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palavras-chave

Doença de Parkinson, Genética Molecular, Stresse Oxidativo, Neurodegeneração.

resumo

A Doença de Parkinson (DP) é a segunda forma de doença neurodegenerativamais frequente, embora a sua etiologia não seja plenamente conhecida. Durante muitos anos foi considerado que a DP não tinha qualquer componentegenética associada, no entanto, no final do século passado, descrições de mutações genéticas que, aparentemente causavam DP, vieram alterar esteconceito. Adicionalmente, sabe-se que na área cerebral afectada nos doentes de Parkinson (substância negra e núcleo estriado), há um aumento daagressão causada por espécies reactivas de oxigénio, o que sugeriu um papeldo stresse oxidativo na etiologia desta afecção. O objectivo deste trabalho é encontrar marcadores biológicos que permitamum diagnóstico mais precoce e correcto desta doença. Por um lado, pretendemos encontrar alterações genéticas em genes associados à DP, quepermitam auxiliar no diagnóstico. Por outro lado, pretendemos verificar se marcadores periféricos de stresse oxidativo se encontram alterados emindivíduos com DP, para que possam ser utilizados no futuro comomarcadores de progressão, ou mesmo da própria doença. Para tal, foram estudados cerca de 130 indivíduos com DP e 130 indivíduos controlo semqualquer sinal de doença neurodegenerativa. Os indivíduos com DP foramseleccionados de forma contínua pela equipa clínica dos H.U.C.. Na nossa amostra, representativa da população portuguesa, encontrámos alterações genéticas, conhecidas e não conhecidas, cujos mecanismos sãosusceptíveis de causar DP. No que diz respeito aos marcadores de stresseoxidativo, encontrámos alterações significativas principalmente no que dizrespeito ao ciclo do glutatião, tornando os seus componentes num eventual marcador periférico da DP. Embora as alterações genéticas possam ser consideradas como causa únicado desenvolvimento da doença, é possível que existam interacções entre osgenes estudados e outros factores. Esta tese evidencia o facto de que a DP é, muito provavelmente, influenciada por factores genéticos e ambientais e,eventualmente, pela interacções entre estes. Embora não tenha sido encontrado um marcador genético, parece evidenteque o diagnóstico genético poderá ser, num futuro próximo, uma ferramenta auxiliar de importância extrema no diagnóstico de algumas formas da DP. Poroutro lado, o estudo de marcadores de stresse oxidativo, em particular do ciclodo glutatião, podem auxiliar no diagnóstico da DP nesta população. São claramente necessários estudos que determinem a função das proteínasaqui descritas, e que tentem estabelecer uma relação entre os factores aquiapresentados (genéticos e de stresse oxidativo) e factores ambientais, umavez que, nesta relação poderá estar a resposta para a maioria das questõesbiológicas colocadas no âmbito da doença de Parkinson.

keywords

Parkinson’s Disease, Molecular Genetics, Oxidative Stress, Neurodegeneration.

abstract

Parkinson’s Disease (PD) is the second most common form ofneurodegenerative disease, although it’s aetiology isn’t fully understood. Formany years, it was considered that PD had no a genetic backgroud, however,late last century, reports of genetic mutations that apparently were the cause of PD in some families, deeply changed this concept. Furthermore, it is welldocumented that in the brain region affected in PD patients (substantia nigraand striatum) there’s an increase of the aggression caused by reactive oxigenspecies, what suggested a role for oxidative stress in the aetiology of thisdisease. In the work presented here, we aim, on one hand, to find genetic alterations ingenes reported to be associated with PD, which may be useful in diagnose;and, on the other hand, to determine if peripheral biomarkers of oxidative stressare altered in individuals with this disease, so that they may also be used in thefuture as an auxiliary tool for diagnosing PD. This study comprised about 130 individuals with PD and 130 healthy controls without any clear sign of neurodegenerative disease. PD patients wereselected in a consecutive manner by the clinical team in the University ofCoimbra Hospital. There was no other inclusion parameter, although onlydefinite PD patients were included. In our sample, which we consider to be representative of the portuguesepopulation, we found genetic mutations, some of them known and othersunreported so far, that may be responsible for pathogenic mechanismssusceptible to cause the onset of PD. The study of peripheral biomarkers of oxidative stress showed statistical significant differences between PD patientsand controls, mainly in the glutathione cycle, making it’s components a suitableperipheral marker of PD. Although in some of the cases presented here, genetic mutations may be considered as the only cause of the onset of the disease, it is likely that for themost part of cases, there are interactions between the genes studied and otherfactors. This work supports the knowledge that PD is, probably, influenced by genetic and environmental factors and, eventually, by interactions between these two. Although we failed to find a suitable genetic marker, it seems clear that geneticdiagnose may become, in the near future, an auxilary tool of extreme importance in PD. Furthermore, the study of biomarkers of oxidative stress,mainly glutathione cycle, may be useful in the diagnose of PD in our population.Further research is clearly needed to determine the function of the mutatedproteins reported here, and to establish a link between the factors presentedhere (genetic and oxidative stress) and environmental factors, since it is likelythat in this relationship lay most of the answers to all biological questions posednowadays in PD research.

Mecanismos Genéticos e de Stresse Oxidativo na Doença de Parkinson

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Índice ÍNDICE .........................................................................................................................................................- 8 -

ÍNDICE DE FIGURAS..............................................................................................................................- 10 -

ÍNDICE DE TABELAS .............................................................................................................................- 11 -

INTRODUÇÃO ..........................................................................................................................................- 12 -

PERSPECTIVA HISTÓRICA DA DOENÇA DE PARKINSON ............................................................................ - 12 - PARKINSONISMO E DOENÇA DE PARKINSON............................................................................................ - 14 - CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E PATOLÓGICAS.......................................................................................... - 15 - EPIDEMIOLOGIA ...................................................................................................................................... - 17 - TRATAMENTO.......................................................................................................................................... - 18 - ETIOLOGIA DA DOENÇA DE PARKINSON................................................................................................... - 20 -

Factores ambientais...........................................................................................................................- 20 - Factores genéticos .............................................................................................................................- 23 -

STRESSE OXIDATIVO ............................................................................................................................... - 41 - Conceito de Stresse Oxidativo e Espécies Reactivas de Oxigénio .....................................................- 41 - Defesas anti-oxidantes enzimáticas e não-enzimáticas .....................................................................- 42 -

Defesas anti-oxidantes enzimáticas ................................................................................................................- 42 - Defesas anti-oxidantes não enzimáticas .........................................................................................................- 44 -

Doença de Parkinson e Stresse Oxidativo .........................................................................................- 45 - Metabolismo do ferro.........................................................................................................................- 47 -

OBJECTIVOS DO ESTUDO ..................................................................................................................- 49 -

MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................................................- 50 -

POPULAÇÃO EM ESTUDO.......................................................................................................................... - 50 - Mecanismos Genéticos.......................................................................................................................- 50 - Mecanismos de Stresse Oxidativo......................................................................................................- 52 -

PROCEDIMENTOS NO ESTUDO DOS MECANISMOS GENÉTICOS ................................................................. - 54 - Colheita e preparação do material biológico....................................................................................- 54 - Metodologias Utilizadas no Estudo dos Mecanismos Genéticos .......................................................- 54 - Estudo molecular de genes envolvidos na DP ...................................................................................- 58 -

PROCEDIMENTOS NO ESTUDO DO STRESSE OXIDATIVO ........................................................................... - 74 - Colheita e preparação do material biológico....................................................................................- 74 - Determinação dos níveis de antioxidantes não enzimáticos ..............................................................- 75 - Determinação dos níveis de antioxidantes enzimáticos.....................................................................- 79 - Marcadores de oxidação Lipídica .....................................................................................................- 80 - Marcadores de oxidação Proteica.....................................................................................................- 81 -

Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados

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Metabolitos do monóxido de azoto ....................................................................................................- 82 - Determinação da concentração de proteínas totais ..........................................................................- 83 - Quantificação de hemoglobina na suspensão de eritrócitos..............................................................- 83 - Análise Estatística..............................................................................................................................- 84 -

RESULTADOS .........................................................................................................................................- 85 -

MECANISMOS GENÉTICOS ....................................................................................................................... - 85 - MECANISMOS DE STRESSE OXIDATIVO ................................................................................................. - 102 -

DISCUSSÃO ...........................................................................................................................................- 118 -

CONSIDERAÇÕES METODOLÓGICAS ....................................................................................................... - 118 - MECANISMOS GENÉTICOS...................................................................................................................... - 120 - STRESSE OXIDATIVO ............................................................................................................................. - 135 -

CONCLUSÕES GERAIS ......................................................................................................................- 141 -

REFERÊNCIAS ......................................................................................................................................- 142 -


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Índice de Figuras

FIG. 1 - ILUSTRAÇÃO DE UM INDIVÍDUO COM DOENÇA DE PARKINSON ......................................................... - 13 - FIG. 2 - IMAGEM DE UM CORPO DE LEWY ..................................................................................................... - 17 - FIG. 3 - ANÁLISE DE SPECT......................................................................................................................... - 17 - FIG. 4 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO METABOLISMO DO MPTP........................................................ - 21 - FIG. 5 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA ESTRUTURA DE UMA SONDA.................................................... - 55 - FIG. 6 - REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA CAPACIDADE EXONUCLEÁSICA DA ENZIMA. ............................ - 56 - FIG. 7 - REPRESENTAÇÃO DA FAMÍLIA ONDE FOI ENCONTRADA A MUTAÇÃO 256DELA................................ - 86 - FIG. 8 - CROMATOGRAMAS DO EXÃO 2 DA PARKINA.. .................................................................................. - 87 - FIG. 9 - CROMATOGRAMAS DO EXÃO 2 DA PARKINA.. .................................................................................. - 88 - FIG. 10 - RESULTADO DE ELECTROFORESE EM AGAROSE DA MUTAÇÃO 256DELA. ..................................... - 89 - FIG. 11 - CROMATOGRAMA DO EXÃO 11 DA PARKINA.. ................................................................................ - 89 - FIG. 12 - REPRESENTAÇÃO DA FAMÍLIA ONDE FOI ENCONTRADA A MUTAÇÃO ASP394ASN.......................... - 90 - FIG. 13 - CROMATOGRAMA DO EXÃO 11 DA PARKINA.. ................................................................................ - 91 - FIG. 14 - REPRESENTAÇÃO DA FAMÍLIA ONDE FOI ENCONTRADA A MUTAÇÃO GLU395STOP........................ - 91 - FIG. 15 - CROMATOGRAMA DO EXÃO 1 DO GENE PINK1.. ............................................................................ - 92 - FIG. 16 - CROMATOGRAMA DO EXÃO 1 DO GENE PINK1.. ............................................................................ - 93 - FIG. 17 - REPRESENTAÇÃO DA FAMÍLIA COM DELECÇÃO HETEROZIGÓTICA DO EXÃO 1 DO GENE PINK1. .... - 93 - FIG. 18 - ELECTROFORESE DO PRODUTO DE DIGESTÃO DO EXÃO 29 NNOS.. ................................................ - 97 - FIG. 19 - ELECTROFORESE DO PRODUTO DE DIGESTÃO DO EXÃO 22 DO GENE DA INOS................................ - 98 - FIG. 20 - RESULTADO DA ELECTROFORESE DA DIGESTÃO DA MUTAÇÃO H63D NO GENE HFE. .................... - 99 - FIG. 21 - RESULTADO DA ELECTROFORESE DA DIGESTÃO DA MUTAÇÃO C282Y NO GENE HFE. ................ - 100 - FIG. 22 - VALORES DE ÁCIDO ÚRICO OBTIDOS NOS GRUPOS DE D.P. E CONTROLO.. .................................... - 103 - FIG. 23 - VALORES DE ÁCIDO ÚRICO DE INDIVÍDUOS COM INÍCIO > 60 ANOS E DE CONTROLOS.. ................ - 104 - FIG. 24 - VALORES DE VIT. E PLASM. DE INDIVÍDUOS COM INÍCIO < 60 ANOS E INDIVÍDUOS CONTROLO.. ... - 105 - FIG. 25 - VALORES DE VIT. A PLASM. DE INDIVÍDUOS INÍCIO <60 ANOS E INDIVÍDUOS CONTROLO.. ........... - 106 - FIG. 26 - RESULTADOS OBTIDOS SIGNIFICATIVOS PARA O CICLO DO GLUTATIÃO........................................ - 108 - FIG. 27 - VALORES DE TAS NOS GRUPOS ESTUDADOS. ............................................................................... - 111 - FIG. 28 - VALORES MÉDIOS DE ACTIVIDADE DA ENZIMA REDUCTASE DO GLUTATIÃO. ............................... - 112 - FIG. 29 - VALORES MÉDIOS DE CONCENTRAÇÃO DE MDA ......................................................................... - 114 - FIG. 30 - VALORES MÉDIOS DE CONCENTRAÇÃO DE GRUPOS CARBONILO................................................... - 115 - FIG. 31 - VALORES MÉDIOS DE CONCENTRAÇÃO DE NITRITOS .................................................................... - 116 -


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Índice de Tabelas TABELA I - LOCI GENÉTICOS E GENES ASSOCIADOS À DOENÇA DE PARKINSON ............................................ - 24 - TABELA II - CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DOS INDIVÍDUOS COM DP ESTUDADOS. ....................................... - 52 - TABELA III - CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS DOS INDIVÍDUOS COM DP E CONTROLOS.......................... - 53 - TABELA IV - SEQUÊNCIAS DE PRIMERS UTILIZADOS NO GENE DA ALFA-SINUCLEINA [92]............................ - 58 - TABELA V - PRIMERS E SONDAS PARA A QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA DO GENE DA ALFA-SINUCLEÍNA . ...... - 62 - TABELA VI - PRIMERS UTILIZADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE DA PARKINA......................................... - 64 - TABELA VII - PRIMERS E SONDAS UTILIZADOS NO ENSAIO DE DOSAGEM GÉNICA DO GENE DA PARKINA...... - 66 - TABELA VIII - SEQUÊNCIAS DOS PRIMERS UTILIZADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE PINK1. .................. - 67 - TABELA IX - SEQUÊNCIAS DOS PRIMERS E SONDAS UTILIZADOS PARA DOSAGEM GÉNICA DO GENE PINK1. - 69 - TABELA X – PRIMERS UTILIZADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE HFE . .................................................... - 70 - TABELA XI - PRIMERS UTILIZADOS PARA O ESTUDO DO GENE DA NOS........................................................ - 72 - TABELA XII - PRIMERS UTILIZADOS NO ESTUDO DO GENE DO GLUTATIÃO S-TRANSFERASE. ...................... - 74 - TABELA XIII - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO ESTUDADO NO EXÃO 29 DO GENE DA NNOS ........................ - 95 - TABELA XIV - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO ESTUDADO NO EXÃO 18 DO GENE DA NNOS........................ - 96 - TABELA XV - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO ESTUDADO NO EXÃO 22 DO GENE DA INOS .......................... - 97 - TABELA XVI - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO H63D ESTUDADO NO GENE DA HFE.................................... - 99 - TABELA XVII - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO C282Y ESTUDADO NO GENE DA HFE .............................. - 100 - TABELA XVIII - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO ILE105VAL ESTUDADO NO GENE DA GSTP.................... - 101 - TABELA XIX - GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO ALA114VAL ESTUDADO NO GENE DA GSTP ..................... - 102 - TABELA XX - VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE ÁCIDO ÚRICO................................................................... - 104 - TABELA XXI - CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE COLESTEROL E DA RAZÃO VIT. E/COLESTEROL.............. - 105 - TABELA XXII - VALORES DE CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE VITAMINA E ............................................ - 106 - TABELA XXIII - VALORES DE CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE VITAMINA A........................................... - 107 - TABELA XXIV - VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE GSH ERITROCITÁRIO .................................................. - 109 - TABELA XXV - VALORES DE CONCENTRAÇÃO DE GSSG ERITROCITÁRIO ................................................. - 109 - TABELA XXVI - VALORES OBTIDOS PARA A RAZÃO GSH/GSSG ERITROCITÁRIA ..................................... - 110 - TABELA XXVII - VALORES OBTIDOS PARA TAS NOS GRUPOS DE INDIVÍDUOS ESTUDADOS. ...................... - 111 - TABELA XXVIII - VALORES OBTIDOS PARA A ACTIVIDADE DA ENZIMA GLRED ........................................ - 112 - TABELA XXIX - VALORES OBTIDOS PARA A CONCENTRAÇÃO DE MDA ERITROCITÁRIO........................... - 113 - TABELA XXX - VALORES OBTIDOS PARA A CONCENTRAÇÃO DE MDA PLASMÁTICO ................................ - 113 - TABELA XXXI - VALORES OBTIDOS PARA A CONCENTRAÇÃO DE GRUPOS CARBONILO ............................. - 115 - TABELA XXXII - VALORES OBTIDOS PARA A CONCENTRAÇÃO DE NITRATOS ............................................ - 116 - TABELA XXXIII - VALORES MÉDIOS DE CONCENTRAÇÃO DE NITRITOS ..................................................... - 117 -


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Introdução

Perspectiva histórica da Doença de Parkinson

James Parkinson, médico e geólogo, publicou uma monografia, em 1817,

descrevendo a entidade patológica que mais tarde tomou o seu nome [1]. Neste trabalho

foram descritas exaustivamente as características clínicas de seis indivíduos. Um deles foi

seguido pelo médico durante um longo período de tempo; os outros cinco consistiram em

observações breves, incluindo dois indivíduos que Parkinson conheceu na rua e outro que

observou apenas à distância. Estas observações realizadas à distância sem qualquer

observação clínica demonstram como esta condição é evidente e facilmente distinguível

apenas pela observação da postura curva, tremor, e alterações do movimento apresentados

pelos doentes. A descrição inicial do trabalho de Parkinson contém a informação médica

essencial que ainda hoje em dia é considerada: “Involuntary tremulous motion, with

lessened muscular power, in parts not in action and even when supported; with a

propensity to bend the trunk forward, and to pass from a walking to a running pace: the

senses and intellects being uninjured.” [1]. Embora com um número de indivíduos

observados muito reduzido, Parkinson forneceu uma descrição muito detalhada dos

sintomas, tendo também discutido a progressiva deterioração dos doentes, numa desordem

à qual deu o nome de shaking palsy. No seu trabalho, Parkinson fez uma revisão dos

diferentes tipos de tremor conhecidos à data, tendo distinguido o tremor observado nestes

indivíduos como um tipo que ocorre apenas quando a parte do corpo se encontra em

repouso e não durante movimentos voluntários. Cerca de setenta anos mais tarde outro

médico, Charcot, defendeu que o nome atribuído por Parkinson à desordem não seria

correcto, uma vez que, o tremor não estaria necessariamente presente nos indivíduos

afectados, tendo sugerido como denominação, “Parkinson’s Disease” nome este, pelo qual

ainda hoje é conhecida esta doença. Hoje em dia, a característica descrita por Parkinson

como diminuição da força muscular, é reconhecida como uma diminuição da rapidez dos

movimentos, frequentemente descrita como acinésia, hipocinésia ou bradicinésia. Estes

três termos representam uma diminuição de movimentos na ausência de fraqueza ou

paralisia.


