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Aos meus pais....

MÓNICA PATRÍCIA SILVA GOMES

ESTUDO DA INFLUÊNCIA DE POLIMORFISMOS FUNCIONAIS

NOS GENES IL-4 E IL-8 NA SUSCEPTIBILIDADE PARA O

DESENVOLVIMENTO DE CANCRO DE PULMÃO

Dissertação de Candidatura ao grau de Mestre

em Oncologia submetida ao Instituto de

Ciências Biomédicas de Abel Salazar da

Universidade do Porto

Orientador- Professor Doutor Rui Manuel de

Medeiros Melo Silva

Categoria- Professor Associado Convidado com

Agregação

Afiliação- Instituto de Ciências Biomédicas de

Abel Salazar

INFORMAÇÃO TÉCNICA TÍTULO: Estudo da Influência de Polimorfismos Funcionais nos genes IL-4 e IL-8 na

susceptibilidade para o desenvolvimento de Cancro de Pulmão

Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre em Oncologia, apresentada

ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar, Universidade do Porto

AUTOR:

Mónica Patrícia Silva Gomes

DATA:

Outubro de 2010

EDITOR: Mónica Patrícia Silva Gomes

MORADA: Rua Rainha Santa, 555

LOCALIDADE: Olival, Vila Nova de Gaia

CÓDIGO POSTAL: 4415-719 Olival

CORREIO ELECTRÓNICO: [email protected]

1ª EDIÇÃO: Setembro 2010

mailto:[email protected]

AGRADECIMENTOS Ao finalizar esta etapa do meu percurso académico, é importante salientar

algumas pessoas que de uma forma ou de outra contribuíram para o sucesso deste

trabalho,

Deste modo, gostaria de agradecer à comissão de Coordenação do Mestrado em

Oncologia, sob a pessoa do Professor Doutor Carlos Lopes, a oportunidade de ingressar

neste mestrado e de enriquecer os meus conhecimentos científicos na área da oncologia.

Ao coordenador do Grupo de Oncologia Molecular, Professor Doutor Rui Medeiros

e meu orientador, gostaria de agradecer a oportunidade de realizar este trabalho no seu

grupo, assim como todos as palavras de incentivo e de confiança que me foi transmitindo

e que foram muito importantes em alguns momentos....Obrigado “Chefe”.

À Liga Portuguesa Contra o Cancro- Núcleo Regional do Norte, na pessoa do Dr.

Vitor Veloso, gostaria de agradecer a Bolsa de Investigação que me foi concedida, a qual

foi indispensável para a realização deste trabalho.

Ao Dr António Araújo, por ter a amabilidade de enviar as amostras dos seus

doentes para o laboratório, e por ter feito com que fosse possível levar além fronteiras

este trabalho, obrigado por tudo.

À Drª Ana Coelho, pelo apoio incansável, pela paciência, pela dedicação, pela

amizade, pela disponibilidade, etc, etc, etc....Para ti só tenho duas palavras: Obrigado

“Bunny”.

Á Drª Raquel Catarino, pela boa disposição que a caracteriza e que transmite

quando chega ao laboratório, e por todo o apoio na elaboração desta tese. Obrigado.

Á Drª Ana Nogal, por tudo o que me ensinou neste laboratório, pela paciência que

teve para comigo e por tudo o resto que é dificíl de enumerar...Noguinha, Obrigado.

Aos restantes investigadores que fazem parte deste laboratório, obrigado pelas

conversas da hora de almoço, pelas pausas para café e por todas as restantes

actividades extra-laboratório que sabem tão bem em momentos mais complicados.

Á Drª Ana Luísa Teixeira, gostaria de agradecer pelo companheirismo e amizade

constantes ao longo dos últimos tempos, pelo tempo perdido a aturar os meus

problemas, pelas fantásticas viagens a congressos...pelos jantares maravilhosos...e por

todos os disparates que fazemos juntas...e por me ajudar a manter a minha sanidade

mental. Para a minha Lesbiana preferida...Um obrigado do tamanho do mundo.

Aos meus amigos de “Braga” que apesar de longe sempre estiveram por perto, e

sempre com uma palavra de apoio e conforto especialmente o Carlos, a Patrícia, o

Ricardo...a vocês um grande obrigado, vão estar sempre no meu coração.

Um obrigado muito especial a quem me ajudou na parte gráfica deste trabalho,

que tanto tempo gastou a fazer esquemas, formatações, capas, cd’s....e que tanta

paciência teve para me aturar...enfim....Obrigado.

À minha família, que sempre me deu todo o apoio e sempre confiou em mim... em

especial aos meus avós que apesar de já não estarem entre nós...tenho a certeza que

estão a olhar por mim... E que ficariam muito felizes com mais este passo na minha

formação. Obrigado....

Por fim, gostaria de deixar o último agradecimento para as pessoas mais

importantes da minha vida.... por todo o apoio, confiança, disponibilidade, entrega,

carinho e amor....por me terem ensinado a lutar e a acreditar nos meus sonhos, por

valorizarem as minha escolhas, por estarem sempre ao meu lado. Por serem os meus

pais... OBRIGADO!!!

AAbbrreevviiaattuurraass

Polimorfismos nos genes IL-4 e IL-8 e Cancro de Pulmão

XIII

Abreviaturas

A

A Adenina

APC Células apresentadoras de antigénio

ADN Ácido desoxirribonucleico

aOR Odds Ratio ajustado

C

C Citosina

CD Células Dendríticas

CPNPC Cancro de pulmão de não pequenas células

ºC Graus centígrados

COX-2 Cicloxigenase-2

D

dNTP Desoxirribonucleosídeo trifosfato

E

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

G

G Guanina

I

IC Intervalo de confiança

Ig Imunoglobulina

IL-4 Interleucina-4

IL-8 Interleucina-8

IFN-γ Interferão- γ



XIV

M

M Concentração molar

mg/mL Miligrama por mililitro

MHC Complexo Maior de Histocompatibidade

mL Mililitro

mM Concentração milimolar

MMP Metaloproteases da Matriz

N

ng Nanograma

ng/mL Nanograma por mililitro

NK Natural Killer

NO Óxido Nítrico

O

OR Odds Ratio

P

P Probabilidade

p/v Peso por volume

PAH’s Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

Pb Pares de bases

PCR Polymerase Chain Reaction

R

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RPM Rotação por minuto

S

SNP Single Nucleotide Polymorphism



XV

T

T Timina

TAM Tumour- associated macrophages

TAF Tumour- associated fibroblasts

TBE Tris-borate EDTA buffer

Tc Linfócitos T citotóxicos

TCR Receptor de células T

Th Linfócitos T helper

TNF-α Tumour-Necrosis Factor- alfa

TGF-β Transforming growth factor -beta

U

U Unidade

μg/μL Microgramas por microlitro

μL Microlitro

μM Concentração Micromolar

V

VEGF Vascular endothelial growth factor

X

χ2 Qui-Quadrado

ÍÍnnddiiccee


XVII

AGRADECIMENTOS ........................................................................................ IX

Abreviaturas .................................................................................................... XI

Resumo ........................................................................................................ XVII

Abstract ......................................................................................................... XXI

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... -1-

1.1. Cancro: Conceitos Gerais .................................................................... - 3 -

1.2 Oncobiologia Molecular ........................................................................ - 4 -

1.2.1 Carcinogénese............................................................................ - 4 -

1.2.2. Variabilidade Genética Individual: Influência no Microambiente

Tumoral ................................................................................................... - 7 -

1.3. Imunologia e Cancro ........................................................................... - 8 -

1.4. Inflamação e Cancro .......................................................................... - 10 -

1.5. Citocinas ............................................................................................. - 12 -

1.6 Interleucina-4 (IL-4) ............................................................................ - 14 -

1.6.1. Polimorfismo -590 C/T no gene da IL-4 ....................................... - 15 -

1.7 Quimiocinas ............................................................................................ - 15 -

1.8 Interleucina -8 (IL-8) .............................................................................. - 17 -

1.8.1. Polimorfismo -251T/A no gene da IL-8 ....................................... - 18 -

1.9. Cancro de Pulmão ................................................................................. - 19 -

1.9.1 Epidemiologia e Mecanismos Moleculares ............................... - 19 -

2. OBJECTIVOS ......................................................................................... -23-

2.1. Objectivo Geral ..................................................................................... - 25 -

2.2. Objectivos Específicos ......................................................................... - 25 -

3. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... -27-

3.1. Caracterização das Amostras ............................................................... - 29 -

ÍÍnnddiiccee


XVIII

3.1.1. Doentes com Cancro de Pulmão ...................................................... - 29 -

3.1.2. Indivíduos do Grupo Controlo ............................................................ - 29 -

3.2. Processamento das amostras ...................................................................... - 31 -

3.3. Genotipagem dos Polimorfismos dos genes da IL-4 e IL-8 ..................... - 31 -

3.3.1. Polimorfismo -590 C/T no gene IL-4 ................................................ - 32 -

3.3.2. Polimorfismo -251 A/T no gene IL-8 ................................................. - 34 -

3.4. Análise estatística ........................................................................................... - 36 -

4.RESULTADOS .......................................................................................... - 37 -

4.1. Associação do Polimorfismo -590 C/T no gene IL-4 na susceptibilidade de

Cancro de Pulmão (CPNPC) ................................................................................. - 39 -

4.2. Associação do Polimorfismo -251 A/T no gene IL-8 na susceptibiliade de

Cancro de Pulmão (CPNPC) ................................................................................. - 43 -

5. DISCUSSÃO ........................................................................................... -47-

5.1. Influência do polimorfismo -590 C/T de IL-4 na susceptibilidade para o

desenvolvimento de CPNPC ................................................................................. - 51 -

5.2. Influência do polimorfismo -251 A/T de IL-8 na susceptibilidade para o

desenvolvimento de CPNPC ................................................................................ - 56 -

6. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS ....................................... -59-

7. REFERÊNCIAS ................................................................................ ......-63-

8. ANEXOS ................................................................................................. -73-

R E S U M

O

RReessuummoo


XXI

O cancro é um importante problema de saúde pública, sendo a segunda causa de

morte por doença em todo o mundo: cerca de 13 milhões de pessoas são diagnosticadas

com cancro todos os anos e cerca de 8 milhões morrem anualmente devido a esta

doença.

A carcinogénese é um processo multifactorial e multifásico, que culmina no

desenvolvimento de neoplasias malignas, pela acumulação de alterações genéticas e/ou

epigenéticas que poderão conduzir a mudanças na actividade génica e a fenótipos

alterados sobre os quais actua a selecção ambiental e microambiental. Este processo

passa por vários estadios até que se constitua um carcinoma in situ, podendo ser dividido

em três fases consecutivas: iniciação, promoção e progressão.

As variações no ADN existentes nos indivíduos de uma população cuja variante

menos frequente está presente em pelo menos 1% dessa população designam-se de

polimorfismos. A maioria dos polimorfismos ocorre em genes envolvidos no controlo da

proliferação e diferenciação celulares, na reparação de ADN e na manutenção da

integridade do genoma, bem como em genes que codificam proteínas envolvidas na

metabolização de diferentes xenobióticos, e em genes importantes na regulação do

sistema imunológico.

O sistema imunológico dos mamíferos é composto por vários tipos de células que

interagem entre si e com outras células que não pertencem ao sistema imunológico,

numa rede complexa e dinâmica, que assegura a protecção contra agentes patogénios

estranhos, mantendo em simultâneo a tolerância para antigénios do próprio.

As células tumorais produzem várias citocinas e quimiocinas que atraem os

leucócitos. A componente inflamatória da neoplasia em desenvolvimento inclui uma

população leucocitária muito diversificada, da qual se destacam macrófagos (abundantes

em vários tipos de tumores), linfócitos, células NK, neutrófilos e células dendríticas.

A forma como as células inflamatórias se comprometem com a via da

carcinogénese não está esclarecida. A hipótese mais plausível é a de que vários tumores

têm origem em locais de infecção, como parte da resposta normal do hospedeiro.

As citocinas desempenham um papel fulcral na indução de diferenciação de células

do sistema imunológico, destacando-se entre outros, a diferenciação de células T

imaturas (Th0) em linfócitos T helper (Th) do tipo Th1 ou Th2.

A IL-4 é uma citocina que desempenha um papel importante no processo de

inflamação, quer pela sua capacidade de induzir diferenciação de linfócitos Th2, quer por

conferir às células sobre as quais actua um efeito anti-proliferativo. Esta interleucina tem

RReessuummoo


XXII

funções muito diversificadas e pode actuar ao nível dos tecidos hematopoiéticos, tecidos

de adesão e nos processos de inflamação.

As quimiocinas compreendem uma grande família de proteínas pró-inflamatórias

de baixo peso molecular, que são potentes activadores e quimioatractores para diferentes

sub-populações de leucócitos e algumas células não hematopoiéticas.

A IL-8 é secretada por diversas células como monócitos, macrófagos, fibroblastos e

queratinócitos. As funções principais são a quimiotaxia de células do sistema imune,

desempenhando também um papel importante como factor angiogénico.

