RENORBIO Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia ...

RENORBIO Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Produção e caracterização de quitooligossacarídeos produzidos pelo fungo Metarhizium anisopliae e avaliação da citotoxicidade em células tumorais

Cristiane Fernandes de Assis

Natal – RN

2010

RENORBIO Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Produção e caracterização de quitooligossacarídeos produzidos pelo fungo Metarhizium anisopliae e avaliação da citotoxicidade em células tumorais

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - PPG-B,

Área de concentração: Biotecnologia Industrial

Linha de Pesquisa: Bioprocessos

Cristiane Fernandes de Assis

Orientador: Everaldo Silvino dos Santos

Co-Orientadora: Gorete Ribeiro de Macedo

Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Central Zila Mamede

Assis, Cristiane Fernandes de.

Produção e caracterização de quitooligossacarídeos produzidos pelo fungo Metarhizium anilopliae e avaliação da citotoxicidade em células tumorais / Cristiane Fernandes de Assis. – Natal, RN, 2009. 110 f.

Orientador: Everaldo Silvino dos Santos. Co-orientador: Gorete Ribeiro de Macedo.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.

1. Quitosana – Tese. 2. Glicosamina – Tese. 3. N-acetilglicosamina – Tese. 4. Quitooligossacarídeos – Tese.

5. Metarhizium anilopliae – Tese. 6. Citotoxicidade – Tese. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Macedo, Gorete Ribeiro de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BCZM CDU 547.995(043.2

CRISTIANE FERNANDES DE ASSIS Produção de caracterização de quitooligossacarídeos produzidos pelo fungo Metarhizium

anisopliae e avaliação da citotoxicidade em células tumorais Tese apresentada a Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO) para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Área de Concentração: Biotecnologia Industrial

Aprovada em 18 de janeiro de 2010 por:

Presidente

Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO)/ UFRN

1º Examinador:

____________________________________ 2º Examinador: Prof.ª Dr.ª Luciana Rocha Barros

Gonçalves Universidade Federal do Ceará (UFC)

_____________________________________ 3º Examinador: Prof.ª Dr.ª Sueli Rodrigues

Universidade Federal do Ceará (UFC)

_____________________________________ 4º Examinador: Prof.ª Dr.ª Maria de Fátima Vitória de Moura

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 2

2. REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................... 4

2.1. Quitina e Quitosana ............................................................................................. 4

2.2. Aplicações da quitosana ...................................................................................... 6

2.3. Hidrólise química e enzimática da quitosana ...................................................... 10

2.4. Produção de quitosanases .................................................................................... 11

2.5. Fungo Metarhizium anisopliae ............................................................................ 13

2.6. Quitooligossacarídeos .......................................................................................... 16

2.7. Aplicações dos Quitooligossacarídeos ................................................................ 18

2.8. Células não tumorais e tumorais ......................................................................... 23

2.9. Citotoxicidade ...................................................................................................... 24

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................... 27

4. ARTIGOS DERIVADOS DA TESE............................................................................. 49

4.1. Primeiro artigo: Chitooligosaccharides enzymatic production by Metarhizium

anisopliae

Abstract ……………………………………………………………..……….…. 50

Introduction ……………………………………………………………....…….. 51

Materials and Methods ………………………………………..…...…….…….. 52

Reagents ………………………………..……………………....…….. 52

Microrganism ………………………………………..………...….….. 53

Fermentation Conditions …………………………………………...… 53

Chitosanolytic activity …………………………...…………………… 53

Chitooligosaccharides Production ……………………………………. 54

Analysis and quantification of chitosan oligosaccharides ……………. 54

Results and Discussion ……………………………………………………...…. 55

Production of Chitosanolytic activity ……………..………………….. 55

Detection of quantification of oligomers produced during 48 hour of 56

cultivation ………………………………………….…………….

Oligomers producing using the crude enzyme extract produced by the 57

fungus ………………………..…………………………………..…....

iii

Conclusion ……………………………………………..………………………. 58

Acknowledgments ………………………………………………..……………. 59

References ……………………………………..……………………………….. 59

LISTA DE FIGURAS

Fig. 1 (a) Production of chitosanase enzyme by M. anisopliae in medium containing chitosan 65

(0.2%), at 25ºC, 110 rpm and (b) reducing sugar produced during cultive. Values are means

of triplicate replicaes with standard deviations less than 10%.....................................................

Fig. 2 Chromatograms of the (GlcN)n, 2-6 patterns (a) and of the production of COS formed 66

over 48 hours of cultivation of M. anisopliae (b). Chromatograms were performed through

HPLC of Shim-Pack CLC-NH2 column. Oligomer analysis was carried out using acetonitrile

(60%) as a mobile phase at a flow rate of 0.8 ml/min and a Refractive Index (RI)

detector………………………………………….…………….......……………………………

Fig. 3 Concentration of oligosaccharides (dimers to pentamers) during 48 hours of fungus 67

cultivation in medium containing 0.2% chitosan, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4, 0.5 % KCl,

0.3% yeast extract, 0.5% peptone, 0.2% NaNO3, and 0.001% FeSO4 (pH 5.5). The growth

was carried out in a rotation incubator for 2 days at 25°C and 110

rpm…………………………………………………...………………………………………….

Fig. 4 Chromatograms of hydrolyzed chitosan formed by the incubation of chitosan with the

crude enzyme extract produced by the Metarhizium anisopliae fungus. (a) 10, (b) 20, (c) 30, 68

(d) 40, (e) 50, (f) 60 minutes. Chromatograms were performed through HPLC of Shim-Pack

CLC-NH2 column. Oligomer analysis was carried out using acetonitrile (60%) as a mobile

phase at a flow rate of 0.8 ml/min and a Refractive Index (RI) detector……………………….

Fig. 5 Concentration of chitosan COS by the crude enzyme extract produced by Metarhizium 70

anisopliae. Dimers (■), trimers (●), tetramers (▲), pentamers (▼) and hexamers (♦) The

results represent the ± SD mean of three experiments in triplicate…………………………….

LISTA DE TABELAS

Table 1 (GlcN) 2-6 oligomers production measured in HPLC …………………...………….. 69

4.2. Segundo artigo: Chitooligosaccharides antagonizes the cytotoxic effect of

glucosamine

iv

Summary………………………………………………………..………………. 71

Introduction ………………………………………..…………………… ................... 72

Materials and methods ..... ………………………………..……….…………….. 73

Reagents …………………………………………….………………... 73

Preparation of chitosan ……………………………….………………. 74

Chitooligosaccharides production ………….………………………… 74

Hydrolysate analysis by HPLC ..................................................................... 74

Cell Culture ................................................................................................. 74

Cell proliferation assay …………………..…………………………… 75

MTT Assay ................................................................................................. 75

Determination of total antioxidant capacity .................................................... 76

Hydroxyl radical scavenging activity assay .................................................... 76

Superoxide radical scavenging activity assay ................................................. 76

Reducing power ........................................................................................... 77

Ferric chelating ............................................................................................ 77

Statistical analysis ........................................................................................ 77

Results ……………...………….………….…………...………………………. 78

Chitosan hydrolysate composition ................................................................. 78

Assessment of cell proliferation and cytotoxicity ………………..…. 78

Antioxidant activity …………………………………………………... 79

Discussion and Conclusion ……………..…………………..……….…..……. 80

Acknowledgments ……………………………………………..………………. 84

References ……………………………………………………….……………... 84

LISTA DE FIGURAS Fig. 1. Cytotoxic assessment of the effect of the olygomer mixture on HepG2, HeLa and 3T3 cells. The cells were treated with different concentrations of the olygomer mixture:

92 compound A (GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4, (GlcN)5, compound B (GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4, and compound C (GlcN), (GlcN)3, for 72 hours. In the absence of these compounds the reduction of MTT was considered as being 0.0%. * p < 0.05 ...................................................................... Fig. 2. Cytotoxic assessment of the effect of olygomers on HepG2, HeLa and 3T3 cells. The cells were treated with different concentrations of (GLcN), (GLcN)2, (GLcN)3, (GLcN)4,

93 (GLcN)5, and (GLcN)6 oligomers for 72 hours. In the absence of these compounds the

v

reduction of MTT was considered as being 0.0%. * p < 0.05...................................................... Fig. 3. Total antioxidant capacity of chitooligosaccharides. Compound A [(GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4, (GlcN)5], compound B [(GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4], and compound C [(GlcN), (GlcN)3]. The results are expressed as ascorbic acid equivalents. Data are expressed as means±stardand deviation. Different letters indicates a significant difference between COS 94 by one –way Anova followed by Student -Newman-Keuls test (p<0.05) .......................................................................................................................... Fig.4. Reducing power of COS being Compound A [(GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4, (GlcN)5], compound B [(GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4], and compound C [(GlcN), (GlcN)3]. Data are

96 expressed as means ± satandard deviation. Reducing power is expressed as a percentage of the activity shown by 0.2mg/mL of acid ascorbic. ......................................................................

LISTA DE TABELAS Table 1: (GlcN) 2-6 oligomers production by different times of hydrolysis measured in HPLC.. 91 Table 2: Hidroxil and superoxide radical scavenging and ferric chelating activity of COS…… 95 Table 3: IC50 values of chitosan oligomers according to MTT assays in HepG2, HeLa and 97 3T3 cells ……………………………………………………………………….…... ..................

4.3. Terceiro artigo: Cytotoxicity of chitosan oligomers produced by crude enzyme

extract from the fungus Metarhizium anisopliae

Abstract .................................................................................................................... 98

Manuscript ………………………………………..…………….……………… 99

Acknowledgments ……………………………..………………….…………… 103

References ………………………………………………..………….….…….... 103

LISTA DE FIGURAS Figure 1: Concentration of chitooligosaccharides formed by the incubation of chitosan with 106 the crude enzyme extract during 20 minutes …………………….….…………………………. Figure 2: Cytotoxic assessment of the effect of the oligomers mixture in HepG2 (■), HeLa (●) and 3T3 (♦) cells. The cells were treated with different concentrations of the supernatant, for

72 hours. In the absence of these compounds the reduction of MTT was considered as being

100%. The experiment was carried out in 96-well plates. The results represent the mean

vi

±SD of three experiments in triplicate. (p < 0.05) ............................................................................ 107

5. CONSIDERAÇÕES GERAIS ............................................................................................. 108

5.1. Trabalhos futuros ...................................................................................................... 109

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura da quitina e quitosana............................................................ 6

Figura 2: Mecanismo de hidrólise de uma molécula de quitosana 80% 12 desacetilada sob ação das enzimas da subclasse I, II, III.......................................

Figura 3: Placa de petri contendo o fungo Metarhizium anisopliae em meio 15 PDA ..................................................................................................................

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Diversas aplicações da quitosana e uma descrição das atividades ................... 9

Tabela 2: Efeitos dos QCOS no crescimento de diferentes tumores ......................... 23

vii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS GlcNAc - 2-aceto-amino-2-deoxi-D-glicose GlcN - 2-amino-2-deoxi-D-glicose KDa - Quilo daltons (1000 daltons) QCOS/COS Quitooligossacarídeos GP - Grau de polimerização CLAE - Cromatografia Liquída de Alta Eficiência SD Desvio Padrão MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolium brometo)] HepG2 Células de hepatocarcinoma Humano HeLa Células de carcinoma uterino Humano 3T3 Células de fibroblastos de embrião de ratos IC50 Concentração Inibitória de 50% VEGF Fator de crescimento endotelial vascular EAT Tumor de ascite de Ehrlish SNC Sistema Nervoso Central IL-1 Interleucina 1 TNF-α Fator de Necrose Tumoral - Alfa

viii

Balb/C Espécie de Camundongos NBT Nitroblue Tetrazolium PDA Potato Dextrose Agar DD Degree of Deacetilation

ix

Ao meu noivo, Iaponan que sempre esteve ao meu lado, me apoiando e me incentivando para a conclusão deste trabalho. Obrigada pela paciência, compreensão, dedicação que sempre teve comigo e por fazer parte da minha vida.

x

Aos meus pais, Vânia e Juvenal, que são muito importantes na minha vida e que não mediram esforços para que eu conseguisse alcançar meus objetivos. Muito obrigada pela força, pelas palavras de incentivo nos momentos difíceis, pelos momentos de alegria. Às minhas queridas irmãs, Alessandra, Camila, pelo carinho, atenção e amizade e por sempre estarem torcendo por mim. Obrigada por tudo!

xi

AGRADECIMENTOS A Deus, sempre presente na minha vida dando a força necessária para superar todos os obstáculos. Ao Grupo Voluntário Irmão João Cecílio da Costa e ao nosso mentor João Cecílio, pela ajuda, força e orientações dadas, que levarei para sempre durante toda a minha vida profissional e pessoal. Ao professor Everaldo, por mesmo sem conhecer meu trabalho aceitou me orientar e nunca mediu esforços para me ajudar na realização do meu trabalho. Os seus ensinamentos foram muito importantes para mim e que guardarei comigo todos eles, com a certeza de que todo esforço é válido quando se quer vencer. A professora Gorete, por me receber em seu laboratório e pela confiança em mim depositada. Obrigada pela ajuda e pelas palavras de incentivo “que tudo iria dar certo” nos momentos em que mais precisamos ouvir essas palavras. Ao professor Hugo, amigo para todas as horas e todos os momentos, obrigada por toda a sua compreensão e paciência com meus desesperos de final de tese! Admiro muito a sua capacidade e deu trabalho!!! A professora Márcia Pedrini pelo empenho em conseguir o microrganismo para a realização deste trabalho! À banca de qualificação professoras Sueli Rodrigues e Ana Porto pelas valiosas contribuições e sugestões apresentadas em meu trabalho! À CAPES, pela concessão de bolsa de estudo e ao CNPq pelo financiamento do projeto. À minha amiga Gio, com quem pude aprender bastante durante o desenvolvimento da tese onde sempre discutíamos os melhores caminhos para melhor o nosso trabalho. Obrigada pela sua atenção, carinho e estímulo constante durante este período. Sou muito feliz por ter sua amizade, por ter passado tantos momentos alegres ao seu lado e poder contar sempre com você. Com a certeza de que agora teremos uma longa caminhada no Departamento de Farmácia e saiba que poderá contar sempre comigo.

xii

À minha amiga Valzinha, que sempre tem algo de bom para nos ensinar, sempre disponível a ajudar todos em qualquer situação. Val é um exemplo para mim de força e determinação nos objetivos que queremos alcançar. À Nath, pela sua amizade e sinceridade sempre disposta a me auxiliar nas atividades do laboratório. Obrigada pela sua dedicação! A todos do Laboratório de Engenharia Bioquímica, pelos momentos agradáveis compartilhados durante esta jornada. Ao Thyrone, por estar sempre disposto a ensinar e ajudar. A todos os docentes, funcionários e pós-graduandos do Departamento de Engenharia Química e Departamento de Bioquímica que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho. À Jessiane, Saint Clair (secretários do ponto focal UFRN) e a Karine (secretária da Renorbio) Aos meus amigos, Leandro, Raniere e Ruth pela disposição em me ajudar durante os experimentos no Biopol!

xiii

RESUMO A quitosana é um polímero natural, biodegradável, não tóxico e de alta massa molecular

obtido a partir de animais marinhos, insetos e microrganismos. Os oligômeros de

glicosamina (GlcN) e N-acetilglicosamina (GlcNAc) têm atividades biológicas

interessantes, incluindo efeitos antitumorais, atividade antimicrobiana, antioxidante

entre outras. A alternativa proposta por este trabalho foi estudar a viabilidade de

produção de quitooligossacarídeos utilizando um extrato bruto de enzimas produzidas

pelo fungo Metarhizium anisopliae. A hidrólise da quitosana foi realizada em diferentes

tempos, de 10 a 60 minutos para a produção de quitooligossacarídeos e a detecção e

quantificação foi realizado pela Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. A avaliação

da citotoxicidade dos oligômeros de quitosana foi realizada em células tumorais (HepG2

e HeLa) e não tumoral (3T3). As células foram tratadas durante 72 horas com os

oligômeros e a viabilidade celular foi feita usando o método do MTT. A produção de

oligômeros de quitosana teve maiores rendimentos durante 10 minutos de hidrólise, os

pentâmeros apresentaram concentração de 0,15 mg/mL, porém os hexâmeros, que

apresentam maior interesse pelas suas propriedades biológicas, só foram detectados com

30 minutos de hidrólise apresentando uma concentração de 0,004 mg/mL. Um estudo

visando avaliar as atividades biológicas dos QCOS entre elas a citotoxicidade em

células tumorais e normais e vários testes de atividade antioxidante in vitro entre

oligômeros puros de quitosana e a mistura dos oligômeros produzidos pelo extrato bruto

enzimático foi realizado. A glicosamina foi o composto com a maior toxicidade dentre

os oligômeros puros, apresentando valores de IC50 0,30; 0,49; 0,44 mg/mL para células

HepG2, HeLa e 3T3, respectivamente. O seqüestro do ânion superóxido foi a principal

atividade antioxidante mostrada pelos QCOS. Sendo que essa atividade também foi

dependende da composição dos hidrolisados de quitosana. Os oligômeros produzidos

xiv

por hidrólise durante 20 minutos foram analisados quanto à capacidade de inibir células

tumorais mostrando inibição da proliferação apenas nas células HeLa, não apresentando

nenhum efeito em células HepG2 e células de fibroblastos (3T3).

