - Mal] 3 mg.g-1 en 90% THF - 40 - 120

0

Figura 16. Função de autocorrelação DLS (g(2)-1) e distribuição do tempo de

relaxamento medidos de 40 - 120° sem fármaco (esquerda) e gráfico da dependência

da frequência de relaxamento (1/τ) no módulo vetorial de onda quadrada para as NP’s

constituídas de CPB (3 mg).

Figura 17. Distribuição dimensional determinada por medições de NTA das suspensões aquosas de 3 mg de MH-b-PS obtidas pelo método B.

1,00E+014 2,00E+014 3,00E+014 4,00E+014 5,00E+014

200

400

600

800

1000

1200

q2 (m

-2)

1/s

-1)

B3 90 - [PS - b - Mal] 3 mg.g-1 en 90% THF - 40 - 120

0

D = 1,9685 x 10-12

m2 s

-1

Rh = 124 nm

R2 = 0,998

1 10 100 1000

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

1,0x106

1,2x106

1,4x106

1,6x106

Co

nc

en

tra

tio

n (

x10

6 p

art

icle

s /

mL

)

Hydrodynamic Radius (nm)

125 nm

Figura 18. Distribuição dimensional determinada por medições de NTA das suspensões aquosas de 3 mg de MH-b-PS carregadas com ZnFc.

4. Eficiência de encapsulamento (EE) e Conteúdo total de fármaco

(CT).

Figura 19. Espectro UV Vis de solução de [ZnPc]THF 0,05 mM evidenciando os

comprimentos de onda utilizados na curva de calibração em HPLC para cálculo de

eficiência de encapsulamento (EE%) e conteúdo total de fármaco (CT).

Figura 20. Dependência linear entre área (detector UV Vis em 675 nm) versus [ZnFc]

para cálculos utilizados em EE% e CT%.