Prof. Dra. Adriana DantasUERGS – Bento Gonçalves

• Watson e Crick propuseram, em 1953, um modelo de modelo de molécula de DNAmolécula de DNA, que seria em DUPLA HÉLICEDUPLA HÉLICE e em ESPIRAL, com duas cadeias de nucleotídeos ligados por PONTES DE HIDROGÊNIO.

Informações disponíveis, quais eram:

1- a molécula de DNA era grande, longa, fina e composta de nucleotídeos: adenina; guanina; timina e citosina;

2- Os estudos de difração de raios X, realizados por Maurice King e Rosalind Franklin sugeriam a forma helicoidal;

3- Linus Pauling (1950), descreveu a estrutura helicoidal com um filamento mantida por pontes de hidrogênio em proteínas e sugeriu que o mesmo pudesse ocorrer com o DNA;

4- Erwin Chargaff havia demonstrado que a proporção entre os nucleotídeos A e T era de 1:1, o mesmo acontecendo entre G e C.

Difração de Raios-X

34A

Estrutura Molecular

O Ácido Desoxirribonucléico é um polinucleotídeo formado por duas “fitas” ou hélices ligadas entre si por pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas.

O pareamento das bases sempre segue a mesma ordem: Adenina com Timina e Guanina com Citosina.

Polímero longo:Polímero longo:

1. A ligação entre a base nitrogenada e a pentose é feita covalentemente através de uma ligação N-glicosídica com a hidroxila ligada ao carbono-1 da pentose.

•2. Os nucleotídeos são unidos por ligações fosfodiéster covalentes que ligar o carbono 5´de um grupo desoxirribose (pentose + base) ao carbono 3´do próximo

Base

Pentose

1

24

1

2

Portanto::

1) ÁCIDOS NUCLEICOS são compostos por nucleotídeos ligados entre si através de ligação covalente.

2) NUCLEOTÍDEOS são as unidades fundamentais dos ácidos nucléicos. Cada nucleotídeo é constituído por um grupo fosfato, uma pentose e uma base.

Purinas: Adenina, GuaninaBASES

Pirimidinas: Citosina, Timina, UracilaDNA RNA

GuaninaAdenina

Purinas

Citosina Timina Uracil

Pirimidinas

-Transportar muita informação, de célula para célula e de geração para geração;

-Capacidade de produzir cópias exatas de si mesmo, pois os cromossomos são copiados em cada divisão celular;

-Capacidade de “replicar erros” de cópia, como se fossem o gene original;

-Apresenta mecanismo de decodificação da informação armazenada, traduzindo-as através da produção de enzimas/proteínas;

-O DNA é chamado de “molécula da vida” pois contém o código pra construção das proteínas em todos os seres vivos;

-Nos eucariontes, o DNA é encontrado no núcleo celular formando os cromossomos e também nas mitocôndrias e nos cloroplastos;

-Nos procariontes encontra-se uma molécula de DNA circular (cromossomo bacteriano) e outras moléculas circulares chamadas plasmídeos;

A Importância do DNAA Importância do DNA

As seqüências ose-fosfato são representadas pelas linhas, e as seqüências de pares de bases é aleatória

Se replicação é semi-conservativa e a polimerização deve ser sempre no sentido 5´→3´

Mas o DNA é antiparalelo ou seja, uma fita ocorre no sentido 5’ → 3’ e a outra no sentido 3’ → 5’

Como ocorre então a replicação nos dois sentidos?

A dupla hélice é como um zíper que se abre, começando por uma ponta, a deselicoidizaçaodeselicoidizaçao dos dois filamentos irá expor as bases isoladas de cada filamento.

Cada base exposta irá se parear apenas com sua base complementar;

Um dos filamentos isolados irá agir como molde e começará a formar uma dupla hélice idêntica a que foi aberta;

Os nucleotídeos será adicionados supostamente vem de reservatório livre presentes na células

Replicação do DNA

O mecanismo O mecanismo de replicação de replicação está baseado está baseado no pareamento no pareamento das bases da das bases da dupla hélice do dupla hélice do DNA.DNA.

A estrutura do A estrutura do DNA contém a DNA contém a informação informação necessária para necessária para perpetuar sua perpetuar sua seqüência de seqüência de basesbases

A replicação da E. coli começa a partir de uma origem fixa, progride bi-direcionalmente

A forquilha se move em ambas as partes, terminando num local chamado términotérmino

A origem única é chamada oriCoriC, tem 245 pb de comprimento;

Seqüência em tandem com 13 pb, chamada seqüência de consenso;

Seqüência de pontos de ligação com uma proteína, onde ocorre etapa inicial na síntese do DNA

Origens de replicaçãoOrigens de replicação

OriCOriC - cromossomo de E.coli

Nos eucariotos são abertos várias Nos eucariotos são abertos várias "bolhas de replicação" ou replicons"bolhas de replicação" ou replicons

Autoradiografias feitas por J. Cairns (1963) em DNA de E. coli tratadas com meio contendo Trimidina comprovaram que a replicação é semi-conservativa, bidirecional e que o DNA e circular.