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Figura 1 - Ilustração de um indivíduo com doença de Parkinson demonstrando a postura curva

observada nesta condição (adaptado de Gowers, 1893, p. 639 [2])

Foi apenas vários anos após a descrição inicial da doença de Parkinson que os

gânglios basais descritos por Meynert em 1871 foram envolvidos na etiologia das doenças

dos movimentos [3]. E foi apenas em 1895 que a substância nigra foi sugerida como

estando afectada na doença de Parkinson. Esta sugestão foi feita por Brissaud [4] tendo por

base um trabalho publicado dois anos antes, no qual estava descrito o caso de um indivíduo

com um tuberculoma naquela região cerebral, que originou um tremor hemiparkinsoniano.

A importância da substância nigra foi confirmada por Tretiakoff em 1919, quando este

realizou um estudo em nove casos de doença de Parkinson, num caso de

hemiparkinsonismo e três casos de parkinsonismo pós-encefálico, tendo encontrado lesões

na região da substância nigra em todos estes casos [5]. A substância nigra, assim

denominada devido ao seu conteúdo de pigmento neuromelanina, foi encontrada, nestes

casos, com uma séria despigmentação, perda de células nervosas e gliose. Estes três factos

permaneceram como características histopatológicas da doença. Neste mesmo trabalho, o

autor confirmou a observação prévia de Lewy que tinha descrito a presença de inclusões

citoplasmáticas na doença de Parkinson, hoje em dia, largamente reconhecidas como a

maior característica histopatológica desta doença e comummente denominada de “Corpos

de Lewy” [6]. Desde então, vários trabalhos demonstraram que a substância nigra era o

alvo das mais constantes e severas lesões no cérebro de indivíduos com doença de

Parkinson, ocorrendo, no entanto, lesões também noutras áreas cerebrais [7-9].


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Antes do ano de 1957, era do conhecimento da comunidade científica que a síndrome

parkinsoniana causada pela administração de reserpina era devido à deplecção de

serotonina no cérebro. Mas nesse mesmo ano, Carlsson e colaboradores descreveram que a

L-dopa revertia o estado de parkinsonismo induzido pela reserpina em coelhos, enquanto o

precursor da serotonina não o fazia [10]. A L-dopa é o precursor da dopamina e da

norepinefrina e, naquela altura, era considerado que a única função da dopamina seria

servir de precursor para a norepinefrina. Em 1958 Carlsson determinou que a dopamina

estava presente no cérebro em condições normais [11], tendo no ano seguinte feito a

primeira sugestão de que a dopamina cerebral estaria relacionada com a doença de

Parkinson [12]. Em 1960 surgiu a primeira descrição da deficiência de dopamina a nível

cerebral em casos de parkinsonismo [13]. Iniciou-se nesta altura a era moderna de

conhecimento da síndrome de parkinsonismo e do papel da dopamina no cérebro nesta

condição. A contribuição de Carlsson para o desenvolvimento do conhecimento desta

condição, rendeu-lhe o prémio Nobel em Fisiologia e Medicina no ano de 2000.

Parkinsonismo e Doença de Parkinson

A síndrome de parkinsonismo deve ser compreendida antes da compreensão do que é

a doença de Parkinson. Actualmente o termo parkinsonismo é definido por qualquer

combinação de seis características motoras específicas: tremor em descanso, bradicinésia,

rigidez, perda de reflexos posturais, postura curva e o fenómeno de “freezing” (quando os

pés se encontram “colados” ao chão momentaneamente) [14]. Nem todos os seis sinais

cardinais precisam de estar presentes, mas pelo menos dois têm que ser visíveis para que

possa ocorrer um diagnóstico de parkinsonismo, com pelo menos um deles a ser tremor ou

bradicinésia. O parkinsonismo é classificado em quatro categorias, parkinsonismo

primário, secundário, e duas categorias nas quais estão envolvidos outras síndromes sendo

os sinais de parkinsonismo um evento secundário. O parkinsonismo secundário é devido,

na maioria dos casos, a factores ambientais, enquanto o parkinsonismo primário se refere

concretamente à doença de Parkinson, podendo ser de origem esporádica ou com etiologia

genética conhecida [15]. Esta última é a categoria mais frequente de parkinsonismo na

prática clínica corrente, sendo também a vertente na qual existe maior investigação. Uma

vez que existem diversas categorias de parkinsonismo, uma dificuldade da clínica é o


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correcto diagnóstico de uma síndrome de Parkinson, por oposição a qualquer uma das

outras categorias. Algumas características dos indivíduos permitem, por vezes, este

diagnóstico diferencial, por exemplo, são características da doença de Parkinson uma

assimetria dos sintomas (frequentemente os sintomas iniciam-se apenas num dos lados do

corpo), a presença de tremor em descanso (embora possa estar ausente na doença de

Parkinson, está sempre ausente nas outras formas de parkinsonismo) ou boa resposta à

terapia com levodopa [15].

O erro de diagnóstico mais comum prende-se com a presença de tremor devido a uma

síndrome denominada tremor essencial, o qual pode ser unilateral, sendo, no entanto, mais

frequentemente bilateral. O que ajuda no diagnóstico nestes casos, é o facto de o tremor

associado à doença de Parkinson ser um tremor em descanso, enquanto que o tremor

essencial ocorre apenas quando há algum movimento [16].

Características clínicas e patológicas

Os sintomas da doença de Parkinson têm um início insidioso com uma gradual

degradação. O tremor em descanso, por ser tão óbvio, é normalmente o primeiro sintoma

reconhecido pelo doente, mas por vezes, a doença inicia-se com bradicinésia e, nalguns

indivíduos, nunca é observado tremor. A bradicinésia manifesta-se como uma diminuição

da velocidade de execução dos movimentos, caligrafia mais pequena, diminuição da

rotação do braço e arrastamento da perna ao andar, diminuição da expressão facial e

diminuição da amplitude de voz. O tremor pode ser intermitente no início dos sintomas,

manifestando-se apenas em situações de stresse, mas gradualmente vai-se manifestando

mais frequentemente, piorando em situações de stresse ou excitação. A pioria dos sintomas

é gradual ao longo do tempo e, na ausência de tratamento, os sintomas levam a uma total

imobilização do indivíduo. Os sintomas e sinais precoces da doença de Parkinson – tremor

em descanso, bradicinésia e rigidez – são devidos à perda de dopamina no striatum e

normalmente são corrigidos pela administração de levodopa ou agonistas da dopamina. À

medida que a doença de Parkinson progride, desenvolvem-se sintomas que não respondem

à levodopa, tal como a postura curva e a paralisia momentânea. Adicionalmente a

bradicinésia, um dos sintomas que no início tinha uma boa resposta ao tratamento, piora e

deixa gradualmente de responder à levodopa. Para além dos sintomas motores que,


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claramente são os que dominam o fenótipo dos indivíduos, muitas vezes existem outros

sintomas não motores relatados pelos doentes, como é o caso de fadiga, depressão,

ansiedade, alterações do sono, obstipação, distúrbios autonómicos e alterações sensoriais.

Estas alterações sensoriais, que ocorrem em cerca de 40% dos doentes, incluem dor, falta

de sensibilidade, formigueiros e sensação de queimadura nos membros afectados. Também

são comuns alterações do comportamento e alterações mentais [17]. A presença de

demência é relativamente comum em indivíduos com idade de início tardia, ocorrendo em

cerca de 40% dos casos, tendo consequências ainda mais graves para o doente do que as

próprias alterações motoras. Para além disso, torna o diagnóstico diferencial mais

complexo, uma vez que os indivíduos podem ser diagnosticados com doença de Alzheimer

e alguns sinais de parkinsonismo, doença de Parkinson ou mesmo demência por corpos de

Lewy [18].

Foi descrito que apenas cerca de 75% dos casos diagnosticados com doença de

Parkinson são confirmados por características de anatomia patológica, o que se deve em

grande parte, a esta variabilidade de sintomas e sua apresentação em diferentes doenças

[19, 20]. Para aumentar a precisão do diagnóstico, foram propostos recentemente novos

critérios. Estes critérios dão ênfase ao início assimétrico dos sintomas como característica

de doença de Parkinson, e diferenciam três níveis de certeza de diagnóstico: definitivo,

provável e possível [21].

As características patológicas da doença de Parkinson são a degeneração selectiva

dos neurónios dopaminérgicos na substância nigra e a formação de inclusões

citoplasmáticas fibrilhares, denominadas corpos de Lewy, nos restantes neurónios. Para um

diagnóstico do ponto de vista da patologia, a presença dos corpos de Lewy é essencial nos

casos de características clínicas típicas [22]. A perda neuronal é já muito avançada

aquando do diagnóstico, uma vez que, está estimado que na altura do desenvolvimento dos

sintomas, os níveis de dopamina tenham diminuído por cerca de 80%.


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Figura 2 - Imagem de um corpo de Lewy (Adaptado de Zarranz et al. [23])

Um método que pode ser utilizado como auxiliar no diagnóstico da doença de

Parkinson é a análise de PET ou de SPECT, análise esta que permite visualizar a

quantidade de células que se encontram a funcionar. Estudando as células dopaminérgicas,

é possível obter uma ideia da quantidade de células normais num indivíduo permitindo,

desta forma, um melhor diagnóstico diferencial [24, 25].

Figura 3 - Análise de SPECT de dois indivíduos controlo (A, B) e de um indivíduo com doença

de Parkinson (C) (Adaptado de Zarranz et. al.[23])

Epidemiologia

Actualmente a doença de Parkinson é a segunda forma de doença neurodegenerativa

mais comum, após a doença de Alzheimer. A incidência da doença de Parkinson, que nos

permite saber o número de casos de doença por ano, é de cerca de 16-19/100 000, de

acordo com dados de um estudo recente [26]. Não existem estudos epidemiológicos da

doença de Parkinson em Portugal, no entanto, existem vários realizados noutros países

europeus, ainda que, por vezes, com resultados algo contraditórios, causados


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provavelmente pelas diferentes metodologias utilizadas. Na maioria dos estudos, o pico de

incidência da doença ocorre entre os 70 e os 79 anos de idade, tendo o início dos sintomas

uma idade média entre os 60 e os 65 anos [26]. A prevalência da doença de Parkinson

aumenta com a idade, cerca de 60 em cada 100 000 indivíduos com idades entre 65 a 69

anos apresentam doença, enquanto que considerando indivíduos com idades entre 85 a 89,

são 350 por cada por cada 100 000 indivíduos a apresentar doença de Parkinson [27]. Num

estudo recente, Elbaz e colaboradores definiram que o risco ao longo da vida de

desenvolver doença de Parkinson é 2% para indivíduos do sexo masculino e 1,3% para

indivíduos do sexo feminino [28]. A preponderância de indivíduos do sexo masculino é

também observada noutros estudos com respeito às taxas de prevalência e incidência [29-

32]. Enquanto a etiologia da doença de Parkinson não é ainda completamente conhecida e

compreendida, a explicação para um maior risco em indivíduos do sexo masculino não é

conhecida de todo.

Embora o conhecimento de diferenças étnicas e geográficas na prevalência da doença

seja ainda escasso, devido à falta de estudos epidemiológicos comparáveis, sabe-se que a

doença de Parkinson ocorre em todos os grupos étnicos em todo o mundo e mostra uma

variação geográfica na sua prevalência, sendo mais baixa na China, Japão e África [33]. A

prevalência da doença de Parkinson parece ser semelhante em todos os países da Europa

[27]. Os factores responsáveis pela variação geográfica na ocorrência da doença de

Parkinson são, ainda, desconhecidos, mas têm sido sugeridos, principalmente, factores

ambientais [33]. Uma explicação alternativa prende-se com a componente genética da

doença, uma vez que se verifica uma maior prevalência entre caucasianos e hispânicos,

quando comparados com afro-americanos e americanos [30].

Tratamento

As estratégias de tratamento melhor conhecidas para a doença de Parkinson podem

ser categorizadas como farmacológicas, cirúrgicas e de estilo de vida, como o exercício,

educação ou nutrição.

No que diz respeito ao tratamento farmacológico, a Levodopa é o fármaco mais

eficiente no tratamento da doença de Parkinson. O tratamento está associado com a

diminuição da morbilidade e da mortalidade, sendo que quase todos os doentes obtêm


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benefícios do tratamento [34]. Actualmente a terapia com levodopa é administrada em

combinação com inibidores de descarboxilase para prevenir a conversão periférica da

levodopa em dopamina o que resulta em efeitos secundários. Após cerca de cinco anos de

terapia, 75% dos doentes desenvolvem respostas à terapêutica com complicações

(fenómeno de on-off e de wearing off) ou discinésias [35, 36]. Durante os fenómenos de

wearing off, ou de on-off há um aumento pronunciado dos sinais e sintomas da doença de

Parkinson, deixando os doentes imóveis com acinésia durante largas horas. Por vezes,

durante estes períodos acinéticos os doentes sofrem contracções muito dolorosas

denominadas distonias em off [37]. Os mecanismos por detrás destas complicações

relacionadas com a levodopa não são compreendidos, embora a curta semi-vida da

levodopa possa ser um factor importante [38]. De uma forma geral, a medicação para a

doença de Parkinson envolve o risco de desenvolvimento de sintomas mentais, como

confusão e alucinações [39].

Outro tipo de fármaco utilizado são os agonistas da dopamina, que têm a capacidade

de estimular directamente os receptores da dopamina. Sob o ponto de vista teórico,

oferecem algumas vantagens relativamente à levodopa. Primeiramente, não necessitam de

uma conversão metabólica para formar um metabolito activo e, por isso, não são

dependentes dos neurónios dopaminérgicos, ao contrário da levodopa. Em segundo lugar a

maior parte dos agonistas da dopamina têm uma duração de resposta mais prolongada,

logo, uma dose individual fornece uma estimulação dos receptores mais longa e mais

estável. Em terceiro lugar, estes agonistas não sofrem metabolismo oxidativo, e, por isso,

não geram radicais livres que podem ser citotóxicos [40].

Os inibidores da COMT, outra classe de fármacos utilizados, inibem a enzima ubíqua

catecol-Orto-metiltransferase na periferia, aumentando assim a quantidade de levodopa

disponível para atravessar a barreira hemato-encefálica. A terapêutica com inibidores da

COMT deve ser utilizada em combinação com a levodopa.

Os fármacos mais antigos no tratamento da doença de Parkinson são os

anticolinérgicos, mas têm sido documentados vários efeitos secundários adversos, pelo

que, a sua utilização é muito limitada.

Outra classe de fármacos utilizados são os inibidores da monoamino oxidase B. Estes

protegem os neurónios motores de toxicidade em estudos in vitro e in vivo. Um estudo, no

entanto, documentou um aumento da mortalidade em indivíduos sujeitos a terapêutica com


- 20 -

um subtipo destes fármacos [41]. Posteriormente este estudo foi desacreditado devido a

falhas metodológicas e estatísticas.

Espera-se que haja uma melhoria nos fármacos utilizados, decorrente do

conhecimento de alterações genéticas existentes numa determinada percentagem de

doentes de Parkinson, aumentando assim a probabilidade de desenvolvimento de fármacos

neuroprotectores dos neurónios dopaminérgicos [42].

No que diz respeito a tratamento cirúrgico, a técnica que hoje em dia se apresenta

como mais promissora é a estimulação crónica. Esta técnica tem obtido resultados muito

positivos, sendo utilizada em Portugal apenas em doentes com determinadas formas da

doença e com um estado já muito avançado sem resposta à terapêutica farmacológica [43,

44].