O cancro de pulmão é a neoplasia mais comum no mundo desde 1985, sendo que

em 2008 cerca de 1,6 milhões de novos casos foram diagnosticados e a taxa de

mortalidade foi de 18,2% (1,4 milhões de mortes). Este tipo de cancro apresenta

diferentes tipos histológicos, sendo que o cancro de pulmão de não-pequenas células

(CPNPC) representa cerca de 75% da totalidade dos cancros de pulmão.

O objectivo deste trabalho consistiu na avaliação da influência dos polimorfismos

genéticos -590 C/T do gene da IL-4 e -251 A/T do gene da IL-8 na susceptibilidade para o

desenvolvimento de CPNPC.

Neste estudo foram incluídos 669 indivíduos sem doença oncológica conhecida,

que constituíram o grupo controlo e 391 indivíduos com diagnóstico histológico de cancro

de pulmão, designado por grupo de casos. Os indivíduos de ambos os grupos foram

genotipados por PCR-RFLP, relativamente aos polimorfismos em estudo. A análise

estatística dos resultados foi realizada com o auxílio do programa estatístico SPSS.

Os resultados obtidos indicam a existência de uma associação entre o

polimorfismo -590 C/T do gene da IL-4 e o desenvolvimento de CPNPC do tipo

histológico epidermóide. Indivíduos portadores do genótipo de alta expressão, TT,

apresentam uma protecção de cerca de 78% para o desenvolvimento da neoplasia,

quando comparados com os portadores CC (OR=0,221; IC95%=0,544-1,900;P=0,958).

Estes resultados vêm de encontro ao que se conhece sobre o papel desempenhado pela

IL-4 na progressão tumoral: maior expressão desta interleucina pode influenciar

negativamente a neoangiogénese, condicionando desta forma o crescimento do tumor.

Relativamente ao polimorfismo -251 A/T do gene IL-8, não foram observadas

associações estatisticamente significativas entre este e a susceptibilidade para o

desenvolvimento do cancro de pulmão.

Estudos futuros deveriam ser realizados noutros modelos tumorais, uma vez que

a inflamação e as suas vias relacionadas podem condicionar o desenvolvimento de várias

neoplasias.

RReessuummoo


XXIII

A B S T R A C T

AAbbssttrraacctt


XXV

Cancer is currently a major public health problem, being the second leading cause

of death by disease in the world: about 13 million people are diagnosed with cancer each

year and about 8 million people die annually due to this disease.

The carcinogenesis is a multifactorial and multi-phase process culminating in the

development of malignancies, the accumulation of genetic mutations and / or epigenetic

alterations that could lead to changes in gene activity and altered phenotypes on which

selection acts on environmental and microenvironmental level. This process goes through

several stages pending the establishment of a carcinoma in situ, and can be divided into

three consecutive phases: initiation, promotion and progression.

Single base pair positions in genomic DNA, at which different sequence alternatives

(or alleles) exist in normal individuals, wherein the least frequent allele has an abundance

of 1% or greater are called polymorphisms.

The majority of polymorphisms occur in genes involved in controlling cell

proliferation and differentiation, in DNA repair and maintaining genome integrity as well as

genes that encode proteins involved in metabolism of different xenobiotics, and genes

important in regulating the immune system.

The immune system of mammals is composed of several cell types that interact

among themselves and with other cells outside the immune system, in a complex and

dynamic network, providing for the protection against foreign pathogens, while maintaining

tolerance to self antigens.

Tumor cells produce various cytokines and chemokines which attract leukocytes.

The inflammatory component of the neoplasm includes developing a diverse leukocyte

population, such as macrophages (abundant in various types of tumors), lymphocytes, NK

cells, neutrophils and dendritic cells.

The way in which inflammatory cells are committed to the pathway of

carcinogenesis is unclear. The most plausible hypothesis is that multiple tumors arise

from sites of infection as part of the normal response of the host.

Cytokines play an important role in inducing differentiation of cells of the immune system,

including the differentiation of immature T cells (Th0) lymphocytes into T helper (Th) type

Th1 or Th2.

IL-4 is a cytokine that plays an important role in the inflammation process, either by

its ability to induce differentiation of Th2 lymphocytes, or by giving the cells on which it

acts an anti-proliferative effect. This interleukin has very diverse functions and may act at

the level of hematopoietic tissue, tissue adhesion and inflammation processes.

AAbbssttrraacctt


XXVI

Chemokines comprise a large family of pro-inflammatory proteins of low molecular

weight, which are potent activators and chemoattractants for different sub-populations of

leukocytes and some non-hematopoietic cells.

The IL-8 is secreted by various cells such as monocytes, macrophages, fibroblasts

and keratinocytes. Its main functions are chemotaxis of immune cells, also play an

important role as an angiogenic factor.

Lung cancer is the most common cancer in the world since 1985, and in 2008 some

1.6 million new cases were diagnosed and the mortality rate was 18.2% (1.4 million

deaths). This type of cancer has different histological types, with non-small cell lung

cancer (NSCLC) representing about 75% of all lung cancers.

The purpose of this study was to understand the relevance of genetic

polymorphisms -590 C / T in IL-4 gene and -251 A / T in gene IL-8 in the susceptibility to

the development of NSCLC.

This study included 669 individuals without known malignant disease, which

constituted the control group and 391 subjects who were diagnosed with lung cancer (the

case group). The subjects from both groups were genotyped by PCR-RFLP for the

polymorphisms studied. The statistical analysis was performed with the aid of SPSS.

The results indicate the existence of an association between the TT genotype of -

590 C / T IL-4 polymorphism and the development of epidermoid NSCLC.

Individuals carrying the high-expression TT genotype showed a protection of about

78% for the development of epidermoid NSCLC when compared to those with CC

genotype (OR=0,221; CI95%=0,544-1,900; P=0,958). These findings are in agreement

with the role of IL-4 in tumor progression: increased expression of this interleukin may

negatively affect neoangiogenesis, conditioning thus tumor growth.

For the -251 A / T IL-8 polymorphism, no statistically significant associations were

found between its genotypes and NSCLC development.

Future studies should be conducted not only in lung cancer but also in other tumor

models, since the inflammation and its related pathways may influence the development

of several tumors.

1.

I N T R O D U Ç Ã O

1. Introdução


- 3 -

1.1. Cancro: Conceitos Gerais

As últimas décadas têm sido acompanhadas de grandes mudanças e enormes

evoluções, que permitiram ao Homem adquirir um maior conhecimento de si mesmo e do

que o rodeia, proporcionando-lhe melhor qualidade de vida, melhores hábitos

alimentares e de higiene, melhores cuidados de saúde e também uma maior esperança

média de vida.

Acredita-se ter sido Hipócrates, médico da Grécia antiga, o primeiro a reconhecer a

existência de tumores malignos. A invasão tumoral lembrava-lhe as garras do

caranguejo, pelo que chamou a esta doença karkino, designação grega para caranguejo,

de onde deriva a palavra carcinoma. O cancro constitui um desafio clínico e molecular

para todos os envolvidos na elucidação dos fenómenos que conduzem ao

desenvolvimento tumoral.

O cancro é actualmente um importante problema de saúde pública [1,2] sendo a

segunda causa de morte por doença em todo o mundo: cerca de 13 milhões de pessoas

são diagnosticadas com cancro todos os anos e cerca de 8 milhões morrem anualmente

devido a esta doença [3]. Atendendo à relação entre a esperança média de vida e o risco

para cancro e usando como referência a população mundial do ano 2000, estima-se que

em 2015 haja um aumento significativo da taxa de incidência de cancro, uma vez que o

número de indivíduos de 65 e 80 anos de idade será 22 e 50% superior, respectivamente

[1]. Desta forma, admite-se que as taxas de incidência de cancro poderão acompanhar o

aumento da esperança média de vida [1].

O cancro é uma doença heterogénea, com diferentes etiologias e história natural,

que se desenvolve através da interacção entre factores ambientais e genéticos. Trata-se

de uma doença multifactorial complexa, cujo processo de desenvolvimento é lento e

envolve a ocorrência de múltiplos eventos sequenciais.

O termo cancro refere-se a um vasto grupo de patologias que se caracterizam pela

auto-suficiência, capacidade de proliferação e deinvasão do tecido adjacente e

capacidade de metastização [4].

1. Introdução


- 4 -

Geralmente, o balanço entre a proliferação e a morte celular programada é

altamente regulado, garantindo a integridade dos órgãos e tecidos [5]. Nas neoplasias, a

ocorrência de uma alteração no equilíbrio crescimento/morte celular pode dever-se a

danos provocados no genoma humano, especialmente em genes envolvidos na

regulação do ciclo celular [4,5].

Em relação ao cancro, muitas questões carecem de elucidação, sendo este o

desafio que encaram quer os que estão envolvidos no seu tratamento clínico, quer os que

se dedicam a estudar e caracterizar os mecanismos moleculares subjacentes ao seu

desenvolvimento.

1.2. Oncobiologia Molecular

1.2.1. Carcinogénese

Os indivíduos adaptam-se ao meio onde estão inseridos por processos de

reparação de danos causados por diferentes tipos de agressões que vão ocorrendo ao

longo da vida. Diversos factores podem originar diferentes danos ao nível celular, mais

especificamente ao nível do ácido desoxirribonucléico (ADN).

As bases moleculares da susceptibilidade para cancro foram colocadas a

descoberto aquando do desenvolvimento das técnicas de análise de ADN [6]. As

agressões que causam danos no ADN podem ser herdadas ou adquiridas ao longo da

vida de um indivíduo, por acção de compostos químicos, agentes biológicos ou agentes

físicos [6]. Para além disso, mutações espontâneas que ocorrem com elevada frequência

durante a replicação do ADN podem exceder a capacidade de reparação por parte das

polimerases de ADN, constituindo um risco potencial para o desenvolvimento de uma

neoplasia [6,7].

A carcinogénese é um processo multifactorial e multifásico, que culmina no

desenvolvimento de neoplasias malignas, pela acumulação de alterações genéticas e/ou

epigenéticas que poderão conduzir a mudanças na actividade génica e a fenótipos

alterados sobre os quais actua a selecção ambiental e microambiental [8]. Este processo

passa por vários estadios até que se constitua um carcinoma in situ (CIS), podendo ser

dividido em três fases consecutivas: iniciação, promoção e progressão [9].

1. Introdução


- 5 -

A iniciação é uma fase que se caracteriza por uma alteração no material genético

de uma célula normal, por acção de um agente carcinogénio, de uma mutação

espontânea ou hereditária, ou outro factor que resulte num dano celular. Caso a célula

não tenha capacidade de reparar o dano sofrido, vai ocorrer uma acumulação sucessiva

de alterações genéticas que conferem vantagem selectiva à célula “iniciada”- fase de

promoção. A acumulação sequencial de alterações genéticas em genes responsáveis

pelo controlo da proliferação celular, da morte celular programada e da manutenção da

integridade do genoma, culmina na expansão clonal da célula “iniciada”. A fase de

progressão é uma fase irreversível, em que o processo evolui até ao aparecimento das

primeiras manifestações clínicas da doença. A progressão do cancro caracteriza-se pela

inactivação de determinados genes e sobrexpressão de outros, dando origem a células

independentes da regulação local e central do organismo, que proliferam sem inibição [9].

Alguns dos genes mais frequentemente alterados no cancro são os proto-

oncogenes, cujo ganho de função promove a proliferação celular e a carcinogénese, os

genes supressores tumorais, que por perda de função promovem a proliferação celular e

a carcinogénese e os genes envolvidos na reparação do ADN [10].

As células tumorais apresentam características distintas das células normais,

sabendo-se que, durante a carcinogénese, adquirem fenótipos essenciais e

discriminativos como: potencial proliferativo ilimitado, capacidade de evasão à apoptose,

auto-suficiência em factores de crescimento, insensibilidade a sinais de inibidores de

crescimento, capacidade de promover a angiogénese, capacidade de invasão tecidular e

metastização à distância (figura 1) [8].

1. Introdução


- 6 -

Figura 1. Alterações adquiridas pela célula maligna ao longo do processo de carcinogénese [8].

Contudo, o número de alterações necessárias para adquirir estas capacidades e a

ordem pela qual elas surgem, variam de acordo com as características da neoplasia [11].

Algumas alterações podem ser transmitidas de geração em geração, através da linhagem

germinativa do indivíduo, originando os cancros familiares, que são raros (entre 5 e 10%),

ao passo que a maioria das neoplasias surgem de um modo esporádico, na linhagem

somática de tipos específicos de células, originado os cancros esporádicos [11].

1. Introdução


- 7 -

1.2.2. Variabilidade Genética Individual: Influência no Microambiente

Tumoral

Devido ao carácter multifactorial das neoplasias malignas, o seu desenvolvimento é

condicionado pela interacção entre o meio ambiente em que o hospedeiro se encontra e

a variabilidade genética individual deste.

A descodificação do genoma humano permitiu constatar que diferenças nas

sequências de ADN podem explicar diferentes susceptibilidades e diferentes padrões de

desenvolvimento tumoral, tendo esta variabilidade implicações ao nível do tratamento e

prognóstico do cancro [12].

As variações no ADN existentes nos indivíduos de uma população cuja variante

menos frequente está presente em pelo menos 1% dessa população designam-se de

polimorfismos [13]. A maioria dos polimorfismos ocorre em genes envolvidos no controlo

da proliferação e diferenciação celulares, na reparação de ADN e na manutenção da

integridade do genoma, bem como em genes que codificam proteínas envolvidas na

metabolização de diferentes xenobióticos e em genes importantes na regulação do

sistema imunológico [14].