Palavras chaves: quitooligossacarídeos, quitosanases, Metarhizium anisopliae, células

tumorais, citotoxicidade, antioxidantes

xv

ABSTRACT Chitosan is a natural polymer, biodegradable, nontoxic, high molecular weight derived

from marine animals, insects and microorganisms. Oligomers of glucosamine (GlcN)

and N-acetylglucosamine (GlcNAc) have interesting biological activities, including

antitumor effects, antimicrobial activity, antioxidant and others. The alternative

proposed by this work was to study the viability of producing chitooligosaccharides

using a crude enzymes extract produced by the fungus Metarhizium anisopliae.

Hydrolysis of chitosan was carried out at different times, from 10 to 60 minutes to

produce chitooligosaccharides with detection and quantification performed by High

Performace Liquid Chromatography (HPLC). The evaluation of cytotoxicity of chitosan

oligomers was carried out in tumor cells (HepG2 and HeLa) and non-tumor (3T3). The

cells were treated for 72 hours with the oligomers and cell viability investigated using

the method of MTT. The production of chitosan oligomers was higher for 10 minutes of

hydrolysis, with pentamers concentration of 0.15 mg/mL, but the hexamers, the

molecules showing greater interest in biological properties, were observed only with 30

minutes of hydrolysis with a concentration of 0.004 mg/mL. A study to evaluate the

biological activities of COS including cytotoxicity in tumor and normal cells and

various tests in vitro antioxidant activity of pure chitosan oligomers and the mixture of

oligomers produced by the crude enzyme was performed. Moreover, the compound with

the highest cytotoxicity among the oligomers was pure glucosamine, with IC50 values of

0.30; 0.49; 0.44 mg/mL for HepG2 cells, HeLa and 3T3, respectively. Superoxide anion

scavenging was the mainly antioxidant activity showed by the COS and oligomers. This

activity was also depending on the oligomer composition in the chitosan hydrolysates.

xvi

The oligomers produced by hydrolysis for 20 minutes was analyzed for the ability to

inhibit tumor cells showing inhibition of proliferation only in HeLa cells, did not show

any effect in HepG2 cells and fibroblast cells (3T3).

Key words: chittoligosaccharides, chitosanases, Metarhizium anisopliae, tumoral cells,

cytotoxicity, antioxidant.

xvii

_____________________________

Capítulo 1

Introdução

_____________________________

Introdução 1. INTRODUÇÃO

Nos últimos anos, a busca de alternativas mais eficientes para a terapia de

doenças infecciosas e neoplásicas tem mobilizado profissionais de diferentes áreas.

Resultados promissores têm surgido, com a utilização de substâncias produzidas por

microrganismos.

A quitosana é um biopolímero hidrofílico obtido a partir da quitina (termo

derivado da palavra grega Khitón, que significa carapaça, casca ou caixa de

revestimento, e que designa um polissacarídeo abundante na natureza, perdendo apenas

para a celulose em quantidade produzida anualmente (Senel & McClure, 2004). A

quitosana é o produto da desacetilação da quitina sendo quimicamente conhecida como

seu derivado N-desacetilado, embora o correto grau de desacetilação que diferencie a

quitina da quitosana não esteja totalmente definido (Muzzarelli & Rocchetti, 1973). A

literatura costuma aceitar materiais obtidos a partir da quitina, com grau de

desacetilação superior a 75% e solúveis em ácidos como o acético e o fórmico, como

sendo quitosana (Kumar, 2000).

A quitosana é geralmente susceptível a um número de diferentes enzimas.

Enzimas quitosanolíticas de diferentes microrganismos incluindo fungos (Kim, Shon e

Lee, 1998) e bactérias (Lee et al., 1996) têm sido relatadas e utilizadas como excelentes

desempenhos na produção de quitooligossacarídeos (QCOS)-(Zhang et al., 1999). Os

quitooligossacarídeos são produtos parcialmente hidrolisados da quitosana, dos quais

pentâmeros e hexâmeros são obtidos como produtos em reações intermediárias e

apresentam atividades biológicas importantes (Ming et al., 2006). Para obtenção dos

QCOS dois métodos podem ser empregados: químico e enzimático. A hidrólise química

é realizada usando-se altas temperaturas sob condições ácidas e produz uma grande

quantidade de glicosamina (monômero da quitosana), o que prejudica o controle do

2

Introdução progresso da reação. Esse método produz baixos rendimentos de pentâmeros e

hexâmeros. A hidrólise enzimática tem algumas vantagens para a produção dos

quitooligossacarídeos, algumas quitosanases podem catalisar a hidrólise sob condições

brandas e não produzir monossacarídeos (Ming et al., 2006).

Alguns QCOS têm sido produzidos com o objetivo de se pesquisar novas

substâncias com atividade antifúngica (Hirano & Nagao, 1989), antibacteriana (Cheng

& Li, 2000), antitumoral (Huang, Mendis & Kim, 2006) e antioxidante (Mendis et al.,

2007).

Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo estudar a viabilidade de

produzir um extrato bruto enzimático a partir do fungo Metarhizium anisopliae para

hidrolisar a quitosana produzindo QCOS. Identificar e quantificar os oligômeros

produzidos, utilizando Cromatografia Liquída de Alta Eficiência (CLAE), e avaliar a

proliferação celular e citotoxicidade destes QCOS em células tumorais e células

normais e verificar a atividade antioxidante destes compostos in vitro.

A presente tese será apresentada na seguinte forma: Inicialmente será

apresentada uma introdução, na qual será contextualizada a importância e os objetivos

da tese. Em seguida, faz-se uma revisão da literatura com sua respectiva referência

bibliográfica, na qual são apresentados os fundamentos teóricos para os capítulos

seguintes. Na presente tese, a metodologia bem como os resultados e as discussões

desenvolvidas serão apresentados na forma de artigos que foram submetidos para

periódicos. Destaca-se que os artigos são apresentados no formato que foram enviados

para os periódicos. Por último, apresenta-se as considerações finais sobre o trabalho.

3

_____________________________

Capítulo 2 Revisão da Literatura

_____________________________

Revisão da Literatura

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Quitina e Quitosana

A quitina é um polissacarídeo estrutural e constitui o segundo polímero mais abundante do planeta. É um heteropolímero linear, formando copolímero com a

quitosana que apresenta o mesmo tipo de unidade monomérica a β-(1-4) N-

acetilglicosamina (MacCarthy et al., 1997; Bathia & Ravi, 2000; Canela & Garcia,

2001). Como se trata de um polímero encontrado na natureza, dependendo da maneira

como é extraída a quitina pode apresentar percentual de grupos amino próximo a 50% e

ser facilmente confundido com a quitosana (Roberts, 1992). A quitina é extraída com

abundância de fontes tais como, camarão e caranguejo, atingindo uma produção de 1010

a 1011 toneladas por ano (Kumar, 2000; Kurita, 2001). Sua imunogenicidade é

excepcionalmente baixa, apesar da presença do nitrogênio. A quitina é um material

semelhante a celulose em sua baixa solubilidade e reatividade química (Majeti &

Kumar, 2000).

A quitina é composta de unidades de 2-aceto-amino-2-deoxi-D-glicose

(GlcNAc). A partir da desacetilação da mesma obtém-se a quitosana. A quitosana é um

amino polissacarídeo composto principalmente de unidades de 2-amino-2-deoxi-D-

glicose (GlcN) ligadas linearmente por ligações glicosídicas β-1,4 com grau de

desacetilação variado, geralmente acima de 80% (Kurita, 2001; Peter, 2005). A

quitosana é o nome usado para formas de quitina substituídas de baixa acetilação e seu

principal componente é a glicosamina, conhecida como 2-amino-2-dioxi-(D-glicose). A

quitosana tem três tipos de grupos funcionais reativos, um grupo amino bem como

ambos os grupos hidroxila primários e secundários na posição C-2, C-3 e C-6,

4

Revisão da Literatura respectivamente (Furusaki et al., 1996). Modificações químicas nesses grupos têm

ampliado o número de aplicações do material em diferentes áreas (Kurita, 1996).

O grau de desacetilação, grau de esterificação, grau de metilação, ou ainda, grau

de substituição, juntamente com a determinação da massa molecular, são parâmetros

primordiais para a caracterização de um polímero, pois através deles é possível

diferenciar e, muitas vezes, explicar as propriedades físico-químicas dos polímeros com

estrutura química similar (Domard, 1987). O parâmetro que diferencia quitosana e

quitina é sem dúvida, o grau de desacetilação ou grau de acetilação, que são

complementares entre si para o valor de 100% do grau determinado (Sannan, Kurita &

Iwakura, 1976).

A quitina e sua forma desacetilada, quitosana, tem sido de interesse de décadas

passadas devido ao seu potencial amplo de aplicações industriais (Shahidi, Arachchi &

Jeon, 1999). A Figura 1 ilustra as estruturas da quitina e da quitosana. Destaca-se o

grupo acetilado no carbono 2 da quitina.

5


Figura 1. Estrutura da quitina e quitosana

2.2. Aplicações da Quitosana

A quitosana é um polímero caracterizado por propriedades específicas que

revelam seu potencial para inúmeras aplicações, destacando-se sua alta

biocompatibilidade. Abaixo estão algumas das aplicações da quitosana.

Nos tratamentos de efluentes industriais a quitosana age como quelante para

remoção de metais pesados e resíduos (Janegitz et al., 2007), podendo remover

corantes. Na indústria de alimentos atua como clarificante de sucos (Devlieghere,

Vermeulen & Debevere, 2004).

Em cosméticos a quitosana faz parte da composição de creme dental, cremes

para mão e corpo, xampus, condicionadores e protetores solares (Synowiecki & Al

Khateeb, 1997).

6


Na agricultura, a quitosana pode ser usada como protetora de sementes e como

estimulante do crescimento de microrganismos, produtores de quitinase, destruidoras de

nematóides patogênicos e ovos (Peter, 2001). A quitosana potencializa a germinação de

sementes, além de ser um agente de encapsulamento para liberação lenta de nutrientes e

adubos. A mesma pode ser usada como um filme protetor biodegradável para

embalagens de frutas e verduras para melhorar a sua conservação (Synowiecki & Al

Khateeb, 1997). Neste caso, é um conservante ideal por suas características anti

fúngicas e também por induzir a produção de quitinase (enzima de defesa contra agentes

agressores) e apresentar segurança para uso humano evidenciado por estudos

toxicológicos (Hirano & Itakura, 1990). Além disso, forma um filme semipermeável

sobre o fruto e, por modificar a atmosfera interna do tecido, a quitosana pode retardar o

amadurecimento de frutas.

Na indústria papeleira, a quitosana potencialmente poderia ser utilizada devido à

capacidade de formar filmes, aumentando a resistência mecânica e impermeabilidade do

papel. Ela também pode ser usada na curtição e no acabamento na fabricação de

artefatos de couro (Koide, 1998).

Foi verificada a eficiência para confecção de biomateriais como membranas

renais, pele artificial, lentes de contato, liberação de fármacos e DNA, engenharia de

tecidos, aplicações ortopédicas e periodontais entre outras (Ito et al., 1999). No

tratamento e regeneração de ferimentos (hemostáticos), a quitosana é aplicada na forma

de bandagens que, além de oferecer mais rápida cicatrização de ferimentos e abscessos,

protege contra infecções contra Staphylococcus (Goosen, 1997). Outro fator chave na

reconstrução de tecidos fisiológicos exercido pela quitosana é um aumento da

vascularização e um contínuo fornecimento de quito-oligômeros em feridas, para

7

Revisão da Literatura estimular a deposição correta, montagem e orientação de fibrilas de colágeno, que são

incorporados dentro dos componentes da matriz extracelular (Muzzarelli, 2009).

Vários materiais injetáveis baseados na quitosana e seus derivados têm sido

usados como substitutos em ossos osteogênicos. Compostos de fosfato de cálcio

quitosana e compostos fosforilados de quitosana tem sido usados para preencher

defeitos no rádio e tíbia in vivo (Lee et al., 2000a, b).

A quitosana age como antiácido natural e solubiliza-se na presença de ácido

gástrico estomacal, capturando íons H+ do meio e retirando o excesso de ácido gástrico

do estômago elevando assim o pH. Devido à sua ação antiácida também eleva o pH da

região bucal, onde atua ligando-se às bactérias que causam a placa dentária e,

consequentemente, a cárie e, assim, prevenindo ambos (Goosen, 1997).

A quitosana pode inibir a replicação de bacteriófagos pelos seguintes

mecanismos: a) diminuição da viabilidade da cultura de células bacterianas, b)

neutralização da infectividade de partículas da fase madura no inóculo e/ou partículas

da fase filha e c) bloqueio da replicação da fase de virulência (Chirkov, 2002).

Vários pesquisadores relatam que a quitosana tem ação antimicrobiana em uma

grande variedade de microrganismos, incluindo algas, fungos, bactérias. Contudo, esta

ação sofre influência de fatores intrínsecos (grau de desacetilação) e extrínsecos

(nutrientes e condições do meio ambiente, substratos químicos). A quitosana apresenta

atividade antimicrobiana para vários microrganismos patogênicos, destacando-se sua

atuação contra bactérias gram positivas e diversas espécies de Candida (Cuero, 1999).

As propriedades policatiônicas permitem a quitosana interagir com substâncias de carga

negativa, assim exibem atividade antimicrobiana contra bactérias, bolores e fungos

(Wang, 1992; Roller & Covill, 1999).

8


A quitosana é usada como aditivo natural, em diversas áreas, no lugar dos aditivos sintéticos. Novos produtos baseados na quitosana e seus derivados têm sido criados com sucesso para a indústria de alimentos (Muzzarelli, 2009). A Tabela 1 mostra um resumo das aplicações da quitosana em diversas áreas.

Tabela 1: Diversas áreas de aplicação da quitosana e uma pequena descrição das atividades.

ÁREAS DE APLICAÇÃO DESCRIÇÃO Tratamento de água Aditivos de cosméticos Agricultura Indústria de filmes Medicina/Farmácia

Quelante de metais pesados Produtos dentários Xampus e condicionadores Loções e cremes protetores Proteção bactericida de sementes

Liberação agroquímica controlada Estabilizante de frutos e verduras perecíveis (pós colheita) Controle de temperaturas Controle de liberação de substâncias antimicrobianas

Controle de liberação de antioxidantes Controle de liberação de nutrientes, condimentos e drogas Efeito bactericida/Antiviral Agente cicatrizante (regeneração de ferimentos e lesões) Liberação controlada de drogas Pele artificial Antiácido (agente antigástrico)

9


2.3. Hidrólise química e enzimática da quitosana

A hidrólise da quitosana resulta em despolimerização da cadeia polimérica pela

clivagem das ligações glicosídicas β-(1-4). A despolimerização da quitosana aumenta a

solubilidade em água e também reduz a viscosidade da solução, facilitando a aplicação

dos materiais de quitosana em várias áreas (Shin-Ya et al., 2001).