Etiologia da doença de Parkinson

Factores ambientais

A procura de factores de risco ambientais para a doença de Parkinson foi

grandemente estimulada no início da década de 80, quando se verificou que vários

utilizadores de drogas intravenosas, que desenvolveram sinais e sintomas típicos de

parkinsonismo, tinham utilizado um narcótico sintético contaminado com a toxina MPTP

[45]. Ao contrário de outras toxinas que danificam várias zonas do cérebro e que estão

associadas a outros sintomas neurológicos para além do parkinsonismo, a exposição a

MPTP resulta numa degeneração selectiva dos neurónios da substância nigra e a uma

síndrome parkinsoniana pura [46]. Mais tarde, foi documentado que o metabolito que

exerce o efeito tóxico neste caso é o MPP+, produto resultante da activação pela enzima

monoamino oxidase B [47]. Outras descobertas importantes foram de que o MPTP entra

nos neurónios através do sistema de entrada da dopamina [48], onde inibe o Complexo I da

cadeia respiratória mitocondrial, resultando na depleção de ATP [49]. No seu conjunto,

todos estes factos apontam para a possibilidade de que o parkinsonismo induzido por

MPTP pode partilhar mecanismos patogénicos com a doença de Parkinson.


- 21 -

Figura 4 - Representação esquemática do metabolismo do MPTP. Após administração sistémica, o MPTP atravessa a barreira hemato-encefálica. Uma vez no cérebro, o MPTP é convertido em MPDP+ pela monoamino oxidase B em células não dopaminérgicas e depois a MPP+ por um mecanismo não conhecido. Este MPP+ é concentrado nos neurónios dopaminérgicos através do tranportador da dopamina (DAT) (Adaptado de Dauer [50])

O facto de que o MPTP tem uma estrutura química semelhante ao herbicida paraquat

[51], sugeriu que este e outros pesticidas possam estar envolvidos na patogénese da doença

de Parkinson. Vários estudos tentaram examinar esta associação. Vários estudos de

associação caso-controlo descreveram risco elevado para o desenvolvimento da doença

com a exposição a pesticidas, e, mais especificamente, a exposição a insecticidas e

herbicidas. Num trabalho incluindo 19 estudos que examinaram a associação entre a

doença de Parkinson e a exposição a pesticidas, foi obtido um Odds Ratio de 1,9 [52]. Um

facto relacionado encontrado por outro grupo é de que uma exposição crónica ao pesticida

rotenona causa uma degeneração selectiva das células da substância nigra associada a

hipocinésia e rigidez em ratinhos [53, 54]. Para além da exposição a pesticidas, vários

outros aspectos associados a uma vida no campo, tal como o consumo de água de poços e a

agricultura, foram demonstrados como factores de risco para o desenvolvimento da doença

de Parkinson. No entanto, estes resultados são inconsistentes. De vinte estudos realizados

que avaliaram a vida no campo enquanto factor de risco para esta doença, sete encontraram


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um risco aumentado, três encontraram um risco diminuído e dez não encontraram qualquer

associação [55].

O traumatismo craniano tem sido, também, apontado como um factor de risco para o

desenvolvimento da doença de Parkinson [56-58], embora vários estudos tenham falhado

em encontrar uma associação significativa [59], está descrito que os lutadores de boxe têm

maior propensão a desenvolver sintomas de parkinsonismo como resultado de

traumatismos repetidos [60].

A exposição crónica a metais tais como chumbo, mercúrio, alumínio, cobre, ferro,

zinco ou manganésio tem também recebido atenção enquanto factor de risco para a doença

de Parkinson. No entanto, várias dificuldades têm surgido na realização destes estudos,

como a dificuldade dos indivíduos em estimar quantidade e tempo de exposição. Por outro

lado, todos estes estudos têm apresentado grupos de indivíduos demasiado pequenos,

dando origem a resultados inconsistentes [59].

Têm sido realizados vários trabalhos na tentativa de encontrar factores na dieta que

sejam, de alguma forma, protectores contra a doença de Parkinson. Entre eles são de maior

importância a vitamina A, C e E e os suplementos com antioxidantes, tendo como premissa

do estudo que estes protegeriam contra a morte neuronal mediada por radicais livres. Até à

data não há evidências consistentes que factores dietéticos ou antioxidantes estejam

envolvidos na etiologia desta doença [59].

Uma evidência consistente é a de que o café parece ser um factor protector contra a

doença de Parkinson, tendo um papel mais importante em indivíduos do sexo feminino do

que em indivíduos do sexo maculino. No entanto, o mecanismo através do qual o café se

torna um factor protector é ainda desconhecido [61]. De forma idêntica, foi descrito um

efeito protector na ingestão de cerveja, embora não tenha sido encontrada qualquer

associação na ingestão de álcool de uma forma geral [62].

Um factor que tem obtido resultados muito consistentes é a relação inversa entre a

doença de Parkinson e a utilização de tabaco [63]. Na maioria dos estudos é obtida uma

redução do risco de cerca de 50%. A activação dos receptores nicotínicos também melhora

os deficits motores nos indivíduos com doença [64]. O uso de adesivos ou pastilhas de

nicotina diminuiu o tremor e/ou a bradicinésia em indivíduos com doença de Parkinson e

idade avançada [65]. Estes resultados sugerem que a nicotina ou agonistas de um subtipo

de receptores nicotínicos, por si só ou em combinação com a terapia com levodopa, têm o


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potencial de melhorar a disfunção motora existente nestes indivíduos. Apesar da forte

associação entre o uso de tabaco e uma menor susceptibilidade para a doença de Parkinson,

vários enviesamentos de resultados podem ter acontecido nestes estudos. Muito

provavelmente a presença da doença origina que os indivíduos não fumem, e não vice-

versa, adicionalmente, se os indivíduos que têm a doença e fumam têm uma sobrevida

menor, a proporção de indivíduos com doença que fumam num qualquer ponto do tempo

será menor do que a dos indivíduos que não fumam.

Vários factores ambientais foram já associados com a doença de Parkinson. Para

alguns deles, o mecanismo patofisiológico é conhecido e compreendido, ao passo que para

outros não só não é conhecido este mecanismo, como diferentes estudos têm obtido

diferentes resultados. No entanto, parece claro que, pelo menos numa percentagem de

casos, factores ambientais estão envolvidos no desenvolvimento da doença, muito

provavelmente, em interacção com factores genéticos de cada indivíduo.

Factores genéticos

A doença de Parkinson foi considerada como o arquétipo de doença não genética até

há cerca de 7 atrás. Esta noção foi sempre suportada por evidências de estudos de gémeos

monozigóticos com doença de Parkinson. Vários destes estudos falharam em encontrar

taxas de concordância mais elevadas nestes gémeos do que em gémeos dizigóticos, o que

levava a crer que causas genéticas não seriam responsáveis pela doença. No entanto, a

doença de Parkinson tem um período de latência muito grande, podendo os sintomas surgir

muito após o início do processo de degeneração e estando, eventualmente, dependente de

contributos ambientais [66]. No entanto, nesta altura estão já descritos cerca de dez loci

genéticos associados com a doença de Parkinson, estando mesmo descritos cinco genes nos

quais, alterações causam doença de Parkinson. Assim sendo, na última década o estudo da

doença de Parkinson, mais concretamente dos aspectos genéticos desta doença, sofreu um

avanço muito considerável, estando descritas alterações que são muito comuns na

generalidade dos doentes. Foi devido a este aumento exponencial de conhecimento nesta

área que hoje em dia se realizam já testes genéticos para o diagnóstico da doença de

Parkinson, algo que seria absolutamente impensável há alguns anos atrás. A Tabela I


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apresenta os genes e os loci identificados até hoje nesta doença, assim como o modo de

hereditariedade característico de cada uma das formas da doença [67].

Tabela I - Loci genéticos e genes associados à doença de Parkinson (adaptado de Hardy et al.[67]).

Locus Modo hereditariedade Idade Início Cromossoma Gene

PARK-1 AD ~45 4q SNCA

PARK-2 AR 7-60 6p parkina

PARK-3 AD 59 2p13 -

PARK-5 AD 30-60 4p14 UCH-L1

PARK-6 AR 36-60 1p36 PINK1

PARK-7 AR 27-40 1p36 DJ-1

PARK-8 AD 45-57 12p-q Lrrk2

PARK-9 AR 10-20 1p36 -

PARK-10 AD >60 1p36 -

PARK-11 AD 46-60 2q36-q37 -

ALFA-SINUCLEÍNA

A família das sinucleínas consiste em três genes distintos, alfa-sinucleína, beta-

sinucleína e gama-sinucleína, que até hoje foram apenas descritos em vertebrados. O gene

da alfa-sinucleína foi mapeado no cromossoma 4 humano 4q21.3-q22 [68], enquanto o

gene da beta-sinucleína foi localizado no cromossoma 5q35 [69] e o gene da gama-

sinucleína no cromossoma 10q23.2-q23.3 [70]. O gene da alfa-sinucleína está organizado

em sete exões, dos quais cinco têm informação que codifica a proteína, enquanto o gene da

beta-sinucleína contém seis exões (5 codificam proteína) e o gene da gama-sinucleína

contém cinco exões todos codificantes para a proteína [71]. Todas as sequências destas

proteínas consistem de um domínio no terminal amínico que inclui um número variável de

repetições de onze resíduos, e um domínio no terminal carboxilo menos conservado, que

inclui uma preponderância de resíduos acídicos. As únicas diferenças significativas entre

estas proteínas localizam-se no domínio que contém as repetições, no qual há uma

delecção de onze aminoácidos em todas as beta-sinucleínas e a adição de outra região de


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repetições após o resíduo 32 nas gama-sinucleínas [72]. Uma característica da alfa-

sinucleína é a presença no terminal amínico de repetições imperfeitas da sequência de

aminoácidos KTKEGV, que se pensa estarem relacionadas com a ligação da proteína a

lípidos [73].

As alfa e beta-sinucleínas são predominantemente expressas no cérebro, em

particular no neocórtex, hipocampo, corpo estriado, tálamo e no cerebelo, encontrando-se a

imunoreactividade aumentada nos terminais pré-sinápticos [74, 75]. Embora as suas

funções fisiológicas normais não sejam ainda conhecidas, vários resultados apontam para

um papel nos processos de membrana nos terminais pré-sinápticos [72].

Em solução aquosa, no seu estado nativo a alfa-sinucleína apresenta-se numa

estrutura linear, sem um centro hidrofóbico [76, 77]. Esta estrutura é em tudo semelhante

áquela encontrada em proteínas de ligação à tunulina/actina, por exemplo a proteína tau, ou

a inibidores de fosfatase/cinase [77] e pode ser crítica nas interacções proteína-proteína. A

alfa-sinucleína liga-se exclusivamente a fosfolípidos acídicos, especialmente ao ácido

fosfatídico, e a membranas de pequeno diâmetro, o que pode significar que os alvos desta

proteína podem ser subpopulações específicas de membranas ou vesículas [78]. No

entanto, nem toda a alfa-sinucleína parece estar ligada a membranas, uma vez que, também

pode ser purificada a partir do citosol [79, 80].

Outra forma de tentar compreender a função desta proteína, passa por estudar quais

são os seus alvos, se estão envolvidos em processos de sinalização celular ou processos

regulatórios. Por outro lado, estes alvos podem, por si só, ser genes candidatos no estudo

de patologias associadas. Assim sendo, sabe-se que a alfa-sinucleína apresenta uma

elevada homologia com uma região das proteínas chaperone 14-3-3, podendo mesmo ser

considerada membro desta família [81]. Alguns dos ligandos conhecidos da alfa-sinucleína

estão envolvidos na regulação da viabilidade celular, podendo, então, a alfa-sinucleína

desempenhar um papel nestes processos de sinalização [82].

Outro ligando da alfa-sinucleína é a proteína sinfilina-1. Esta é uma proteína com

muito poucas semelhanças a outras proteínas já conhecidas. Contém, no entanto, vários

domínios de interacção proteína-proteína, podendo desempenhar um papel de adaptador,

permitindo a ligação da alfa-sinucleína a outras proteínas. Adicionalmente, a sinfilina-1

encontra-se presente nos corpos de Lewy, dos quais a alfa-sinucleína é um dos principais

componentes [83]. Foram realizados estudos para verificar se alterações no gene da


- 26 -

sinfilina-1 poderiam estar na base de algumas formas da doença de Parkinson, mas não

foram encontrados resultados positivos, pelo que, alterações neste gene não parecem

causar a doença [84].

Está também descrita a interacção da alfa-sinucleína com a proteína tau [85]. Está

descrito que a proteína tau se liga ao terminal carboxilo da alfa-sinucleína através do seu

domínio de ligação aos microtúbulos. Consequentemente, apenas a tau que não está ligada

a microtúbulos pode interagir com a alfa-sinucleína. Uma vez que a alfa-sinucleína se liga

à A-beta e a vesículas cerebrais através do seu terminal amínico, é possível que uma das

suas funções seja formar de ponte de ligação entre estes dois ligandos [86, 87]. Para além

desta função, sabe-se que a alfa-sinucleína estimula a função da proteína cinase A que

fosforila o resíduo Ser262 da tau [85]. Uma vez que a fosforilação deste resíduo impede a

tau de se ligar aos microtúbulos [88], a alfa-sinucleína pode modular a função da proteína

tau.

O papel da alfa-sinucleína nos processos de neurodegeneração foi posto em evidência

quando, em 1993 Ueda e colaboradores, ao estudarem as placas amilóides presentes nos

cérebros de doentes de Alzheimer, purificaram um pequeno péptido que era derivado de

uma proteína precursora maior [89]. Hoje sabe-se que esta proteína é idêntica à alfa-

sinucleína. Desde então, foram já encontradas várias alterações neste gene que conduzem

ao desenvolvimento da doença de Parkinson.

A análise de linkage numa família de origem Grega com doença de Parkinson de

forma autossómica dominante, revelou um locus no cromossoma 4q21, localização esta

onde se sabia estar presente o gene da alfa-sinucleína [90]. Esta foi a primeira evidência de

que este gene poderia estar envolvido na patogénese desta doença. De seguida foi feita a

análise deste gene nos indivíduos desta família, o que revelou uma mutação missense que

causava a troca de uma guanina para uma adenina na posição 209 (G209A), resultando na

troca de uma alanina por uma treonina na posição 53 da sequência aminoacídica [91]. Esta

mutação co-segregava com a doença noutras três famílias, aparentemente não relacionadas,

e não estava presente em cerca de 314 controlos.

Desta forma, a alfa-sinucleína foi considerado o primeiro gene patogénico da doença

de Parkinson, tendo revolucionado o conceito de que a doença de Parkinson não tinha uma

base genética na sua etiologia. No entanto, alguns problemas surgiram na sequência deste

achado. O primeiro foi a baixa frequência desta mutação. Após a sua descoberta vários


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grupos tentaram replicar este resultado em famílias com formas autossómicas dominantes

da doença, inclusivamente em famílias de origem europeia, tendo falhado [92]. O que

sugeria que esta alteração era uma causa rara da doença de Parkinson. Outra dificuldade

que se apresentou foi o facto de esta mutação dar origem à sequência normal da alfa-

sinucleína presente no rato, o que levantou dúvidas quanto à sua patogenicidade [93].

No entanto, pouco tempo depois foi descrita uma outra mutação neste mesmo gene, o

que reforçou a hipótese de que estas mutações estariam envolvidas na patogénese da

doença. A segunda mutação encontrada neste gene foi descrita numa família de origem

alemã, e consistia de uma alteração de uma guanina para uma citosina na posição 88

(G88C) o que resulta na transição de uma alanina para uma prolina na posição 30 da cadeia

aminoacídica [94]. Subsequentemente, foram feitos vários estudos na procura de qualquer

uma destas mutações no gene da alfa-sinucleína em diferentes formas familiares da doença

(dominante e recessiva), esporádica e de início precoce, tendo sido obtidos resultados

semelhantes áqueles da primeira mutação descrita [95-99]. Apesar de todos estes esforços,

até à data, apenas uma dúzia de famílias autossómicas dominantes foram descritas como

possuindo mutações no gene da alfa-sinucleína em todo o mundo [100-102]. Com a

excepção de uma família, todas as outras possuíam a mutação A53T, e, de acordo com a

análise de haplótipos, provavelmente têm ascendência Grega [103]. Também foi descrita

uma reduzida penetrância da mutação nalgumas famílias [102, 104].

Foram realizados vários estudos in vitro com estas mutações na tentativa de perceber

qual a alteração que estas provocam. Está descrito que as formas mutadas da proteína têm a

sua conformação alterada [105], agregam com mais facilidade quando expostas a insultos

tóxicos [106-108], para além de serem elas próprias neurotóxicas in vivo [109].

Uma evidência interessante destas mutações prende-se com a expressão do mRNA

dos alelos mutados em indivíduos heterozigóticos. Verificou-se que em indivíduos com um

fenótipo grave da doença, e em estado já avançado, há uma diminuição da expressão do

alelo mutado quando comparado com o alelo normal, enquanto em indivíduos com um

fenótipo menos grave, a expressão destas duas formas é praticamente idêntica. Estes

resultados suportam a teoria de que o gene da alfa-sinucleína é sujeito a haploinsuficiência

na presença de uma das duas mutações pontuais descritas na doença de Parkinson. Assim

sendo, a relação entre a expressão destas formas, em indivíduos heterozigóticos para estas


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mutações, daria um bom marcador biológico do desenvolvimento do processo

neurodegenerativo [110].

Não foram detectadas outras mutações neste gene até muito recentemente. No ano de

2003, Zarranz e colaboradores descreveram uma nova mutação pontual no gene da alfa-

sinucleína [23]. Esta mutação, que origina a troca de um ácido glutâmico por uma lisina na

posição 46, ocorre numa zona muito conservada na sequência do gene, mais concretamente

numa das repetições que se pensa terem função de ligação a vesículas lipídicas. A grande

diferença entre esta mutação e as mutações previamente descritas baseia-se no fenótipo dos

indivíduos. Ao passo que as primeiras davam origem a doença de Parkinson, esta mutação

origina não só doença de Parkinson, mas também demência com corpos de Lewy, o que

sugere um papel da alfa-sinucleína nestas duas patologias [23]. Esta mutação, até hoje, não

foi encontrada em qualquer outro indivíduo, sugerindo ser uma variante do gene ainda

mais rara do que as anteriores, e, portanto, uma causa muito rara da doença.