Os polimorfismos mais comuns são caracterizados pela alteração de apenas um

nucleotídeo na sequência de ADN e designam-se por Single Nucleotide Polymorphisms

(SNPs) [15]. Os SNPs são a principal fonte de variabilidade individual, pelo que cada

indivíduo é portador de um vasto grupo de polimorfismos, o que lhe confere um

património genético único. No entanto, a distribuição da frequência dos SNPs apresenta

variações dentro da mesma população, para além de variações inter-populacionais. Dado

que o risco para cancro parece ser influenciado pelos padrões de SNPs que cada

indivíduo possui em determinados genes chave de susceptibilidade [14], o estudo de

polimorfismos em genes alvo poderá ajudar a definir grupos de risco para o

desenvolvimento neoplásico e onde estes possam constituir factores de prognóstico.

Cada indivíduo, como portador de um conjunto de polimorfismos, apresentará um

perfil de carcinogénese singular. Alguns desses polimorfismos podem ser caracterizados

como variantes genéticas funcionais, sendo a sua ocorrência responsável por padrões de

expressão/função genética alteradas. Estes, por originarem diferenças na expressão

génica e/ou diferenças na produção adequada da respectiva proteína, terão a capacidade

1. Introdução


- 8 -

de determinar o microambiente tumoral que, por sua vez, exercerá influência no processo

de desenvolvimento tumoral [9].

Entende-se por microambiente tumoral o conjunto de todos os elementos não-

epiteliais adjacentes às células tumorais incluindo fibroblastos, células do sistema imune,

matriz extracelular e vasos sanguíneos [16]. Actualmente, admite-se que o mesmo não

desempenhe apenas funções de suporte, tendo também a capacidade de contribuir para

o desenvolvimento e progressão tumorais, por interacções mediadas entre moléculas

secretadas por células do sistema imunitário [16]

1.3. Imunologia e Cancro

Bactérias, vírus, ou outros agentes patogénicos uni e pluricelulares e células

cancerígenas representam ameaças para o organismo, contra as quais este desenvolveu

defesas activas, que constituem o sistema imunológico [17]. A associação entre células

do sistema imunológico e o cancro foi estabelecida há mais de um século, acreditando-se

inicialmente que os infiltrados de leucócitos encontrados no estroma e rodeando o tumor

representavam uma tentativa de erradicação do tumor por parte do hospedeiro [16]. O

conceito de vigilância imunológica, que foi delineado no inicio do século XX, foi definido

por Macfarlane Burnet nos anos 50, baseado no pressuposto de que uma das funções

fisiológicas do sistema imunológico é a do reconhecimento e destruição de clones de

células transformadas antes que estas originem um tumor e, após a formação do mesmo,

a morte das células tumorais [17]. A importância desta vigilância imunológica tem sido

questionada pelos resultados de diversos estudos e o seu papel pode variar em

diferentes tipos de tumores [17].

O sistema imunitário dos mamíferos é composto por vários tipos de células que

interagem entre si e com outras células que não pertencem ao sistema imunológico,

numa rede complexa e dinâmica, que assegura a protecção contra agentes patogénios

estranhos, mantendo em simultâneo a tolerância para antigénios do próprio. Baseado na

especificidade para o antigénio e na altura em que é activado, podem distinguir-se dois

compartimentos no sistema imune – o inato e o adquirido. Ainda que a composição

celular e a especificidade antigénica de ambos sejam distintas, cada um deles

desenvolveu um sofisticado sistema de comunicação que permite respostas rápidas a

danos tecidulares [16].

1. Introdução


- 9 -

As células da imunidade inata, incluindo as células dendríticas (CD), as células

natural killer (NK), os macrófagos, os neutrófilos, os basófilos, os eosinófilos e os

mastócitos constituem a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos estranhos

[16].

Quanto à sua acção as CD, os macrófagos e os mastócitos, alojados nos tecidos,

funicionam como células sentinela e monitorizam constantemente o seu microambiente,

detectando sinais irregulares [16]. Quando a homeostasia do tecido é perturbada, os

macrófagos e mastócitos libertam mediadores soluvéis, como citocinas, quimiocinas,

proteases remodeladoras da matriz, espécies reactivas de oxigénio e mediadores

bioactivos, como histamina, que induzem a mobilização e infiltração de leucócitos no

tecido danificado. Podem também induzir respostas vasculares e activar fibroblastos, de

forma a orquestrar a eliminação de microorganismos invasores e iniciar a reparação do

tecido danificado [16]. A característica que melhor distingue a imunidade inata da

imunidade adquirida é a capacidade intrínseca da primeira responder rapidamente a

danos no tecido sem especificidade antigénica ou necessidade de encontro prévio com o

antigénio [16]. A activação aguda da imunidade inata desencadeia a activação do sistema

de imunidade adquirida. A indução de uma resposta imune adquirida eficiente requer a

interacção directa com células apresentadoras de antigénio (APC) e um ambiente pró-

inflamatório. As células responsáveis pela resposta imune adquirida são os linfócitos T

helper (Th) e linfócitos T citotóxicos (Tc), que pertencem ao ramo celular da imunidade

adquirida e os linfócitos B, que compõem o ramo humoral. A componente humoral da

resposta imune adquirida está envolvida na produção de anticorpos capazes de

neutralizar ou destruir agentes que causem dano ao organismo. A componente celular é

particularmente relevante para a imunologia tumoral [9].

As células da imunidade inata, em particular macrófagos associados a tumores

(TAM), mastócitos e granulócitos, contribuem de forma directa para a formação de

tumores através da indução de danos no ADN pela geração de radicais livres, e através

da regulação parácrina de factores de transcrição que controlam vias de sinalização

intracelulares, (como o NF-Kβ, factor nuclear κβ). Estas células contribuem também de

forma indirecta para a progressão tumoral, através da promoção da angiogénese, e de

remodelação de tecidos, pela produção de factores de crescimento, citocinas,

quimiocinas e metaloproteases da matriz (MMPs), regulação positiva da ciclooxigenase-2

(COX-2) e pela supressão da resposta imune adquirida anti-tumoral [16]. A imunidade

adquirida pode modular a carcinogénese, quer directamente, pela inibição do crescimento

tumoral mediada pelos linfócitos T citotóxicos, ou pela lise das células tumorais mediada

1. Introdução


- 10 -

por citocinas, quer indirectamente, pela promoção do crescimento tumoral por acção da

resposta imune humoral que promove a inflamação crónica no microambiente tumoral

[16].

Embora o sistema imunológico seja capaz de responder à presença das células

tumorais, o número anual de mortes por cancro sugere que a resposta imune às células

tumorais é pouco eficiente. O que se verifica é que a resposta imune falha

frequentemente na prevenção do crescimento tumoral. Esta incapacidade de erradicação

de células transformadas prende-se com diversos factores. As células tumorais derivam

de células do hospedeiro, assemelhando-se a células normais. A maior parte das células

tumorais expressam poucos antigénios passíveis de serem reconhecidos pelo sistema

imune como estranhos, pelo que a maior parte dos tumores é pouco imunogénica,

originando apenas respostas imunes fracas ou indetectáveis [16].

Por outro lado, o rápido crescimento e disseminação dos tumores podem sobrepor-

se à capacidade do sistema imune para erradicar as células tumorais, e muitos dos

tumores conhecidos possuem mecanismos especializados que lhes permitem a evasão à

resposta imune desencadeada pelo hospedeiro. Outra explicação plausível para o

escape das células tumorais aos mecanismos de vigilância imunológica prende-se com o

facto de o microambiente tumoral favorecer estados inflamatórios pró-tumorigénicos, ao

invés de promover respostas imunes anti-tumorais agudas [16].

1.4. Inflamação e Cancro

O conhecimento da relação funcional entre a inflamação e o cancro não é recente.

Em 1863, Virchow propõe que o cancro possa ter origem em locais de inflamação

crónica, baseando-se na hipótese de que alguns tipos de agentes que provocam irritação,

associados a danos nos tecidos e a inflamação subsequente, promoveriam a proliferação

celular e consequente neoplasia [4,18]. Embora esteja claro que a proliferação celular por

si só não é a causa do aparecimento do cancro, a proliferação celular sustentada num

ambiente rico em células inflamatórias, factores de crescimento, estroma activado e

agentes promotores de danos no ADN certamente potenciam e/ou promovem o risco

para o surgimento de neoplasias. O microambiente tumoral é composto não apenas por

células do tecido residente, como fibroblastos e células endoteliais, mas também por

infiltrados de leucócitos do hospedeiro [19].

1. Introdução


- 11 -

As células tumorais produzem várias citocinas e quimiocinas que atraem os

leucócitos. A componente inflamatória do neoplasma em desenvolvimento inclui uma

população leucocitária muito diversificada, da qual se destacam macrófagos (abundantes

em vários tipos de tumores), linfócitos, células NK, neutrófilos e células dendríticas.

Estes componentes inflamatórios do tumor são considerados factores chave na

promoção da progressão tumoral devido à sua capacidade para libertar uma grande

variedade de citocinas, quimiocinas, mediadores citotóxicos, como espécies reactivas de

oxigénio, metaloproteases (MMPs) e agentes perforantes de membrana e mediadores

solúveis de morte celular, como o TNF-α (Tumour Necrosis Factor-α), interleucinas e

interferões [4].

Muitos dos mediadores libertados durante o processo de inflamação crónica

desregulada promovem a proliferação celular e invasão, induzem a mutagénese e

aumentam a angiogénese. Devido a estas características, os mediadores inflamatórios

promovem a transformação e a iniciação de um fenótipo maligno e se a sua expressão

for sustentada, promovem também a progressão tumoral. Para além disto, muitos dos

factores libertados pelas células inflamatórias conduzem, directa ou indirectamente, a

uma supressão marcada da resposta imune, que de outra forma poderia ter um papel

importante na erradicação do tumor [19].

A forma como as células inflamatórias se comprometem com a via da

carcinogénese não está esclarecida. A hipótese mais plausível é a de que vários tumores

têm origem em locais de infecção e inflamação, como parte da resposta normal do

hospedeiro [20].

Sabe-se que os macrófagos podem ser activados como resposta a agentes

microbianos e citocinas em particular o interferão-γ (IFN-γ) (activação clássica de

macrófagos). No entanto, descobriu-se recentemente que moléculas anti-inflamatórias,

como as hormonas glucocorticóides e as citocinas IL-4, IL-13 e IL-10 induzem um

programa diferente de activação de macrófagos (activação alternativa de macrófagos).

[21-23].

1. Introdução


- 12 -

1.5. Citocinas

As citocinas são polipéptidos ou glicoproteínas de baixo peso molecular, igual ou

inferior a 30 Kda, secretadas por leucócitos e outros tipos de células. Estas moléculas

apresentam acções pleiotrópicas, dada a sua capacidade para actuar sobre diferentes

tipos celulares conduzindo a diferentes respostas. As citocinas podem actuar em sinergia

ou antagonicamente, apresentando algumas delas acções redundantes [24]. Estas

proteínas actuam através de uma rede intrincada de sinalização, que envolve a

interacção com receptores de superfície celular específicos, os quais apresentam alta

afinidade para o seu ligando. Devido a esta interacção, as citocinas são capazes de

exercer os seus efeitos biológicos de estímulo ou de repressão, quer no local da sua

secrecção quer à distância. A sua actividade pode desencadear um efeito em cascata,

activando genes que induzem processos de divisão celular, proliferação, diferenciação,

migração ou apoptose das células envolvidas [24].

As citocinas desempenham um papel fulcral na indução de diferenciação de células

do sistema imunológico, destacando-se entre outros, a diferenciação de células T

imaturas (Th0) em linfócitos T helper (Th) de tipo Th1 ou Th2 (figura 2) [22]. A IL-4 é uma

importante citocina que actua na diferenciação de Th0 para Th2, podendo bloquear o

desenvolvimento de Th0 para Th1 [25].

Figura 2. Diferenciação dos linfócitos Th0 e respectivas citocinas secretadas.

Efeito imunológico

pró-inflamátório

Efeito imunológico

anti-inflamátório

1. Introdução


- 13 -

A diferenciação de uma célula Th0 em Th1 ou Th2 depende dos diferentes

estímulos a que estão sujeitos os linfócitos T naϊve (Tho). Entre estes incluem-se o tipo

de células apresentadoras de antigénio (APC) presentes no local, a quantidade do

antigénio, a afinidade química da molécula do complexo maior de histocompatibilidade

(MHC) para com o antigénio, a interacção entre o receptor de células T (TCR) e o

complexo MHC peptídeo e a afinidade das ligações entre as moléculas co- estimuladoras

[26,27].

As células Th1 apresentam um efeito imunológico pró-inflamatório, produzindo

citocinas como o interferão-γ (IFN-γ), a interleucina-2 (IL-2), o factor de necrose tumoral-α

(TNFα), que induzem a secrecção de anticorpos opsonizantes e fixadores de

complemento pelas células B, activam macrófagos e promovem a citotoxicidade celular e

a imunidade mediada por células [24].