A hidrólise pode ser conduzida pelo uso de ácidos orgânicos ou inorgânicos

(hidrólise química) ou pela utilização de enzimas hidrolíticas específicas ou não

específicas (hidrólise enzimática), degradação oxidativa com peróxido de hidrogênio,

degradação ultra-sônica, químico-enzimático (Kim & Rajapakse, 2005) e radiação (Hai

et al., 2003).

A hidrólise química é um método de fácil execução, porém, esse mecanismo

resulta em um baixo rendimento de oligômeros e grande quantidade de monômeros (D-

glicosamina), além de não poderem ser utilizados como material bioativo devido à

possível presença de contaminação por compostos químicos tóxicos; principalmente,

nas hidrólises com HNO2 podem ocorrer modificações estruturais no produto final

(Cabrera & Cutsem, 2005). Outro inconveniente desse método é a necessidade de

utilizar altas temperaturas e grandes concentrações de reagentes, podendo causar

problemas ambientais (Roncal et al., 2007).

Ao invés do agressivo método de hidrólise ácida, a quitosana pode ser

hidrolisada em condições brandas utilizando enzimas. As enzimas catalisam a sua

hidrólise de forma mais específica e permitem controle no decorrer do processo e,

consequentemente, do grau de polimerização (GP) dos oligômeros gerados (Kim &

Rajapakse, 2005; Ming et al., 2006; Roncal et al., 2007; Kuo, Chen & Chiang, 2004). A

ação hidrolítica não específica sobre a quitosana tem sido descrita na literatura como

10

Revisão da Literatura uma alternativa efetiva com respeito à obtenção de oligossacarídeos e de polímeros de

menor massa molar e, ao mesmo tempo, de custo relativo menor em comparação às

enzimas específicas. Foi evidenciada a atividade hidrólitica sobre quitosana para as

enzimas papaína (de origem vegetal), lípase, celulase, pectinase, glucanase e protease

(de origem microbiana) –(Muzzarelli et al., 1995; Izume et al., 1992). A quitosanase,

por apresentar maior especificidade, é a principal enzima utilizada para a hidrólise da

quitosana.

2.4. Produção de Quitosanases

As enzimas quitosanases são um membro da família 46 do grupo glicosil

hidrolase, sendo produzidos por uma grande variedade de microrganismos, incluindo

bactérias, actinomicetos e fungos e, em pequena quantidade, em plantas (Chen, Xia &

Yu, 2005). De uma maneira geral as quitosanases apresentam baixo peso molecular em

uma faixa de 10-50 KDa (Grenier & Asselin, 1990).

As quitosanases de várias origens hidrolisam quitosana e seus derivados e

mostram especificidades diferentes pelos substratos (Somoshekar & Joseph, 1996). As

estruturas das ligações glicosídicas na quitosana afetam o processo de hidrólise

enzimática. Diferentes quitosanases desacetiladas tem 4 diferentes tipos de distribuição

randômica de ligação glicosídica em sua estrutura. Essas incluem ligações entre duas

unidades acetiladas (GlcNAc-GlcNAc), unidade acetilada e desacetilada (GlcNAc-

GlcN), desacetilada e acetilada (GlcN-GlcNAc), e duas unidades desacetiladas (GlcN-

GlcN). A especificidade da quitosanase com relação à clivagem de 4 diferentes ligações

glicosídicas em quitosana parcialmente desacetilada é determinada pela identificação de

extremidades redutoras ou não redutoras na quitosana com grau de desacetilação (Kim

11

Revisão da Literatura & Rajapaske, 2005). De acordo a especificidade, as quitosanases são classificadas em 3

subclasses. Na classe I as enzimas quebram as ligações GlcN-GlcN ou GlcNAc-GlcN.

Quitosanases da classe II quebram somente as ligações GlcN-GlcN, reconhecendo

especificamente a seqüência –(GlcN)3. As enzimas da classe III quebram as ligações

das unidades GlcN-GlcN e GlcN-GlcNAc (Peter, 2005; Saito et al., 1999). Na Figura 2

é possível visualizar como acontece a hidrólise de uma molécula de quitosana.

Figura 2: Mecanismo de hidrólise de uma molécula de quitosana 80%

desacetilada, sob ação das enzimas da subclasse I, II e III.

Os mecanismos de hidrólise da quitosana podem variar de acordo com o tipo de

quitosanase obtida, pois diferentes microrganismos produzem enzimas

com determinadas diferenças na conformação da molécula o que leva a terem

mecanismos de ação hidrolíticas diferentes (Kurita et al., 1977; Sakai et al., 1991,

Seino, Tsukuda & Shimasue, 1991). As quitosanases podem ser divididas

em duas categorias, endoquitosanases e exoquitosanases. As endoquitosanases

catalisam a hidrólise de maneira aleatória no interior da molécula de quitosana,

gerando oligossacarídeos de 12

Revisão da Literatura diversos tamanhos. As exoquitosanases hidrolisam as terminações não redutoras,

resultando em produtos finais com unidades redutoras (Peter, 2005).

Muitas bactérias e fungos secretam quitosanases extracelularmente (Monaghan

et al., 1973; Hedges & Wolfe, 1974; Price & Storck, 1975; Fenton & Eveleigh, 1981;

1984; Yabuki et al., 1988; Pelletier & Sygusch, 1990; Sakai et al., 1991; Boucher et al.,

1992; Yamasaki et al.,1992; Shimosaka et al., 2001). As quitosanases intracelulares são

encontradas em plantas (Grenier et al., 1991) e fungos zigomicetos (Reyes et al., 1985).

Neste caso as enzimas estão diretamente envolvidas nas modificações da parede celular.

Ambas as formas induzíveis e constitutivas são conhecidas.

2.5. Fungo Metarhizium anisopliae

A ampliação dos conhecimentos sobre a capacidade biossintética dos

microrganismos permitiu o desenvolvimento da biotecnologia bem como auxiliou na

aplicação de produtos. Estas perspectivas, associadas aos produtos de alto valor

agregado e de interesse industrial, têm conduzido nos últimos anos a investigações e

desenvolvimento de modelos que constituem as bases das novas tecnologias para

processos unitários de origem microbiana (Campos-Takaki, 2005).

Assim os fungos constituem um grupo de organismos, cuja importância para

humanidade tem sido reconhecida há mais de um século. São microrganismos

importantes como agentes primários decompositores no ciclo do carbono, nitrogênio e

de outros nutrientes da biosfera, e na deterioração de materiais e produtos úteis. Podem,

também, serem causadores de sérias doenças em plantas e animais, incluindo seres

humanos, mas não somente por seu ataque direto e invasivo, mas também,

indiretamente, através de substâncias excretadas e toxinas. (Trabulsi et al., 2004).

13

Revisão da Literatura Os fungos são microrganismos unicelulares ou multicelulares formados por

células eucarióticas. A parede celular é rica em quitina, além de galactose e manana, e

alguns também podem apresentar celulose (β-1,4-glucana), como é o caso dos

Oomycota. De um modo geral, os fungos são microrganismos aeróbios, entretanto

alguns estão envolvidos diretamente nos processos fermentativos. As formas

unicelulares podem formar estruturas alongadas, em condições especiais denominados

pseudo – hifas. As formas filamentosas, consideradas as mais numerosas, apresentam-se

como células tubulares, denominadas hifas, sendo o conjunto de hifas denominado

micélio (Trufem, 2000).

A produção de esporos por fungos filamentosos é um importante estágio na

reprodução do fungo e consiste na formação e liberação de conidiosporos. Essa

produção de conidiosporos é diretamente relacionada com a quantidade e natureza das

fontes de carbono e nitrogênio avaliadas em meio de cultura e depende de alguns

fatores: modo de inoculação, presença de sais, razão de carbono e nitrogênio, aeração e

conteúdo de água (Papagianni, 2004; Gárcia-Soto et al., 2006).

Os fungos entomopatogênicos exercem a função de controle de insetos em

ambientes naturais e ecossistemas agrícolas, ocupando um lugar relevante na

manutenção do equilíbrio ecológico. No Brasil, a utilização de fungos

entomopatogênicos está na produção de ingrediente ativo de micoinseticidas, sendo o

fungo Metarhizium anisopliae o mais utilizado, capaz de infectar uma grande variedade

de pragas. No Nordeste o M. anisopliae é utilizado para controle da cigarrinha–da–folha

da cana de açúcar (Faria & Magalhães, 2001). Ele produz enzimas quitosanolíticas, as

quais têm importante papel na digestão da cutícula dos insetos durante o desenvolvimento de doenças. Esse microrganismo é um fungo filamentoso,

14

Revisão da Literatura deuteromiceto pertencente à ordem Moniliales, família Moniliaceae (Tulloch, 1976;

Rombach, Humber, Evans, 1987).

As características morfológicas e fisiológicas do M. anisopliae apresentam

grande variação em diferentes meios de cultura. Em alguns casos, ocorre alteração na

coloração dos conídios em resposta à composição do meio. É tolerante a uma faixa de

pH de 2,0 a 8,5, sendo 6,9 a melhor condição para o crescimento vegetativo e

esporulação. Com relação à composição nutricional, é um microrganismo pouco

exigente, desenvolvendo-se em diversos meios de cultura, utilizando como fonte de

carbono: amido, glicose, glicerina, levulose, maltose, sacarose e quitina (Jabor et al.,

2003).

Figura 3. Placa de petri contendo o fungo Metarhizium anisopliae em meio PDA.

15


2.6. Quitooligossacarídeos

Oligossacarídeos são polímeros contendo de 2 a 10 unidades de monossacarídeos unidos por ligações hemiacetálicas, denominadas ligações

glicosídicas. Na polimerização de n moléculas de monossacarídeos ocorrem à liberação

de n-1 moléculas de água, obtidas a partir da condensação do grupo hidroxila anomérico

de um monossacarídeo com uma das hidroxilas da unidade adjacente. É essa hidroxila

anomérica que confere propriedades redutoras ao monossacarídeo e reduz,

principalmente, íons metálicos como cobre e prata e que se oxida a ácido carboxílico.

Esses carboidratos são denominados redutores devido a essas propriedades (Ribeiro &

Seravalli, 2007).

A hidrólise da quitosana é um processo similar ao que ocorre com outros

polissacarídeos, onde a presença de determinados agentes rompe as ligações

glicosídicas. Esse rompimento das ligações glicosídicas pode ser obtido utilizando

diferentes metodologias, nas quais os produtos gerados (QCOS) variam o grau de

polimerização, o número, e a seqüência das unidades de GlcN e GlcNAc no oligômero

gerado.

Para a produção em grande escala de QCOS a hidrólise ácida pode ser utilizada

para romper as ligações glicosídicas da quitosana, esta pode ser realizada através do uso

de HCl (Domard & Cartier, 1989) ou HNO2 (Tømmeraas et al., 2001).

Alguns pesquisadores têm estudado enzimas comerciais não específicas

(Pantaleone, Yalpani & Scollar, 1992), pois estas têm sido usadas em indústrias

alimentícias por muitos anos e são relativamente seguras e com menor custo. O

mecanismo de degradação da quitosana por essas enzimas não está claro, entretanto,

pectinase, celulase, hemicelulase, papaína, pepsina e lipase têm sido efetivas na

16

Revisão da Literatura hidrólise da quitosana (Kittur et al., 2003; Muzzarelli et al., 2004; Pantaleone, Yalpani e

Scollar, 1992; Qin et al, 2004; Yalpani & Pantaleone, 1994).

A produção dos QCOS de quitosana pode também ser realizada utilizando um

complexo enzimático incluindo celulase, alfa-amilase e proteinase (Zhang et al. 1999).

A produção contínua de oligossacarídeos de quitosana tem sido estudada por

muitos pesquisadores. Jeon & Kim (2000a, 2000b) desenvolveram um sistema de reator

de membrana e um sistema duplo de reatores. Nos dois casos o objetivo foi aumentar a

produção dos QCOS com maior grau de polimerização, minimizando a produção dos

monômeros.

O sistema descontínuo de produção de oligossacarídeos utilizando enzimas

livres foi realizado por Kuroiwa e colaboradores (2002) obtendo aumento da

concentração dos produtos com 40 e 50 minutos de hidrólise. O sistema contínuo para a

produção dos oligossacarídeos usando enzimas quitosanases imobilizadas mostrou um

maior rendimento de pentâmeros e hexâmeros (Kuroiwa et al., 2003). A partir daí a

utilização do sistema de enzimas imobilizadas para produção dos oligômeros de

quitosana foi realizada em suportes de ágar, utilizando nanopartículas magnéticas e

utilizando um biorreator de membranas (Ming et al., 2006; Kuroiwa et al., 2008, 2009).

Liu & Zeng (2009) utilizaram uma quitosanase recombinante para a produção

dos quitooligossacarídeos.

A produção de QCOS usando extrato bruto de enzimas de Paenibacillus

illioisensis KJA-424 (Jung et al., 2007) e Bacillus amyloliquefaciens V656 (Liang et al.,

2007) também tem sido estudada e os oligossacarídeos produzidos apresentam atividade

biológica contra células tumorais.

17


2.7. Aplicações Biológicas dos Quitooligossacarídeos

Os QCOS de baixo peso molecular têm recebido atenção, por causa de suas

propriedades biológicas, incluindo seus efeitos inibitórios no crescimento de fungos e

bactérias, atividade antitumoral associada, ativação da resposta imune. A atividade

antioxidante dos QCOS tem sido bastante estudada até mesmo por estar relacionada

com muitas patologias.

QCOS (N-acetilquitohexose e quitohexose) inibiram o crescimento do tumor

sólido Meth A camundongos (BALB/c) transplantados em quando administrados por

via endovenosa (Tokoro et al., 1988).

O macrófago é uma das células mais importantes imunocompetentes e tem um

papel central na defesa imunológica do hospedeiro. Os macrófagos ativados podem

liberar citocinas tais como: interleucina 1 (IL-1), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)

e intermediários ativos de oxigênio para defender o hospedeiro contra infecção

microbiana e lisar células tumorais. Esses oligômeros são captados para o interior das

células através de receptores de manose presentes na superfície do macrófago (Feng,

Zhao & Yu, 2004).

O glutamato é um aminoácido neurotransmissor excitatório do sistema nervoso

central (SNC), o acúmulo de glutamato no SNC e excessiva estimulação de seus

receptores induzem à potente ação neurotóxica envolvendo dano neuronal e desordens

degenerativas no SNC (Choi et al., 1988). Zhou et al. (2008), demonstraram que os

QCOS exercem efeito protetor na neurotoxicidade induzida pelo glutamato. Os QCOS

atuam como seqüestradores de espécies reativas de oxigênio que estão associados à

toxicidade do glutamato em células neuronais.

18


O Carcinoma hepatocelular é um dos mais comuns tumores sólidos e tem como

características um longo estabelecimento, rápido crescimento, forte malignidade, fácil

invasão e metástase. Apoptose é a morte fisiológica programada da célula e desempenha

papel essencial na sobrevivência do organismo (Jones, 2001). A apoptose em células de

hepatoma com drogas antitumorais poderia ser uma promissora terapia do câncer de

fígado e também auxiliaria no tratamento de outras doenças. Os QCOS induziram

apoptose em células de hepatocarcinoma (SMMC-7721) e o mecanismo possível é que

eles regulam a expressão da proteína pró-apoptótica BAX e ativação de caspases (serino

proteases), acionando o programa de apoptose da célula (Xu et al., 2008).