Outra evidência relevante no estudo da alfa-sinucleína é o facto de variabilidade na

região promotora do gene estar associada ao desenvolvimento da doença de Parkinson, tal

como descrito por Pals e colaboradores [111].

No mesmo ano foi descrita uma outra mutação neste gene. Desta feita foi descrita

uma alteração do número de cópias do gene. Mais concretamente foi descrita a triplicação

do gene da alfa-sinucleína, o que significa que em vez de estar presente apenas uma cópia

do gene num cromossoma, ela aparece três vezes [112]. Esta mutação apresenta um

resultado muito mais previsível do que as mutações anteriores, ou seja, um aumento da

quantidade da proteína, sem o consequente aumento da capacidade da sua degradação, leva

à sua deposição, formando corpos de Lewy. No ano seguinte, Miller e colaboradores

demonstraram que os indivíduos possuindo uma triplicação do gene, apresentam uma

duplicação da quantidade de proteína no soro, e um aumento da sua deposição no cérebro

[113]. No entanto, e à semelhança do que aconteceu nas mutações anteriores, também foi

demonstrado que a triplicação do gene da alfa-sinucleína é uma causa rara da doença de

Parkinson [114].

Na sequência da descoberta de alterações do número de cópias neste gene, outros

estudos foram feitos, tendo sido encontradas duplicações do gene em três famílias, nas

quais o fenótipo era de parkinsonismo idiopático sem qualquer forma de demência [115,

116].


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No que diz respeito à forma das doenças originadas por todas as mutações

conhecidas, verifica-se que um aumento da proteína normal, tem efeitos mais graves do

que uma quantidade normal de proteína mutada [117], originando uma idade de início mais

precoce e um mais rápido desenvolvimento da doença. Por outro lado, mesmo um pequeno

aumento da proteína, devido à sua sobre-expressão, ou a uma lenta degradação, podem

constituir um factor de risco para o desenvolvimento da doença de Parkinson.

A alfa-sinucleína é o principal componente dos corpos de Lewy, característica

patológica da doença de Parkinson. No entanto, a única prova do envolvimento deste gene

no processo patológico desta doença, são algumas famílias com mutações missense neste

gene, não se conhecendo qual o efeito das mutações pontuais no processo de

neurodegeneração. Com o conhecimento actual, uma das explicações mais fáceis será de

que as mutações são tóxicas, apenas porque aceleram a agregação da proteína em

protofibrilas, fibrilas e, finalmente, a sua deposição nos corpos de Lewy. No entanto, as

mutações também podem ser tóxicas por afectar algumas das numerosas funções

potenciais atribuídas à proteína ou diminuir a sua disponibilidade por favorecer a formação

de fibrilas.

No que diz respeito às mutações por alteração do número de cópias, a explicação

parece ser mais simples, tendo um resultado aparentemente directo no aumento da

quantidade de proteína presente.

Também a sobre-expressão de formas normais e mutadas da proteína estão descritas

como conduzindo células rapidamente a apoptose [118].

Assim sendo, parece evidente que a alfa-sinucleína desempenha um papel na

patogénese da doença de Parkinson, pelo menos em alguns indivíduos com história

familiar sugestiva de forma autossómica dominante e uma idade de início da doença por

volta dos 45 anos de idade.

Nos indivíduos com estas características o estudo/diagnóstico genético por este gene

parece ser indicado.

PARKINA

O parkinsonismo juvenil autossómico recessivo (AR-JP) é caracterizado por uma

idade de início precoce, tendo início frequentemente na segunda década de vida e sempre


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antes da quarta década. Estes doentes são caracterizados pela perda específica de uma

subpopulação de neurónios da substância nigra, os mesmos neurónios afectados na doença

de Parkinson idiopática. Assim sendo, as características patológicas do AR-JP são

indistinguíveis das características da doença de Parkinson idiopática.

Em 1998, o gene da parkina foi identificado por clonagem posicional a partir de

material genético doado por famílias de origem Japonesa, afectadas por esta forma de

doença de Parkinson [119]. Foi então demonstrado que o AR-JP tem um modo de

hereditariedade recessivo, no qual ambos os alelos necessitam de estar mutados [120]. Até

à data foram identificadas inúmeras mutações no gene da parkina relacionadas com AR-JP,

como revisto por Hedrich e colaboradores [121]. Recentemente, foi descrito que cerca de

50% das famílias europeias com formas autossómicas recessivas de parkinsonismo juvenil,

têm mutações na parkina [82, 122-124].

Esta forma de parkinsonismo, na qual a actividade da parkina é inexistente, ocorre

normalmente na ausência de corpos de Lewy [125, 126]. No entanto, em certos casos de

AR-JP verifica-se a presença de corpos de Lewy, como no caso descrito recentemente por

Farrer e colaboradores de um indivíduo que possuía um alelo com uma mutação null e

outro com uma mutação que demonstrava uma actividade parcial da parkina [127]. Em

formas autossómicas dominantes da doença de Parkinson, detecta-se imunorreactividade

para a parkina em mais de 90% dos corpos de Lewy. Assim sendo, estes resultados

sugerem uma função da parkina normal na formação dos corpos de Lewy.

O gene da parkina extende-se por 12 exões com cerca de 1.4 Mb. No que diz respeito

à estrutura da proteína parkina, esta contém 456 aminoácidos e sabe-se que no terminal

amínico apresenta um domínio ubiquitin-like, tendo no terminal carboxilo dois motivos

RING finger e um domínio IBR (In Between Ring finger) [128]. Evidências recentes

demonstraram a função de proteínas RING finger. A maioria destas proteínas parece

desempenhar um papel fundamental na mediação da ubiquitinização de proteínas

específicas, assim como delas próprias [129].

Actualmente, tem-se dado um grande ênfase ao papel do sistema proteassoma (UPS)

em vários processos, uma vez que é através deste sistema que existe um controlo apertado

de, pelo menos, 30% das proteínas sintetizadas no interior da célula [130]. Este processo

tem um papel fundamental em eventos como o ciclo celular, transdução de sinal,

metabolismo e resposta imune [131, 132].


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O evento iniciador de todo este processo é a poliubiquitinação das proteínas substrato

[133], num processo que, no total, envolve três enzimas específicas. A ubiquitina, uma

pequena proteína muito conservada ao longo da evolução, consiste em 76 resíduos

aminoacídicos, e tem a função de marcar uma grande variedade de proteínas para

subsequente proteólise [134]. Inicialmente a ubiquitina é activada numa reacção

dependente de ATP por uma enzima E1, sendo, de seguida, transferida para uma enzima

conjugadora (E2). Nalguns casos, esta enzima transfere directamente a ubiquitina para a

proteína substrato, mas, frequentemente, necessita da participação de uma enzima E3

(enzima de ligação). Através de uma cascata de reacções enzimáticas, a ubiquitina é

covalentemente ligada, através do resíduo de glicina no seu terminal carboxilo, ao resíduo

lisina no terminal amínico da proteína-alvo. Finalmente, é formada uma cauda de

poliubiquitina através da adição sucessiva de moléculas desta proteína [135].

Actualmente sabe-se que existem menos proteínas E1 do que E2, pertencendo as

proteínas E2 a uma família de proteínas com mais de doze espécies. No entanto, no que diz

respeito às proteínas E3, sabe-se que existe uma enorme variedade de proteínas,

possivelmente na casa dos milhares [136]. O papel das proteínas E3 no UPS é

fundamental, uma vez que, cada proteína E3 normalmente se liga a uma proteína substrato

com um elevado grau de selectividade, de forma regulada no espaço e no tempo [135].

Sabe-se que a parkina faz parte da família de proteínas E3 [137], desempenhando,

por isso, um papel importante no processo de degradação pelo proteassoma e estando

envolvida na degradação das suas proteínas substrato, que podem ser desde receptores

membranares até enzimas citosólicas [129]. Assim, pensa-se que a parkina tenha uma

função de ponte entre a proteína substrato e a enzima E2 que contém ubiquitina, para que

esta molécula possa ser transferida para o substrato. Esta ubiquitinação leva à degradação

da proteína substrato através do proteassoma [137, 138]. Tem sido sugerido que uma

ausência de função da parkina (por exemplo por mutação em ambos os alelos) leva a uma

acumulação tóxica dos seus substratos ou da própria parkina.

A sobre-expressão da parkina tem demonstrado uma redução da quantidade de

proteínas ubiquitinadas [139]. Por outro lado, a sobre-expressão de formas mutadas da

proteína, causa stresse oxidativo, excesso da produção de monóxido de azoto (NO) e

consequente morte celular, provavelmente via inibição do proteassoma [139].


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Para determinar quais as proteínas que interagem com a parkina, foi sobre-expresso

um receptor transmembranar (Pael-R) tendo-se verificado que, nestas condições, este

acumulava e aumentava os níveis de stresse celular, culminando na morte da célula [140].

Posteriormente foi verificado que o Pael-R interage com a proteína parkina através do

terminal carboxilo desta. O Pael-R é expresso em todas as regiões cerebrais, mas a sua

expressão é particularmente elevada nos neurónios da substância nigra que contêm tirosina

hidroxilase [141]. A degradação deste substrato da parkina protege a célula da toxicidade

induzida pela acumulação de Pael-R.

Quanto à expressão do gene, verificou-se que há diferentes formas do gene expressas

no cérebro e nos linfócitos. Mais concretamente, foi observado que estas diferentes formas

da proteína são criadas por splicing alternativo [142]. A proteína existente no cérebro tem a

totalidade da informação contida nos 12 exões do gene, enquanto a proteína existente na

periferia não possui a informação contida nos exões 3-5. Um facto particularmente

interessante, é que a maioria das delecções conhecidas no gene da parkina ocorrem

precisamente nesta zona do gene [143, 144], a mesma zona que se encontra apagada nos

linfócitos de indivíduos normais. Este facto pode auxiliar na compreensão dos

mecanismos, através dos quais, ocorrem as delecções exónicas nas formas cerebrais do

gene em indivíduos com doença de Parkinson.

No que diz respeito a mutações no gene da parkina, há uma enorme variedade de

mutações descrita, que vão desde transições pontuais ou delecções/inserções pontuais a

delecções/inserções exónicas, estando descritas alterações em praticamente todos os exões

do gene.

A primeira mutação encontrada neste gene, tratou-se de uma delecção exónica [119],

tendo várias mutações sido descritas desde essa altura. No ano seguinte à publicação deste

trabalho pioneiro, Abbas e colaboradores descreveram um estudo com várias famílias,

onde encontraram mutações no gene da parkina em cerca de 30% dos indivíduos [122], o

que comparado com a percentagem de 0,5% obtida para o gene da alfa-sinucleína, era

claramente superior. Embora em percentagem claramente inferior, também estão descritos

casos de mutações patogénicas, tanto pontuais como exónicas no gene da parkina, em

indivíduos com formas esporádicas da doença e início precoce [144, 145].

Uma das questões quanto às mutações encontradas neste gene prende-se com o facto

de haver um grande número de indivíduos heterozigóticos. Nesta condição existe uma


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cópia normal do gene para além de uma cópia mutada, o que pode reflectir que

haploinsuficiência neste gene é um factor de risco para a doença, e que determinadas

mutações são dominantes, conferindo um efeito dominante negativo na função da proteína,

ou um ganho de função tóxica [146]. No entanto, o cenário mais provável talvez seja, de

que os vários trabalhos apenas falharam em encontrar a outra mutação no outro alelo, a

qual pode estar situada na região promotora do gene ou mesmo nalgum intrão [147]. A

confirmar a hipótese de haploinsuficiência no gene da parkina está a descrição de uma

família, na qual a presença da mutação em estado de heterozigotia, confere uma idade de

início da doença mais tardia [148].

Assim sendo, parece evidente que alterações no gene da parkina são responsáveis por

uma elevada percentagem de casos de doença de Parkinson autossómica recessiva com

início precoce. O modo como o gene da parkina está envolvido neste processo não é ainda

totalmente conhecido, embora a sua função no processo de degradação proteica pelo

proteassoma sugira alguns mecanismos possíveis. Nesse sentido está a evidência de que a

maioria das mutações patogénicas neste gene, ocorre na região que codifica os RING

fingers, ou seja, no domínio funcional deste mecanismo.

Com uma percentagem de casos tão elevada, este gene deve, provavelmente no

futuro, ser utilizado como método auxiliar de diagnóstico em indivíduos com formas de

doença sugestivas.

DJ-1

O estudo do gene DJ-1 teve o seu início quando Bonifati e colaboradores

identificaram, por análise de linkage, a região PARK7 como a região responsável por

conter alterações, que dão origem à doença de Parkinson em quatro famílias com forma

autossómica recessiva de início precoce [149]. Posteriormente foi descrito que o gene

contido nesta região responsável pelo fenótipo seria o gene DJ-1 [150], tendo nesse mesmo

ano, sido descritas mutações causadoras da doença em duas famílias europeias com

história de consanguinidade.

Uma das mutações encontradas, numa família de origem belga, foi uma grande

delecção, de cerca de 14 kb, que contém os exões 1-5 do gene; a outra mutação encontrada


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foi uma mutação missense na posição 166 da sequência aminoacídica, na qual ocorre uma

troca de uma leucina para uma prolina [151].

O gene DJ-1 está localizado no cromossoma 1p36 e consiste de oito exões, dois dos

quais não são codificantes e sofrem splicing alternativo (1A/B). Estes oito exões contêm a

informação de uma proteína com 189 aminoácidos e cerca de 20 kDa. A localização

subcelular da proteína foi demonstrada ser citoplasmática e nuclear em várias linhas

celulares [152]. A localização das formas L166P e normal, em modelos celulares, está

descrita como sendo na mitocôndria, embora não na sua totalidade [153], uma evidência

ainda não confirmada para a proteína endógena em tecido humano, ou em neurónios de

ratinho [154]. No cérebro, a marcação para DJ-1 demonstrou a sua presença em várias

regiões, com maior expressão nos neurónios [155] e nos astrócitos [154]. No entanto,

embora seja expressa nos neurónios, a proteína DJ-1 não é um constituinte dos corpos de

Lewy [154, 155].

A estrutura cristalográfica da proteína foi recentemente descrita por vários grupos

[156-158], confirmando a existência desta proteína como um homo-dímero in vitro. Em

contraste, a forma mutada L166P existe como um monómero devido à sua incapacidade

para auto-interagir. Como resultado, esta forma da proteína é muito instável, sendo

rapidamente degradada pelo proteassoma [153, 159, 160]. Assim sendo, a dimerização da

proteína parece ser fundamental para o seu funcionamento normal, sendo que a ausência

desta capacidade resulta na sua degradação, e, consequentemente, perda de função.

Os dados funcionais retirados das formas mutadas L166P e da delecção 14kb,

indicam que o mecanismo através do qual esta proteína está envolvida na doença de

Parkinson passa pela sua completa perda de função [161]. Esta proteína tem várias funções

putativas e conhecem-se várias moléculas com as quais ela interage. Sabe-se que restaura a

actividade da transcrição de gene que codifica o receptor de androgénio [162]. Assim

sendo, a proteína DJ-1 parece ter uma função como regulador positivo do receptor de

androgénio e, portanto, de todos os genes sob o seu controlo, os quais são essenciais para o

desenvolvimento e manutenção da função reprodutiva masculina. Das funções atribuídas a

esta proteína, a mais relevante para a doença de Parkinson prende-se com o seu papel na

neuroprotecção. Tem sido demonstrado que células que não expressem DJ-1 são muito

mais sensíveis à agressão oxidativa, nomeadamente ao stresse oxidativo induzido por

peróxido de hidrogénio. Situação esta que pode ser revertida pela expressão de DJ-1 wild-


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type, mas não da sua forma mutada L166P [163]. Estes resultados, em conjunto com

aqueles que descrevem um aumento da expressão desta proteína em resposta à agressão

com peróxido de hidrogénio, sugerem que uma acção da DJ-1 é eliminar peróxido de

hidrogénio, funcionando como um potente antioxidante. A perda de DJ-1 pode, portanto,

resultar num aumento do dano atribuído aos radicais livres, produzidos como um produto

secundário do metabolismo da dopamina [164, 165].

Desde a descrição inicial de mutações no gene DJ-1, vários grupos tentaram

encontrar mutações nas suas séries de doentes de Parkinson. Todos estes estudos se

caracterizaram por encontrar uma muito baixa quantidade de mutações, embora tenham

sido feitas análises de sequência muito completas, incluindo regiões promotoras e regiões

de splice, e mesmo análises de dosagem génica. Para além da mutação L166P encontrada

na família Italiana, foi encontrada outra mutação homozigótica, M26I, descrita num

indivíduo de origem judaica com idade de início precoce [166]; o mesmo estudo relata a

existência de uma mutação missense heterozigótica D149A num indivíduo de origem

africana, também com idade de início precoce. O efeito funcional destas mutações não é

ainda conhecido. Embora a mutação M26I ocorra numa alfa-hélice da proteína, que está

envolvida na interface de dimerização, esta não altera a estrutura terciária da DJ-1 como

acontece com a mutação L166P [159].