Por outro lado, as células Th2, que segregam IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13,

promovem uma resposta humoral, induzindo a produção de imunoglobulinas da classe E

(IgE), favorecendo a diferenciação e activação de eosinófilos e supressão da imunidade

mediada por células [28]. A figura 3 ilustra como diferentes microambientes induzem

respostas inflamatórias também distintas.

O equilíbrio entre uma resposta Th1 e Th2 é fundamental para uma resposta

imunológica adequada. No entanto, em situações de inflamação, ou outras que exijam

uma resposta imune, é necessário que uma das respostas seja mais eficaz. Este parece

ser o caso do ambiente tumoral, em que o tumor induz uma activação de resposta Th2,

conduzindo esta à expressão de mediadores que são caracterizados como anti-

inflamatórios, sendo estes favoráveis ao desenvolvimento tumoral [24].

Figura 3. Balanço na resposta imunológica numa situção normal e no microambiente tumoral.

1. Introdução


- 14 -

1.6. Interleucina-4 (IL-4)

A interleucina-4 (IL-4), é uma citocina que desempenha um papel importante no

processo de inflamação, quer pela sua capacidade de induzir diferenciação de linfócitos

Th2, quer por conferir às células sobre as quais actua, um efeito anti-proliferativo [29].

O gene que codifica a IL-4 localiza-se no braço longo do cromossoma 5, 5q23-31,

próximo de outros genes que codificam citocinas de diferenciação Th2 (IL-5, IL-13) (figura

4) [30-32].

Figura 4. Localização cromossómica do gene da IL-4. (adaptado de:www.ncbi.nlm.nih.gov)

A IL-4 é uma citocina pleiotrópica, sendo produzida por células T, mastócitos e

basófilos [33,34]. Esta citocina apresenta múltiplas funções imunomoduladoras. Tem

características anti-inflamatórias, estimulando a produção de citocinas com propriedades

semelhantes (IL-10, antagonista IL-1R) e inibe a expressão de citocinas pró-inflamatórias,

como IL-1, IL-6, IL-12, contribuindo desta forma para a redução da inflamação [35,36].

A IL-4 é um potente inibidor do processo de inflamação e angiogénese, bem como

do crescimento tumoral, tendo um efeito directo anti-proliferativo em alguns carcinomas

(mama, gástrico, renal, cólon, pulmão e mieloma múltiplo) [37-40].

A IL-4 é capaz de actuar quer localmente, quer sistemicamente de forma a bloquear

a neovascularização [41], modulando a activação de fibroblastos associados a tumores

(TAF). Esta capacidade da IL-4 permite a supressão do crescimento de novos vasos

sanguíneos, processo que é fundamental para o desenvolvimento tumoral [42]. Esta

interleucina tem funções muito diversificadas e pode actuar ao nível dos tecidos

hematopoiéticos, tecidos de adesão e nos processos de inflamação [33,34]. É de

destacar a sua influência nos tecidos de adesão, onde tem a capacidade de regular

moléculas de adesão (ICAM-1, intercellular adhesion molecule-1), fundamentais no

processo de metastização [43].

1. Introdução


- 15 -

1.6.1. Polimorfismo -590 C/T no gene IL-4

O polimorfismo funcional -590 C/T do gene IL-4 é um dos vários que este gene

apresenta. Este polimorfismo representa uma substituição de uma citosina (C) por uma

timina (T) na posição -590 (rs 2243250) na região promotora, afectando a actividade

transcriptional do gene [30,32,38,44,45]. Este polimorfismo induz um aumento na

expressão de IL-4 na presença do alelo T, verificando-se um aumento dos níveis desta

citocina no soro. Por outro lado, o alelo C está associado a uma menor expressão do

gene [37,38,44,45].

A frequência do alelo T dito de “alta expressão” varia entre os 70% e 85% na

população Asiática e 15% a 25% na população Europeia [38,45,46]. Este alelo tem sido

relacionado com o desenvolvimento de vários tipos de cancro, como mama, cólon e

cabeça e pescoço [37].

1.7. Quimiocinas

Quimiocinas são citocinas com características quimioatractoras. Foram

inicialmente definidas como factores solúveis que regulam a migração de leucócitos

durante os vários estadios da inflamação. Contudo, a biologia das quimiocinas estende-

se a todos os tipos de células, incluindo células tumorais [4], desempenhando um papel

crucial nas reacções imunológicas e inflamatórias [21].

As quimiocinas compreendem uma grande família de proteínas pró-inflamatórias de

baixo peso molecular [47], que são potentes activadores e quimioatractores para

diferentes sub-populações de leucócitos e algumas células não hematopoiéticas [48].

Quase todos os membros da super-família das quimiocinas possuem quatro resíduos

conservados do aminoácido cisteína no N-terminal, sendo as quimiocinas agrupadas em

quatro grupos, de acordo com a separação dos dois primeiros resíduos [49].

O maior grupo de quimiocinas é caracterizado por possuir 2 resíduos adjacentes de

cisteína no N-terminal, donde lhe advém a designação CC. As quimiocinas CC exercem a

sua acção em linfócitos, monócitos e macrófagos, basófilos, eosinófilos, células NK e

células dendríticas. O segundo maior grupo, o grupo CXC, é caracterizado por possuir

um resíduo de aminoácido variável que se encontra entre os dois resíduos de cisteína N-

terminais. As quimiocinas CXC actuam sobretudo sobre linfócitos e neutrófilos [50].

1. Introdução


- 16 -

Os dois outros grupos de quimiocinas são o grupo XC, onde apenas um resíduo de

cisteína está presente no N-terminal e o grupo CX3C, que tem três resíduos de

aminoácidos entre os dois primeiros resíduos de cisteínas [50].

As quimiocinas exercem os seus efeitos biológicos ligando-se a receptores

acoplados à proteína G (GPCRs) presentes na membrana citoplasmática da célula alvo.

Todos estes receptores são constituídos por aproximadamente 350 aminoácidos, com um

peso molecular que ronda os 40 kDa. O domínio extracelular consiste no N-terminal e

três loops extracelulares, que actuam de forma conjunta para a ligação do ligando

quimiocina. A região intracelular é composta por três loops e pelo C-terminal, que

colaboram para a transdução do sinal induzido pela ligação da quimiocina [51] .A rede de

quimiocinas e seus receptores que se encontra em tumores epiteliais pode contribuir para

vários aspectos do desenvolvimento e invasão tumoral. As quimiocinas são os principais

determinantes dos infiltrados de leucócitos nos tumores e podem contribuir para um

ambiente de imuno-supressão [50].

Devido ao envolvimento das quimiocinas numa tão vasta gama de actividades no

hospedeiro, torna-se natural assumir que estas terão um grande impacto na patobiologia

do cancro [52].

1. Introdução


- 17 -

1.8. Interleucina -8 (IL-8)

A interleucina-8 (IL-8 ou CXCL8 de acordo com a nova nomenclatura das

quimiocinas), foi originalmente identificada como neutrophils chemotactic factor no

sobrenadante de monócitos humanos activados e foi caracterizada como um membro da

familia de quimiocinas CXC [53-56]. As quimiocinas CXC actuam sobretudo sobre

linfócitos e neutrófilos sendo que a IL-8 tem um papel importante como citocina

quimioatractora de neutrófilos [53-56].

Os primeiros estudos que permitiram associar a expressão de IL-8 a tumores foram

realizados em melanócitos humanos e linhas celulares de melanoma [57]. Estes estudos

demonstraram que a IL-8 era importante na regulação do crescimento de melanoma e

das suas metástases. A expressão de IL-8 foi observada em vários tumores, incluindo

leucemias, cancro de mama, tumores cerebrais, cancro gástrico e cancro de pulmão [57].

O gene IL-8 codifica uma proteina de 99 aminoácidos que são subsequentemente

processados por proteínas competentes, dando origem a 77 aminoácidos nas células não

imunológicas e 72 aminoácidos em monócitos e macrófagos [55]. Os efeitos biológicos

desta citocina são mediados pela ligação da IL-8 a 2 receptores acoplados à proteína G,

CXCR1 e CXCR2. Estes receptores são considerados estruturalmente semelhantes, o

que sugere que tenha havido uma duplicação de genes [55].

A IL-8 é secretada por diversas células como monócitos, macrófagos, fibroblastos e

queratinócitos [54]. As suas funções principais são a quimiotaxia de células do sistema

imune (neutrófilos e macrófagos), desempenhando também um papel importante como

factor angiogénico [58]. Esta citocina está relacionada com a produção de outras

citocinas como o TNF-α e IL-6 [58].

O gene que codifica a IL-8 localiza-se no braço longo do cromossoma 4, 4q13-q21

[59] (Figura 5) e contém quatro exões e três intrões, estando descritos vários

polimorfismos em diferentes locais do gene [59].

1. Introdução


- 18 -

Figura 5: Localização cromossómica do gene da IL-8. (adaptado de: www.ncbi.nlm.nih.gov)

1.8.1. Polimorfismo -251T/A no gene IL-8

De entre os polimorfismos descritos no gene que codifica a IL-8, é de destacar o

SNP -251T/A na região promotora, caracterizado pela substituição de uma timina (T) por

uma adenina (A) (rs4073) [54]. Este polimorfismo funcional correlaciona-se com a

expressão de IL-8, estando descrito que o alelo A está associado à diminuição dos níveis

de proteína [57-60]. A frequência do alelo A deste polimorfismo está descrito que na

população normal das várias etnias varia entre 30% a 50% [60].

1. Introdução


- 19 -

1.9. Cancro de Pulmão

1.9.1. Epidemiologia e Mecanismos Moleculares

O cancro de pulmão é a neoplasia mais comum no mundo desde 1985, sendo que

em 2008 foram diagnosticados cerca de 1,6 milhões de novos casos e a taxa de

mortalidade foi de 18,2%, o que corresponde a 1,4 milhões de mortes [3]. Na Europa, em

2008 foram registados cerca de 391 000 novos casos, originando no mesmo período

cerca de 19,9% do total de mortes por cancro (342 000 mortes) [1]. Em Portugal o

cenário é bastante semelhante, sendo que a taxa de mortaliadade foi de 28,5% o que

corresponde a 2666 mortes por cancro de pulmão, no ano de 2008 [3]. A incidência do

cancro do pulmão é maior nos homens e nos indivíduos mais velhos, sendo

aproximadamente o dobro da taxa de incidência deste tipo de cancro na mulher [1-3]. A

taxa de incidência desta neoplasia na mulher tem vindo a aumentar durante a última

década, devido sobretudo à alteração dos hábitos tabágicos das mulheres [1-3].

A maioria dos países desenvolvidos apresenta um decréscimo nas taxas de

mortalidade devidas a cancro, com excepção para o cancro de pulmão que continua a

aumentar [2]. Tais alterações parecem estar directamente relacionadas com o estilo de

vida dos habitantes dos países desenvolvidos, nomeadamente devido ao consumo de

tabaco [2].

1. Introdução


- 20 -

Figura 6. Taxas de incidência anuais do cancro de pulmão por 100 000 individuos, em

ambos os sexos em 2008 [3].

Desde 1954 que está estabelecida a relação directa entre o fumo do tabaco e o

cancro do pulmão [61], e as evidências desta associação são claras: o risco para o

cancro do pulmão aumenta com o número de cigarros fumados, anos de tabagismo, grau

de inalação, a tara e o conteúdo de nicotina e o uso de cigarros sem filtro [61-63].

Os indivíduos fumadores apresentam um risco 10 vezes superior de desenvolver esta

neoplasia do que individuos não fumadores. O fumo do tabaco contém numerosos

agentes procarcinogéneos, como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH) e

benzeno, que após a sua activação, são altamente nocivos para o epitélio respiratório.

Outros factores que poderão contribuir para o aparecimento desta neoplasia

incluem doenças pulmonares anteriores e exposição a agentes carcinogéneos ambientais

[64,65]. No entanto, nem todos os fumadores desenvolvem cancro de pulmão, o que

indica que outros condicionantes podem estar envolvidos no desenvolvimento tumoral.

Diferenças genéticas na capacidade de reparação de ADN e no metabolismo de

0 3.3 10.4 26.8 47.8 80

1. Introdução


- 21 -

carcinogéneos têm sido apontadas como factores importantes na definição de subgrupos

com maior ou menor risco de desenvolver cancro de pulmão [64-67].

O cancro de pulmão apresenta diferentes tipos histológicos, sendo que o cancro de

pulmão de não-pequenas células (CPNPC) representa cerca de 75% da totalidade dos

casos de cancro de pulmão. Dependendo do tipo de célula que lhe dá origem, o

carcinoma do pulmão pode ser classificado como epidermóide, adenocarcinoma,

carcinoma de grandes células, CPNPC misto ou indiferenciado [64]. A avaliação do tipo

histológico do tumor, juntamente com o estadio, aquando do diagnóstico do cancro do

pulmão, é determinante na escolha do tratamento e no prognóstico do doente [68]. O

estadiamento do tumor é feito com base no sistema TNM, proposto pelo American Joint

Committee on Cancer (AJCC) em 1973, que classifica o tumor de acordo com o seu

tamanho e potencial invasivo (T), com o envolvimento de gânglios linfáticos na região (N)

e com a presença ou não de metástases à distância (M) [68-71].