A metástase é um processo altamente complexo que ocorre através de múltiplos

passos, os quais incluem a invasão e migração celular, transporte através do sistema

circulatório, novamente invasão e crescimento em órgãos secundários (Mehlen &

Puisieux, 2006), este processo representa a transição do estágio benigno para progressão

maligna (Deryugina & Quigley, 2006). QCOS (derivados de quitina e quitosana) foram

capazes de manifestar efeito inibitório de crescimento e antimetastático em carcinoma

de pulmão de ratos com administração intramuscular (Tsukada et al., 1990). Os QCOS

produzidos por fungos inibiram a proliferação celular de carcinoma hepatocelular

humano (HepG2) e a metástase tumoral no pulmão de ratos in vitro e in vivo (Shen et

al., 2009).

O efeito protetor dos QCOS também foi verificado contra o peróxido de

hidrogênio que induz estresse oxidativo em células de diversas linhagens celulares. Xu e

colaboradores (2009) estudaram o efeito dos QCOS em células embrionárias de

hepatócitos (células L02) e constataram a proteção exercida por estes compostos. Essa

19

Revisão da Literatura proteção ocorre devido à internalização dos QCOS no núcleo celular o que

provavelmente deve induzir vias de sinalização na célula para sua proteção.

O estresse oxidativo tem sido identificado como um ponto comum para várias

doenças tais como diabetes, artrite, doenças neurodegenerativas, cardiovasculares e

tumores. Essas doenças estão diretamente e indiretamente relacionadas com a oxidação

de biomoléculas celulares por espécies reativas de oxigênio geradas extensivamente

pelos tecidos (Calabrese et al., 2005).

Em algumas doenças, tratamentos envolvendo antioxidantes têm mostrado ser

efetivo em reduzir marcadores do estresse oxidativo levando ao crescente interesse na

progressão do desenvolvimento mundial para explorar efetivos antioxidantes

especialmente de origem natural (Mendis et al., 2007).

Os seqüestradores de radicais livres são antioxidantes preventivos e a presença

destes compostos pode quebrar as sequências oxidativas em diferentes níveis (Kim &

Rajapakse, 2005).

As propriedades antioxidantes dos quitooligossacarídeos têm atraído à atenção

dos pesquisadores, pricipalmente, devido a sua habilidade de doar prótons. Essa

propriedade depende, portanto, do grau de desacetilação e do peso molecular desses

quitooligossacarídeos (Rajapakse et al., 2007).

A geração de espécies reativas de oxigênio pelas células endoteliais está

envolvida em várias condições clínicas associadas à aterosclerose, hipercolesteremia e

coagulação intravascular disseminada (Pandian et al., 2005; Fasanaro et al., 2006). A

utilização de QCOS em cultura de células endoteliais mostrou melhora na injúria celular

em associação com a diminuição do estresse oxidativo. Além disso, interfere na

20

Revisão da Literatura apoptose e na progressão do ciclo celular por atenuar o estresse oxidativo exógeno (Liu

& Zeng, 2009).

Os neutrófilos são uma classe de células sanguíneas leucocitárias que faz parte

do sistema imunológico do organismo. Essas células em repouso têm uma expectativa

de vida muito baixa principalmente quando in vitro, quando tratados com QCOS a

viabilidade in vitro, produção de intermediários reativos de nitrogênio – NO e produção

de intermediários reativos de oxigênio (O-2) foi aumentada, porém, os QCOS regularam

negativamente os neutrófilos ativados. Esse fato chama a atenção para uma aplicação

potencial dos QCOS utilizando-os em tratamento à resposta inflamatória onde ocorre

extenso dano tecidual devido a prolongada sobrevivência dos neutrófilos durante o

processo inflamatório (Dou et al., 2007). Em outro estudo, os QCOS mostraram

capacidade pró-apoptótica nos neutrófilos quando utilizado um modelo animal (ratos

com peritonite induzida por glicôgenio), por mediar a geração do ânion superóxido

contribuindo para a apoptose do neutrófilo o que pode diminuir o dano tecidual causado

pelos mesmos (Dou et al. 2009).

Angiogênese é o processo de crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de

vasos pré-existentes e é requerido para vascularização do tumor. (Dass, Tran & Choong,

2007). Durante a idade adulta, angiogênese ocorre somente em condições fisiológicas

normais. A angiogênese também tem um importante papel em alguns estados

patológicos, por exemplo, crescimento de tumor, artrite reumatóide, retinopatia

diabética e desordens inflamatórias (Carmeliet, 2003; Milkiewicz & Ispanovic, 2006).

Especialmente no câncer, o crescimento e a metástase são dependentes da angiogênese.

O estudo de ratos suíços albinos que foram induzidos intraperitonealmente com células

do tumor de ascite de Ehrlish (EAT) foi estudado por Prashanth & Tharanathan (2005).

21

Revisão da Literatura Os autores verificaram uma possível indução de apoptose nas células EAT tratadas com

os QCOS. A diminuição do número de células EAT e a ascite na cavidade

intraperitoneal e também a inibição especialmente em direção a pequenos vasos

sanguíneos germinados foram observados quando os ratos foram tratados com os

QCOS.

A heparanase está envolvida indiretamente facilitando a migração e a

proliferação das células endoteliais e atuam auxiliando a invasão tumoral e metástase

(Neta, Michael & Israel, 2006). Quan e colaboradores (2009) verificaram que os QCOS

podem inibir competitivamente a enzima heparanase por sua semelhança estrutural com

o substrato desta enzima, que trata-se de um glicosaminoglicano.

Os fatores de crescimento são responsáveis por estimular a proliferação celular

mediante a regulação do ciclo celular, iniciando a mitose, mantém a sobrevivência celular,

estimulam a migração celular, a diferenciação celular e também a apoptose. Guminska,

Ignacak & Wojck (1996) observaram que os QCOS podem reprimir a expressão do fator de

crescimento endotelial vascular (VEGF) ou inibir a secreção de tais fatores, assim inibindo a

formação de novos vasos sanguíneos, isso ocorre pela diminuição da glicólise nas células

EAT pela diminuição na captação de glicose em nível de ATP, provavelmente devido à

inibição de variante tumor específico da piruvato quinase. Esse fato não foi observado em

ratos com músculo e fígado normais.

Produtos despolimerizados de quitosana, particularmente hexâmero e heptâmero

mostram notável atividade antitumoral em tumores sólidos (Suzuki et al., 1986). Xiong

e colaboradores (2009) estudaram o efeito de oligômeros de quitosana com diferentes

graus de polimerização e verificaram que o hexâmero apresentou-se como mais potente

22


inibidor da angiogênese provavelmente por inibir a expressão do VEGF (fator de

crescimento endotelial vascular).

Os QCOS aumentaram a viabilidade das células de uma cultura primária das

ilhotas pancreáticas de ratos, uma vez que aumentaram a proliferação destas células em

altas concentrações e estimularam a liberação de insulina de 6 a 14 vezes mais quando

comparada a um grupo de células normais (Liu et al., 2007). A Tabela 2 apresenta o

efeito dos QCOS no crescimento de diferentes tumores.

Tabela 2: Efeito dos QCOS no crescimento de diferentes tumores

Quitooligossacarídeos Tipo de Tumor Inibição (%)

PM (KDa) DD Dose (%) (mg/Kg/dia)

~1 100 10 Tumor sólido 41

~1 100 300 Sarcoma 180 93

~1 100 500 MM 46 tumor 55

sólido

6,5 – 12 90 10 Sarcoma 180 61,7

1,5 – 5,5 90 10 Tumor cervical 66,7

uterino

1,5 – 5,5 90 50 Sarcoma 180 73,6

1,4 85 50 Sarcoma 180 50,4

3 – 10 80 200 Sarcoma 180 56,9

Fonte: Kim & Rajapakse (2005)

2.8. Células não tumorais e tumorais

A linhagem de células 3T3 constitui-se de fibroblastos de embrião de

camundongo e tem sido largamente utilizada em ensaios de citotoxicidade (Spielmann,

et al., 1998; Carere, Stammaki & Zucco, 2002). Dentre as características desta linhagem

23

Revisão da Literatura destacam-se a alta velocidade de proliferação celular, alta eficiência de clonagem, a

estabilidade do cariótipo e a manutenção das características após a criopreservação.

As células HepG2 foram isoladas em 1979 por Aden e colaboradores e são uma

linhagem de células derivadas de hepatocarcinoma humano de um paciente de 11 anos

de idade e do sexo masculino, livre de agentes virais hepatotrópicos conhecidos que

expressam uma grande variedade de funções metabólicas específicas do fígado (Javitt,

1990).

As células HeLa são as primeiras células de linhagem de câncer (Gey, Coffman

& Kubiceck, 1952) e receberam essa designação porque foram retiradas de uma

paciente com tumor cervial, chamada Henrietta Lacks, de 30 anos. Posteriormente

descobriu-se que o que causou o tumor em Lacks foi uma infecção com HPV (Herpes

Papiloma Vírus) conhecido por estar presente em grande parte dos casos de câncer

cervical, e que tem marcadores moleculares que podem ser encontrados nas células

HeLa (Masters, 2002).

2.9. Citotoxicidade

A legislação atual exige que novas drogas sejam testadas antes de serem

liberadas para uso farmacológico ou alimentício, onde a toxicidade é um fator

importante e limitante para a liberação e consumo (Freshney, 1994). Assim, a

descoberta e caracterização físico-química de substâncias causaram um grande aumento

na demanda de ensaios biológicos necessários para avaliação das atividades

toxicológicas destas substâncias (Groth, Falck, Miethke, 1995; Clemedson et al., 1996).

24


A determinação da toxicidade de um xenobiótico é tão importante quanto à

verificação de sua atividade biológica. É de fundamental importância a análise do efeito

terapêutico versus toxicidade de um composto para determinar seu índice terapêutico.

O estudo toxicológico in vivo tem sido preterido em virtude da utilização de

elevado número de animais, acarretando alto custo financeiro, além de aspectos éticos

questionados por entidades protetoras de animais. Desta forma, estudos in vitro têm sido

cada vez mais utilizados, já que o efeito deletério de um xenobiótico em determinada

linhagem celular é um indicativo da sua toxicidade in vivo. Além disto, apesar das

limitações da cultura de células, os resultados obtidos são reprodutíveis (Freshnet, 1994;

Rodriguez & Haun, 1999).

Citotoxicidade é a medida do potencial de um agente causar injúria celular

como: alterações morfológicas, lesões na membrana, perda de atividade metabólica,

viabilidade e adesão; inibição do crescimento celular; danos no material genético

(genotoxicidade) e morte celular.

Estudos de citotoxicidade são realizados para avaliar a viabilidade celular, os

quais podem avaliar a função celular através da integridade da membrana e de

organelas, conteúdo celular (metabólito ou macromolécula) e atividade enzimática

(Loveland et al., 1992; Repeto & Sanz, 1993; Olivier et al., 1995). Vários métodos

foram descritos nas últimas décadas, para a avaliação da toxicidade in vitro, sendo ainda

usualmente empregados:

Exclusão do azul de Tripan [Tripan Blue] – avalia a integridade da membrana

celular, pois células viáveis excluem este corante (Renzi et al., 1993).

25


Redução do MTT [brometo de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio] –

avalia a função mitocondrial através da atividade de enzimas como a succinato

desidrogenase (Mosmann, 1983).

Incorporação do vermelho neutro (cloridrato de 2-amino-3-metil-7-dimetil-

amino fenanzina) - analisa a função lisossomal (Renzi et al., 1993).

Conteúdo de ácidos nucléicos e proteínas – fornecem uma estimativa do número

de células (Cingi et al., 1991).

Atividade da fosfatase total – dá indicação do metabolismo celular em relação ao

metabolismo do fosfato (Aoyama et al., 2000).

26

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48

_____________________________

Capítulo 3 Artigos Derivados da Tese

_____________________________

4. ARTIGOS DERIVADOS DA TESE

A seguir serão apresentados os 3 artigos, submetidos para periódicos na área, derivados da tese.

O primeiro artigo intitulado ―Chitooligosaccharides enzymatic production by

Metarhizium anisopliae‖ foi aceito pelo Bioprocess and Biosystem Engineering, o segundo

“Chitooligosaccharides antagonizes the cytotoxic effect of glucosamine‖ foi submetido à

Biomedicine and Pharmacoterapy, e por último ―Cytotoxicity of chitosan oligomers

produced by crude enzyme extract from the fungus Metarhizium anisopliae in HepG2 and

HeLa cells‖, submetido ao Brazilian Journal of Microbiology.

49

_______________________________

Artigo Aceito para Publicação pelo

Bioprocess and Biosystem Engineering

_______________________________

Authors: Cristiane Fernandes de Assis*, Nathália Kelly Araújo*, Maria Giovana Binder

Pagnoncelli**, Márcia Regina da Silva Pedrini*, Gorete Ribeiro de Macedo*, Everaldo

Silvino dos Santos*

Full Title: Chitooligosaccharides enzymatic production by Metarhizium anisopliae Institution: *Departamento de Engenharia Química, Instituto de Tecnologia, **

Departamento de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59072-970

Natal, Rio Grande do Norte, Brasil, Brazil.

Correspondence to: MSc. Cristiane Fernandes de Assis Departamento de Engenharia Química Centro de Tecnologia Av. Senador Salgado Filho, s/n, Lagoa Nova, 59072-970 NATAL - Rio Grande do Norte BRASIL Phone: 55-84-3215-3769 Fax: 55-84-3215-3770 Email: [email protected]

ABSTRACT: The products of chitosan hydrolysis are chitooligosaccharides and are used mainly for

medical applications due to their specific biological activities. The objective of this

study was to detect and identify the products of enzymatic hydrolysis of chitosan

(dimers to hexamers) using a crude extract of chitosanlytic enzymes produced by the

fungus Metarhizium anisopliae. These fungus was able to produce, during 48 hours

cultivation in a medium containing chitosan, chitooligosaccharides ranging from

dimers, trimers, tetramers and pentamers at concentrations 0.2; 0.19; 0.06; 0.04 mg/mL,

respectively, and the enzymatic activity was 2.5 U/L. Using the crude enzyme extract

for chitosan hydrolysis we detected the presence of dimers to hexamers at hydrolysis

times of 10, 20, 30, 40 50 and 60 minutes of enzymatic reaction, but the yields were

higher at 10 minutes (54%). The hexamers was obtained only with 30 minutes of

reaction with concentration of 0.004mg/mL.

Palavras Chaves: Metarhizium anisopliae, chitosan, chitooligosaccharides, hydrolysis of

chitosan .

50

Artigos Derivado da tese Introduction

Chitin is one of the most abundant polysaccharides in nature. It is one of the

main components of the cell wall of fungi, the exoskeleton of arthropods such as

crustaceans (crab, lobster, and shrimp), and insects (ants, beetles, and butterflies); and is

present in the radula of mollusks and in the beaks of cephalopods (e.g., squid and

octopus) [1].

Chitosan is a deacetylated derivative of chitin which is a linear polysaccharide

consisting of β-1,4-N-acetyl-glucosamine [2]. Chitosan is insoluble in water but

dissolves in aqueous solutions of organic acids such as acetic, formic, and citric acids,

and in inorganic acids such as diluted hydrochloric acid. The solubility of chitosan is

related to the amount of protonated amino groups (-NH3 +) in the polymer chain. The

more of these groups there are, the greater the electrostatic repulsion between the chains

and the greater the solvation in water. Therefore, the degree of acetylation of chitosan

has a marked effect on its solubility [3].

Chitosan demonstrates antimicrobial, antiviral, and antifungal properties that

make it a favorable option for biomedical applications [4]. In the food industry, chitosan

has been used as a stabilizer and thickener. It can also be used as a preservative,

cleaning agent, and health food additive [5,6]. In cosmetics, chitosan forms a protective

and hydrating elastic coat on the surface of the skin that has the ability to bind the other

ingredients that act on the skin. In the environmental field, chitosan has been used as

adsorbent of heavy metal ions and organic compounds [7,8].