Para além destas mutações, verificou-se a inexistência de mutações no gene DJ-1

numa série de 190 indivíduos com doença de Parkinson esporádica, o que indica que

mutações neste gene são responsáveis por uma pequena minoria dos casos esporádicos

[161].

Em 2003 Hague e colaboradores identificaram um indivíduo heterozigótico

composto, com duas novas mutações, e um indivíduo heterozigótico para uma nova

mutação numa série de doentes hispânicos com início precoce da doença [167].

No ano seguinte, Hedrich e colaboradores realizaram um estudo com 100 indivíduos

de origem europeia e idade de início precoce, para determinar a presença de mutações e

rearranjos no gene DJ-1, por uma combinação de HPLC desnaturante e PCR em tempo-

real. Encontraram duas delecções heterozigóticas: uma grande delecção contendo três

exões do gene (Ex5-7) que se prevê que afecte de forma severa a transcrição, e uma

pequena delecção de onze pares de base no intrão cinco, que se prevê que remova um local

de splice, resultando num produto de transcrição anormal [168]. Dois outros estudos foram


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publicados nos quais não são encontradas quaisquer mutações neste gene em indivíduos

com forma familiar autossómica recessiva da doença [169, 170].

O fenótipo clínico dos doentes afectados com mutações no gene DJ-1 é em tudo

semelhante àquele descrito dos doentes com mutações na parkina. A idade de início

encontra-se na terceira década de vida, boa resposta à terapêutica com L-dopa e uma

progressão da doença lenta [161].

Mutações no gene DJ-1 são uma causa rara de parkinsonismo. Até à data foram

publicados resultados de um total de 442 indivíduos com início precoce da doença, dando

origem a um total de uma mutação homozigótica, um indivíduo heterozigótico composto, e

três heterozigóticos sem segunda mutação encontrada. A frequência de mutações neste

gene pode ser estimada em cerca de 1-2% em indivíduos com início precoce. Não existe

qualquer descrição de mutações em indivíduos com início tardio, ou com formas mais

idiopáticas da doença. Embora não sejam conhecidos os mecanismos da patogénese deste

gene, não restam dúvidas que a sua participação se dá por perda de função, com a maioria

das mutações encontradas a causarem proteínas incompletas, seja por alteração dos locais

de splice, seja por delecções.

Os resultados sugerindo que a proteína DJ-1 pode proteger células do stresse

oxidativo, funcionando como um destruidor de espécies reactivas de oxigénio livres, são

muito interessantes, uma vez que, há várias décadas que o stresse oxidativo tem sido

apontado como causa primária para a doença de Parkinson.

A baixa frequência de mutações neste gene em indivíduos com doença de Parkinson

sugere que estas não devem ser consideradas como marcadores de factor de risco para o

desenvolvimento desta doença [171, 172].

PINK1

Recentemente foi identificado o gene localizado no locus PARK6 responsável pela

doença de Parkinson associada a este local. Mutações neste gene, denominado PINK1

(PTEN Induced Kinase-1), foram descritas como sendo causadoras de doença em várias

famílias com formas recessivas e de início precoce [173]. O gene PINK1 codifica uma

proteína, com o mesmo nome, com 581 aminoácidos que possui dois domínios já

determinados: um domínio de ligação mitocondrial e um domínio de proteína cinase com


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grande homologia com as cinases serina/treonina. Foi sugerido que formas mutadas desta

proteína poderiam danificar os neurónios por apoptose induzida por stresse e disfunção

mitocondrial [173].

A função das proteínas cinase é fosforilar proteínas alvo, que depois realizam

importantes funções celulares como, por exemplo, transdução de sinal. Tanto a forma

normal da proteína como as formas mutadas se localizam na mitocôndria, o que está de

acordo com o domínio de ligação mitocondrial apresentado pela proteína [174]. Em cultura

celular a forma wild-type da proteína parece proteger as células do stresse induzido pela

disfunção mitocondrial, assim como da apoptose induzida por stresse, um fenómeno que é

abolido com a transfecção de formas mutadas do gene PINK1 [173]. Desta forma, o gene

PINK1 estabelece uma relação molecular directa entre a mitocôndria e a doença de

Parkinson, uma relação de que se suspeitava há algum tempo [175, 176].

Uma das hipóteses para o funcionamento da proteína é ela fosforilar proteínas-alvo,

ainda não conhecidas, na mitocôndria como resposta a situações de stresse celular,

protegendo, desta forma, contra a disfunção mitocondrial.

As mutações no gene PINK1 foram inicialmente descritas em três famílias de origem

Italiana e Espanhola. Até à data, foram descritas mais de nove famílias adicionais de

origem Europeia e Asiática [177-179].

Até agora todas as mutações descritas no gene PINK1 são mutações pontuais,

sinónimas ou missense, não há qualquer descrição de rearranjos no gene [179].

Tendo por base os trabalhos publicados até agora, as características clínicas do

parkinsonismo associado a mutações no gene PINK1, parecem ser semelhantes àquelas

apresentadas pelos doentes com mutações no gene da parkina, com uma idade de início

perto dos 30 anos de idade, uma progressão lenta da doença e boa resposta à terapia com

levodopa, embora também estejam descritos alguns casos com um início precoce de

distonia, o que parece ser discrepante com os dados dos doentes com mutações na parkina

ou DJ-1 [174].

Tendo por base os poucos estudos de prevalência realizados até agora, parece que a

prevalência de mutações no gene PINK1 é inferior à prevalência das mutações no gene da

parkina [179, 180].


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UCH-L1

A proteína Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) pertence a uma

família de enzimas, que têm como função remover moléculas de ubiquitina. Há três

funções que foram atribuídas à UCH-L1: actividade de hidrolase ao reciclar ubiquitina de

cadeias de poliubiquitina, para formar monómeros após a degradação proteica no

proteassoma; actividade de ubiquitina ligase; papel na regulação da degradação de

monómeros de ubiquitina, pelo processo de degradação lisossomal [181].

No ano de 1998 Leroy e colaboradores, adoptando a metodologia do gene candidato

sequenciaram o gene UCH-L1 em 73 indivíduos com história familiar de doença de

Parkinson, tendo encontrado numa família uma mutação heterozigótica no exão 4 do gene

[182]. Esta mutação resulta na substituição de um resíduo muito conservado de isoleucina

por uma metionina na posição 93 (I93M). A família portadora desta mutação era de origem

alemã, e consistia de dois irmãos, ambos com doença de Parkinson. A mutação era

concordante com a doença nestes indivíduos, embora não tivesse sido possível estudar

qualquer outro membro da família [182]. As características clínicas apresentadas por estes

indivíduos eram idênticas às características da doença de Parkinson idiopática. O primeiro

sintoma foi tremor, tendo, ambos os indivíduos, desenvolvido acinésia, rigidez e

instabilidade postural e demonstrado uma boa resposta ao tratamento com levodopa. A

idade de início era, no entanto, inferior àquela da doença de Parkinson idiopática (49-51

anos de idade).

A razão para a escolha deste gene, ao contrário da selecção habitual por estudos de

linkage, foi principalmente porque está descrito que a proteína está presente nos corpos de

Lewy, tal como a alfa-sinucleína, e porque, tal como a parkina, a UCH-L1 faz parte do

processo de degradação proteica pelo proteassoma [182]. Se a mutação I93M é de facto

uma mutação patogénica, não é ainda conhecido, embora o facto de não ter sido encontrada

em cerca de 1340 doentes de Parkinson e 726 controlos, diminua a possibilidade de poder

ser um polimorfismo, mesmo que raro [183-185].

Estudos recentes têm sugerido mecanismos que possam explicar a patogenicidade

desta mutação. Nishikawa e colaboradoes demonstraram que a mutação I93M resulta numa

proteína com uma estrutura secundária diferente, com uma diminuição do seu conteúdo em

alfa-hélice [186]. Esta alteração de estrutura poderia conferir a tendência para a proteína


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mutada agregar nos neurónios, no entanto são claramente necessários mais estudos nesta

área [186].

Outro estudo realizado recentemente revelou que esta proteína sofre modificações

oxidativas, mais concretamente, há cinco resíduos de metionina que são oxidados; é por

isso tentador pensar que a mutação I93M confere uma maior susceptibilidade ao stresse

oxidativo [187]. No entanto, este trabalho não clarifica qual o efeito que a oxidação tem na

função da proteína.

No ano de 2003 Osaka e colaboradores demonstraram que a UCH-L1 está envolvida

na regulação da degradação de monómeros de ubiquitina. No entanto, a mutação I93M não

afecta esta função, sugerindo que este mecanismo não media o mecanismo de onset da

doença [181].

Ao realizar o screening de mutações no gene UCH-L1, Maraganore e colaboradores

identificaram outra mutação não sinónima que se encontrava sub-representada numa série

de doentes de Parkinson de origem europeia, indicando por isso um efeito protector [183].

Em particular foi observado que os portadores desta mutação têm um risco

significativamente mais baixo de desenvolver a doença, e que o efeito protector exercido

pela mutação é dependente da dose. No entanto, desde esta observação inicial, tem havido

alguma controvérsia quanto a este resultado. No total, cinco trabalhos publicados

encontraram uma associação [183, 184, 188-190], enquanto outros seis não encontraram

qualquer associação entre esta mutação e a doença [188, 191-195].

Se qualquer uma ou ambas destas mutações e mecanismos se provarem estar

biologicamente correctos, então o gene UCH-L1, que codifica uma enzima

estrategicamente localizada no centro do processo de degradação pelo proteassoma, com

risco para a doença determinado geneticamente, será sem dúvida um alvo muito apetecível

para estratégias de tratamento e de modificação da doença no futuro [196].

LRRK2 (Dardarina)

Em 2002 por análise de linkage numa família com doença de Parkinson de origem

japonesa, foi determinada a localização do mais recente gene associado a esta doença. Os

autores deste trabalho identificaram o locus PARK-8 como se situando no cromossoma

12p11.2-q13.1 [197]. Nesta família o haplótipo associado à doença era partilhado por todos


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os quinze membros afectados, assim como por oito membros não afectados, o que sugeriu

uma reduzida penetrância deste gene. Possivelmente existindo facores ambientais ou

outros factores genéticos envolvidos no desenvolvimento desta forma da doença [197].

Em Novembro de 2004 dois trabalhos publicados, simultaneamente, na revista

Neuron forneceram outras evidências quanto à forma da doença associada ao locus PARK-

8. Num dos trabalhos, Zimprich e colaboradores encontraram seis mutações patogénicas

num gene pertencente à família de proteínas ROCO com um domínio cinase do tipo

MAPKKK, ao qual deram o nome de Leucine Repeat Rich Kinase-2 (lrrk2) [198]. Embora

não se conheça ainda a função concreta desta proteína, os autores colocaram a hipótese de

esta fosforilar alvos como a alfa-sinucleína ou a proteína tau, podendo assim a actividade

cinase da lrrk2 ser um evento chave na agregação e deposição destas proteínas nos

neurónios degenerados [198].

No mesmo número da revista foi publicado o trabalho de Páisan-Ruíz e

colaboradores com resultados idênticos aos já referidos [199]. Foram encontradas

mutações patogénicas numa série de doentes de origem basca e britânica, todos com

características clínicas muito semelhantes. A idade de início de todos os doentes é de cerca

de 65 anos de idade, com uma evolução lenta e benigna da doença, e uma excelente

resposta à terapia com levodopa, apresentando também a maioria dos doentes tremor

unilateral e a ausência de defeito cognitivo. Para além da identificação do gene os autores

relataram também a identificação desta proteína, que denominaram dardarin (derivada da

palavra basca para tremor dardara) em vários tecidos, incluindo no cérebro [199], o que

facilita a compreensão de um eventual papel no processo neurodegenerativo.

Nesta altura vários estudos estão a ser realizados, com o objectivo de verificar se

mutações neste gene são uma causa frequente de doença de Parkinson.

Dos estudos produzidos até agora, verifica-se a preponderância de uma mutação em

particular (G2019S) nos indivíduos estudados. Esta mutação não só existe numa região

muito conservada ao longo do desenvolvimento, como faz parte de um conjunto de

tripletos existente absolutamente necessários para o funcionamento de todas as proteínas

cinases humanas [200].

Os resultados obtidos para esta mutação indicam uma prevalência bastante alta, tanto

em indivíduos com história familiar da doença, com cerca de 5 a 6,6% [200, 201], como

em indivíduos com forma esporádica, 1,6 a 6% [202, 203]. Indicando, desta forma, que


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esta mutação é, de facto, um evento comum em doentes de Parkinson e que o gene lrrk2 e

consequentemente a proteína dardarin devem ser estudados, não só do ponto de vista de

método auxiliar de diagnóstico, mas também com o intuito de identificar novas formas

terapêuticas.

Stresse Oxidativo

Conceito de Stresse Oxidativo e Espécies Reactivas de Oxigénio

De uma forma muito genérica o stresse oxidativo está descrito como a desregulação

do equilíbrio entre a produção e a eliminação de Espécies reactivas de Oxigénio (ROS) e

Espécies Reactivas de Nitrogénio (RNS). Assim, o stresse oxidativo refere-se a um estado

no qual os radicais livres e os seus produtos se encontram em excesso quando comparados

com os níveis de defesas antioxidantes. Este desequilíbrio pode ocorrer como resultado do

aumento da produção de radicais livres ou da diminuição das defesas antioxidantes [204].

Os radicais livres definem-se como qualquer átomo ou molécula que possui um ou

mais electrões desemparelhados na sua orbital mais externa. Alguns são produtos normais

do metabolismo celular, sendo que as espécies radicalares celulares predominantes são o

anião superóxido (O2•−) e o radical hidroxilo (OH•). Outras moléculas tais como o peróxido

de hidrogénio (H2O2), apesar de não serem radicais livres, podem levar à formação destas

espécies através de várias reacções químicas [205]. Assim, a redução do oxigénio

molecular a água é a maior fonte de radicais, sendo esta produção proporcional ao

consumo de oxigénio. A etapa inicial nesta reacção envolve o radical superóxido o qual

produz peróxido de hidrogénio por adição de um electrão. A redução do peróxido de

hidrogénio leva à formação do radical hidroxilo altamente reactivo. No seu conjunto, estas

moléculas são denominadas espécies reactivas de oxigénio (ROS), que enquadram o

significado das suas capacidades de conduzir a alterações oxidativas a nível da célula

[206]. Para além destas, várias moléculas reactivas de nitrogénio, óxido nítrico (NO•) e

peroxinitrito (ONOO−) são também importantes moduladores do stresse oxidativo. O

peroxinitrito formado pela reacção do óxido nítrico com o superóxido é uma molécula

altamente reactiva que também se quebra para dar origem a OH• [207].


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O stresse oxidativo pode causar dano celular e as ROS oxidam componentes

celulares críticos como lípidos, proteínas e ácidos nucleicos alterando a sua estrutura e

função, induzindo apoptose ou necrose [208].

Vários factores contribuem para uma maior susceptibilidade do cérebro ao stresse

oxidativo. O tecido cerebral possui um elevado conteúdo em ácidos gordos

poliinsaturados, para além disso tem uma taxa de consumo de oxigénio extremamente

elevada e por último não possui defesas antioxidantes fortes [209, 210].

Defesas anti-oxidantes enzimáticas e não-enzimáticas

Com o objectivo de evitar os danos causados pelas ROS, tais como quebras nas

cadeias de DNA, peroxidação lipídica e modificações proteicas, durante a evolução têm

sido desenvolvidos mecanismos que previnem a geração de ROS ou que promovem a sua

eliminação. Por exemplo, a remoção de H2O2 e de anião superóxido previne a formação de

radicais hidroxilo altamente reactivos e citotóxicos [211].

Existe um grande número de compostos anti-oxidantes, mas apenas alguns foram

formalmente estudados em ensaios clínicos. A eficácia destes agentes pode ser melhorada

pela administração combinada com outros anti-oxidantes ou fármacos com efeitos

neuroprotectores diferentes. Por exemplo, a vitamina C pode ajudar à reposição de

vitamina E, logo estas duas vitaminas anti-oxidantes devem ser co-administradas [205].

Defesas anti-oxidantes enzimáticas

Ciclo do glutatião

O glutatião (GSH) tem funções de antioxidante, é um transporte e uma forma de

armazenamento de cisteína, é um parceiro de reacção para a destoxificação xenobiótica e é

um cofactor em reacções de isomerização.

O sistema do glutatião é especialmente importante na defesa celular contra ROS. O

GSH reage directamente com os radicais em reacções não enzimáticas e é o dador de

electrões nas reduções de peróxidos catalizadas pela glutatião peroxidase (GlPx). O


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produto da oxidação do GSH é o glutatião dissulfido (GSSG). O GSH é regenerado a partir

do GSSG dentro das células numa reacção catalizada pela flavoenzima glutatião redutase

(GR). Esta enzima regenera o GSH através da transferência de equivalentes de redução do

NADPH para o GSSG [212].

Durante as reacções catalisadas pela GlPx e pela GR, o glutatião reduzido é

regenerado. Pelo contrário, o GSH é consumido durante a geração de glutatião-S-

conjugados pela glutatião-S-transferase ou pela libertação de glutatião das células. Ambos

os processos fazem baixar os níveis de glutatião total intracelular. Logo, para ser mantida a

concentração intracelular de GSH, o GSH consumido tem de ser reposto por síntese a

partir dos seus aminoácidos constituintes [211].

Superóxido Dismutase (SOD)

Outro mecanismo de defesa antioxidante envolve a enzima superóxido dismutase

(SOD). Esta transforma o ião superóxido, um radical livre extremamente reactivo, em

H2O2 e O2. Embora através desta reacção seja formado peróxido de hidrogénio, este é

menos citotóxico que o anião superóxido.