O tratamento do cancro de pulmão é bastante individualizado, variando com o tipo

histológico, localização e extensão do tumor e também com a idade e estado geral do

doente. As opções terapêuticas disponíveis são a cirurgia, a radioterapia e a

quimioterapia, podendo ser aplicadas isoladamente ou como terapia combinada, visando

controlar o desenvolvimento tumoral e a metastização [72].

Numerosas evidências sugerem que a progressão tumoral é condicionada não

apenas por alterações genéticas intrínsecas ao cancro, mas também por factores

epigenéticos e ambientais sendo a inflamação crónica representativa de ambos [73].

Nas últimas décadas, tem sido sugerido que a inflamação e vias relacionadas têm

um papel importante na patogénese do cancro do pulmão [74,75], em particular no

epitélio dos fumadores, embora os mecanismos que conduzem a tal não estejam ainda

esclarecidos [73].

A inflamação envolve um conjunto de respostas do hospedeiro, que incluem o

recrutamento de células específicas do sistema imunológico, a libertação de mediadores

solúveis e interacções entre sistemas de citocinas e os seus receptores. O cancro do

pulmão é um modelo tumoral em que a inflamação crónica associada ao tabagismo se

reveste de especial importância, pelo que a modulação de mediadores imunológicos

pode ser encarada como alvo molecular de estratégias terapêuticas inovadoras contra a

progressão tumoral.

O B J E C T I V O S

2.

2. OObbjjeeccttiivvooss


- 25 -

2.1. Objectivo Geral

Compreender a relevância dos polimorfismos genéticos -590 C/T do gene IL-4 e -

251 A/T do gene IL-8 na susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro de pulmão

de não-pequenas células (CPNPC).

2.2. Objectivos Específicos

- Analisar a frequência dos polimorfismos genéticos - IL-4 590C/T e IL-8 -251 A/T

em indivíduos com CPNPC e indivíduos sem doença oncológica conhecida;

- Avaliar a existência de associações entre a frequência dos polimorfismos

estudados e a susceptibilidade para cancro de pulmão;

- Avaliar a associação dos polimorfismos estudados com características clínico-

patológicas dos doentes com CPNPC.

3.

M A T E R I A L

E

M É T O D O

S

3. Material e Métodos


- 29 -

3.1. Caracterização das Amostras

Para a realização deste trabalho experimental, foi realizado um estudo de base

hospitalar do tipo caso-controlo, para o qual foram recrutados 391 doentes do Instituto

Português de Oncologia – Porto (IPO-Porto), caucasianos, com diagnóstico

histopatológico de Cancro de Pulmão (grupo de casos) e 669 indivíduos sem doença

oncológica conhecida, caucasianos, dadores de sangue do IPO-Porto (grupo controlo),

perfazendo um total de 1060 individuos.

Os indivíduos participantes neste estudo (controlos e casos) são residentes na

região Norte de Portugal. Os casos são acompanhados no Instituto Português de

Oncologia Francisco Gentil – Centro Regional de Oncologia do Porto, E.P.E.. As

amostras foram recolhidas após prévio consentimento de todos os indivíduos, de acordo

com a Declaração de Helsínquia.

3.1.1. Doentes com Cancro de Pulmão

Foram analisadas amostras referentes a 391 indivíduos diagnosticados com cancro

de pulmão no Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil – Centro Regional de

Oncologia do Porto, E.P.E. com uma idade média de 62,7 anos (desvio padrão de 10,0

anos). Foram avaliados vários parâmetros clínico-patológicos, tais como: estádio e tipo

histológico do tumor, como descrito na tabela 1.

3.1.2. Indivíduos do Grupo Controlo

O grupo de controlo incluiu 669 indivíduos sem qualquer patologia oncológica

conhecida, sendo estes dadores de sangue do Instituto Português de Oncologia

Francisco Gentil – Centro Regional de Oncologia do Porto, E.P.E., com uma idade média

de 48,2 anos (desvio padrão de 9,79 anos), descrito na tabela 1.



- 30 -

Tabela 1. Características clínico-patológicas do grupo de casos com CPNPC e carcterísticas

gerais do grupo controlo.

Casos

(n=391)

Controlos

(n=669)

n % n % Género

Masculino 311 79,5 269 40.2

Feminino 79 20,2 400 59.8

Sem informação 1 0,3

Total 391 100,0 669 100.0

Idade

Média ± SD 62,7± 10,0 48,2 ± 9,79

Histologia

Epidermóide 149 38,1

Não epidermóide 238 60,9


Total 391 100,0

Estadio

I 41 10,5

II 30 7,7

III 174 44,5

IV 143 36,6


Total 391 100,0

Fumadores

Fumadores e Ex-Fumadores 288 73,7 266 39,8

Não fumadores 101 25,8 351 52,5

Sem informação 2 0,5 52 7,8

Total 391 100,0 669 100,0



- 31 -

3.2. Processamento das amostras

O ADN genómico utilizado no decorrer do trabalho experimental foi isolado a partir

de células nucleadas de sangue periférico. O isolamento de ADN genómico foi efectuado

segundo o Kit de extracção da Qiagen ®, QIAmp® DNA Blood Mini Kit, (Qiagen® 51106)

executando o procedimento laboratorial fornecido pelo fabricante.

3.3. Genotipagem dos Polimorfismos dos genes IL-4 e IL-8

A caracterização dos polimorfismos em estudo foi realizada recorrendo às técnicas

de PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Lenght Polymorphism),

tendo sido utilizadas diferentes condições, para a análise dos diferentes polimorfismos,

as quais estão descritas na tabela 2.

Tabela 2. Descrição dos protocolos de PCR-RFLP dos polimorfismos estudados

Gene Método Sequência de Primers Enzima de

Restrição

Tempo de

incubação ºC Ref.

IL-4

- 590 C/T PCR-RFLP F- 5’- ACT AGG CCT CAC CTG ATA CG– 3’

R- 5’GTT GTA ATG CAG TCC TCC TG – 3’ BsmFI 4 H 65 [30]

IL-8

-251 A/T PCR-RFLP F- 5’- CCA TCA TGA TAG CAT CTG TA– 3’

R- 5’– CCA CAA TTT GGT GAA TTA TTA A- 3’ Ase I 3H 37 [76]



- 32 -

3.3.1. Polimorfismo -590 C/T no gene IL-4

Para análise do polimorfismo -590 C/T do gene IL-4, amplificou-se um fragmento de

ADN por PCR (Polymerase Chain Reaction) com base no protocolo descrito por Gyan et

al [30].

Submeteram-se a PCR cerca de 20 ng de ADN de cada caso, o que corresponde a

aproximadamente 2 µl de cada amostra.

O volume de reacção foi de 50 µl, e a mistura de reacção incluiu: 5µl de tampão de

reacção de PCR (1x), 1U de Taq ADN Polimerase, 2,5mM de MgCl2 (Go Taq®Flexi DNA

Polymerase #M8305), 0,2mM de dNTPs (dinucleosídeos trifosfato) (Fermentas, #R0192)

e 0,3µM de cada um dos primers.

As condições de amplificação utilizadas foram: pré-desnaturação a 95ºC durante 10

minutos, seguida de 30 ciclos de 50 segundos a 95ºC (desnaturação), 50 segundos a

62ºC (emparelhamento) e 50 segundos a 72ºC (extensão) aos quais se seguiu um passo

final de extensão a 72ºC durante 5 minutos. A reacção foi efectuada num termociclador

programável BioRad®.

Para confirmar a correcta amplificação dos fragmentos de ADN obtidos e o seu

respectivo peso molecular (252 pb), analisaram-se 15 µl do produto de PCR por

electroforese em gel de agarose a 1.5% (p/v), corado com brometo de etídeo (10µg/ml).

Os géis foram preparados em tampão TBE (Anexo I), sendo este também utilizado como

tampão de electroforese. As amostras foram aplicadas no gel e foi utilizado um marcador

molecular de 100pb (Fermentas #SM0243). A visualização dos géis foi efectuada

recorrendo a um transiluminador Gel DocXR, Biorad® (figura 7).

Figura 7. Gel de agarose a 1,5 % (p/v), mostrando a banda de 252 pb que corresponde à

região de IL-4 -590 C/T amplificada por PCR (M- marcador de 100 pb).

252 pb

252 pb



- 33 -

Para a análise dos genótipos do polimorfismo foram utilizados 10 μl de produto de

PCR de cada amostra para a restrição com 1 unidade da endonuclease BsmFI (New

England Biolabs®, R0572L) num volume final de reacção de 15 μL. As amostras foram

incubadas a 65 ºC, durante 4 horas. O resultado da digestão do fragmento amplificado do

gene IL-4 contendo o locus de interesse foi observado por electroforese em gel de

agarose a 2 % (p/v), corado com brometo de etídeo (10μg/mL).

A digestão do fragmento do gene IL-4 resulta em 3 padrões de bandas, permitindo

identificar os diferentes genótipos do polimorfismo -590 C/T: 192pb e 60pb (não é

possível visualizar) corresponde ao genótipo CC, uma banda de 252 pb corresponde ao

genótipo TT, e um padrão de bandas de 252pb, 192pb e 60pb (não é possível visualizar)

corresponde a um genótipo CT (Figura 8).

Figura 8. Gel de agarose a 2 % (p/v), após PCR- RFLP, observando-se os 3 genótipos

possíveis do polimorfismo IL-4 -590 C/T (M- marcador 100 pb).

252 pb

192 pb



- 34 -

3.3.2. Polimorfismo -251 A/T no gene IL-8

Para análise do polimorfismo -251 A/T do gene IL-8, amplificou-se um fragmento de

ADN por PCR com base no protocolo descrito por Heinzmann et al. [76].

Submeteram-se a PCR cerca de 20 ng de ADN de cada caso, o que corresponde a

aproximadamente 2 µl de cada amostra.

O volume de reacção foi de 50 µl, e a mistura de reacção incluiu: 5µl de tampão de

reacção de PCR(1x), 1U de Taq ADN Polimerase, 2,5mM de MgCl2 (Go Taq®Flexi DNA

Polymerase #M8305), 0,2 mM de dNTPs (dinucleosídeos trifosfato) (Fermentas, #R0192)

e 0,3µM de cada um dos primers .

As condições de amplificação utilizadas foram: pré-desnaturação a 94ºC durante 5

minutos, seguida de 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC (desnaturação), 55 segundos a

57ºC (emparelhamento) e 60 segundos a 72ºC (extensão) aos quais se seguiu um passo

final de extensão a 72ºC durante 8 minutos. A reacção foi efectuada num termociclador

programável BioRad®. Para confirmar a correcta amplificação dos fragmentos de ADN

obtidos e o seu respectivo peso molecular (173 pb), analisaram-se 15 µl do produto de

PCR por electroforese em gel de agarose a 1.5% (p/v), corado com brometo de etídeo

(10µg/ml). Os géis foram preparados em tampão TBE (Anexo I), sendo este também

utilizado como tampão de electroforese. As amostras foram aplicadas no gel e foi

utilizado um marcador molecular de 100pb (Fermentas #SM0243). A visualização dos

géis foi efectuada recorrendo a um transiluminador Gel DocXR, BioRad.® (figura 9).

Figura 9. Gel de agarose a 1,5 % (p/v), mostrando a banda de 173 pb que corresponde à

região de IL-8 -251 A/T amplificada por PCR (M- marcador de 50 pb).

M

173 pb



- 35 -

Para a análise do polimorfismo no gene IL-8 foram utilizados 10 μL de produto de

PCR de cada amostra para a restrição com a endonuclease AseI (New England Biolabs®,

R0526S) num volume final de reacção de 15 μL. As amostras foram incubadas a 37 ºC,

durante 3 horas. O resultado da digestão do fragmento amplificado do gene IL-8

contendo o locus de interesse foi observado por electroforese em gel de agarose a 2%

(p/v), corado com brometo de etídeo (10μg/mL).

A digestão do fragmento do gene IL-8 resulta em 3 padrões de bandas, permitindo

identificar os diferentes genótipos do polimorfismo -251A/T: 152pb e 21pb (não é possível

visualizar) corresponde ao genótipo AA, uma banda de 173 pb corresponde ao genótipo

TT, e um padrão de duas bandas de pesos moleculares de 173pb, 152pb e 21pb (não é

possível visualizar) corresponde ao genótipo AT (figura 10).

Figura 10. Gel de agarose a 2 % (p/v), após PCR- RFLP, observando-se os 3 genótipos

possíveis do polimorfismo IL-8 -251 A/T (M- marcador 100 pb).

AA

173 pb

152 pb



- 36 -

3.4. Análise estatística

A análise estatística dos resultados foi realizada com o auxílio do programa

estatístico SPSS (versão 15.0, SPSS Inc, 2004).

A análise pelo teste Qui-Quadrado (χ2) foi utilizada para comparação das diferentes

variáveis categóricas. O valor de p foi obtido pelo teste de χ2 e considerado

estatísticamente significativo quando inferior a 0,05.

O valor de Odds Ratio (OR) indica o risco relativo para determinado acontecimento

num estudo do tipo caso-controlo, e foi calculado juntamente com o intervalo de

confiança de 95% (IC 95%) para medir a associação entre os genótipos de IL-4, IL-8 e o

risco para cancro da pulmão.