Chitosan is hydrolyzed to chitooligosaccharides by chitinolytic enzymes, which

are produced by microorganisms and some plants [9]. Chitosanases (EC 3.2.1.132) are

glycosyl hydrolases that catalyze the ß-1, 4 glycosidic bond hydrolysis of chitosan to produce glucosamine oligosaccharides. These enzymes are gaining increasing

51

Artigos Derivado da tese importance because of their products, low molecular weight chitosans (LMWC) and

chitosan oligomers, which are obtained by partial enzymatic hydrolysis and have

applications in the medical and pharmaceutical fields [10,11]. Chitosanases are found in

microorganisms, bacteria, and fungi [12, 13, 14].

The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae produces a chitinolytic

system, which is believed to have a role in the digestion of insect cuticles during the

development of diseases [15]. This microorganism is a filamentous fungus,

Deuteromycete, Moniliales order and Moniliaceae family [16]. A chitinolytic system

was analyzed in terms of secretion and also in terms of regulation, demonstrating high

variation among the isolates [17, 18].

Studies on chitosan have increased interest in its conversion to

chitooligosaccharides (COS), because these compounds are soluble in water and have

potential use in various biomedical applications [19]. COS are known to exhibit many

biological activities such as: antifungal [20], antibacterial [21, 22, 23], and antitumor

[24, 25] activities; immune cell proliferation effects [26]; and protection against

infection [21,22].

The objective of this study was to produce and identify the products of

enzymatic hydrolysis of chitosan (COS) using a crude extract of chitosanlytic enzymes

produced by the fungus M. anisopliae.

Materials and methods Reagents

Chitosan (85% deacetylated, molecular weight (MW): 90 - 190 Da, acquired

from Sigma - Aldrich (MO, USA)) was prepared using the modified method of Yabuki [27]. The patterns of chitosan oligomers (dimers, trimers, tetramers, pentamers,

52

Artigos Derivado da tese hexamers) were acquired from Seikagaku Co. (Japan). All other reagents used were of

the highest quality available.

Microorganism

The microorganism, Metarhizium anisopliae, strain (CG374), used in this study

was kindly provided by EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology

(Brasilia/DF-Brazil).The strain was maintained on a potato dextrose agar (PDA)

containing 1% of yeast extract at 4ºC.

Fermentation Conditions

Ten milliliters of spore suspension (107 spores/ml) from a 5-day-old culture in

Potato Dextrose Agar (PDA) medium was transferred using 2 mL of sterile water. Next,

this spore suspension was transferred to a 250 mL Erlenmeyer containing 90 mL of

culture medium consisting of: 0.2% chitosan, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4, 0.5 %

KCl, 0.3% yeast extract, 0.5% peptone, 0.2% NaNO3, and 0.001% FeSO4 (pH 5.5) [28].

The growth was carried out in a rotation incubator for 2 days at 25°C and 110 rpm.

From this suspension, 10 mL was transferred to 90 mL of the same medium. Samples of

this culture were taken every 12 hours, the broth was centrifuged at 13,400 x g for 15

minutes, and the supernatant was used to determine the enzyme activity assay and the

reducing sugars.

Chitosanolytic Activity

Enzymatic activity was assessed by determining the reducing sugars generated

by chitosan hydrolysis. In this case, 500 µL of the fermented broth was mixed with 500

µL of chitosan solution solubilized in hydrochloric acid (0.1N). The reaction was

53

Artigos Derivado da tese carried out for 30 minutes at 55°C. To terminate the reaction, 2.5 ml of dinitrosalicylic

acid was added and then cooled in an ice bath, and quantification of the reducing sugars

was performed using a spectrophotometer (Thermo Spectronic) at 600 nm [29] and a

standard curve with D-glucosamine. One unit (U) of chitosanase was defined as the

amount of enzyme that is capable of releasing 1 µmol of reduced sugar equivalent to

chitosan D-glucosamine per minute.

Chitooligosaccharide Production

Production of chitosan oligomers was accomplished through enzymatic

hydrolysis (using the crude extract of chitosanlytic enzymes of the fungus M.

anisopliae). The reactions were performed in a mixture containing a total volume of 1.0

mL (0.5 mL chitosan solution and 0.5 mL of crude enzyme extract). The reactions were

incubated at 55°C for 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutes. The reaction was stopped by

immersing the tube in boiling water for 10 minutes [30]. For the time of 48 h the

hydrolysates were analyzed in HPLC.

Analysis and Quantification of Chitosan Oligosaccharides

Detection of chitosan oligosaccharides was conducted using high performance

liquid chromatography (HPLC) and a Shim-Pack CLC-NH2 column (Shimadzu Co.,

Japan). Oligomer analysis was carried out using acetonitrile (60%) as a mobile phase at

a flow rate of 0.8 mL/min and a Refractive Index (RI) detector. The (GlcN) chitooligomer peaks were quantified using a standard curve (1-10 mg/mL) in

accordance with Liang [31].

54

n=2-6

Artigos Derivado da tese Results and discussion Production of Chitosanloytic Enzymes

In this work we chosen M. anisopliae for study because it is a entomopathogenic

fungus and produce chitinolitic enzymes, which are believed to have a role in the

digestion of insect cuticles, then it will possible produce inducible chitosanolytic

enzymes when in presence of chitosan as carbon and energy source. According ours

results the fungus M. anisopliae, when grown in a medium containing chitosan as its

sole source of carbon, is able to induce enzyme production with chitosanolytic

activities. Figures 1a and 1b show chitosanolytic enzymatic activity and the

concentration of reducing sugars, respectively, during cultivation of the fungus.

Figure. 1

Observed in Fig. 1a are two peaks showing chitosanolytic activity (48 and 170

h) with the most activity, 2.5 U/L, occurring after 48 hours of cultivation. A

chitosanolytic activity of 1.5 U/L was obtained using the Fusarium solani fungus [32],

which is the same order of magnitude as that obtained at 170 cultivation hours using M.

anisopliae. Regarding the time at which the highest peak of chitosanolytic activity was

obtained, the result is similar to that found by [15], who studied production of

chitinolytic enzymes by the M. anisopliae fungus in a medium containing chitin.

Metarhizium anisopliae, when grown in a medium containing chitin, is capable of

producing enzymes with chitinolytic activity. Some authors found that the chitinolytic

enzymes of the M. anisopliae fungus also seem to be dependent on the induction system

used, development stage, germination, or exponential growth phase [33,15].

Entopathogenic fungi such as M. anisopliae, when growing in a liquid culture

containing insect cuticles as a carbon source, produce a variety of chitinolytic enzymes

55

Artigos Derivado da tese [17]. With respect to the peak obtained at 170 hours of cultivation, a hypothesis for its

existence is that during the microorganism’s growth phase, it secretes enzymes

extracellularly to allow growth, most of which are endochitosanases and during

prolonged cultivation times it begins to secrete predominantly exochitosanases [15].

The amount of reducing sugars increased significantly, mainly due to the presence of

chitosanolytic enzymes in the culture medium, and reached the maximum in 48 hours,

the length of time in which chitosanolytic activity is maximized. Thus, the amount of

sugars formed by enzymatic hydrolysis is higher than that consumed by the

microorganism. There is a slight reduction of reducing sugars after 48 cultivation hours

(Fig. 1b). This fact can be explained by the use of reducing sugars for the metabolism of

the fungus itself.

Detection and Identification of Oligomers Produced During 48 Hours of Cultivation

During cultivation of the M. anisopliae microorganism the composition of the

broth containing chitosanolytic enzymes was analyzed using HPLC, as shown in the

chromatograms in Figs. 2 (a-b).

Figure 2

It is important to note that these oligomers were produced during 48 hours of

cultivation. These results show that during cultivation of the Metarhizium anisopliae

fungus the production of dimers to pentamers occurs. In Figure 1a we can observe that

the concentration of reducing sugars with 48 hours of cultivation was 0.55 mg/mL.

According to Figure 3, the concentration of total reducing sugars (dimers to pentamers)

was 0.5 mg/mL, showing that the amount of reducing sugars produced during 48 hours

of cultivation consisted of chitooligomers from dimers to pentamers. The other growing

56

Artigos Derivado da tese periods were not analyzed because our objective was to determine the cultivation time

in which we would see the highest enzymatic activity and assess whether oligomer

production occurred during this period. Later, the crude enzyme extract was used for

chitosan hydrolysis.

Figure 3 Oligomer production using the crude enzyme extract produced by the fungus

The crude extract (cell free) containing chitosanolytic enzymes produced by the

M. anisopliae fungus was used to hydrolyze chitosan (10 mg/mL) and the chitosanolytic

activity of this extract was 2.3 U/mL during hydrolysis (data not shown).The

chromatograms obtained from the enzymatic hydrolysis at different hydrolysis times

(10, 20, 30, 40, 50 and 60 min) are shown in Fig. 4 a, b, c, d, e and f, respectively.

Figure 4

Table 1 shows the yields of chitosan oligomers obtained at different hydrolysis times.

Table 1

The data verifies that the best yields were obtained within 10 minutes of

hydrolysis (54%). Taking into account the time and productivity of oligomers using the

crude enzyme extract of the M. anisopliae fungus, we can see that the enzymatic system

is very efficient. Choi et al. [34] obtained a total yield of 40% oligomers over 60

reaction hours using Bacillus sp. KCTC 0377BP chitosanase; and Roncal et al. [35],

using pure enzyme obtained from Sigma-Aldrich, obtained a yield of 46.3% COS.

57

Artigos Derivado da tese

Figure 5

In accordance with Figure 5 it is observed that the highest concentration of

oligomers was obtained at 10 minutes of hydrolysis, and as hydrolysis occurs, the

concentration of chitosan oligomers (dimers to pentamers) decreases. This decrease in

the concentration of COS may suggest that there is an increase in the production of the

chitosan monomer (GlcN) through a combined action mechanism of the complex of

chitosanolytic enzymes, a result of both endo- and exo-enzymes [36].

The biological properties of COS depend on the degree of polymerization.

Chitosan oligomers show higher biological activity than chitosan, and the best

functional characteristics are obtained with oligomers with a degree of polymerization

between pentamer and heptamer compared to oligomers with a relatively low degree of

polymerization [37].

According to Fig. 5, the maximum concentration of pentamers (0.8 mg/ml)

occurred with 10 minutes of hydrolysis. The hexamers were only detected after 30

minutes of hydrolysis at low concentrations (0.004 mg/mL).

The oligomer production system used in this study aimed at verifying the

possibility that enzymes produced by the M. anisopliae fungus would hydrolyze

chitosan into oligomers of commercial interest. Most studies on oligomer production

with a degree of polymerization between pentamers and hexamers were performed

using a continuous system with immobilized enzymes [21,22,38,39,40,41]. However, in

the present study a batch of satisfactory results were obtained.

Conclusion

COS have drawn considerable attention for their application, mainly in

medicine. Several authors have studied the production of COS using immobilized

58

Artigos Derivado da tese enzyme systems with the goal of increasing the production of products of interest,

mainly pentamers and hexamers. This process is more expensive because it usually

works with the purified enzyme in a continuous production system. This study verified

the ability of the M. anisopliae fungus to produce a crude enzyme extract in an

induction medium using chitosan as a main source of carbon. Later these chitosanolytic

enzymes were used in chitosan hydrolysis. In addition, the oligomers formed during 48

hours of microorganism cultivation were analyzed and the presence of dimers, trimers,

tetramers and pentamers was found, but in small concentrations. In order to increase the

concentration of oligomers chitosan hydrolysis was carried out using the crude enzyme

extract produced by the fungus. Higher concentrations of oligomers were obtained

during 10 minutes of hydrolysis. It was observed that the crude extract containing

chitosanolytic enzymes produced by M. anisopliae is effective in the production of

COS, facilitating its potential in industrial application.

Acknowledgments The authors thank Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP),

Conselho Nacional de Desenvolvimentos Científico e Tecnológico (CNPq) and

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) for support

that made this work possible.

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3,0

a

2,5

)

/ L 2,0

( U

tic

a

zim

1,5

n E

ctiv

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1,0

A

0,5

0,0

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a r

(m g

/m L

)

0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0

T im e o f C u ltiva tio n (h o u r)

0,55 b

0,50

0,45

0,40

0,35

0,30

0,25 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0

T im e (h o u rs) Fig. 1 (a) Production of chitosanase enzyme by M. anisopliae in medium containing

chitosan (0.2%), at 25ºC, 110 rpm and (b) reducing sugar produced during cultive.

Values are means of triplicate replicates with standard deviations less than 10%.

65


V o

lts

(m V

)

0,07

0,06

a

0,05

0,04

0,03

0,02

(G lcN )2

0,01 (G lcN ) (G lcN )4

3 (G lcN )5

(G lcN )6

0,00

5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8

T im e (m in u te s)

V o

lts

(m V

)

0,07

b 0,06

0,05 0,04 0,03 0,02

0,01 (G lcN )2 (G lcN )3 (G lcN )4 (G lcN )5

0,00 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

T im e (m in u te s) Fig. 2 Chromatograms of the (GlcN)n, 2-6 patterns (a) and of the production of COS

formed over 48 hours of cultivation of M. anisopliae (b). Chromatograms were

performed through HPLC of Shim-Pack CLC-NH2 column. Oligomer analysis was

carried out using acetonitrile (60%) as a mobile phase at a flow rate of 0.8 ml/min and a

Refractive Index (RI) detector.

66


[O li

g o

m e

rs]

m g

/m L

0,20 0,15 0,10 0,05 0,00

D im ers T rim ers T etram ers P entam ers Fig. 3 Concentration of oligosaccharides (dimers to pentamers) during 48 hours of

fungus cultivation in medium containing 0.2% chitosan, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4,

0.5 % KCl, 0.3% yeast extract, 0.5% peptone, 0.2% NaNO3, and 0.001% FeSO4 (pH

5.5). The growth was carried out in a rotation incubator for 2 days at 25°C and 110 rpm.

67

Artigos Derivado da tese 0,07

0,06 a

0,05

)

V 0,04

(m

lts

o 0,03

V

0,02

0,01 (G lcN )2

(G lcN )3

(G lcN )4 (G lcN )5

0,00

5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 T im e (m in u te s)

0,07

0,06 c

0,05

) 0,04

V

(m

lts

0,03 o

V

0,02

0,01 (G lcN )3

(G lcN )2 (G lcN )4 (G lcN )5 (G lcN )6

0,00

5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7

T im e (m in u te s) 0,07

0,06 e

0,05

) 0,04

V

(m

lts

0,03 o

V

0,02

0,01

(G lcN )3

(G lcN )2 (G lcN )4

0,00

5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5


0,07

0,06

b

0,05

) 0,04

V

(m

lts

0,03 o

V

0,02

0,01 (G lcN )3

(G lcN )2

(G lcN )4

(G lcN )5

0,00

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

T im e (m in u te s) 0,07

0,06 d

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) 0,04

V

(m

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0,03 o

V

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(G lcN )3

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0,01 (G lcN )4

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0,00

5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5

T im e (m in u te s )

0,07

0,06 f

0,05

) 0,04

V

(m

lts

0,03 o

V

0,02

(G lcN )3

0,01 (G lcN )2 (G lcN )4

0,00

5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5


Fig. 4 Chromatograms of hydrolyzed chitosan obtained by the incubation of chitosan

with the crude enzyme extract produced by the Metarhizium anisopliae fungus. (a) 10, (b) 20, (c) 30, (d) 40, (e) 50, (f) 60 minutes. Chromatograms were performed through

HPLC of Shim-Pack CLC-NH2 column. Oligomer analysis was carried out using

acetonitrile (60%) as a mobile phase at a flow rate of 0.8 ml/min and a Refractive Index

(RI) detector.

68


Table 1 (GlcN) 2-6 oligomers production by different times of hydrolysis measured in

HPLC

Hydrolysis Time Total Yields (mg/mL) Relative Production*

(minutes) (GlcN)2-6 (10mg/mL de chitosan)

10 5.43 54.3%

20 2.53 25.3%

30 1.87 18.7%

40 0.76 7.6%

50 1.06 10.6%

60 0.42 4.2%

* Relative production was measured by the total (GlcN) 2-6 yield/chitosan

concentration *100.