Existem três isoformas da SOD identificadas em mamíferos que são caracterizadas

pelo ião metálico do seu grupo prostético e pela sua localização celular. A isoenzima

expressa mais ubiquamente contém cobre e zinco (CuZnSOD ou SOD1) e é um dímero

que contém 153 aminoácidos existente no compartimento intracelular.

A isoforma indutível da SOD que contém manganésio (Mn-SOD ou SOD2) localiza-

se na mitocôndria e possui 24 kD.

A terceira isoforma possui como grupos prostéticos átomos de cobre e zinco (SOD3)

e localiza-se no compartimento extracelular.

As SOD1 e 2 estão distribuídas de formas diferentes nas células neuronais e gliais. A

SOD1 está localizada maioritariamente nos astrócitos em todo o sistema nervoso central

(SNC), mas também é detectável, em menor quantidade, em neurónios. Por outro lado, a

SOD2 localiza-se predominantemente nos neurónios cerebrais e na espinhal medula [213].

A imunoreactividade de ambas as enzimas é extremamente baixa, em condições

fisiológicas normais, nas células da microglia, oligodendrócitos e células endoteliais, o que


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pode explicar o facto da oligodendroglia ser particularmente vulnerável ao stresse

oxidativo [214].

Ao contrário dos neurónios, os astrócitos conseguem aumentar a expressão da

glutatião peroxidase combatendo assim o dano oxidativo [215].

Estudos da actividade da SOD têm obtido resultados contraditórios. Por outro lado a

imuno-reactividade da SOD1 e da SOD2, assim como da catalase está aumentada nas

regiões de tranças neurofibrilares e placas senis [216, 217].

Catalase

A enzima catalase é outro dos componentes do mecanismo de defesa antioxidante.

Esta enzima decompõe peróxido de hidrogénio em água e oxigénio, complementando desta

forma a acção antioxidante da SOD.

É constituída por quatro sub-unidades, cada uma delas com um grupo heme no local

activo, que catalisa a reacção:

2H2O2 2H2O + O2

Compartimentada nos peroxissomas, existe em grande quantidade no fígado e

glóbulos vermelhos, mas o cérebro, coração e músculo-esquelético mostram baixa

actividade de catalase [218].

Defesas anti-oxidantes não enzimáticas

Vitamina A

A vitamina A (retinol) é um anti-oxidante lipossolúvel derivado de carotenóides

obtidos através da dieta. Em 1989, Jeandel et al. [219] descobriram que a concentração

desta vitamina no soro se encontrava abaixo dos níveis normais em doentes de Alzheimer.

Da mesma forma, outros investigadores descreveram resultados semelhantes [220, 221].

Vitamina E (α-tocoferol)

A vitamina E é um anti-oxidante lipossolúvel que se incorpora na região hidrofóbica

das biomembranas e, por cedência de átomos de hidrogénio, interrompe reacções de

Catalase


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peroxidação lipídica, protege os neurónios da toxicidade da β-amiloide e capta radicais

livres [222, 223].

Existem algumas evidências que apontam no sentido do metabolismo da Vitamina E

se encontrar alterado em doentes de Alzheimer. No mesmo estudo anteriormente referido

[219], foram descritas concentrações séricas diminuídas de vitamina E em doentes de

Alzheimer quando comparados com indivíduos saudáveis.

Vitamina C (ácido ascórbico)

A vitamina C é um anti-oxidante hidrossolúvel, importante no processo de

regeneração da forma activa da vitamina E [224]. Para além disso, participa na remoção de

espécies reactivas como O2•−, OH• e hidroperóxidos lipídicos. Pode ainda estabilizar as

catecolaminas, impedindo a formação de ROS [225].

Ácido úrico

O ácido úrico é um produto final do metabolismo das purinas que se encontra a nível

do plasma e remove, quando em concentrações fisiológicas, radicais superóxido e

hidroxilo, reduzindo também a formação de peroxinitrito [226].

Doença de Parkinson e Stresse Oxidativo

A ocorrência de stresse oxidativo na doença de Parkinson é evidenciada por estudos

post-mortem, mas também por estudos que demonstraram a capacidade do stresse

oxidativo induzir morte celular nas células da sunstância nigra [227]. Há evidências de que

existem elevados níveis de stresse oxidativo em condições basais na substância nigra no

cérebro normal, e que estes níveis estão ainda mais elevados em indivíduos com doença de

Parkinson [228]. Para além disso, o tratamento com L-dopa pode aumentar a carga

oxidativa e desempenhar um papel na progressão da doença [229, 230]. A degradação da

dopamina pela enzima monoamino oxidase leva à produção de peróxido de hidrogénio, o

que sugere um mecanismo pelo qual pode surgir stresse oxidativo [231]. A produção de

peróxido de hidrogénio leva a um aumento da formação de glutatião oxidado, sugerindo a

diminuição da capacidade protectora do maior sistema antioxidante biológico [232].


- 46 -

O aumento da degradação da dopamina pode gerar um excesso de peróxido de

hidrogénio e, subsequentemente, formação do radical hidroxilo, conduzindo à morte da

célula dopaminérgica [233]. Sabe-se que a actividade da MAO aumenta com a idade,

expondo desta forma, as células a lesões devido apenas ao normal envelhecimento dos

indivíduos [234].

As células da SN, e o Sistema Nervoso Central (SNC) de um modo geral, são muito

sensíveis ao stresse oxidativo. Uma das razões para esta sensibilidade prende-se com o seu

elevado consumo de O2: em humanos o cérebro representa uma pequena percentagem do

peso corporal, mas processa mais de 20% do consumo de O2. Este oxigénio é utilizado

pelos neurónios para, através da mitocôndria, produzirem ATP. Em condições fisiológicas

normais, cerca de 1-2% do O2 consumido pelas células é convertido em espécies reactivas

de oxigénio (ROS) [235].

Outra das razões deve-se à produção de monóxido de azoto (-NO) e a espécies

reactivas de nitrogénio (RNS). O radical livre -NO é um mensageiro biológico altamente

difusível que desempenha um papel fundamental na fisiologia do CNS. Existem três

isoformas responsáveis pela produção de -NO: NO sintetase neuronal (nNOS), NO

sintetase indutível (iNOS) e NO sintetase endotelial (eNOS). A isoforma responsável pela

maioria da actividade do NO no CNS é a nNOS. O NO, na presença de anião superóxido

(O.-2), uma espécie reactiva de oxigénio que se forma na mitocôndria, durante a respiração

celular, leva à formação de ONOO.-, uma espécie radicalar com elevada citotoxicidade

[236].

A degradação enzimática da dopamina, através da enzima monoamino oxidase que

leva à produção de peróxido de hidrogénio, explica até certo ponto os elevados níveis

basais de stresse oxidativo na SN [237].

Na doença de Parkinson tem sido descrito um deficit do complexo I da cadeia

respiratória mitocondrial, o que conduz à disfunção e aumento da produção de espécies

reactivas de oxigénio pela mitocôndria [238].

Este defeito foi observado a nível do tecido cerebral colhido em autópsia de doentes

de Parkinson e em plaquetas isoladas de sangue periférico de doentes. Estes factos vieram

reforçar a procura de marcadores periféricos para a doença, que clarifiquem o papel da

mitocôndria na morte neuronal por apoptose.


- 47 -

Metabolismo do ferro

Um evento que está de acordo com a existência de stresse oxidativo na doença de

Parkinson é o metabolismo do ferro. Sofic e colaboradores demonstraram existir um

aumento da quantidade de ferro na substância nigra de doentes de Parkinson quando

comparados com controlos [239, 240]. Uma evidência que está de acordo com um papel do

ferro na patogénese desta doença é a possibilidade de, através da reacção de Fenton,

originar ião hidroxilo, ião este que é reactivo. Para além disso, o ferro promove a auto-

oxidação da dopamina, libertando peróxido de hidrogénio [241]. Adicionalmente, o ferro

promove a conversão do excesso de dopamina em neuromelanina, um pigmento insolúvel

que se acumula nos neurónios dopaminérgicos com o avançar da idade [18]. De uma forma

geral, a neuromelanina funciona como um factor protector, sequestrando espécies reactivas

no interior da célula, no entanto, uma vez ligada ao ferro torna-se pró-oxidante.

Um neurónio típico da substância nigra de um indivíduo com doença de Parkinson

contém dopamina, neuromelanina, elevados níveis de ferro e baixos níveis de GSH, sendo

assim um bom ambiente para a formação de espécies reactivas de oxigénio. Assim sendo, o

stresse oxidativo existente na doença de Parkinson é provavelmente consequência da

produção de peróxido de hidrogénio devido a uma combinação de factores, como a

oxidação da dopamina, depleção de GSH e ião Fe3+ gerado pela neuromelanina [242]. Esta

hipótese é fortalecida pela observação de que os neurónios pigmentados (devido à presença

de neuromelanina) são preferencialmente perdidos no decurso da doença de Parkinson

[243].

A hemocromatose é uma doença hereditária caracterizada pela acumulação de ferro.

A maioria dos casos deve-se a duas mutações no gene HFE [244]. A mutação C282Y é

altamente penetrante e leva ao sequestro intracelular de ferro [245]. A mutação H63D é

menos penetrante e é considerada um factor de risco para a hemocromatose [246]. Em

indivíduos com hemocromatose têm sido observadas características clínicas de

parkinsonismo, para além dos depósitos de ferro nos gânglios basais [247]. Desta forma, o

seu papel no metabolismo do ferro torna o gene HFE num gene candidato para a doença de

Parkinson. Resultados de vários estudos realizados, sobre a influência das mutações neste


- 48 -

gene com esta doença, variam desde um papel protector da heterozigotia C282Y [248] até

à ausência de qualquer efeito de qualquer uma das mutações [249].


- 49 -

Objectivos do estudo

Apesar da intensa investigação a que os factores genéticos da doença de Parkinson

têm sido sujeitos nos anos mais recentes, existem ainda algumas dúvidas no que diz

respeito ao papel da genética na etiologia da doença de Parkinson idiopática. Embora se

conheçam alguns genes associados com a doença nalgumas famílias e indivíduos com

formas esporádicas, não existem estudos de qualquer destes genes na população

portuguesa. A existência de stresse oxidativo na doença de Parkinson tem sido apontada

como um dos eventos iniciadores da doença. Neste trabalho pretendemos determinar se

existem diferenças em marcadores biológicos de stresse oxidativo entre doentes e um

grupo de indivíduos controlo. Para além disso, pretendemos verificar se polimorfismos em

enzimas associadas com estes mecanismos podem ser associadas a um maior ou menor

risco de desenvolvimento da doença. Uma vez que o metabolismo do ferro tem sido

associado com o aumento de processos de stresse oxidativo na doença de Parkinson,

pretendemos determinar se mutações no gene HFE podem ser consideradas como factor de

risco para o início da doença de Parkinson.

Objectivos específicos

1) Determinar a existência de mutações patogénicas nos genes alfa-sinucleína, parkina

e PINK1, associados a doença de Parkinson numa amostra representativa da

população portuguesa;

2) Determinar se polimorfismos nas enzimas NOS e GST, associadas aos mecanismos

de stresse oxidativo, conferem risco aumentado ou reduzido para o

desenvolvimento desta doença;

3) Determinar se mutações no gene da hemocromatose (HFE) podem ser consideradas

como factor de risco para a doença de Parkinson;

4) Determinar se os doentes de Parkinson apresentam marcadores de stresse oxidativo

periféricos alterados, em comparação com indivíduos controlo.


- 50 -

Materiais e Métodos

População em estudo

Mecanismos Genéticos

A selecção e caracterização clínica dos indivíduos participantes neste estudo foram

feitas no Serviço de Neurologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra (H.U.C.) por

parte da equipa médica desde Junho de 2002 a Dezembro de 2004. Todos os indivíduos

seleccionados pertencem à população da região centro de Portugal abrangida pela consulta

de doenças do movimento dos H.U.C.. Os indivíduos em estudo foram seleccionados de

forma consecutiva durante este período de tempo e não houve por parte da equipa médica

qualquer outro parâmetro de inclusão.

Os indivíduos com sinais secundários de parkinsonismo ou características atípicas,

tais como demência na fase inicial da doença, sinais piramidais ou cerebelosos foram

excluídos do estudo.

O grupo controlo é também constituído por indivíduos da região centro de Portugal.

É uma amostra aleatória de indivíduos com idades semelhantes às do grupo em estudo.

Todos os indivíduos pertencentes a este grupo foram sujeitos a observação por parte do

médico especialista, que excluiu qualquer forma de doença neurodegenerativa.

O estudo foi realizado com a aprovação da Comissão de Ética dos Hospitais da

Universidade de Coimbra. Todos os participantes tomaram conhecimento do estudo e da

importância dos resultados esperados e assinaram um consentimento informado. Sendo

este estudo de cariz genético, foi mantido o sigilo de todos os dados respeitantes aos

participantes.

Devido à natureza do estudo e concretamente à sua componente genética, foi

determinado que o grupo em estudo seria subdividido num grupo de indivíduos

esporádicos e num grupo de indivíduos com história familiar. Como critério para inclusão

no grupo de indivíduos com história familiar, foi considerada a presença de doença em

pelo menos um familiar em 1º ou 2º grau.


- 51 -

Sempre que possível foram observados no serviço pela equipa médica todos os

familiares afectados, como forma de confirmação da presença de Doença de Parkinson ou

exclusão por qualquer outra forma de fenótipo.

Foi diagnosticada Doença de Parkinson (DP) em 128 indivíduos, no período em que

decorreu este trabalho, os quais foram incluídos no estudo. Do grupo de 128 doentes, 28

indivíduos possuíam história familiar positiva para DP e foram colocados num subgrupo

para estudo genético mais detalhado. Foram recolhidas amostras para estudo genético

durante este período a 126 indivíduos saudáveis, com idades semelhantes aos indivíduos

em estudo constituindo assim o grupo controlo.

O grupo de doentes de Parkinson para o estudo genético é constituído por 61

indivíduos do sexo masculino (47,7%) e 67 indivíduos do sexo feminino (52,3%) com uma

média de idades de 66,9±10,4 anos. Neste grupo foram incluídos indivíduos com início

precoce da doença, mas também com início tardio. A média de idades de início da doença

neste grupo é de 56,7±11,9 anos.

Da totalidade de doentes de Parkinson estudados, foram seleccionados dois grupos:

grupo de doentes esporádicos e um grupo de doentes com história familiar positiva. O

grupo de doentes esporádicos é constituído por 100 indivíduos e apresenta uma média de

idades de 67,1±11,2 anos e uma média de idades de início de 57,5±12,6 anos. O grupo de

doentes com história familiar positiva é constituído por 28 indivíduos com uma média de

idades de 65,9±7,8 anos e uma média de idades de início de 54±10 anos.

O grupo de indivíduos controlo, com 126 indivíduos, é constituído por 40 indivíduos

do sexo masculino (31,8%) e 86 indivíduos do sexo feminino (68,2%). A média de idades

neste grupo é de 67,9±14,4 anos. (Tabela III) No que diz respeito a idades, o grupo de

indivíduos com DP não difere estatisticamente do grupo de indivíduos controlo (p=0,549).

Dos indivíduos com forma esporádica da doença, 13 (13%) apresentam demência, 16

(16%) apresentam distonia enquanto 4 (4%) apresentam tremor essencial. No grupo de

indivíduos com forma familiar 2 sujeitos apresentam demência (7,1%), outros 2

apresentam tremor essencial e 11 (39,3%) apresentam distonia (Tabela II).


- 52 -

Tabela II - Características clínicas dos indivíduos com DP estudados.

Características gerais eDP (n=100) fDP (n=28)

Distonia 16 11

Demência 13 2

Tremor essencial 4 2

Número de familiares afectados

1 22

2 4

3 1

+3

1

eDP – doença de Parkinson esporádica; fDP – doença de Parkinson familiar.

Mecanismos de Stresse Oxidativo

A selecção e caracterização clínica dos indivíduos participantes neste estudo foram

feitas no Serviço de Neurologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra (H.U.C.) pela

equipa médica, desde Setembro de 2003 a Janeiro de 2005. Todos os indivíduos

seleccionados pertencem à população da região centro de Portugal abrangida pela consulta

de doenças do movimento dos H.U.C.. Os indivíduos em estudo foram seleccionados de

forma consecutiva durante este período de tempo, não houve por parte da equipa médica

qualquer outro parâmetro de inclusão.

Os indivíduos com sinais secundários de parkinsonismo ou características atípicas,

tais como demência na fase inicial da doença, sinais piramidais ou cerebelosos foram

excluídos do estudo.

O grupo controlo, constituído por indivíduos da região centro de Portugal, contém, na

sua maioria, familiares dos indivíduos afectados que os acompanharam à consulta. Todos

os indivíduos pertencentes a este grupo foram sujeitos a observação pelo neurologista, que

excluiu qualquer forma de alteração neurológica. Foram excluídos todos os familiares em

primeiro grau.


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O estudo foi realizado com a aprovação da Comissão de Ética dos Hospitais da

Universidade de Coimbra. Todos os participantes tomaram conhecimento do estudo,

importância dos resultados esperados e assinaram um consentimento informado. Foi

mantido o sigilo de todos os dados respeitantes aos participantes.

Durante o período em que decorreu este estudo, foi diagnosticada Doença de

Parkinson em 130 indivíduos os quais foram incluídos no grupo de estudo. Foram

recolhidas amostras para estudo, durante este período, a 54 indivíduos saudáveis, com

idades semelhantes aos indivíduos em estudo constituindo assim o grupo controlo.