Foi realizada uma análise de regressão logística multivariada para calcular o Odds

Ratio ajustado (aOR) e respectivo IC95% para a influência das variantes genéticas no

risco para o desenvolvimento de CPNPC, ajustado para possíveis variáveis de

confundimento.

.


- 37 -

4.

R E S U L T A D O

S

4. RReessuullttaaddooss


- 39 -

4.1. Associação do Polimorfismo -590 C/T no gene IL-4 na susceptibilidade

de Cancro de Pulmão (CPNPC)

A distribuição das frequências dos vários genótipos do polimorfismo -590 C/T do

gene da IL-4 (CC, CT e TT) no grupo controlo e no grupo de casos com CPNPC está

descrita na tabela 3.

Relativamente ao grupo controlo, dos 669 indivíduos incluídos neste estudo, 67,9%

apresenta genótipo CC, 24,7% genótipo CT e 7,5% genótipo TT. Estas frequências estão

de acordo com outros estudos em populações saudáveis [38,45,46].

No grupo dos casos com CPNPC, foram incluídos no estudo 321 indivíduos e

obtiveram-se frequências de 65,4% para o genótipo CC, 29,6% para o genótipo CT e

5,0% para o genótipo TT.

Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre o grupo de casos e

o grupo controlo, tendo em conta os vários genótipos do polimorfismo.

Tabela 3: Frequências genotípicas do polimorfismo -590 C/T IL-4 nos grupos controlo e CPNPC.

p- valor de p obtido pelo teste de χ2; OR- odds ratio; IC 95%- intervalo de confiança a 95%

IL-4 590 C/T

n (%)

Controlos (n=669)

CPNPC (n=321)

OR IC 95% P

Genótipo

CC 454 (67,9) 210 (65,4) 1,00 referência -

CT 165 (24,7) 95 (29,6) 1,245 0,921-1,682 0,153

TT 50 (7,5) 16 (5,0) 0,692 0,385-1,243 0,216



- 40 -

As frequências genotípicas do polimorfismo -590 C/T do gene IL-4 no grupo

controlo, nos grupos de pacientes com CPNPC e resultados da análise estatística

atendendo ao genótipo de alta e baixa expressão, TT e CC, respectivamente, estão

descritos na tabela 4.

Através da análise dos resultados observou-se que os indivíduos portadores do

genótipo TT apresentam uma protecção de aproximadamente 78% para o

desenvolvimento de CPNPC do tipo histológico epidermóide (OR=0,221; IC95%= 0,053-

0,928; P=0,024), quando comparados com os indíviduos do grupo controlo.

Considerando os tipos histológicos não-epidermoides, não foram verificadas diferenças

estatisticamente significativas na distribuição dos genótipos do polimorfismo entre o

grupo controlo e os grupos de pacientes com CPNPC (OR= 1,017; IC95%= 0,544-1,900;

P=0,958).

Tabela 4: Distribuição das frequências de alta e baixa expressão, TT e CC, respectivamente, do

polimorfismo -590 C/T IL-4 no grupo controlo e em doentes com CPNPC de acordo com o tipo

histológico.


IL-4 -590C/T

n (%) OR 95% IC P

CC TT

Controlos (n=504)

454 (90,1)

50 (9,9)

1,00

referência

-

Epidermóides (n=84) 82 (97,6) 2 (2,4) 0,221 0,053-0,928 0,024

Não epidermóides (n=139) 125 (89,9) 14 (10,1) 1,017 0,544-1,900 0,958



- 41 -

Dada a relevância do fumo de tabaco na carcinogénese do pulmão, foi realizada

uma análise ajustada para o tabaco e também para o género.

Esta análise foi dividida por tipo histológico, visto ter sido encontrada uma forte

associação estatística no tipo histológico epidermóide.

Para os casos do tipo histológico epidermóide, esta análise mostra que o

polimorfismo -590 C/T IL-4 genótipo de “alta expressão” TT, continua a ter uma grande

relevância, uma vez que este polimorfismo ajustado às variaveis referidas mantém uma

significativa associação estatística, sendo ainda reforçada (aOR= 0,184; IC 95%= 0,042-

0,804; P*= 0,024) (tabela 5). A análise multivariada demonstra que indivíduos portadores

do genótipo de “alta expressão” de gene da IL-4 (TT), sendo fumadores e do género

masculino, apresentam uma protecção para o desenvolvimento de CPNPC do tipo

epidermóide.

Tabela 5: Análise multivariada ajustada para o tabaco e género, nos casos do tipo histológico

epidermóide

P*, aOR e 95%IC é calculado usando regressão logística

P* aOR IC 95%

IL-4 “alta expressão” TT 0,024 0,184 0,042-0,804

Tabaco <0,0001 9,680 4,673-20,052

Género <0,0001 6,080 2,532- 14,602



- 42 -

Na tabela 6 estão descritos os resultados da análise multivariada ajustada para o

tabaco e género nos casos com tipo histológico não epidermóide. Estes resultados

mostram que somente a variável tabaco tem importância no desenvolvimento desta

neoplasia (OR= 2,354; IC95%=1,563-3,544; P<0,0001) e que as restantes váriaveis,

nomeadamente o genótipo de “alta expressão” TT não apresenta associação

estatisticamente significativa (OR= 0,940; IC95%= 0,495-1,787; P=0,851).

Tabela 6: Análise multivariada ajustada para o tabaco e género, nos casos do tipo histológico não

epidermóide.

P*, aOR e 95%IC é calculado usando regressão logística

P* aOR IC 95%

IL-4 “alta expressão” TT 0,851 0,940 0,495-1,787

Tabaco <0,0001 2,354 1,563-3,544

Género 0,267 1,279 0,828-1,976



- 43 -

4.2. Associação do Polimorfismo -251 A/T no gene IL-8 na susceptibiliade

de Cancro de Pulmão (CPNPC)

A distribuição dos genótipos do polimorfismo -251 A/T do gene IL-8 (AA, AT e TT),

no grupo controlo e no grupo de casos com CPNPC encontram-se descritos na tabela 7.

As frequências dos genótipos AA, AT e TT observadas no grupo controlo

constituído por 476 indivíduos, foram 6,3%, 49,3% e 22,9% respectivamente. Nos 346

casos analisados, obtiveram-se frequências de 8,7% para o genótipo AA, 53,7% para o

genótipo AT e 26,1% para o genótipo TT.

Não se observaram diferenças estatisticamente significativas na distribuição dos

genótipos entre o grupo controlo e o grupo de casos.

As frequências genotípicas do polimorfismo em estudo no grupo controlo e no

grupo de doentes com CPNPC, tendo em conta os genótipos (AT+AA e TT), modelo

recessivo, encontram-se descritas na tabela 7. Os resultados mostram que no grupo

controlo, 29,0% apresenta um genótipo TT e que 71,0% têm genótipos portadores do

alelo A. No grupo de casos, são portadores do genótipo TT 29,5 % e portadores do alelo

A, 70,5% dos indivíduos. No entanto, não se verificaram associações estatisticamente

significativas entre os grupos tendo em conta os genótipos do polimorfismo no gene da

IL-8 (OR=0,977; IC95%= 0,720-1,340; P= 0,879)



- 44 -

Tabela 7: Frequências genotípicas do polimorfismo -251A/T IL-8 nos grupos controlo e CPNPC.


De forma a avaliar a influência deste polimorfismo nos diferentes tipos histológicos,

foi realizada uma análise estratificada por tipo histológico. Os resultados encontram-se

descritos na tabela 8.

No grupo controlo foram analisados 476 indivíduos, dos quais 29,0% apresentavam

genótipo TT e 71,0% tinham genótipos portadores do alelo A. No grupo dos casos com

CPNPC, foram incluídos nesta análise 342 casos, dos quais 132 eram do tipo histológico

epidermóide e 210 eram não-epidermóide. Relativamente ao tipo histológico

epidermóide, 29,5% apresentam genótipo TT e 70,5% eram portadores do alelo A. Não

foram encontradas associações estatísticamente significativas para estes casos, em

comparação com os controlos, atendendo aos genótipos do polimorfismo (OR= 0,974;

IC95%=0,638-1,486; P=0,901).

Em relação ao indivíduos do tipo histológico não epidermóide, 29,5% apresentavam

genótipo TT, e 70,5% eram portadores de genótipos como o alelo A. Também neste

subgrupo não foram encontradas associações estatisticamente significativas nas

frequências dos genótipos do polimorfismo entre o grupo de casos e o grupo controlo.

(OR=0,975; IC95%=0,682-1,392; P=0,888).

IL-8-251 A/T

n (%) OR IC 95% P

Controlos

(n=476)

CPNPC

(n=346)

Genótipos

TT 138 (29,0) 102 (29,5) 1,00 referência -

AT 300 (63,0) 210 (60,7) 0,95 0,69-1,31 0,73

AA 38 (7,9) 34 (9,8) 1,21 0,69-2,12 0,48

Modelo Recessivo

TT 138 (29,0) 102 (29,5) 1,00 referência -

Portador A 338 (71,0) 244 (70,5) 0,977 0,720-1,340 0,879



- 45 -

Tabela 8: Distribuição das frequências do genótipo TT e portador A, respectivamente do

polimorfismo -251 A/T IL-8 no grupo controlo e no grupo de casos com CPNPC, de acordo com o

tipo histológico.


IL-8 -251 A/T

n (%) OR 95% IC P

TT Portador A

Controlos (n=476)

138 (29,0)

338 (71,0)

1,00

referência

-

Epidermóides (n=132) 39 (29,5) 93(70,5) 0,974 0,638-1,486 0,901

Não epidermóides (n=210) 62 (29,5) 148 (70,5) 0,975 0,682-1,392 0,888

5.

D I S C U S S Ã

O

- 48 -

5. DDiissccuussssããoo


- 49 -

No decorrer dos últimos anos, os avanços alcançados pela investigação na área da

oncologia permitiram definir o cancro como uma doença complexa, que envolve

alterações dinâmicas do genoma, destacando a importância da componente genética na

sua etiologia.

Os tumores sólidos compreendem, para além de células malignas, vários tipos de

células não malignas, o que lhes confere um microambiente que pode modificar as

propriedades neoplásicas das células tumorais [77]. Grande parte da investigação em

oncologia tem-se centrado nas células malignas que constituem o tumor. A explicação

para este facto prende-se, provavelmente, com o sucesso dos estudos que definiram a

necessidade de vários eventos mutagénicos nas células epiteliais para a formação de

tumores malignos, no isolamento de oncogenes cuja expressão restrita ao epitélio

provoca cancro, e na concordância entre os resultados experimentais e estudos

epidemiológicos que indicam que múltiplos eventos são necessários para a aquisição, por

parte das células, de um fenótipo de malignidade [78]. Apesar dos progressos

alcançados no sentido da definição molecular das alterações genéticas intrínsecas que

ocorrem nas células malignas, tornou-se claro que os tumores são uma rede intrincada

de diferentes tipos de células e que a manifestação plena do potencial maligno das

células epiteliais transformadas requer um suporte estrutural apropriado por parte do

estroma do tumor [79]. Este é complexo, sofre alterações constantes e depende do local

onde o tumor tem origem [80]. Pode consistir em fibroblastos residentes, adipócitos,

vasos sanguíneos e linfáticos e pode conter infiltrados de diversos leucócitos

[21,77,79,80]. Estudos recentes demonstram que todos estes tipos de células podem

influenciar a progressão tumoral a vários níveis, dependendo do tipo de tumor [77,79].

Durante o desenvolvimento tumoral ocorrem alterações em importantes processos

celulares. A resposta imunológica é um desses processos, que poderá estar afectado

quando se inicia o processo de carcinógenese, podendo existir uma sobre ou sub

expressão das células que regulam este sistema [77]. Paralelamente às alterações

genéticas somáticas que as células adquirem durante a transformação neoplásica, a

variabilidade genética do hospedeiro, nomeadamente em genes-alvo especificos,

também contribui e influencia todo o desenvolvimento tumoral [15].



- 50 -

A IL-4 e a IL-8 são citocinas importantes na resposta inflamátoria. Em situações

fisiológicas estas duas interleucinas encontram-se em equilíbrio, existindo um balanço

entre uma resposta Th1 e uma resposta Th2. Em situações em que exista algum tipo de

stress, a expressão destas moléculas pode sofrer alterações de forma a manter a

homeostasia entre as respostas imunológicas [81]. Neste sentido, polimorfismos

funcionais como o -590 C/T e -251 A/T nos genes IL-4 e IL-8, que induzem alterações no

perfil de expressão de IL-4 e IL-8, respectivamente, podem ser considerados importantes

na definição de um perfil de susceptibilidade associado ao desenvolvimento tumoral, de

CPNPC.

O objectivo deste trabalho consistiu na avaliação da frequência genotípica dos

polimorfismos -590 C/T do gene da IL-4 e -251 A/T do gene da IL-8 na população

controlo e em indivíduos com cancro do pulmão e avaliar a existência de associações

entre a frequência dos polimorfismos estudados e a susceptibilidade para o

desenvolvimento de CPNPC.