69


1,5

1,2

L

/m

0,9 g

m

rs]

e

0,6

m

o

lig

[O

0,3

0,0

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0

T im e h yd ro lysis (m in u te s) Fig. 5 Concentration of chitosan COS by the crude enzyme extract produced by Metarhizium anisopliae. Dimers (■), trimers (●), tetramers (▲), pentamers (▼) and

hexamers (♦) The results represent the ± SD mean of three experiments in triplicate

70

_______________________________ Artigo Submetido à Biomedicine and Pharmacoterapy

_______________________________

Title: Chitooligosaccharides antagonizes the cytotoxic effect of glucosamine Authors: Cristiane Fernandes de Assisa, Leandro Silva Costab, Raniere Fagundes Melo-

Silveirab, Ruth Medeiros de Oliveirab, Hugo Alexandre de Oliveira Rochab*, Gorete

Ribeiro de Macedoa, Everaldo Silvino dos Santos a

Affiliations: aDepartamento de Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil b Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil *Correspondente authors: Address: Departamento de Bioquímica Centro de Biociências, Av. Senador Salgado Filho, s/n, Lagoa Nova, 50072-970

NATAL - Rio Grande do Norte, BRAZIL Phone: 55-84-3215-3769 Fax: 55-84-3215-3770 Email address: [email protected]


Summary Chitooligosaccharides (COS) are partially hydrolyzed compounds of chitosan that

exhibit a number of biological activities such as antitumor, antibacterial and antifungal

action. In this work, we studied the cytotoxicity of pure COS and oligomers A, B and C

(solution composed by different amount of COS) produced by enzymatic hydrolysis

using a crude enzyme extract produced by the fungus Metarhrizium anisopliae. The

antiproliferative activity of these molecules was analyzed using tumor cell lines (HepG2

and HeLa cells) and in a normal cell line (3T3). The antioxidant activity was analyzed

by several in vitro tests. Glucosamine showed a higher toxic effect (about 92%) against

the all cell lines studied. However, the oligomers obtained after hydrolysis demonstrated

no toxic effects for the normal cells (3T3). Besides, it was showed that the small amount

of other COS can decrease the glucosamine citotoxic effect against 3T3 cells which

indicates that glucosamine could be used as antitumoral drug in the presence of other

COS. In addition, different effects were found in antiproliferative assays, depending on

the COS in the different composition of oligomers (A, B and C), showing that the

combination among them may be essential for developing antineoplastic drugs.

Superoxide anion scavenging was the mainly antioxidant activity showed by the COS

and oligomers. This activity was also depending on the oligomer composition in the

chitosan hydrolysates. Further work will identify ideal proportion among the COS and

glucosamine for several biological activities.

Keywords: Glucosamine, chitosan, chitosan hydrolysates, Metarhrizium anisopliae.

71

Artigos Derivado da tese 1. Introduction

Drugs used in the clinical treatment of cancer act mainly as antiproliferative

agents. They exhibit little selectivity [1] and attack fast-growing tissues by interfering

with cell division, inducing unbalanced growth, interspersing with or modifying DNA

or altering chromosome structure. [2]. Because of the diversity of proliferating host

tissues [3], these agents have limited clinical relevance owing to their toxic side effects

in normal host tissues [3]. Although antiproliferative drugs play a central role in the

clinical treatment of cancer, a new alternative for treating tumors could be evaluated.

Chitosan is a non-toxic N-deacylated biopolymer derived from chitin. It is

widely distributed in the exoskeleton of crustaceans and in the cell wall of fungi, insects

and yeasts [4]. Chitosan exhibits antitumor [5], antimicrobial [6] and antimutagenic [7]

activity. Although chitosan displays very strong biological activities, its insolubility in

water and high molecular weight are drawbacks in a number of applications [8]. Recent

studies of chitosan have increased the interest of its conversion to chitooligosaccharides

(COS) because these compounds are water-soluble, have low molar mass and several

functional properties such as antitumor [9, 10] and antioxidant activity [11].

Furthermore, they act as free radical scavengers [12] and exhibit antihepatotoxic [11]

and antiangiogenic activity [9].

The degradation of o-glycosidic bonds of chitosan using different methods

favors the production of COS with different degrees of polymerization as well as the

number and sequence of glucosamine (GlcN) and GlcNAc units. These methods include

acid hydrolysis [13], enzymatic hydrolysis [14], and oxidative degradation [15], among

others. Enzymatic hydrolysis has been proposed as a preferred method for the

production of bioactive COS for the past few decades. A host of chitosanlytic enzymes

72

Artigos Derivado da tese (chitosanases) have been obtained from different microorganisms such as fungi [16, 17]

and bacteria [18, 19].

The search for compounds that can inhibit tumor cell proliferation has resulted

in the emergence of cytotoxicity tests that measure viability and in vitro cell

proliferation. In vitro methods have a number of advantages over their in vivo

counterparts, such as limiting the number of experimental variables, obtaining

significant data more easily and often requiring a shorter test period [20]. A number of

researchers have studied the antitumor activity of oligomers obtained from chitosan and

their mechanism for inducing cell death [21, 10]. Accordingly, the aim of this study was

to assess cytotoxicity and cell proliferation in 3T3 (fibroblasts), HepG2 (heptocellular

carcinoma) and HeLa (adenocarcinoma) cell lines induced by pure oligosaccharides

acquired from Seikagaku Corp. (Japan) and a mixture of oligosaccharides obtained from

the enzymatic hydrolysis of chitosan using a crude enzyme extract produced by the

fungus Metarhizium anisopliae and evaluate their antioxidant activity in vitro.

2. Materials and methods 2.1. Reagents

Chitosan (85% deacetylated, molecular weight (MW): 90 - 190 Da) and standard

glucosamine, purchased from Sigma - Aldrich (MO, U.S.A.) Chitosan oligomer

standards (dimers, trimers, tetramers, pentamers and hexamers) were acquired from

Seikagaku Corp. (Japan). The other reagents used were of the highest quality available.

73

Artigos Derivado da tese 2.2. Preparation of chitosan

Water-soluble chitosan was obtained using the modified Yabuki method [22]. 2.3. Chitooligosaccharide production

Chitosan oligomer production was achieved by enzymatic hydrolysis (using the

crude extract of chitosanlytic enzymes from the fungus M. anisopliae). The reactions

were carried out in a mixture containing a total volume of 1.0 mL (0.5 mL of chitosan

solution - 10mg/mL and 0.5 mL of crude enzyme extract). The reactions were incubated

at 55ºC for 10, 30 and 40 minutes. The reaction was interrupted by immersing the tube

in boiling water for 10 minutes [23]. The hydrolysates, denominated here as hydrolysate

A, B, and C were analyzed in HPLC.

2.4. HPLC analysis of the hydrolysates

Chitosan oligosaccharides were detected by High Performance Liquid

Chromatography (HPLC), using a Shim - Pack CLC - NH2 column (Shimadzu

Co.,Japan). Oligomer analysis was performed in HPLC with acetonitrile (60%) mobile

phase, a flow of 0.8 mL/min and an RI detector. GlcN n = 1-6, peaks were identified

and estimated using a standard calibration curve (1-10 mg/mL) according to Liang’s

equation [24]. The total number of oligomers obtained by enzymatic hydrolysis was

considered to be 100% for the calculation of oligomer proportions.

2.5. Cell Culture

Embryonic 3T3 fibroblast cells (ATCC CCL-164) were provided by Prof.

Carmen Ferreira (Department of Biochemistry, UNICAMP, Brazil). Hepotocarcinoma

HepG2 (ATCC HB8065) and cervical adenocarcinoma HeLa cells (ATCC CCL-2) were

74

Artigos Derivado da tese also used in this work. The cells grew in DMEM supplemented with 10% newborn calf

serum (CUTILAB, Campinas-SP, Brazil) and penicillin/streptomycin (1µg/mL) (Sigma-

Aldrich, St. Louis, USA). The cells were incubated at 37ºC for 72 hours in a humidified

oven containing 5% CO2.

2.6. Cell proliferation assay

The in vitro proliferation assays were conducted as follows: 0.1 mL (5x103 cells)

of each cell suspension was transferred to 96-well polystyrene plates. Cell adhesion was

performed for 12 hours. Before the addition of chitosan oligomers, the medium

containing the non-adhered cells was removed and the oligomer-containing medium

(from 0.1 to 1 mg/mL) was used in the tests along with a control containing no

oligomers. Cell growth at 72 hours of incubation was assessed using the MTT method.

2.7. MTT Assay

After treatment, the cytotoxic effect of chitosan oligomers on HepG2, HeLa and

3T3 was determined using the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide)] method described by Mosmann [25] with modifications.

Briefly, the cells were washed with PBS (Phosphate Buffer Saline) at 37ºC and added

with 100µL of serum-free medium containing 0.5 mg/mL of MTT in each well. After 4

hours of incubation, the culture medium was removed and 100 µL of isopropyl alcohol

was added to each well for formazan solubilization. The plates were agitated for 10

minutes and absorbance was measured with a plate-reading spectrophotometer at 570

nm [26]. Absorbance of the treated cells was compared with that of the control, where

the cells, exposed only to the medium, were considered 100% viable.

75

Artigos Derivado da tese 2.8. Determination of total antioxidant capacity

The assay is based on the reduction of Mo (VI) to Mo (V) by the COS and

subsequent formation of a Green phosphate/Mo(V) complex at acid pH [27]. The tubes

containing sulfated polysaccharides and reagent solution (0.6 M) sulfuric acid, 28 mM sodium phosphate and 4 mM ammonium molybdate) were incubated at 95ºC for 90

min. After the mixture had cooled to room temperature, the absorbance of each solution

was measured at 695 nm against a blank. The antioxidant capacity was expressed as

ascorbic acid equivalent.

2.9. Hydroxyl radical scavenging activity assay

Hydroxyl radical scavenging activity assay The scavenging activity of COS

against the hydroxyl radical was investigated using Fenton’s reaction (Fe2 ++ + H2O2 →Fe3 ++ + OH- + OH-). These results were expressed as an inhibition rate. Hydroxyl

radicals were generated using a modified method [28] in 3 mL sodium phosphate buffer

(150 mM, pH 7.4), which contained 10 mM FeSO4.7H2O, 10 mM EDTA, 2 mM sodium

salicylate, 30% H2O2 (200 mL) and varying COS concentrations. In the control, sodium

phosphate buffer replaced H2O2. The solutions were incubated at 37ºC for 1 h, and the

presence of the hydroxyl radical was detected by monitoring absorbance at 510 nm. 2.10. Superoxide radical scavenging activity assay

The assay was based on the capacity of sulfated polysaccharides fractions to

inhibit the photochemical reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) in the riboflavin–

light–NBT system [29]. Each 3 mL reaction mixture contained 50 mM phosphate buffer

(pH 7.8), 13 mM methionine, 2 mM riboflavin, 100 mM EDTA, NBT (75 mM) and

1mL sample solution. The production of blue formazan was followed by monitoring the

76

Artigos Derivado da tese increase in absorbance at 560 nm after a 10 min illumination from a fluorescent lamp.

The entire reaction assembly was enclosed in a box lined with aluminum foil. Identical

tubes with the reaction mixture were kept in the dark and served as blanks.

2.11. Reducing power

The reducing power of the samples was quantified as described later [30].

Briefly, 4 mL of reaction mixture, containing different sample concentration in

phosphate buffer (0.2 M, pH 6.6), was incubated with potassium ferricyanide (1% w/v)

at 50 ºC for 20 min. The reaction was terminated by TCA solution (10% w/v). The

solution was then mixed with distilled water and ferric chloride (0.1% w/v) solution and

the absorbance was measured at 700 nm. The result was expressed as a percentage of

the activity shown by 0.2 mg/mL of vitamin C.

2.12. Ferric chelating

The ferrous ion chelating ability of samples was investigated according to

posterior studies [31]. Briefly, the reaction mixture, containing samples of FeCl2

(0.05mL, 2 mM) and ferrozine (0.2 mL, 5 mM), was shaken well and incubated for 10

min at room temperature. The absorbance of the mixture was measured at 562 nm

against a blank.

2.13. Statistical analysis

All data were expressed as mean ± standard deviation. Statistical analysis was

done by one-way Anova using the SIGMAStat version 2.01 computer software.

Student-Newmans-Keuls post-tests were performed for multiple group comparison. In

all cases statistical significance was set at p < 0.05.

77

Artigos Derivado da tese 3. Results 3.1. Chitosan hydrolysate composition

Chitosan hydrolysates contain a mixture of oligomers. The percentage of each

chitooligosaccharide is presented in Table 1. Chitosan monomer concentration increases

with hydrolysis time, whereas tetramers and pentamers decrease. Percent trimer remains

practically constant over the different hydrolysis times.

3.2. Assessment of cell proliferation and cytotoxicity

In this work, we investigated the cytotoxicity of chitosan oligomers in normal

(3T3) and tumor cells (HepG2 and HeLa) using the MTT assay. Normal cells should

always be used as standard to test the cytotoxicity of compounds. In this study 3T3 cells

(embryonic fibroblasts) were used to assess proliferation and cell toxicity.

Fig. 1 shows the results obtained when the cells were treated with chitosan

hydrolysates (compounds A, B and C). Compounds A and B did not cause significant

inhibition of 3T3 and HepG2 cells. Only compound C inhibited cell proliferation

(~20%). Furthermore, HeLa proliferation was inhibited by the compounds. The higher

activity was observed when compound A was used with 0.5 mg/mL, in this case the rate

of inhibition was about 60%. Table 3 shows the IC50 values obtained for the

compounds A, B and C.

As showed in Table 1 there are the presence of only the following COS

glucosamine, trimer, tetramer and pentamer in the compounds A, B and C. Thus, the

effect these COS on cell proliferation was also analyzed. Fig. 2 shows the viability (%)

of cells treated for 72 hours using these COS at concentrations ranging from 0.1 to 1

mg/mL. The trimer, tetramer and pentamer showed a weak antiproliferative activity.

78

Artigos Derivado da tese However, this last one showed a high antiproliferative activity against 3T3 (~90%). The

higher activity was observed with glucosamine. This compound (0.8 mg/mL) inhibited

proliferation of all the cell lines at the same extension (about 90%). The IC50 values

determined for glucosamine and hexamer were 0.39 and 1.3 mg/mL, respectively (See

table 2).

3.3. Antioxidant activity

Antioxidant activity was evaluated in different assays: total capacity antioxidant

(TCA), scavenging hydroxyl and superoxide radicals, ferric chelating, reducing power.

Total antioxidant activity (expressed in equivalents of ascorbic acid) demonstrated that

the pentameter was the compound that exhibited the highest total antioxidant activity

(62.74 mg/g equivalents of ascorbic acid (Fig. 3). None of the chitosan hydrolysates (A,

B, C) showed significant total antioxidant activity (p>0.05).

Hydroxyl radical and of the superoxide anion scavenging and ferric chelating in

the presence of COS is shown in Table 2. Anyone compound analyzed has neither

hydroxyl radical scavenging nor ferric chelating activity. However, all of them shown

activity in superoxide radical scavenging. The pentamer was the pure oligomer that

exhibited the highest activity (53%) with approximately 1.6-fold lesser than gallic acid,

respectively, at 0.5 mg/mL. All the compounds obtained from chitosan hydrolysis

showed superoxide anion scavenging activity and the greatest activity was exhibited by

hydrolysate A (58%) with approximately 1.5-fold lesser than gallic acid, respectively, at

0.5 mg/mL. The IC50 values found in this assay were: glucosamine (2.2mg/mL), trimer

(1.4mg/mL), tetramer (3.4mg/mL), pentamer (0.6mg/mL), A (0.05mg/mL), B

(0.9mg/mL), and C (1.6mg/mL).