Relativamente à idade, o grupo de indivíduos com DP não difere estatisticamente do grupo

de indivíduos controlo (p>0,05).

Tabela III - Características demográficas dos indivíduos com DP e controlos.

Grupo n (% sexo masculino) Idade média ± D. P. (anos) Média Idade Início ± D. P. (anos)


Controlos 48 (29,2%) 62,8±13,5 (sexo masculino)

63,5±15,3 (sexo feminino)

DP 135 (43,7%) 65,9±11,1 (sexo masculino) 56,4±12,1 (sexo masculino)

65,7±11,1 (sexo feminino) 56,4±12,2 (sexo feminino)


Controlos 126 (31,8%) 70,4±12,5 (sexo masculino)

66,7±15,1 (sexo feminino)

DP 128 (47,7%) 67±12,1 (sexo masculino) 58±12 (sexo masculino)

67±8,7 (sexo feminino) 55±12 (sexo feminino)

eDP 100 (49%) 67,1±11 57,7±13

fDP 28 (42,9%) 65,9±7,8 54±10

DP – doença de Parkinson; eDP – doença de Parkinson esporádica; fDP – doença de Parkinson familiar.


- 54 -

Procedimentos no estudo dos Mecanismos Genéticos

Colheita e preparação do material biológico

Para o estudo genético foram colhidos a cada indivíduo 6 ml de sangue por punção

venosa para um tubo com o anticoagulante EDTA. O DNA foi extraído recorrendo a um

kit da marca Roche (DNA Isolation Kit for Mammalian Blood), que se baseia na

destruição das células nucleadas, precipitação proteica e posterior precipitação do DNA

por adição de etanol [250, 251]. Este método permitiu obter cerca de 600 ul de solução de

DNA com concentração entre 700 e 1300 ug/ul e pureza da ordem de 1,8 determinada por

método espectrofotométrico.

Metodologias Utilizadas no Estudo dos Mecanismos Genéticos

A execução do estudo dos mecanismos genéticos associados à DP foi baseada na

utilização de quatro técnicas de biologia molecular.

A técnica provavelmente mais utilizada em qualquer laboratório de biologia

molecular é a reacção em cadeia da polimerase (PCR) que tem como objectivo aumentar o

número de cópias de uma pequena região de DNA que se pretende estudar. Esta reacção

baseia-se na utilização de uma enzima (DNA polimerase) termoestável, que em condições

adequadas tem a capacidade de criar uma nova cadeia de DNA utilizando como “molde”

uma sequência de cadeia simples. Durante a PCR são utilizadas três temperaturas com

diferentes objectivos: inicialmente a reacção é levada a temperaturas da ordem dos 95ºC, a

esta temperatura a dupla cadeia de DNA é desnaturada originando duas sequências de

cadeia simples; a temperatura seguinte ocorre na casa dos 50-65ºC e tem como objectivo

permitir que pequenas sequências oligonucleotídicas (primers), criadas de forma a

flanquear a região pretendida, se liguem ao DNA original; a terceira temperatura ocorre a

cerca de 72ºC e tem como objectivo permitir que a DNA polimerase tenha actividade

máxima criando uma nova cadeia de DNA utilizando como sequência inicializadora os

primers que se ligaram anteriormente. Cada reacção de PCR contém para além do DNA


- 55 -

alvo, DNA polimerase, com o seu respectivo tampão, um par de primers que flanqueiem a

região pretendida e nucleótidos livres que a polimerase possa utilizar na criação de novas

cadeias de DNA.

Assim, a PCR é realizada por repetição deste ciclo de três temperaturas, permitindo

aumentar exponencialmente o número de cópias de uma pequena região de DNA

previamente determinada.

Outra técnica utilizada que tem por base a PCR é o PCR em Tempo-Real. O princípio

da técnica é o mesmo, sendo a única diferença a possibilidade de saber, em tempo real, se

está a ocorrer amplificação do DNA. A grande vantagem deste método é permitir a

determinação do número de cópias de um determinado gene por comparação com outro

gene conhecido e amplificado em simultâneo.

Esta metodologia permite visualizar, à medida que uma reacção de PCR decorre, a

quantidade de produto amplificado. Para além dos reagentes utilizados numa reacção de

PCR normal, é também adicionada uma sonda, complementar à região delimitada pelos

primers utilizados [252]. Esta sonda possui em cada uma das suas extremidades um grupo

repórter, que tem como objectivo emitir fluorescência, e na outra extremidade um grupo

quencher, que tem como objectivo absorver a fluorescência emitida pelo grupo repórter.

Quando ocorre a fase de extensão da polimerase e esta atinge a região onde se encontra a

sonda, faz uso da sua capacidade exonucleásica, removendo nucleótido a nucleótido toda a

sonda. Quando há a separação da sonda, o grupo repórter fica afastado do grupo quencher,

podendo assim emitir fluorescência e sendo esta detectada pelo aparelho [252].

Figura 5 - Representação esquemática da estrutura de uma sonda utilizada em PCR em tempo-real


- 56 -

Figura 6 - Representação esquemática da capacidade exonucleásica da enzima utilizada no PCR em tempo-real.

Para determinação da quantidade do gene em estudo, a análise é feita por comparação

com um gene de referência. Normalmente utiliza-se um gene house-keeping que se saiba

que existe em quantidade normal na população.

Cada amostra é estudada, pelo menos, em triplicado de forma a normalizar ao

máximo a quantidade de produto PCR obtido.

A comparação entre os genes é feita com base no ciclo em que se atinge a fase de

amplificação exponencial. Se houver grande quantidade do gene em estudo, e, portanto, de

DNA, esta fase da PCR é atingida mais rapidamente do que se houver menor quantidade de

DNA. Como esta reacção de PCR é uma reacção multiplex, no mesmo tubo, a partir do

mesmo DNA, são amplificados os dois genes (alvo e referência), excluindo assim a

variável de diferentes concentrações de DNA em cada amostra. Desta forma, em cada tubo

em que esteja presente amostra serão amplificados simultaneamente os gene alvo e o gene

referência. A comparação é feita entre os valores destes dois genes obtidos para cada

amostra [253].

Para além dos métodos de normalização já referidos, é também utilizado DNA

controlo. Este DNA possui um número de cópias normal tanto de gene alvo como de

referência. Os valores obtidos para o DNA controlo são também utilizados para a

determinação do número de cópias das amostras em estudo, num método denominado

Delta Delta C(T) [253].

Outra técnica muito utilizada em laboratórios de biologia molecular é a análise por

endonucleases de restrição. Esta técnica ocorre sempre posteriormente a uma reacção de


- 57 -

PCR e baseia-se na utilização de enzimas que reconhecem pequenas sequências de DNA e,

ao reconhecerem-nas, cortam o DNA nesse local específico. Desta forma, qualquer

alteração que modifique uma sequência reconhecida por uma endonuclease de restrição, é

possível de ser estudada por este método. Após esta reacção de digestão, o produto é

separado, por electroforese, num gel de agarose, permitindo desta forma verificar se houve

corte do DNA pela enzima, concluindo assim sobre a sequência em estudo [254].

Assim, é possível distinguir, utilizando uma enzima apropriada, entre a presença de

uma mutação pontual ou a presença da sequência original.

Para a determinação de sequências de DNA foi utilizada a técnica de sequenciação de

ácidos nucleicos, baseada na tecnologia BigDye® Terminator da casa comercial Applied

Biosystems. Esta técnica baseia-se no método de sequenciação descrito por Sanger em

1977 [255]. Inicialmente é realizada uma reacção de PCR de forma a amplificar a região

do DNA pretendida. Após esta reacção e uma subsequente purificação do produto PCR, é

realizada outra amplificação do DNA, utilizando apenas um primer e, desta forma,

amplificando apenas uma das cadeias. Nesta reacção são utilizados, para além de

nucleótidos normais, dideoxinucleótidos que diferem dos anteriores por possuírem no seu

carbono 3’ um átomo de hidrogénio em vez de um grupo hidroxilo. Desta forma, não é

possível adicionar outro nucleótido ao carbono 3’ de um dideoxinucleótido, terminando

assim, nesta posição, a extensão da nova cadeia de DNA. Neste método, os

dideoxinucleótidos são também marcados com um fluorófuro, sendo que cada nucleótido

A, C, G ou T é marcado com um fluorófuro diferente. Após este PCR de sequenciação, os

produtos são separados por electroforese capilar, e, finalmente, excitados por um laser,

emitindo assim fluorescência num comprimento de onda correspondente ao nucleótido em

causa, permitindo desta forma estabelecer a sequência de nucleótidos de um fragmento de

DNA [256].


- 58 -

Estudo molecular de genes envolvidos na DP

Alfa-sinucleína O gene da alfa-sinucleína foi o primeiro gene a ser relacionado com o processo de

desenvolvimento da DP, tendo sido descritas duas mutações, completamente penetrantes,

em duas famílias. Desta forma, o estudo deste gene reveste-se de grande importância.

Este gene foi estudado por três metodologias diferentes: numa primeira análise foi

realizada a pesquisa das três mutações pontuais previamente descritas na totalidade das

amostras; posteriormente foi feita a pesquisa de novas mutações pontuais nos sete exões do

gene, num grupo de 19 doentes com características e história clínica sugestivas; por final

foi feita uma pesquisa de alteração do número de cópias do gene no mesmo grupo de

indivíduos.

Pesquisa de mutações previamente descritas

Após extracção de DNA genómico, este foi sujeito a PCR utilizando os primers para

os exões 3 e 4 apresentados na Tabela IV.

Tabela IV - Sequências de primers utilizados e tamanhos dos fragmentos esperados no gene da alfa-sinucleína [92].

Primer Sequência Fragmento

esperado

1F GAGAAGGAGGAGGACTAGGACC

2R GTCTCACACTTTGGGGGTTCTC 499pb

3F CGGCGTTCTCCAGGATTTC

3R CACCTACCTACACATACCTCTGAGAG 395pb

4F GATATGTTCTTAGATGCTCAG

4R GCTAATCAGCAATTTAAGGCTAG 216pb

5F CGATGGCTAGTGGAACACG

5R CGGAGGCATTGTGGAGTTTAG 325pb

6F CCCACAGTAAGTATCTTGCTCC

6R GACTGGGCACATTGGAACTGAG 363pb

7F CCACGTAATGAGCATGTAGAGAGC

7R GCTGTCAGTGCTGATGCGTAATTG 189pb


- 59 -

De forma breve, cada um dos exões foi amplificado utilizando um programa PCR

com as seguintes características: 92 ºC 2 minutos, 30 ciclos de 92ºC 30 seg., 55ºC 30 seg.,

72ºC 30 seg. e 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos. Em cada reacção foram colocados 30

ng DNA, tampão PCR (50 mM Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 10

pmol/ul de cada primer, 2 mM dNTPs e 5U/ul Taq DNA polimerase [92].

Para a pesquisa da primeira mutação descrita no gene da alfa-sinucleína o produto

PCR obtido da amplificação do exão 4 foi sujeito a digestão com enzima de restrição. A

digestão ocorreu durante 3h a uma temperatura de 65ºC com 2U de enzima.

A enzima utilizada foi Tsp 45 I que reconhece especificamente a sequência de DNA

GTGAC. Quando ocorre a mutação G209A, que origina a transição de uma alanina para

uma treonina na posição 53 da sequência aminoacídica, a sequência wild-type GTGGC é

alterada para GTGAC sendo assim reconhecida pela endonuclease de restrição e originando

o corte no DNA [91]. A presença de uma sequência wild-type é caracterizada por um

fragmento com 216 pares de bases, enquanto a presença da mutação é caracterizada por

dois fragmentos com 128 e 88 pares de bases. Os produtos da digestão foram separados por

electroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz

ultra-violeta.

A segunda mutação pontual descrita no gene que codifica a alfa-sinucleína consiste

numa transição de G para C na posição 88 traduzindo-se numa alteração de uma alanina

para uma prolina na posição 30 da sequência de aminoácidos.

O produto PCR obtido da amplificação do exão 3 foi sujeito a uma digestão por parte

da enzima Mva I a 60ºC durante 3 horas. Esta enzima reconhece a sequência mutada

cortando o DNA numa posição específica [94]. A presença da mutação origina 2

fragmentos em 136 e 56 pares de base, enquanto a ausência da mutação origina apenas o

fragmento original de 192 pares de base. Os produtos da digestão foram separados por

electroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz

ultra-violeta.

A terceira mutação pontual descrita mais recentemente neste gene foi pesquisada de

forma análoga. O produto PCR obtido a partir da amplificação do exão 3 do gene foi

sujeito a digestão pela enzima de restrição Sty I. Esta mutação é caracterizada pela


- 60 -

transição de uma guanina para uma adenina na posição 188 que se traduz numa transição

de um ácido glutâmico para uma lisina na posição 46. Esta mutação abole o local de corte

da enzima de restrição [23]. Os produtos da digestão foram separados por electroforese em

gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta.

Pesquisa de novas mutações

Para a pesquisa de novas mutações no gene da alfa-sinucleína foi realizada uma

análise de sequenciação de ácidos nucleicos.

Inicialmente foi realizada uma reacção de PCR como descrito anteriormente. A

amplificação e tamanho dos fragmentos foram confirmados recorrendo a uma electroforese

em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta.

Após esta confirmação o produto PCR foi purificado de forma a retirar da solução

todos os reagentes da PCR e o DNA não amplificado. Esta purificação foi realizada

utilizando microplacas Millipore Montage® PCRu96. Este procedimento baseia-se numa

separação através de uma membrana, sob vácuo, dos dNTPs não incorporados, primers e

sais contaminantes do DNA alvo.

Após este passo inicial, o produto PCR purificado foi sujeito a PCR de sequenciação.

Em cada reacção PCR apenas uma das cadeias é amplificada e os nucleótidos incorporados

incluem uma marcação fluorescente. Esta reacção foi realizada recorrendo à química

BigDye® Terminator comercializada pela marca ABI. Nesta reacção de PCR para além do

DNA amplificado, foi pipetado um dos primers, correspondente ao exão amplificado,

numa concentração de 3.2 pmol, tampão de sequenciação BigDye® 5X, Mix Terminator

BigDye® e ddH2O [257]. Cada exão foi sequenciado em ambas as direcções, com os

primers descritos na Tabela IV.

Após esta reacção, aos produtos PCR foram retirados todos os nucleótidos não

incorporados utilizando o kit Dye Terminator Removal Kit da marca ABgene.

Os produtos desta reacção foram então separados num ABI 3100 Genetic Analyzer

(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) e analisados recorrendo ao software

Sequencher (Genecodes VA).


- 61 -

Pesquisa de alterações do número de cópias

A análise do número de cópias do gene da alfa-sinucleína presente em cada indivíduo

foi realizada recorrendo à tecnologia de PCR em Tempo-Real com química TaqMan®. O

gene utilizado neste estudo como gene de referência foi o gene da β-globina. Na realização

deste ensaio foram utilizados 5 ng/ul de DNA, 10 pmol/ul de cada primer (alvo e

referência) 5 pmol/ul de cada sonda (alvo e referência) e mix TaqMan® contendo enzima,

nucleótidos e co-factores necessários. Os primers utilizados estão descritos na Tabela V.

Esta solução foi colocada num aparelho de PCR em tempo real Applied Biosystems

7900HT e a quantificação absoluta determinada recorrendo ao software SDS 2.1 (Applied

Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA).


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Tabela V - Primers e sondas utilizados para a quantificação absoluta do gene da alfa-sinucleína [258].

Primer Sequência

1F CCTTCAAGCCTTCTGCCTTTC

2R TGAATTTGTTTTTGTAGGCTCCAA

3F AGGACTTTCAAAGGCCAAGGA

3R TCCACTGTCTTCTGGGCTACTG

4F CGAATGGCCACTCCCAGTT

4R GCTTACCTGTTGCCACACCAT

5F AAAGAGCAAGTGACAAATGTTGGA

5R TCTGCCACACCCTGTTTGGT

6F TGGAACTGAGCACTTGTACAGGAT

6R TCAGCTTGGACTCCTACCTCAGA

7F TCTTTGCTCCCAGTTTCTTGAGA

7R TATGCCTGTGGATCCTGACAAT

BF TGGGCAACCCTAAGGTGAAG

BR GTGAGCCAGGCCATCACTAAA

S1 ACCCTACTGAGCGGA

S3 TGGCTGCTGCACGGA

S4 ACCTTGGAGGGAGTGGT

S5 AGCAGTCCAGACGGGT

S6 AGGCTTATGAAAACGC

S7 TGCTGACAGAACATC

SB CTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGC

Parkina

No gene que codifica a proteína parkina foi já encontrada uma enorme variedade de

mutações, estando descritas mais de 50 mutações pontuais, delecções ou multiplicações em

todos os exões [121].


- 63 -

A metodologia de estudo deste gene foi em tudo semelhante à realizada para o gene

da alfa-sinucleína: pesquisar mutações pontuais e alterações do número de cópias dos

exões do gene.

A pesquisa de mutações pontuais foi feita recorrendo ao método de sequenciação de

ácidos nucleicos, como descrito anteriormente.

Foram utilizados os primers descritos na Tabela VI.


- 64 -

Tabela VI - Primers utilizados para amplificação dos 12 exões do gene da parkina e tamanhos dos fragmentos esperados [119].