- 51 -

5.1. Influência do polimorfismo -590 C/T da IL-4 na susceptibilidade para

o desenvolvimento de CPNPC

Durante décadas, o objectivo da investigação na área da oncologia era tentar

explicar alterações genéticas e fenotípicas nas células tumorais, numa tentativa de

compreender a essência desta doença [77]. Actualmente, tornou-se claro que é

imprescindível a análise do estroma tumoral, como uma parte crucial no esclarecimento

dos mecanismos neoplásicos [77]. Durante a progressão de uma neoplasia ocorrem

eventos em que as células tumorais apresentam a capacidade de modular as células do

tecido residente, de forma a induzirem uma resposta inflamatória para permitir o

recrutamento de células do estroma que são essenciais para a progressão neoplásica

[77]. O estroma tumoral é constituído por uma mistura de vários tipos celulares e diversos

factores de crescimento bem como matriz extracelular, que são essenciais para a

sustentação e manutenção dos tecidos [77].

As citocinas têm a capacidade de influenciar o crescimento, a sobrevivência e a

eliminação das células neoplásicas e esta pode ser uma influência negativa ou positiva,

dependendo da interacção entre a resposta imunológica inata e a adquirida [42].

A IL-4 é uma citocina pleitrópica que exerce a sua actividade biológica em diversas

células [82]. Esta citocina apresenta a capacidade de modular a diferenciação de células

T naíve em células Th2 [42].

Recentemente, foi demonstrado quer in vivo, quer in vitro, que a IL-4 apresenta

uma importante actividade anti-tumoral em vários modelos tumorais [82]. Esta citocina é

expressa no microambiente de alguns tumores, local onde existem também [42]. Os

leucócitos que se encontram no estroma tumoral têm a capacidade de produzir leucócitos

infiltrados altos níveis de IL-4 e baixos níveis de IFN-γ, o que conduz a uma diferenciação

em células Th1 menos eficaz, favorecendo a diferenciação Th2 [42,83].

A IL-4 desempenha um papel fulcral na inibição da diferenciação de macrófagos

induzida por citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1 e IL-8) [84], pelo que é considerada

um mediador chave, juntamente com a IL-10, na inibição de respostas mediadas por

células Th1, promovendo a resposta Th2. Assim, tumores que expressam IL-4 e IL-10,

incluindo os do pulmão, apresentam um favorecimento da resposta Th2 em relação a Th1

[84,85].



- 52 -

Sendo a IL-4 é uma citocina multifuncional, desempenha um papel ambíguo na

carcinogénese, comportando-se em algumas situações como citoquina inibitória do

desenvolvimento tumoral, efeito verificado em linhas celulares de cancro da mama,

gástrico, rim e colo-rectal. No entanto, noutras situações pode ser considerada um

estímulo para o desenvolvimento tumoral como se verifica nos tumores da cabeça e

pescoço [37,38]. Atendendo a este papel paradoxal da IL-4 no desenvolvimento tumoral,

Li e colaboradores [86], propuseram uma distinção, atendendo ao tipo de expressão

desta proteína, em dois grupos: exógena e endógena, sendo que a IL-4 endógena se

refere à molécula de IL-4 que é gerada sem a intervenção humana, quer em processos

fisiológicos, quer patológicos. A IL-4 endógena é usualmente produzida por células T,

basófilos, mastócitos e a sua produção é estritamente regulada por interação de sinais,

de forma a regular a homeostasia do sistema imune [86]. Em contraste, a IL-4 exógena

pode ser distribuída de forma sistémica como proteína recombinante no hospedeiro, ou

localmente pelo gene modificado por células tumorais [86]. Contudo, as condições

fisiológicas do microambiente tumoral podem condicionar a forma de actuação da IL-4

[42] (Figura 11).

Figura 11. Efeito paradoxal da IL-4 no controlo da progressão tumoral atendendo ao micro-

ambiente do tumor [42].



- 53 -

A progressão tumoral é estritamente dependente da angiogénese, observando-se

uma elevada contribuição das células que compõem o sistema imunológico para este

processo, facilitando o crescimento da neoplasia [80]. O tumor, para conseguir evoluir,

tem que ser capaz de induzir modificações no estroma do tecido residente, sendo o

aumento do número de fibroblastos do tecido uma modificação essencial ao

desenvolvimento tumoral [80].

Os fibroblastos são as principais células constituintes de um tecido, e as suas

principais funções incluem a deposição da matriz extracelular, regulação da diferenciação

do epitélio, regulação de alguns mecanismos associados à inflamação e encontram-se

também envolvidos no processo de cicatrização [80]. Além destas funções, os

fibroblastos são responsáveis pela síntese da maioria dos constituintes da matriz

extracelular, como o colagénio do tipo I, II, III e IV e a fibronectina. Os fibroblastos são

também uma importante fonte de proteases responsáveis pela degradação da matriz

extracelular, as MMP’s, enzimas essas importantes na manutenção da homeostasia dos

tecidos [80].

No início do crescimento tumoral, as células que formam a lesão neoplásica estão

envolvidas por um microambiente que é facultado pelo tecido residente. Com o decorrer

do desenvolvimento tumoral, as células do sistema imunológico, vasos sanguíneos,

fibroblastos e matriz extracelular constituem o estroma tumoral [80].

O estroma normal da maioria dos orgãos contém um número mínimo de

fibroblastos associados com a fisiologia da matriz extracelular. No entanto, no caso de

um estroma reactivo, este é associado ao aumento do número de fibroblastos, ao reforço

da densidade de vasos sanguíneos e ao aumento do depósito de colagénio do tipo I e de

fibrina [80].

Os fibroblastos associados ao estroma tumoral adquirem um fenótipo modificado,

que se torna semelhante ao do processo de cicatrização. Os fibroblastos “activados”,

incluídos no estroma tumoral, são designados de fibroblastos reactivos ou fibroblastos

associados a tumores [80]. Este tipo de fibroblastos apresenta a capacidade de promover

a progressão tumoral, uma vez que são capazes que recrutar factores essenciais ao

desenvolvimento do tumor (VEGF, TGF-β) [80]. Os fibroblastos associados a tumores são

pró-angiogénicos, quer actuando via promoção da expressão de VEGF quer pela

produção de fibrina e colagénio, permitindo o desenvolvimento de novos vasos [80].



- 54 -

A IL-4 é considerada uma citocina pleiotrópica e crucial como modulador do sistema

imune, tendo sido associada ao processo de angiogénese [87]. Os fibroblastos

associados a tumores são constantemente descritos como indutores da progressão e

crescimento tumorais. Contudo, um estudo de Blankestein e colaboradores, mostrou que

este tipo de fibroblastos pode condicionar a eliminação do tumor [88]. Este autor

demonstrou que a IL-4 é capaz de modular a activação dos fibroblastos e desta forma

este tipo de células não consegue auxiliar a formação de novos vasos sanguíneos, uma

vez que perde a sua capacidade reactiva [88]. O processo de angiogénese é fundamental

para o desenvolvimento tumoral, e uma vez condicionado, poderá limitar o

desenvolvimento de uma determinada neoplasia. Atendendo ao facto da IL-4 apresentar

a capacidade de modular a activação dos fibroblastos associados a tumores e de estes

serem fundamentais para o desenvolvimento da neoangiogénese, pode presumir-se que

a IL-4 condiciona a neovascularização. Desta forma, a relação da IL-4 com a

angiogénese pode constituir um mecanismo indirecto de eliminação do tumor, uma vez

que a estrutura do estroma tumoral será danificada, em consequência da perda de

capacidade de proliferação e disseminação que as células neoplásicas sofrem [42].

O microambiente de alguns tumores, incluindo cancro de pulmão, apresenta uma

sobrexpressão de algumas enzimas essenciais para o seu desenvolvimento, sendo a

COX-2 uma dessas enzimas. Esta enzima é descrita em inúmeros estudos

farmacológicos, biológicos e genéticos como uma enzima relacionada com a

tumorigénese [85].

Nas células não neoplásicas, como monócitos e neutrófilos, a IL-4 e IL-10 têm a

capacidade de inibir a expressão de COX-2. Nas células neoplásicas esta inibição por

parte da IL-10 é suprimida. Contudo, foi descrito que nas células de CPNPC a IL-4

continua a manter a capacidade de inibir a produção de COX-2 [85]. Este facto contribui

para a diminuição da progressão tumoral condicionando uma possível redução e/ou

eliminação do tumor [85].

Em virtude da relevância da IL-4 no desenvolvimento tumoral, o estudo desta

molécula reveste-se de especial importância na compreensão dos mecanismos

imunológicos subjacentes ao desenvolvimento tumoral. Desta forma, um dos objectivos

em que se centrava este trabalho era a análise da frequência do polimorfismo -590C/T do

gene IL-4 em indivíduos sem qualquer patologia oncológica conhecida e em doentes com

CPNPC e na avaliação de possíveis associações entre as frequências observadas do

polimorfismo em estudo e a susceptilidade para o desenvolvimento de CPNPC.



- 55 -

As frequências encontradas para o polimorfismo -590 C/T IL-4 foram 67,9%, 24,7%

e 7,5% para os genótipos CC, CT e TT, respectivamente, no grupo controlo e 65,4%,

29,6% e 5,0% para os genótipos CC, CT e TT respectivamente, no grupo de casos com

CPNPC. Estas frequências encontram-se em concordância com outros estudos em

populações caucasianas [37,44]. Uma vez que o alelo T deste polimorfismo promove uma

maior expressão da proteína, foi realizada a análise estatistica atendendo ao nível de

expressão, ou seja, considerando o genótipo TT como “alta expressão” e de “baixa

expressão” o genótipo CC. Atendendo a esta estratificação, foi possível verificar que os

indivíduos portadores do genótipo de “alta expressão” apresentam uma protecção para o

desenvolvimento de CPNPC do tipo histológico epidermóide (OR=0,221; IC95%=0,053-

0,928; P=0,024), quando comparados com indivíduos portadores do genótipo de “baixa

expressão” CC.

Os resultados obtidos indicam a existência de uma associação entre o genótipo TT

e o desenvolvimento de CPNPC epidermóide. Indivíduos portadores do genótipo de alta

expressão apresentam uma protecção de cerca de 78% para o desenvolvimento da

neoplasia, quando comparados com os portadores do genótipo CC. Deste modo,

indivíduos portadores de um fenótipo de alta expressão de IL-4 apresentarão uma maior

expressão desta citocina, o que poderá contribuir para uma diminuição da

neoangiogénese e consequentemente um menor risco para o desenvolvimento de

CPNPC. Estes resultados vêm de encontro ao que se conhece sobre o papel

desempenhado pela IL-4 na progressão tumoral: maior expressão desta interleucina pode

influenciar negativamente a neoangiogénese e inibir a expressão de COX-2,

condicionando desta forma o crescimento do tumor.

.



- 56 -

5.2. Influência do polimorfismo -251 A/T da IL-8 na susceptibilidade para

o desenvolvimento de CPNPC

Nos últimos anos a evolução do conhecimento na área da investigação oncológica

tem demonstrado que a inflamação apresenta um papel importante e complexo na

iniciação e promoção tumorais [89]. A interação entre o sistema imunológico e a

inflamação pode ser uma condicionante para o desenvolvimento tumoral, uma vez que

quando o sistema imunológico apresenta uma resposta inflamatória aguda, a inflamação

é auto-limitada [89]. Neste caso a produção de citocinas pro-inflamatórias, ou citocinas

Th1, é seguida pelas citocinas anti-inflamatórias, ou citocinas Th2 e o equilibrio entre os

dois tipos de respostas é mantido e a inflamação é controlada [89]. Por outro lado,

quando existe uma situação de inflamação crónica o balanço entre citocinas Th1 e Th2

não é conseguido, prolongando-se a inflamação, o que pode conduzir a uma elevada

produção de radicais de oxigénio ou de azoto [89].

Na literatura está descrito que a IL-8 é produzida por várias populações celulares

(células não neoplásicas e/ou células neoplásicas) [56,90]. A produção desta citocina

pode ser induzida por diversos estímulos, como IL-1, TNF-α e algumas células tumorais

que expressam constitutivamente IL-8 [55,56].

Ao nível das células tumorais, a expressão de IL-8 pode ser condicionada

significativamente por diversos factores como a hipóxia, acidose, óxido nítrico (NO) e

densidade celular [55,56].

Relativamente ao NO, este é um potente agente mediador de actividades

biológicas, incluindo vasodilatação, neurotransmissão e outras actividades mediadas pelo

sistema imune [56].

Estudos recentes indicam que o NO é um importante modulador da expressão da

IL-8, provocando um aumento da produção desta citocina por um aumento da actividade

do respectivo promotor [56]. Alguns estudos indicam que a IL-8 é predominantemente

expressa em locais onde as células tumorais se encontram rodeadas de áreas

necróticas, que surgem em locais de hipóxia do tumor, sugerindo que o estado de hipóxia

condiciona a expressão de IL-8 levando a uma sobrexpressão desta citocina [56], tal

como se verifica com o aumento de NO.



- 57 -

A IL-8 tem como função fisiológica primária a quimiotaxia de leucócitos (neutrófilos

e macrófagos) [56]. A sobrexpressão de IL-8 pelas células tumorais pode condicionar o

aumento do infiltrado leucocitário tumoral facilitando a produção de vários tipos de

factores de crescimento (EGF) e factores angiogénicos (VEGF), que em larga escala

promovem a rápida expansão da massa tumoral [56].