79


Reducing power was expressed as a percentage, using ascorbic acid as control

(0.2mg/mL) and the data are shown in Fig. 4. The sugars are arranged from the highest

to the lowest activity, which ranged from 30% to 92%. Thus, two groups were clearly

distinguishable; the first group including compounds A and B, glucosamine, tetramer

and trimer; the second group including compound C (92%) and the pentamer (72%).

4. Discussion and Conclusions

Oligosaccharide production during enzymatic hydrolysis of chitosan is

influenced by the hydrolytic capacity of the enzyme used (non-specific enzymes or

chitosanases). According to Cabrera et al. [32], the hydrolysis potential (enzymatic

activity) and stability of each enzyme differ according to the conditions to which it is

submitted and its microbial origin. In this work, the conditions used for oligomer

production were determined in prior assays, which showed chitosan concentration of 10

mg/mL, enzymatic hydrolysis temperature of 55 ºC and pH of 5.5 (data not shown).

Liang et al. [24] determined chitin oligomer production, using a crude enzyme extract of

Bacillus amyloliquefaciens V656, which showed moderate endo and exochitinase

activity. The selective production of glucosamine (GlcN) from chitinolytic material was

accompanied by the cooperative action of both enzymes. Trimer (GlcN)3, tetramer

(GlcN)4 and pentamer (GlcN)5 were also produced.

Chitosan oligomers have attracted considerable attention owing to their

antitumor activity [5, 10, 8], which was first reported in 1970 [32]. This activity was

suggested mainly due to the cationic properties exerted on amino acid clusters. It would

subsequently be accepted that molecular weight also plays an important role in their

antitumor activity [5]. According to our results obtained for the pure oligomers, the

variations exhibited by COS in different cell lines indicate that their activity varies

80

Artigos Derivado da tese depending on the specific properties of each cell. In addition, an increase in the degree

of polymerization did not lead to an increase in cell proliferation inhibition. In fact,

glucosamine was more potent than other COS.

Glucosamine, a naturally-occurring sugar amino acid, is an important

carbohydrate component of many glycoproteins, glycolipids and glycosaminoglycans

[33]. Few works have shown toxic effect of glucosamine against cancer in vivo or in

vitro. Quastel and Cantero [34] administered glucosamine to tumor-bearing rats and

observed retraction of the nucleus and the cytoplasm and marked eosinophilia in the

neoplastic tissue within 2 hours. Rubin et al. [35] reported that the incubation of

Sarcoma 37 cells with D-glucosamine caused extensive cell degeneration. Fjelde et al.

[36] observed that glucosamine caused marked inhibition of epidermoid carcinoma cell

growth in tissue culture. Using histological examinations they observed striking nuclear

alterations and cytoplasmic granulation in neoplastic cells treated with glucosamine.

Molnar & Bekesi [37] verified cytoplasmic and nuclear alterations in Ehrlish cells

exposed to glucosamine. The cytotoxicity mechanisms of glucosamine are complex and

seem to be involved in the concatenation of several different effects [33]. The most

prominent and rapid alterations are produced in the cell membrane. Two hypotheses

have been suggested for its antitumor activity: the first theory is that glucosamine causes

tumor cell lysis through depletion of cell nucleotides; the second postulates that

structural disorganization occurs in the cell membrane system [37, 1].

Several works have shown glucosamine exhibits low toxicity against normal

tissues [35]. However, in this work glucosamine have shown high antiproliferative

activity against normal 3T3 cells when it was used in high concentration (0.5 and

1.0mg/mL). These results corroborate Mori et al. [38], who determined that high

concentrations of glucosamine inhibited the cell proliferation of L929 mice fibroblasts

81

Artigos Derivado da tese in cell cultures. The greatest challenge in cancer chemotherapy is to develop selective

drugs that are toxic for neoplastic cells without affecting normal host tissue [1].

Glucosamine could have a potential as antineoplastc drug it very important to block its

toxic effect for normal cells.

The compounds produced by enzymatic hydrolysis are composed of a mixture of

oligomers and according to the results of this study. All of them are composed mainly

by glucosamine (from 75 to 88%). However, even in high concentration, the

antiproliferative activity of these compounds against HeLa cells was lower than

glucosamine. In addition, when their antiproliferative effect was analyzed with 3T3 and

HepG2 only the compound C showed antiproliferative effect, whereas compounds B

and C did show any effect. These data indicate that the chitoligosaccharides present in

the compounds A, B and C seem to impede the toxicity mechanism of glucosamine.

Further work will identify the mechanism of action these chitoligosaccharides (COS).

The beneficial properties of COS has recently been recognized and exploited in

the development of nutricional food [39]. The health beneficial effects of COS can be

largely attributed to its antioxidant activity [40]. Anyone compound analyzed has

neither hydroxyl radical scavenging nor ferric chelating activity. However, all of them

showed superoxide anion scavenging activity. Earlier, it was reported that the

scavenging mechanism of chitosan is related to the fact that the free radical can react

with the residual free amino group NH2 to form ammonium groups NH3+ by absorbing

a hydrogen ion from solution [41]. This can explain superoxide anion scavenging

activity of the COS as well as the compounds A, B and C. The more potent superoxide

anion scavenging activity was found with the compound A (p<0.05). In addition, the

activity of the compounds C and B did not showed significant difference (p<0.569). The

compound A is the only that presents pentamer in its composition, which can explain its

82

Artigos Derivado da tese high activity in comparer to compounds B and C. Since, the pentamer was the pure

oligomer that exhibited the highest activity (53%) (Table 2).

All the molecules analyzed here showed reducing power. The compound C

showed stronger reducing power. It has been previously reported that there was a direct

correlation between antioxidant activities and reducing power of polysaccharide. The

reducing activities were usually related to the development of reductones. Reductones

were reported to be terminators of free radical chain reactions by donating a hydrogen

atom. In most cases, irrespective of the stage in the oxidative chain, in which the

antioxidant action is assessed, most nonenzymatic antioxidative activity is mediated by

redox reactions [31]. Thus, several workers have reported that the antioxidant activity

was concomitant with the reducing power. Zhang et al. [42] showed that

chitooligosaccharides with high donating-hydrogen abilities showed excellent reducing

power. So, the presence of NH2 groups in the COS is probably responsible for their

reducing power activity. In addition, our data suggest that the reducing power of COS

contributes to the antioxidant activity observed in this work.

The glucosamine has a higher antiproliferative activity against tumor cell. On

the other hand, it is active against normal cells. For the use of this monosaccharide as

antitumoral drug it is important to block or decrease its citotoxic effect against normal

cells. The oligomers produced by the raw extract of the enzyme from the fungus

Metarhizium anisopliae shows that the COS mixtures exert a pronounced effect on the

HeLa cells but not on HepG2 cells. Furthermore, the oligomers obtained (A, B, C)

demonstrated no toxic effects for the normal cells (3T3). Besides, we showed that the

small amount of other COS can decrease the glucosamine citotoxic effect against 3T3

cells which indicates that glucosamine could be used as antitumoral drug in the presence

of other COS. In addition, different effects were found in antiproliferative assays,

83

Artigos Derivado da tese depending on the COS composition in the compounds (A, B and C), showing that the

combination between them may be essential for developing antineoplastic drugs. In

addition to the antiproliferative effect of COS on tumor and non-tumor cells, we studied

the in vitro antioxidant properties that these compounds exhibit. Superoxide anion

scavenging was the mainly antioxidant activity showed by the COS. This activity was

also depending on the oligomer composition in the chitosan hydrolysates. Further work

will identify ideal proportion among the COS and glucosamine for several biological

activities.

Acknowledgements: The authors acknowledge Financiadora de Estudos e Projetos

(FINEP), Conselho Nacional de Desenvolvimentos Científico e Tecnológico (CNPq)

and (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) for

support that made this work possible.

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90


Table 1

Effect of hydrolysis time on the yield of (GlcN)1-6

Compound (GlcN) (GlcN)3 (GlcN)4 (GlcN)5

A 75% 11% 7% 6%

B 81% 11% 8% -b

C 88% 12% - -

Chitosan was hydrolyzed by the raw extract of an enzyme solution from the fungus M.

anisopliae at 55ºC for 10 (compound A), 30 (compound B) and 40 minutes (compound

C). GlcN – glucosamine; (GlcN)3 – trimer; (GlcN)4 – tetramer; (GlcN)5 – pentamer.

Total concentration of olygomers was considered 100%.

b Not detected

91

Artigos Derivado da tese Fig. 1. Cytotoxic assessment of the effect of the olygomer mixture on HepG2, HeLa and 3T3 cells. The cells were treated with different concentrations of the olygomer

mixture: compound A (GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4, (GlcN)5, compound B (GlcN), (GlcN)3

(GlcN)4, and compound C (GlcN), (GlcN)3, for 72 hours. In the absence of these

compounds the reduction of MTT was considered as being 0.0%. * p < 0.05.

92

Artigos Derivado da tese Fig. 2. Cytotoxic assessment of the effect of olygomers on HepG2, HeLa and 3T3

cells. The cells were treated with different concentrations of (GLcN), (GLcN)2,

(GLcN)3, (GLcN)4, (GLcN)5, and (GLcN)6 oligomers for 72 hours. In the absence of

these compounds the reduction of MTT was considered as being 0.0%. * p < 0.05. 93

Artigos Derivado da tese Fig. 3. Total antioxidant capacity of COS. Compound A [(GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4,

(GlcN)5], compound B [(GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4], and compound C [(GlcN), (GlcN)3].

The results are expressed as ascorbic acid equivalents. Data are expressed as

means±satardand deviation. Different letters indicates a significant difference between

COS by one –way Anova followed by Student -Newman-Keuls test (p<0.05).

94

Artigos Derivado da tese Table 2. Hidroxil and superoxide radical scavenging and Ferric chelating activity of COS.

COS Concentration (mg/mL) Inhibition (%)

O2- OH. Fe++

Glucosamine 0.10 20.5 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.20 24.7 ± 8.5 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.50 33.6 ± 9.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

1.00 32.0 ± 7.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

Trimer 0.10 3.2 ± 2.5 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.20 9.1 ± 4.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.50 16.2 ± 8.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

1.00 36.6 ± 1.9 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

Tetramer 0.10 3.5 ± 2.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.20 3.1 ± 3.5 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.50 16.4 ± 2.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

1.00 14.2 ± 1.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

Pentamer 0.10 45.7 ± 3.9 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.20 44.2 ± 0.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.50 48.9 ± 6.9 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

1.00 53.1 ± 1.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

Compound A 0.10 48.5 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.20 51.8 ± 4.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.50 57.1 ± 8.6 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

1.00 58.0 ± 8.8 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

Compound B 0.10 5.3 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.20 42.6 ± 8.3 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.50 41.6 ± 6.4 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

1.00 48.2 ± 6.8 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

Compound C 0.10 15.5 ± 3.1 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.20 28.1 ± 8.6 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

0.50 38.9 ± 0.2 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

1.00 40.0 ± 6.4 0.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0

Gallic acid 0.05 30.0 ± 3.0 12.6 ± 1.0 -

0.10 40.0 ± 4.1 44.6 ± 2.7 -

0.25 73.1 ± 2.5 63.7 ± 4.0 -

0.50 87.1 ± 3.1 94.5 ± 6.0 -

EDTA 0.10 - - 31.3 ± 0.7

0.20 - - 37.8 ± 2.7

0.50 - - 45.4 ± 1.1

1.00 - - 66.8 ± 0.8

95

Artigos Derivado da tese Fig.4. Reducing power of COS being Compound A [(GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4, (GlcN)5], compound B [(GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4], and compound C [(GlcN), (GlcN)3]. Data are expressed as means ± satandard deviation. Reducing power is expressed as a percentage of the activity shown by 0.2mg/mL of acid ascorbic.

96


Table 3

IC50 values of chitosan oligomers according to MTT assays in HepG2, HeLa and 3T3

cells.

IC50 (mg/mL)

COS HepG2 HeLa 3T3

GLcN 0.39 0.49 0.44

(GLcN)5 b 0.5 0.56

(GLcN)6 1.3 2.2 0.1

A b 0.60 b

B b 1.0 b

C b 1.95 b

b Not detected

Compound A (GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4, (GlcN)5

Compound B (GlcN), (GlcN)3 (GlcN)4

Compound C (GlcN), (GlcN)3 97

_______________________________

Short Communication

Submetido ao Brazilian Journal of Microbiology

_______________________________

Title: Cytotoxicity of chitosan oligomers produced by crude enzyme extract from the

fungus Metarhizium anisopliae in HepG2 and HeLa cells

Authors: Cristiane Fernandes de Assis1, Raniere Fagundes Melo-Silveira2, Ruth

Medeiros de Oliveira2, Leandro Silva Costa2, Hugo Alexandre de Oliveira Rocha2,

Gorete Ribeiro de Macedo1*, Everaldo Silvino dos Santos1

Affiliations: 1Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil

2 Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, Rio Grande do Norte, Brazil *Correspondente authors: Address: Departamento de Engenharia Química Centro de Tecnologia, Av. Senador Salgado Filho, s/n, Lagoa Nova, 50072-970 NATAL - Rio Grande do Norte, BRAZIL Phone: 55-84-3215-3769 Fax: 55-84-3215-3770 Email address: [email protected]

Artigos Derivado da Tese 1 Abstract

2 Chitooligosaccharides exhibit biological activities, including antitumor, antimicrobial

3 and antioxidant. In this study we used a mixture of chitooligosaccharides produced by

4 enzymatic hydrolysis in two tumor cell lines and assessed the cell proliferation and

5 cytotoxicity of these compounds. The proliferation of HeLa cells was inhibited by 60%.

6

7 key-words: chitooligosaccharides, HepG2 cells, HeLa cells, cytotoxicity

8

9

10 11

98

Artigos Derivado da Tese 12 MANUSCRIPT 13 In recent years, the research for more efficient alternatives in the treatment of 14 infectious and neoplastic diseases has mobilized professionals from a host of different 15 areas. Promising results have emerged from the use of substances produced by 16 microorganisms. 17 Chitosan is derived from chitin, an abundant polysaccharide in nature, extracted 18 mainly from crab, lobster and shrimp shells (14, 16). Chitosan is generally susceptible 19 to a number of different enzymes that indicate substrate specificity. Chitosanolytic 20 enzymes from different microorganisms, including fungi (6) and bacteria (7), have been 21 reported and used with excellent results in the production of chitooligosaccharides (17). 22 Chitooligosaccharides are partially hydrolyzed products of chitosan, within which 23 pentamers and hexamers can be obtained as intermediate reactions (11). A number of 24 chitooligosaccharides have been produced to investigate new substances with antifungal 25 (3), antibacterial (1), antitumor (4) and antioxidant (10) activity.