A replicação do cromossomo circular

RepliconReplicon: : Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação

Replicon:Replicon:

1. Origem + Término

2. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular

3. O genoma de uma célula procariótica constitui um únicoúnico replicon

4. Cada cromossomo eucariótico constitui vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente

O genoma bacteriano circular constitui um único replicon

A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min

Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)

Origem da replicação

Forquilhas de

replicação

Fitas novas

Fitas velhas

Origem da replicação

Forquilhas de

replicação

Fitas novas

Fitas velhas

Origem da replicação

Forquilhas de

replicação

Fitas novas

Fitas velhas

Origem da replicação

Forquilhas de

replicação

Fitas novas

Fitas velhas

O genoma eucariótico constitui vários replicons

A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000 pb/min

Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes

Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática

A síntese de DNA deve ser iniciada com um primer, oligonucleotideos curtos, que gera um segmento de DNA duplex;

A replicação de cromossomos de E. coli usa primers de RNA, são sintetizados ou pela RNA polimerase ou pela enzima primase;

Primase sintetiza um trecho curto (aproximadamente 30 pb) de RNA complementar a uma região especifica do cromossomo;

A Cadeia de RNA é então amplificada com DNA pela DNA polimerase

A primase de E. coli forma um complexo com o molde de DNA e proteínas adicionais, com dnaB, dnaT, priB e priC. O complexo total é chamado de primossomo;

DNA polimerase sintetizam novas cadeias no sentido 5’- 3’;

Devido a polaridade inversa da molécula de DNA, movem-se no sentido 3’- 5’no filamento molde;

Enquanto o filamento leading(novo) é sintetizado continuamente, o lagging é sintetizado em segmentos curtos e descontínuos

O novo filamento cresce em sentido oposto da forquilha de replicação

Em E.coli a poli III faz a maior parte da síntese do DNA em ambos os filamentos, a poli I completa os espaço deixados no filamento lagging, que então são fechados pela DNA ligase

Fita contínua (líder)

Fita descontínua

Polimerases de DNA: As enzimas que sintetizam DNA

A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3´OH da cadeia em crescimento.

O precursor da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato

Sentido da síntese sempre é 5’ 3’

A replicação é um processo extremamente fiel. As DNA-polimerases tem atividade revisora

DNA polimerase•A DNA polimerase estendem a cadeia, (polimerizaçãopolimerização) mas não podem iniciar a cadeia

•DNA polimerase - enzima que catalisa a reação de replicação

•Reação funciona com as formas de trifosfato dos nucleotídeos

•Quantidade total de DNA ao final da reação pode ser de até 20 vezes a quantidade original de DNA.

As enzimas e suas açõesAs enzimas e suas ações

Polimerases:Polimerases: todas podem tanto adicionar como remover nucleotídeos, somente no sentido 5’ → 3’;

Quando removem do final do filamento são chamadas de exonucleasesexonucleases

Se os removem em algum outro lugar do filamento, são chamadas de endonucleasesendonucleases..

A remoção é feita no sentido inverso, ou seja 3’ → 5’.

Desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato (precursor)

Fita sendo polimerizada

Fita molde

As DNA-polimerases sempresempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado

Atividade revisora 3’ 5’ garante a fidelidade da replicação

Tipo Função

DNA Polimerase I DNA Polimerase I Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5´3´Atividade de exonuclease 3´5´ e 5´3´Preenche pedaços pequenos de DNA durante a replicação e processo de reparo

DNA Polimerase II DNA Polimerase II Polimerase alternativa de reparo, mas também pode replicar DNA quando o filamento molde é danificado

DNA Polimerase III DNA Polimerase III Catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5´3´. É a polimerase primária durante a replicação normal do DNA

Helicases são enzimas que rompem pontes de hidrogênio que unem os dois filamentos de DNA na dupla hélice;

Entre as helicases de E.coli estão a proteína dnaB e rep;

Gera torções no DNA circular que tem que ser removidas para permitir que a replicação continue;

A superelicoidizaçao pode ser criada ou relaxada por enzimas chamadas topoisomerases;

As topoisomerases podem induzir ou remover alças, ou ligações em uma cadeia.

Proteínas de iniciação identificam a origem da replicação e participam da ligação da DNA helicase ao DNA;

A proteína de iniciação acoplada à DNA helicase abre o DNA na junção “Y”.

