Prof. Ronald NetoBiomédico – Lab. Citogenética USS

Replicação de Ac. Nucléicos in vitro

Replicação de DNA

in vivo:

• Biossíntese de DNA a partir de um molde de DNA

• Ocorre na fase S

• Ocorre no sentido 5’ – 3’• contínua• descontínua (Fragmentos de OKASAKI)

• Semi-conservativo

• Várias origens de replicação (A-T)

Replicação de DNA

Componentes da reação:

• Primer

• Helicase

• DNA Polimerase SIGMA

• Topoisomerase

• Primase

• DNA Ligase

Replicação de DNA

Reação em Cadeia da Polimerase – PCR(polymerase chain reaction)

Descoberta:

1983- Kary Banks Mullis

1985- 1º paper (Nature/Science - recusado)

1993 - Nobel da Química

• Método de amplificação rápida in vitro de seguimentos específicos de ácidos nucléicos.

• Se baseia em uma ação enzimática através de ciclos contínuos de alternância de temperaturas.

PCR

Princípios da metodologia:

Etapas da PCR:

Coleta e Preparo da Amostra

Extração de DNA

PCR

Detecção e Análise de Resultados

Enzima - Polimerase termoestável (Tac ou Pfu);

dNTPs - A,T,C,G;

Molde ou Template;

Um ou mais pares de primers;

Tampão e sais;

Cofatores enzimáticos;

TERMOCICLADOR

Componentes da PCR:

Temperatura:

Desnaturação: 95o C

Hibridização: 60oC

Extensão: 72oC

Vários Ciclos: 30

Condições da PCR:

PCR

Video:

Análise:

Aplicações:

• Diagnósticos de doenças genéticas e infecciosas;

• Estabelecimento de vínculo genético;

• Genética forense;

• Pesquisa;

PCR por um mundo melhor

ronald.neto@bol.com.br