26 Two methods can be used to obtain chitooligosaccharides: chemical and

27 enzymatic. Chemical hydrolysis is carried out using high temperatures under acidic

28 conditions and produces a large amount of glucosamine (chitosan monomer),

29 compromising control over the reaction progress. This method produces low pentamer

30 and hexamer yields. Enzymatic hydrolysis has a number of advantages for the 31 production of chitooligosaccharides and some chitosanases may catalyze hydrolysis 32 under mild conditions and not produce monosaccharides (11). 33 Cytotoxicity studies conducted to assess cell viability can evaluate cell function 34 through membrane and organelle integrity, cell content (metabolite or macromolecule) 35 and enzymatic activity (9, 15, 13). 36 The aim of this study was to quantify and analyze the chitooligosaccharides

99

Artigos Derivado da Tese 37 produced during 20 minutes of enzymatic hydrolysis of chitosan and evaluate the 38 cytotoxicity and cell proliferation of these compounds in hepatocarcinome (HepG2) and 39 uterine carcinome (HeLa) cells. The 3T3 cell lines, which are fibroblast cells, were used 40 as standard non-toxic concentrations. 41 The fungus Metarhizium anisopliae was kindly gifted by Embrapa Recursos 42 Genéticos e Biotecnologia (Brasília/DF-Brazil). Ten milliliters of spore suspension (107 43 spores/mL) from a 5-day culture in PDA medium were transferred using 2 mL of sterile 44 water. Next, this spore suspension was once again transferred to a 250 mL Erlenmeyer 45 containing 90 mL of culture medium consisting of: 0.2% chitosan, 0.1% K2HPO4, 46 0.05% MgSO4, 0.5 % KCl, 0.3% yeast extract, 0.5% peptone, 0.2% NaNO3, 0.001% 47 FeSO4 (pH 5.5); growth took place in a rotating incubator (110 rpm) for 2 days at 25ºC. 48 From this suspension, 10mL was transferred to 90mL of the same medium. After 48 49 hours of culture the broth was centrifuged at 13400 x g for 15 minutes and the 50 supernatant was used to determine the enzymatic activity assay. The hydrolysis reaction 51 of chitosan to obtain the chitooligosaccharides consisted of mixing a solution of 1% 52 (m/v) soluble chitosan in chloridric acid (pH adjusted with NaOH to 5.5) to the broth 53 fermented at a ratio of 1:1; the mixture was maintained at 55°C for 20 minutes. The 54 reaction was finalized by the thermal inactivation of the enzyme at 100°C for 10 55 minutes, followed by centrifugation at 13400 x g for 15 minutes and filtration in a 0.22 56 µm filtering membrane. Detection of glucosamine and of chitosan oligosaccharides 57 from dimer to hexamer was determined by high-performance liquid chromatography 58 using a CLC-NH2 Shim-Pack column (Shimadzu Co, Japan). Oligomer analysis was 59 performed in HPLC with 60% acetonitrile as mobile phase and flow rate of 0.8 mL/min

60 and using an RI detector. The peaks of (GlcN) n = 1-6 were identified and estimated using

61 a standard calibration curve (1-10 mg/mL) according to Liang’s equation (8). Embryo

100

Artigos Derivado da Tese 62 3T3 fibroblast cells (ATCC CCL-164), HepG2 hepatocarcinome cells (ATCC HB- 63 8065) and cervical adenocarcinome HeLa cells (ATCC CCL-2) were used for 64 proliferation and cytotoxicity. The cells grew in DMEM medium (Dulbecco's Modified 65 Eagle Medium) supplemented with 10% newborn calf serum (CUTILAB, Campinas- 66 SP, Brazil) and penicillin/streptomycin (1µg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). The 67 cells were incubated in oven at 37ºC under moisture atmosphere containing 5% CO2. 68 The proliferation assays were conducted in vitro as follows: 100µL (5x103 cells) of cell 69 suspension was plated in 96-well polystyrene plates. Cell adhesion was conducted for 70 12h. Before the addition of chitosan oligomers, the medium with the non-adhered cells 71 was removed and the medium containing the oligomers (from 0.1 to 1 mg/mL) was 72 used. A control without oligomers was also used. After treatment, the cytotoxic effect of 73 the chitosan oligomers in HepG2, HeLa 3T3 cells was determined using the MIT 74 method described by Mosmann (12) with some modifications. The cells were washed 75 with PBS at 37ºC and then 100µL of serum-free medium containing 0.5mg/mL of MTT 76 was added to each well. After 4 hours of incubation, the culture medium was removed 77 and 100 µL of isopropyl alcohol was added to each well for solubilization of the 78 formazan formed. The plates were agitated for 10 minutes and the mean absorbance of 79 the plate was measured in the spectrophotometer at 570 nm (2). The absorbance of the 80 treated cells was compared with that of the control. The control cells were considered 81 100% viable, whereas the percentage of cell growth inhibition was calculated for those 82 treated with the hydrolysate. All the analyses were conducted in triplicate. 83 The products of chitosan hydrolysis were analyzed by HPLC. Figure 1 shows the 84 croncentration obtained for a hydrolysis time of 20 minutes using the crude enzyme 85 extract. This figure also demonstrates the formation of monomers (GlcN), trimers 86 (GlcN)3, tetramers (GlcN)4 and pentamers (GlcN)5 at concentrations of 6.532; 0.792;

101

Artigos Derivado da Tese 87 0.395 and 0.352 (mg/mL), respectively. The monomer (glucosamine) shows the highest

88 concentration. Such a polymer profile suggests the presence of enzymes with exo and

89 endochitosanase activity (18).

90

91 Figure 1

92

93 Figure 2 shows the cytotoxicity of the tested compounds in tumor and normal

94 cells. In the MTT assays we used different hydrolysate concentrations containing a

95 mixture of chitooligosaccharides (0.1 – 1 mg/mL) in the different cell lines.

96

97 Figure 2

98

99 The 3T3 cells were used as control to assess the toxicity of the compound. When

100 these cells were treated with the hydrolysate containing the chitosan oligomers, no 101 alteration in cell proliferation was detected. Thus, the tumor cells (HepG2 and HeLa) 102 were treated with concentrations that were non-toxic to normal cells. 103 The HepG2 cells, when treated with the chitooligosaccharides at a concentration 104 of 0.2 mg/mL, induced cell proliferation of 20% and at higher concentrations, it 105 remained practically unaltered. These results corroborate literature data, in that 106 chitooligosaccharides did not show any activity against Hep3B cells (9). 107 In the HeLa cells, diminished cell viability was directly proportional to the 108 increase in concentration, where cell viability decreased by 60% at a concentration of

109 0.5 mg/mL. Similar results were found by Jeon and Kim (5), where

110 chitooligosaccharides inhibited uterine tumors in rats by 73.6%. The modified

111 chitooligosaccharides used in HeLa cells showed an IC50 value of 0.45 mg/mL (9) and

102

Artigos Derivado da Tese

112 similar results were found in this study, where IC50 was 0.67 mg/mL. Kim and

113 Rajapakse (18) observed that a mixture of chitosan oligomers from tetramer to pentamer

114 could inhibit tumor cell growth in rats. The biological functions of 115 chitooligosaccharides depend not only on the degree of polymerization (18,19). 116 According to the results obtained, chitooligosaccharides may reduce the viability 117 of HeLa tumor cells. The effect of the antitumor activity of chitooligosaccharides is 118 mainly due to stimulation in the immune system, increasing in vivo macrophage 119 activity. However, according to our findings, chitosan oligomers act directly on HeLa 120 tumor cells, decreasing cell proliferation and viability. Moreover, it is interesting to 121 observe the non-toxicity of the compound in 3T3 fibroblast cells. 122 123 Acknowledgements: The authors thank Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), 124

Conselho Nacional de Desenvolvimentos Científico e Tecnológico (CNPq) and 125 (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) for financial 126 support that made this work possible. 127 128 REFERENCES 129 1. Cheng, C.Y.; Li Y. (2000). An Aspergillus chitosanase with potential for large- 130 scale preparation of chitosan oligosaccharides. Biotechnol. Appl. Biochem. 32, 197-203. 131 2. Denizot, F.; Lang, R. (1986). Rapid colorimetric assay for cell growth and 132 survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity 133 and reliability. J Immunol Methods 89, 271-277.

103

Artigos Derivado da Tese 134 3. Hirano, S.; Nagao, N. (1989) Effects of chitosan, pectic acid lysozyme and 135 chitinase on the growth of several phytopathogens. Agric. and Biol. Chem. 53, 3065- 136 3066. 137 4. Huang, R.E.; Mendis, E.; Rajapakse, N.; Kim, S.K. (2006). Strong electronic 138 charge as an important factor for anticancer activity of chitooligosaccharides (COS). Lif. 139 Sci. 78 (20), 2399-2408. 140 5. Jeon, Y.J.; Kim, S.K. (2002). Antitumor activity of chitosan oligosaccharides 141 produced in an ultra filtration membrane reactor system. J. Microbiol. Biotechnol. 12, 142 503-507. 143 6. Kim, S.Y.; Shon, D.H.; Lee, K. H. (1998) Purification and characteristics of two 144 types of chitosanases from Aspergillus fumigatus. J. Microbiol. Biotech. 8, 568-574. 145 7. Lee, H-W.; Choi, J-W.; Han, D-P.; Lee, N-W.; Park, S-L.; Yi, D-H. (1996). 146 Purification and characteristics of chitosanase from Bacillus sp. HW-002. J. Microbiol. 147 Biotech. 6, 12-18. 148 8. Liang, T-W.; Chen, Y-J.; Yen Y-H.; Wang, S-L. (2007) The antitumor activity 149 of the hydrolysates of chitinous materials hydrolyzed by crude enzyme from Bacillus 150 amyloliquefaciens V656. Proc. Biochem. 42(4), 527 - 534. 151 9. Loveland, B.E.; Jonhs, T.G.; Mackay, I.R.; Vaillant, F.; Wang, Z.X.; Hertzog, 152 P.J. (1992). Validation of the MTT dye assay for enumeration of cells in proliferative 153 and antiproliferative assays. Biochem. Int. 27, 501-510. 154 10. Mendis, E.; Kim, M. M.; Rajapakse, N.; Kim, S. (2007). An in vitro cellular 155 analysis of radical scavenging efficacy of chitooligosaccharides. Lif. Sci. 80, 2118 – 156 2127.

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Artigos Derivado da Tese 157 11. Ming, M.; Kuroiwa, T.; Ichikawa, S.; Sato, S.; Mukataka, S. (2006). Production 158 of chitosan oligosaccharides by chitosanase directly immobilized on an agar gel-coated 159 multidisk impeller. Biochem. Engin. J. 28 (3), 289-294. 160 12. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: 161 application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods 65, 55-63. 162 13. Olivier, P.; Testard, P.; Marzin, D.; Abbott, D. (1995). Effect of high polyol 163 concentrations on the neutral red absorption assay and tetrazolium – MTT test of rat 164 hepatocytes in primary culture. Toxicon. Vitr. 9, 133-138. 165 14. Pelletier, A.; Sygusch, J. (1990). Purification and characterization of three 166 chitosanase activities from Bacillus megaterium P1. Appl. Environ. Microbiol. 56 (4), 167 844-848. 168 15. Repeto, G.; Sanz, P. (1993). Neutral red uptake, cellular growth and lysosomal 169 function: in vitro effect of 24 metals. ATLA. 21, 501-507. 170 16. Somoshekar, D.; Joseph, R. (1996) Chitosanases - Properties and applications: a 171 review. Bioresource Technol. 55, 35-55. 172 17. Zhang, H.; Du, Y.; Yu, X.; Mitsutomi, M.; Aiba, S. (1999). Preparation of 173 chitooligosaccharides from chitosan by a complex enzyme. Carbohydr. Res. 320, 257– 174 260. 175 18. Kim, S-K.; Rajapakse, N. (2005). Enzymatic production and biological activities 176 of chitosan oligosaccharides (COS): A review. Carbohydrate Polymers 62(4): 357368. 177 19. Shen, K-T.; Chen, M-H.; Chan, H-Y.; Jeng, J-H.;Wang, Y-J. (2009). Inhibitory 178 effects of chitooligosaccharides on tumor growth and metastasis. Food Chem Toxic 47: 179 1864-1871. 180 181

105

Artigos Derivado da Tese 182 183 184 185 186 187 188

7

6

) L

/m

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C 1

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(G lcN ) (G lcN )3 (G lcN )4 (G lcN )5 189 190 Figure 1. Concentration of chitooligosaccharides formed by the incubation of chitosan 191 with the crude enzyme extract during 20 minutes. 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202

106

Artigos Derivado da Tese 203 204 205 206 207 208 209 210 211

1 2 0

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C h ito o lig o sa cch a rid e s (m g /m L )

212 213 Figure 2. Cytotoxic assessment of the effect of the oligomer mixture in HepG2 (■), 214 HeLa (●) and 3T3 (♦) cells. The cells were treated with different concentrations of the 215 supernatant, for 72 hours. In the absence of these compounds the reduction of MTT was 216 considered as being 100%. The experiment was carried out in 96-well plates. The 217 results represent the mean ± SD of three experiments in triplicate. (p < 0.05). 218 219 220 221

107

_______________________________

CAPITULO 4

CONSIDERAÇÕES FINAIS

_______________________________

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

A Biotecnologia é um ramo muito amplo da Tecnologia que se ocupa da transformação ou tratamento de materiais de origem biológica. De certa forma, os

processos fermentativos representam um elo que liga as antigas artes de elaboração de

alimentos (por exemplo, queijos, vinho), mediante o uso de uma flora microbiana

natural com a moderna indústria de fermentação de alimentos que utilizava cultivos

puros e sofisticados equipamentos de controle do processo.

Apesar da utilização de microrganismos para a produção de enzimas por sistema

de indução já está bem consolidada dentro da biotecnologia, a busca crescente por

microrganismos com potencial para transformação de substrato em produtos de maior

valor agregado aumenta a cada dia.

Inicialmente, tentou-se produzir o extrato bruto enzimático a partir da hidrólise

da quitosana utilizando o fungo Aspergillus ochraceus, porém esse microrganismo não

foi capaz de hidrolisar a quitosana produzindo os quitooligossacarídeos.

O fungo Metarhizium anisopliae foi capaz de produzir, através de mecanismos

de indução, um extrato bruto da enzima que hidrolisam a quitosana. A hidrólise da

quitosana em diferentes tempos apresentou a produção de quitooligossacarídeos

(dímeros a hexâmeros), e com 10 minutos de hidrólise houve a maior concentração dos

oligômeros (dímeros a pentâmeros) enquanto o hexâmero só foi detectado com 30

minutos de hidrólise (primeiro artigo). Após verificar que o extrato bruto enzimático é

capaz de produzir o quitooligossacarídeos (dímeros a hexâmeros) com concentrações

significativas para um processo descontínuo, identificou-se também a produção do

monômero.

Os tratamentos quimioterápicos existentes geralmente ocasionam uma série de reações adversas por atuarem contra células normais e a busca crescente por

108

medicamentos que minimizem essas reações é constante. O estudo comparativo entre os

oligômeros puros e a mistura dos QCOS foi apresentado no segundo artigo. Apesar da

grande importância dada aos QCOS de maior grau de polimerização (pentâmeros a

heptâmeros) com relação as suas atividades biológicas, a glicosamina apresentou maior

citotoxicidade nas três linhagens de células (HeLa, HepG2 e 3T3), mostrando ser um

importante alvo na terapia contra o câncer. Porém, a toxicidade da glicosamina em

células normais (3T3) pode ser um impedimento para sua utilização na terapêutica, mas

a associação dela com outros oligômeros é interessate, porque provavelmente atua

minimizando a toxicidade da glicosamina em células normais.

Neste trabalho foi visto que os QCOS também apresentam atividade

antioxidante, principalmente contra o ânion superóxido indicando que no futuro poderá

ser uma alternativa para ser incluída em dietas com propriedades antioxidantes. O

radical superóxido é produzido pelo metabolismo normal das células e elas têm

mecanismos para eliminar esse radical que pode prejudicar o sistema celular. A enzima

superóxido desmutase é responsável pela conversão desse ânion em peróxido de

hidrogênio que posteriormente irá se transformar em água e oxigênio. Entretanto,

quando a produção desse anion é muito grande a célula não consegue eliminá-lo e então

causará danos a célula como a peroxidação lipídica, danos a proteínas e ao DNA. Dietas

contendo antioxidantes estão sendo responsáveis por evitar o envelhecimento precoce e

algumas doenças relacionadas ao estresse oxidativo.

5.1. Trabalhos futuros

A produção de um extrato bruto de enzimas por fermentação descontínua

utilizando um fungo entomopatogênico que hidrolisa a quitosana dá início a uma série

de trabalhos futuros, como por exemplo, o melhoramento do meio de cultivo para

109

aumento da produção da enzima. A caracterização parcial e cinética da enzima foi

realizada, porém um estudo mais aprofundado sobre inibidores e ativadores é essencial

para conhecer os fatores que interferem na atividade desta enzima. O estudo das

atividades biológicas destes compostos é um passo importante para o desenvolvimento

de novos trabalhos como verificar o mecanismo de morte celular induzido por esses

compostos.

110

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