As pontes de H se rompem e a molécula se abre como um zíper e se desespiraliza e a ela unem-se a primase e outras proteínas

(DNA helicase + primase + outras proteínas = primossomo)

As fitas se mantêm separadas durante a replicação graças à ação de uma proteína a Single-strand binding proteins - SSB

A primase (que é uma RNA-polimerase) constrói o primer de RNA em uma região não coberta pelas SSB;

A topo isomerase alivia a tensão da espiralização provocada pela abertura do DNA Ex. DNA girase;

A DNA polimerase (III) sintetiza as novas cadeias.

Capturam os nucleotídeos, prontos com um trifosfato, os levam ao molde, retiram dois fosfatos e os ligam ao C 3’ do nucleotídeo anterior.

A polimerização ocorre muito rapidamente (100.000 (100.000 nucl./min)nucl./min).

Outras DNA polimerases preenchem as falhas e corrigem erros.

Os Fragmentos de Okazaki (complementam o filamento lagging);

É formado um primer de RNA pela enzima primase;

Os primers são continuados pela DNA polimerase III até o primer do próximo fragmento de Okasaki;

DNA polimerase I retira o primer de RNA e completa o pedaço com nucleotídeos corretos;

Os fragmentos são ligados pelas DNA ligases.

Duas DNA polimerases III ficam unidas e trabalham conjuntamente, a helicase e a primase movem-se ao longo do DNA;

O filamento leading é alimentado imediatamente pela polimerase;

O filamento lagging não é complementado pela polimerase até que um primer seja colocado sobre o filamento.;

Isto significaIsto significa: que um longo pedaço de DNA fica aberto durante o processo e que a replicação que ocorre primeiro no filamento leading enquanto a do filamento lagging ocorre em pulsos

A subunidade Beta da DNA-polimerase III envolve o duplex das fitas-filhas

Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coliDnaADnaA Reconhece a origem e abre a dupla Reconhece a origem e abre a dupla

fita em sítios específicosfita em sítios específicos

DnaB (helicase)DnaB (helicase) Desenrola o DNADesenrola o DNA

DnaCDnaC Auxilia a ligação de DnaB na origemAuxilia a ligação de DnaB na origem

HUHU Proteína do tipo histona que estimula Proteína do tipo histona que estimula a iniciaçãoa iniciação

Primase (DnaG)Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNASintetiza os primers de RNA

Single strand Single strand binding (SSB)binding (SSB)

Liga a fita simples de DNALiga a fita simples de DNA

RNA polimeraseRNA polimerase Facilita a ação da DnaAFacilita a ação da DnaA

DNA giraseDNA girase Alivia a tensão torsional gerada pela Alivia a tensão torsional gerada pela abertura da dupla-fitaabertura da dupla-fita

Dam MetilaseDam Metilase Metila as sequências GATC na OriCMetila as sequências GATC na OriC

A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA

Fita contínua

Fita descontínua

Síntese da Fita descontínua

Síntese da Fita Contínua

Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua

A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA

A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas

A DNA ligase sela as quebras

A DNA ligase sela as quebras

Proteínas presentes na forquilha de Replicação de E.coli

SSBSSB Liga a fita simples de DNALiga a fita simples de DNA

DnaB (helicase)DnaB (helicase) Desenrola o DNADesenrola o DNA

Primase (DnaG)Primase (DnaG) Sintetiza os primers de RNASintetiza os primers de RNA

DNA Polimerase DNA Polimerase IIIIII

Sintese da fita novaSintese da fita nova

DNA Polimerase IDNA Polimerase I Preenche as lacunas e excisa os Preenche as lacunas e excisa os primersprimers

DNA LigaseDNA Ligase Liga os fragmentosLiga os fragmentos

DNA giraseDNA girase SuperenrolamentoSuperenrolamento

O complexo de replicação

A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha

Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas

O primossomo afasta uma das fitas molde

Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas

Forquilha sentido horário

Forquilha sentido antihorário

Terminação Terminação

Forquilha sentido horário

Forquilha sentido antihorário

Terminação Terminação

A replicaçao do DNA de bacterias como a E. coli, segue bidirecionalmente ao redor do cromossomo.

Duas forquilhas de replicação movem-se em direções opostas, para longe da origem de replicação

Como cromossomo bacteriano é um alça fechada, as forquilhas de replicação acabam se encontrando quando a replicação esta completa

Após a replicação cada célula filha recebe uma copia da molécula nova de DBA, isto é – um cromossomo completo.