Atendendo às funções da IL-8 num ambiente inflamatório e à sua importância no

processo de carcinogénese, esta citocina torna-se uma molécula relevante na elucidação

dos processos imunológicos relacionados com a carcinogénese [56].

Um dos objectivos deste estudo consistia na análise da frequência do polimorfismo

-251 A/T do gene IL-8 em indivíduos sem qualquer patologia e em doentes com cancro

de pulmão de não-pequenas células e na avaliação da existência de associações entre a

frequência do polimorfismo estudado e a susceptibilidade para o desenvolvimento de

CPNPC.Este é o primeiro estudo que associa este polimorfismo ao desenvolvimento de

cancro de pulmão.

O polimorfismo -251 A/T promove a sobrexpressão da citocina IL-8 em indivíduos

portadores do alelo A [58,91]. Este aumento traduz-se num aumento do recrutamento de

leucócitos, nomeadamento neutrófilos e macrófagos, o que permitirá uma rápida

dissiminação de factores de crescimento[56].

Relativamente às frequências genotípicas do polimorfismo - 251 A/T do gene IL-8,

no nosso estudo as frequências encontradas foram 22,9%, 49,8% e 6,3 %

respectivamente para os genótipos TT, CT, AA no grupo dos individuos controlo. No

grupo de doentes com CPNPC as frequências observadas foram 26,1 %, 53,7% e 8,7%

respectivamente para os genótipos TT, AT e AA. Na análise estatística segundo o

modelo recessivo TT vs portador A, no presente estudo não se observam diferenças

estatísticamente significativas entre os dois grupos, casos e controlos (OR=0,997;

IC95%=0,720-1,340;P=0,879).

6.

P E R S P E C T I V A S

F U T U R A

S

C O N C L U S Ã

O

E

6. CCoonncclluussããoo ee PPeerrssppeeccttiivvaass FFuuttuurraass


- 61 -

As citocinas, intermediários cruciais do sistema imunológico, têm sido relacionadas

com aspectos fundamentais do desenvolvimento tumoral, ao nível do tumor, do seu

microambiente e ao nível do hospedeiro. Assim, as citocinas IL-4 e IL-8, importantes

mediadores da inflamação, tornam-se alvos de estudo bastante aliciantes na investigação

oncológica. A actuação destas citocinas, que condicionam processos inflamatórios,

parece estar envolvida no desenvolvimento de cancro de pulmão de não pequenas

células.

A análise de polimorfismos funcionais poderá contribuir para a caracterização da

susceptibilidade individual para o desenvolvimento de cancro. Desta forma, variantes

genéticas funcionais nos genes das interleucinas IL-4 e IL-8 poderão influenciar o

processo de carcinogénese e o desenvolvimento de cancro de pulmão. A definição de

grupos de indivíduos com maior susceptibilidade para o desenvolvimento desta neoplasia

poderá contribuir para um diagnóstico mais precoce.

Os polimorfismos -590 C/T IL-4 e -251 A/T IL-8 surgem na literatura associados a

uma maior expressão destas duas moléculas, o que condicionará uma maior

biodisponibilidade das respectivas proteínas. De acordo com os resultados obtidos, o

polimorfismo funcional -590 C/T IL-4 parece influenciar a susceptibilidade para o

desenvolvimento de CPNPC. Este polimorfismo, segundo os resultados do presente

estudo, confere uma protecção aos indivíduos portadores do genótipo de “alta expressão”

para o desenvolvimento de CPNPC do tipo histológico epidermóide. No entanto, o

polimorfismo -251 A/T IL-8, de acordo com os resultados deste estudo, não parece estar

associado ao desenvolvimento de cancro de pulmão na população alvo do estudo.

Estudos posteriores passarão pela replicação do presente estudo numa

amostragem maior de casos e controlos, de forma a confirmar estes resultados, devendo

incluir uma variante funcional, como a realização de ensaios de ELISA, para

quantificação da expressão de IL-4 e IL-8 no soro dos doentes com CPNPC e em

indivíduos saudáveis, relacionando-os com os diversos genótipos dos polimorfismos em

estudo.

Atendendo ao papel central que as moléculas em estudo desempenham no

microambiente tumoral, a quantificação dos seus níveis de expressão no tecido tumoral

reveste-se de especial importância para a elucidação dos mecanismos envolvidos na

progressão do tumor. Assim, estudos futuros passarão pela realização da quantificação

da expressão de IL-4 e IL-8 por imunocitoquímica em amostras de tecido tumoral de

doentes com CPNPC.

6. CCoonncclluussããoo ee PPeerrssppeeccttiivvaass FFuuttuurraass


- 62 -

Dado que a inflamação e vias relacionadas podem condicionar o desenvolvimento

de várias neoplasias, é importante relacionar estas variantes genéticas funcionais com o

desenvolvimento de outras neoplasias malignas, bem como envolver no estudo outras

citocinas e moléculas chave dos processos inflamatórios com capacidade de modular a

expressão das proteínas em estudo.

A imunoterapia é uma abordagem promissora para o desenvolvimento de terapias

integradas contra o cancro. Em combinação com estratégias como a cirurgia,

quimioterapia ou a radioterapia, a imunoterapia pode constituir um ataque eficiente à

sobrevivência residual do tumor. Literatura recente indica que as citocinas, quimiocinas e

os seus receptores, possam ser alvos terapêuticos aliciantes em terapias adjuvantes,

como é o caso da imunoterapia [92]. Neste sentido, o conhecimento aprofundado sobre

mecanismos e vias de actuação de mediadores da inflamação como IL-4 e IL-8 reveste-

se de particular interesse no contexto da definição de potenciais candidatos a inclusão

em novas estratégias de imunoterapia.

Um dos objectivos futuros passa pelo alargamento do presente trabalho a uma

perspectiva farmacogenómica, com o intuito de avaliar o papel dos polimorfismos que

foram alvos deste estudo na resposta à terapia.

Um melhor conhecimento da interacção das moléculas do sistema imune com o

tumor permitirá uma melhor avaliação do comportamento do tumor, podendo contribuir

para a definição de grupos de indivíduos com maior susceptibilidade para o

desenvolvimento de determinada neoplasia. A continuação deste trabalho será

fundamental para a elucidação do papel desempenhado pelos genes IL-4 e IL-8 não

apenas no cancro do pulmão, como também em outras neoplasias malignas.

R E F E R Ê N C I A

S

7.

77.. RReeffeerrêênncciiaass

Polimorfismos nos genes IL-4 e I-8 e Cancro de Pulmão

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8.

A N E X O

S

88.. AAnneexxooss


- 75 -

Anexo I

TBE 10X

Tris Base 108 g/L (Merck 1083821000)

Ácido Bórico 55 g/L (Merck 1001651000)

EDTA 6,72 g/L (Sigma E-1644)

88.. AAnneexxooss


- 76 -

Anexo II

Abstract apresentado sob a forma de poster na 15th European Cancer Organisation and

34th Congress of the European Society for Medical Oncology, em Berlim (Setembro

2009)

Influence of IL-4 -590C/T polymorphism in Non-Small Cell Lung

Cancer (NSCLC) susceptibility

Mónica Gomes1,2, Ana Coelho1,4, António Araújo2,3, Raquel Catarino1,4, Ana Nogal1, Rui Medeiros1,2

1 Molecular Oncology Group - CI, Portuguese Institute of Oncology, Porto, Portugal

2 ICBAS, Abel Salazar Institute for the Biomedical Sciences, University of Porto, Porto, Portugal

3 Oncology Department, Portuguese Institute of Oncology, Porto, Portugal

4 Faculty of Medicine of University of Porto, Portugal

Background:

Lung cancer is the leading cause of death by cancer in the world, originating about 17.5% of

total deaths from cancer (1.18 million). Inflammation and related pathways play an important role

in the pathogenesis of lung cancer. IL-4 is an anti-inflammatory cytokine, which reduces the

production of proinflammatory cytokines by monocytes and with direct antiproliferative effects in

some tumors. The polymorphism -590 C/T SNP is a C to T transition in the -590 position of the

promoter region of the IL-4 gene, and the T variant is associated with increased expression of IL-4.

The aim of this study was to evaluate the influence of this polymorphism in the susceptibility to

non-small cell lung cancer development (NSCLC).

Methods:

DNA was extracted from peripheral blood of 696 individuals (277 patients diagnosed with

NSCLC and a control group of 419 individuals without cancer). The characterization IL-4 -590C/T

genotypes was performed by PCR-RFLP (BsmFI).

88.. AAnneexxooss


- 77 -

Results:

The -590 C/T polymorphism genotypes were classified as low (CC) and high expression (TT).

The frequencies obtained for the CC and TT genotypes were 86.3% and 13.7%, respectively, in the

control group and 92.3% and 7.7%, respectively, in the case group. The analysis of the TT and CC

genotype frequencies in the two groups under study showed a statistically significant difference in

its distribution, indicating a protection of 48% for the development of NSCLC in individuals with

the TT genotype when compared with individuals with CC genotype (P=0.036, OR=0.522: 95%

CI=0.282-0.965).This result is more pronounced when considering only the NSCLC epidermoid

histological type (P=0.003, OR=0.086: 95% CI=0.012-0.636). Stratifying according to smoking

status, the results also show that smokers with the TT genotype have a protection for the

development of NSCLC (P=0.007, OR=0.100: 95% CI=0.013-0.772), when compared with the non-

smoking group with TT genotype.

Conclusion:

The results of this study point to the involvement of CC and TT genetic variants of the IL-4 -

590 C/T polymorphism in the development of NSCLC. Increased expression of IL-4 associated with

the TT genotype may contribute to the promotion of immune surveillance during NSCLC

development, which could explain the results obtained in this work. However, further functional

studies regarding IL-4 expression according to IL-4 -590 C/T polymorphism genotypes should be

conducted in order to validate this hypothesis.

88.. AAnneexxooss


- 78 -

Anexo III

Resumo apresentado sob a forma de poster no 3º Congresso Nacional de Cancro de

Pulmão, em Albufeira (Outubro 2008)

Influência do polimorfismo -590C/T do gene da IL-4 na

susceptibilidade para o desenvolvimento de CPNPC

Mónica Gomes1, Ana Coelho1, António Araújo2, Raquel Catarino1, Ana Nogal1, Rui Medeiros1

1- Departamento de Oncologia Molecular/Virologia- Instituto Português de Oncologia- Porto 2- Servico de Oncologia Médica- Instituto Português de Oncologia- Porto

Introdução: O cancro do pulmão é a principal causa de morte por cancro em todo o mundo, originando cerca

de 17.6% do total de mortes por cancro (1.18 milhões).

A interleuquina-4 é um modulador da resposta inflamatória contra infecções e células

tumorais, mediada por células B, T e macrófagos. Esta citoquina apresenta também efeitos anti-

proliferativos durante o desenvolvimento tumoral, estando descrita a sua associação à

patogénese do cancro do pulmão, em particular no epitélio respiratório dos fumadores.

O polimorfismo -590 C/T é um SNP que consiste na susbstituição de citosina (C) por timina

(T) na região -590 do promotor do gene da IL-4, estando a variante T associada à expressão

aumentada de IL-4. O objectivo deste estudo consistiu na avaliação da influência do polimorfismo

-590C/T na susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro de pulmão de não pequenas

células (CPNPC).

Métodos:

Foram extraídas amostras de ADN do sangue periférico de 696 indivíduos divididos num

grupo de 277 pacientes diagnosticados com CPNPC no IPO do Porto e num grupo controlo de 419

indivíduos sem qualquer patologia conhecida.

A caracterização genótipica do polimorfismo -590C/T do gene da IL-4, foi realizada por

PCR/RFLP (BsmFI).

88.. AAnneexxooss


- 79 -

Resultados:

Os genótipos do polimorfismo -590 C/T foram classificados como de baixa (CC) e elevada

expressão (TT). As frequências obtidas para os genótipos CC e TT foram de 86.3% e 13.7%,

respectivamente, no grupo controlo e de 92.3% e 7.7%, respectivamente, no grupo de casos.

Quando se comparam as frequências destes dois genótipos nos dois grupos em estudo, observa-

se uma diferença estatísticamente significativa na sua distribuição, que indica numa protecção de

48% para o desenvolvimento de CPNPC em indivíduos com o genótipo TT relativamente aos

indivíduos com o genótipo CC (P= 0,036; OR= 0,522: IC 95%= 0,282-0,965).

Conclusão:

Os resultados obtidos neste estudo apontam para o envolvimento das variantes

genéticas CC e TT do polimorfismo -590 C/T no desenvolvimento de CPNPC. O aumento da

expressão da IL-4 associado ao genótipo TT pode contribuír para a promoção da vigilância

imunológica no decurso da transformação celular subjacente ao aparecimento de CPNPC, o que

permitiria explicar o efeito deste genótipo no desenvolvimento de CPNPC, observado neste

trabalho. No entanto, esta hipótese terá que ser validada por estudos funcionais que permitam

avaliar a expressão da interleuquina associada aos diferentes genótipos do polimorfismo em

estudo.

repositorio-aberto.up.pt de... · Orientador- Professor Doutor Rui Manuel de ... que tanto tempo...

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