DNA Polimerase em DNA Polimerase em eucariotos eucariotos

Função Função

DNA Polimerase α DNA Polimerase α Replicação do cromossomo Replicação do cromossomo nuclear (fita lagging) nuclear (fita lagging)

DNA Polimerase β DNA Polimerase β Reparo de DNA no Reparo de DNA no preenchimento de espaços do preenchimento de espaços do cromossomo nuclear. Análoga cromossomo nuclear. Análoga a Polimerase I a Polimerase I

DNA Polimerase γ DNA Polimerase γ Replicação de DNA Replicação de DNA mitocondrial mitocondrial

DNA Polimerase δ DNA Polimerase δ Replicação do filamento Replicação do filamento leaderleader a da a da lagginglagging do do cromossomo nuclear cromossomo nuclear

DNA Polimerase ε DNA Polimerase ε Reparo do DNA do Reparo do DNA do cromossomo nuclear cromossomo nuclear

DNA Polimerase ζ DNA Polimerase ζ Aparentemente reparo de Aparentemente reparo de DNA DNA

Nos fragmentos de Okasaky, os primers de RNA são removidos por uma Rnase que é complementado por uma polimerase de reparo.

A finalização da replicação é feita com a formação de estruturas complexas no topo do cromossomo, os telômeros

Os telômeros são replicados com a ajuda das telomerases.

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TRANSCRIÇÃO : EUCARIOTO X PROCARIOTOTRANSCRIÇÃO : EUCARIOTO X PROCARIOTO

EUCARIOTOS PROCARIOTOS

Fita complementar de RNA a partir de uma DNA

TRÊS tipos de RNA em procariotos: RNA mensageiro – codifica a informação RNA ribossômico – maquina para síntese

protéica RNA de transferência

RNA polimerase liga-se ao DNA em local denominado promotor. Somente uma das duas fitas serve de molde para síntese de RNA para um dado gene

O RNA é sintetizado na direção 5’- 3’ RNA polimerase monta nucleotídeos livres em uma

cadeia nova, utilizando o pareamento complementar

A medida que a cadeia nova de RNA cresce, RNA polimerase se move ao longo do DNA

A síntese de RNA continua até que a RNA polimerase atinja um local no DNA denominado terminador.

A RNA polimerase e o mRNA recém-formado de fita simples são liberados do DNA

Transcrição

A T G G CT A C C G

A TG C A C

TAC G T

5’ 3’

AT

5’3’

A U G C A

A U G G

C

5’

3’

RNA polimerase

Molécula de RNA nascente complementar a fita molde•Fita única •No lugar da Timina haverá uma Uracila

Gene ativo

DNA - Fita molde

Tradução

Molécula de mRNA

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

CysMetAla

5’ 3’

AspGlu

Phe

His

Direção do avanço do ribossomo

Ribossomo

Proteína

tRNA

AA livre

codon

Gly

Cada códon é traduzido num AA específico

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

CysMetAla

5’ 3’

AspGlu

PheGly His

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

Phe

MetAlaCysAspGlu

5’ 3’

GlyHis

Ile

G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G

Met

MetAlaCysAspGluPheGlyHisIle

LysLeu

5’ 3’

Asn

A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C

Ala Cys Asp Glu PheMet Gly

HisIle

Lys Leu

Met Asn

ProGln

5’ 3’STOP

A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C

Ala Cys Asp Glu PheMet Gly

His Ile Gln Lys

Pro LeuAsn Met

5’ 3’

RNAm será degradado

Ala Cys Asp Glu PheMet Gly

His Ile Gln Lys

Pro LeuAsn Met

PROTEÍNA NORMAL PROTEÍNA NORMAL

A T G C A C5’ 3’A T G G CT A C C G T A C G T

AT

5’3’

A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

Alanina

5’ 3’

A T G G AT A C C T

A T G CA C

T A C G T

5’ 3’AT5’3’

A U G G A A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

Acido Glutâmico

3’5’

Gene Normal = Proteína Normal

Gene Mutado =Proteína Anormal - G T

mRNA

mRNA

Exemplo hipotético de uma mutação pontual

O RNAm transcrito no núcleo chega ao citoplasma e se liga a um ou mais ribossomos.

O ribossomo “lê” o primeiro códon e um RNAt com o anticódon correspondente transporta um aminoácido e se liga ao códon.

O ribossomo se desloca, no sentido 5’3’ e lê o próximo códon.

Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas.

Ao final da tradução o polipeptídeo se desliga e se constituí na proteína.

A TraduçãoA Tradução

Asp Glu

Glu Cys

PheGly

Met

His

Gln

I

le

Lys

Pro

Leu

Asn Met

PROTEÍNA DEFEITUOSA PROTEÍNA DEFEITUOSA

Ala Cys Asp Glu PheMet Gly

His Ile Gln Lys

Pro LeuAsn Met

PROTEÍNA NORMAL PROTEÍNA NORMAL