Primer Sequência 5’-3’ Fragmento

esperado

1F GCGCGGCTGGCGCCGCTGTGTACG

1R GCGGCGCAGAGAGGCTGTAC 112pb

2F ATGTTGCTATCACCATTTAAGGG

2R ACATGTCACTTTTGCTTCCCT 308pb

3F AGATTGGCAGCGCAGGCGGCATG

3R AGGCCATGCTCCATGCAGACTGC 427pb

4F ACAAGCTTTTAAAGAGTTTCTTGT

4R ACATGTCTTAAGGAGTACATTT 261pb

5F AGGCAATGTGTTAGTACACA

5R TCTCTAATTTCCTGGCAAACAGTG 227pb

6F AGAGATTGTTTACTGTGGAAACA

6R TGCCTTTCCACACTGACAGGTACT 268pb

7F GAGTGATGCTATTTTTAGATCCT

7R TCTGTTCTTCATTAGCATTAGAGA 239pb

8F TGATAGTCATAACTGTGTGTAAG

8R GGGTGAAATTTGCAGTCAGT 206pb

9F ACTGTCTCATTAGCGTCTATCTT

9R ATTGCCAAATGCAACCTMTGTC 278pb

10F AATATAATCCCAGCCCATGTGCA

10R TTGGAGGAATGAGTAGGGCATT 165pb

11F ACAGGGAACATAAACTCTGATCC

11R GTTTGGGAATGCGTGTTTT 303pb

12F CAACACACCAGGCACCTTCAGA

12R AGAATTAGAAAATGAAGGTAGACA 255pb


- 65 -

Cada um dos exões foi amplificado utilizando 10 ng de DNA, tampão PCR (50 mM

Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2) 2 mM de cada dNTP, 0,3 uM de cada

primer e 0,35 U DNA Taq polimerase numa reacção de 10 ul.

Cada amplificação foi realizada recorrendo ao seguinte programa touchdown-PCR: 1

ciclo de 95ºC 3 min; 20 ciclos de 95ºC durante 30 segundos, 65-58ºC 30 segundos, 72ºC

30 segundos; 20 ciclos de 95ºC 30 segundos, 57ºC 30 segundos, 72 ºC 30 segundos; 1 ciclo

de 72ºC durante 10 minutos. A amplificação e tamanho dos fragmentos foram confirmados

recorrendo a uma electroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio

(10mg/ml) e visualizado sob luz ultra-violeta.

O produto da reacção de PCR foi purificado utilizando o processo de purificação em

microplaca Millipore Montage® PCRu96.

Após purificação, os produtos PCR foram sujeitos a PCR de sequenciação,

recorrendo à química BigDye® Terminator. Nesta reacção de PCR para além do DNA

amplificado, foi pipetado um dos primers, correspondente ao exão amplificado, numa

concentração de 3.2pmol, tampão de sequenciação BigDye® 5X, Mix Terminator

BigDye® e ddH2O. Cada exão foi sequenciado em ambas as direcções. O produto desta

reacção foi purificado, retirando todos os nucleótidos não incorporados, utilizando o kit da

marca ABgene: Dye Terminator Removal Kit.

Após esta purificação final, os produtos foram sequenciados num Genetic Analyzer

3100 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA), e o resultado analisado com o

auxílio do software Sequencher (GeneCodes, V.A.).

Para a realização do ensaio de dosagem génica foi utilizado o método descrito

anteriormente de PCR em Tempo-Real.

Cada amostra foi realizada em triplicado com 5 ng/ul de DNA sendo amplificado

simultaneamente o gene alvo e o gene de referência. Os primers foram desenhados tendo

por base a sequência publicada (GenBank 4758883) (ver Tabela VII). O gene utilizado

neste estudo como gene de referência foi o gene da β-globina.

Em cada reacção foram utilizadas 10 pmol/ul de cada primer (alvo e referência) 5

pmol/ul de cada sonda (alvo e referência) e mix TaqMan®. A reacção foi realizada num

aparelho de PCR em tempo real Applied Biosystems 7900HT e a quantificação absoluta


- 66 -

determinada recorrendo ao software SDS 2.1 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA,

USA).

Tabela VII - Primers e sondas utilizados no ensaio de dosagem génica do gene da parkina.

Primer Sequência

1F CGGCGCAGAGAGGCTGTA 1R CCACCTACCCAGTGACCATGAT 2F CCCAGTGGAGGTCGATTCTG 2R CCCCCTGTCGCTTAGCAA 3F CCCGCCGCGTTTCTG 3R CGTGGAGAAAAGGTCAAGAAATG 4F TTCTTCTCCAGCAGGTAGATCAATC 4R TTTTCCCGGCTGCACTCTT 5F CCGGATGAGTGGTGAATGC 5R AGAGGAATGAATGTGACCAGGTACT 6F GCACACCCCACCTCTGACA 6R TGCAAGTGATGTTCCGACTATTTG 7F CCGCCACGTGATTTGCTTA 7R CTGCCGATCATTGAGTCTTGTC 8F GCAGCCTTTGAGATGCTCACT 8R AGAGCTCCATCACTTCAGGATTCT 9F GGACACACTCCTCTGCACCAT 9R CAATCTGCTTTTTGGGTTTTGC 10F GGAGACACTCTCTGCAGGTA 10R TGCGGAAAGGAGAAACAAAGG 11F GCTCGGCGGCTCTTTCA 11R ACGCCTTTCCTCTTTGTTTCC 12F CGAACCCACCACACCTTTGT 12R TGCGGACACTTCATGTGCAT BF TGGGCAACCCTAAGGTGAAG BR GTGAGCCAGGCCATCACTAAA S1 CTGGCAGGTACCC S2 ACCAGCATCTTCCAGCTCAAGGAGGTG S3 TCGTCGCCTCCAGTTG S4 TTTTATGTGTATTGCAAAGGCCCCTGTCA S5 CCACACTGCCCTGGGACTAGTGCA S6 AAACATCAGTAGCTTTGCACCTGATCGCA S7 CTGTTTCCACTTATACTGTG S8 ACCTGCTCTTCTCC S9 CTGCTGGTACCGGTTG S10 GGAGAAACAAAGGAGG S11 CGACTCTGTAGGCCTG S12 TTCTGCCCCCAACAGGAGGCTG SB CTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGC


- 67 -

PINK1

O estudo do gene PINK1 incidiu na pesquisa de mutações pontuais e na procura de

alterações do número de cópias dos exões.

Para a realização da pesquisa de mutações pontuais foi utilizada uma metodologia

idêntica à descrita anteriormente – sequenciação de ácidos nucleicos.

O DNA genómico dos indivíduos foi sujeito a uma reacção de PCR com os primers

descritos na Tabela VIII. Os sete exões do gene foram amplificados utilizando 10 ng de

DNA, tampão PCR (50 mM Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 4 mM de

cada dNTP, 0,2 uM de cada primer e 0,5 U Taq DNA polimerase. Cada amplificação

decorreu de acordo com o seguinte programa PCR: 1 ciclo de 95ºC 2 minutos; 30 ciclos de

95ºC 30 segundos, 60ºC 30 segundos e 72ºC 30 segundos. A confirmação da amplificação

e dos tamanhos dos fragmentos obtidos foi realizada após electroforese num gel de agarose

a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta.

Tabela VIII - Sequências nucleotídicas dos primers utilizados para amplificação dos 7 exões do gene PINK1.

Primer Sequência 5’-3’ Fragmento

esperado

1F GCCCCAAGTTTGTTGTGAC

1R CTCCGCTCGGCTTAGGAC 351pb

2F TGTTTCCCTTTTCTTGGGCC

2R TGGGCATTTTGAGAACATCTCC 401pb

3F TCGAAGGTCAGAGCCAATTCTAG

3R ACCAGGTGCTGAGGACATAAGTG303pb

4F TTGTATCTGATGCTGGCCTCAT

4R GCACATGGAGGGCAGGAA 305pb

5F TCGTCGATGTGTGGTAGCCA

5R TCTAGTGCCCCTGGAGAGCTC 251pb

6F GCTATGTCTTGCTGGTGGCTTTA

6R CAAGGCATCGAGTCTCCTGC 301pb

7F GGAAGAATTGGGTTGGGACC

7R CGAGGCCTTTTCCGGCTA 318pb


- 68 -

Os produtos PCR foram purificados recorrendo ao método de purificação em

microplaca Millipore Montage® PCRu96.

Após a purificação o DNA foi sujeito a uma segunda reacção de PCR, desta vez uma

reacção de PCR de sequenciação. Esta reacção foi realizada utilizando a química BigDye®

Terminator. Para cada amostra e para cada direcção (sense a anti-sense) foi utilizado o

DNA amplificado anteriormente, 3.2 pmol do primer correspondente, tampão de

sequenciação BigDye® 5X, Mix BigDye® Terminator e ddH2O. O produto desta reacção

foi purificado, de forma a retirar todos os nucleótidos não incorporados, utilizando o kit da

marca ABgene: Dye Terminator Removal Kit.

Após esta purificação os produtos foram separados num Genetic Analyzer 3100

(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA), e o resultado analisado com o auxílio

do software Sequencher (GeneCodes, V.A.).

Para a realização do ensaio de quantificação génica foi utilizado o sistema de

quantificação absoluta por PCR em Tempo-Real.

Cada amostra foi realizada em triplicado com 5 ng/ul de DNA e amplificado

simultaneamente o gene alvo e o gene de referência. O gene utilizado neste estudo como

gene de referência foi o gene da β-globina. Em cada reacção foram utilizados 10 pmol/ul

de cada primer (alvo e referência) 5 pmol/ul de cada sonda (alvo e referência) e mix

TaqMan® (ver Tabela IX). A reacção foi realizada num aparelho de PCR em tempo real

Applied Biosystems 7900HT e a quantificação absoluta determinada recorrendo ao

software SDS 2.1 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA).


- 69 -

Tabela IX - Sequências nucleotídicas dos primers e sondas utilizados para os ensaios de dosagem génica do gene PINK1.

Primer Sequência

1F CCATGGTTGGCAAAAAAATATCAG

1R CACTGGTCCTGGGCAAAATC

2F GGACACGAGACGCGTTGCA

2R CCAATGGACTGCCCTATCAGA

3F GGTTCCCTTGTGGGTGTTCCA

3R TCCTGGCTCATTGTGTTCAAGA

4F CCAAGAGAGGTCCCAGCAGC

4R CGGAGAACCCGGATGATGT

5F CTGGAAGGCGTGGACCAT

5R GTTGTCGGATTTCAGGTCTCTGT

6F GCCCCTGGCTGGTGATC

6R CAACTGCAGGCCGCATGCT

7F GCCCTGAAGAATCTGAAGTTAGACA

7R GCGGCCGATTGTTGGA

BF TGGGCAACCCTAAGGTGAAG

BR GTGAGCCAGGCCATCACTAAA

S1 TTCCCTCTCGACTTCT

S2 CTTTCGGCTGGAGGAGT

S3 CCTCCAGCGAAGCC

S4 AGCCCCTCACCCC

S5 TTCAACAGGGCATCGC

S6 AGATTTTGGGCGCTGCT

S7 ATGGTTGGCTGGCTC

SB CTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGC


- 70 -

HFE

A pesquisa das duas mutações mais frequentes no gene HFE foi feita em todos os

doentes e no grupo de indivíduos controlo. Foi feito o screening das mutações C282Y e

H63D.

A análise foi realizada por PCR seguido de digestão com enzima de restrição. De

forma breve foram utilizadas reacções de 25 ul com 0,1 ug de DNA, tampão PCR (1,5 mM

MgCl2), 10 mM dNTPs, 25 pmol de cada primer (ver Tabela X) e 0,5 U Taq DNA

polimerase. O programa PCR para a amplificação do fragmento contendo a mutação

C282Y incluiu uma desnaturação a 94ºC durante 10 minutos, 35 ciclos de 94ºC 1 minuto,

62ºC durante 1 minuto, 72ºC 1 minuto, seguidos por 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos. O

programa para amplificação do fragmento contendo a mutação H63D utilizou 30 ciclos

com uma temperatura de annealing de 64ºC, sendo idêntico nas restantes temperaturas e

tempos [259]. O produto PCR da amplificação do fragmento contendo a região da mutação

C282Y foi digerido durante a noite com a enzima SnaBI. O produto desta digestão foi

separado por electroforese num gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e

visualizado sob luz ultra-violeta. A presença da mutação cria um novo local de corte para a

endonuclease, resultando em dois fragmentos: 285 e 111 pares de base, a ausência da

mutação dá origem a apenas um fragmento não digerido com 396 pares de base [260]. Para

a detecção da mutação H63D o produto amplificado com 293 pares de base contendo esta

região foi digerido durante a noite com a endonuclease de restrição MboI. A ausência da

mutação origina 3 fragmentos com 138, 99 e 56 pares de base, enquanto a presença da

mutação abole um local de restrição e origina apenas dois fragmentos com 237 e 56 pares

de base. Os produtos da digestão foram separados por electroforese em gel de agarose a

2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta [259].

Tabela X - Sequências oligonucleotídicas de primers utilizadas para amplificação dos fragmentos contendo as mutações C282Y e H63D.

Mutação Sequência forward 5’-3’ Sequência reverse 5’-3’

C282Y ACATGGTTAAGGCCTGTGTG CTTGCTGTGGTTGTGATTTAGG

H63D TGGCAAGGGTAAACAGAAGG CTCAGGCACTCCTCTCATGG


- 71 -

Sintetase do Monóxido de Azoto (NOS)

O estudo do gene da NOS foi feito na totalidade do grupo de doentes e do grupo de

indivíduos controlo. Foram estudados dois polimorfismos no gene da isoforma neuronal

(nNOS) e um polimorfismo no gene da isoforma indutível (iNOS) pela metodologia de

PCR-RFLP.

No gene da iNOS foi estudada uma transição de uma Guanina para uma Adenina na

posição 37498 no exão 22, originando um polimorfismo sinónimo, ou seja, não se traduz

numa alteração de aminoácido. O DNA genómico foi submetido a amplificação do exão 22

do gene por PCR com as seguintes condições: 10 ng de DNA, tampão PCR (50 mM Tris-

HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 4 mM de cada dNTP, 0,2 uM de cada primer

e 0,5 U Taq DNA polimerase. A reacção de PCR decorreu com os seguintes ciclos de

temperatura: 1 ciclo de 95ºC durante 3 minutos; 35 ciclos de 95ºC 1 minuto, 66ºC 30

segundos, 72ºC 30 segundos; 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos. A confirmação da

amplificação e do tamanho dos fragmentos obtidos foi feita por electroforese em gel de

agarose a 2%, corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta. Após a

confirmação da amplificação, o restante produto PCR foi digerido com a endonuclease de

restrição BtgI a 37ºC durante a noite. Após a digestão foi realizada nova electroforese de

agarose em condições idênticas às descritas anteriormente. A presença do alelo G origina

três fragmentos com 79, 24 e 23 pares de base, enquanto a presença do alelo A origina

apenas dois fragmentos com 103 e 23 pares de base [261].

No gene da nNOS um dos polimorfismos estudados ocorre no exão 29 sendo

caracterizado pela transição de uma Citosina para uma Timina. O DNA genómico foi

sujeito a PCR para amplificação da região contendo o exão 29, com as seguintes

condições: 10 ng de DNA, tampão PCR (50 mM Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM

MgCl2), 10 mM de cada dNTP, 30 uM de cada primer e 1,5 U Taq DNA polimerase. O

programa PCR utilizado decorreu com as seguintes temperaturas: 1 ciclo de 95ºC durante 5

minutos, 30 ciclos de 95ºC 30 segundos, 68ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos; 1 ciclo de

72ºC durante 10 minutos. Foi confirmada a correcta amplificação do fragmento pretendido

por separação das bandas em gel de electroforese a 2%, corado com brometo de etídio e

visualizado sob luz ultra-violeta. Após a amplificação, o restante produto PCR foi digerido

durante a noite a 37ºC com a endonuclease de restrição NlaIII. O produto da digestão foi,


- 72 -

então, separado em gel de electroforese a 2%, sendo o alelo C definido por três fragmentos

com 102, 69 e 16 pares de base, enquanto o alelo T é definido pela presença de quatro

fragmentos com 94, 69, 16 e 8 pares de base. A visualização dos fragmentos foi feita sob

luz ultra-violeta [262].

O outro polimorfismo estudado no gene da nNOS ocorre no exão 18 e é caracterizado

por uma transição de uma Citosina para uma Timina. Para a determinação deste

polimorfismo foi desenhado um par de primers (Tabela XI) para amplificar toda a região

do exão 18. 10 ng de DNA genómico foram sujeitos a amplificação por PCR na presença

de tampão PCR (50 mM Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 2 mM de cada

dNTP, 15 uM de cada primer e 1 U Taq DNA polimerase. A amplificação do fragmento

pretendido foi confirmada por electroforese, de 10 ul do produto PCR, em gel de agarose a

2% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta. O restante produto

PCR foi digerido durante a noite a 37ºC com 0,8U da enzima de restrição DraIII. O

produto desta digestão foi separado por electroforese, sendo o alelo C caracterizado pela

presença de dois fragmentos com 127 e 85 pares de base, enquanto o alelo T é

caracterizado pela presença de apenas um fragmento com 212 pares de base.

Tabela XI - Sequências oligonucleotídicas de primers utilizadas para o estudos das isoformas indutível e neuronal do gene da NOS.

Primer Sequência forward 5’-3’ Sequência reverse 5’-3’

iNOS 22 CTGCTGGCTTCCTGCTTCGG CTCGGGTGTGGTAGGTGTGG

nNOS 29 TTGAGTTTTCCTGCTGCGAACA GCTTGTGCCTAGTTCCTCGT

nNOS 18 AACATTCTGTCATCTCCTACT GAGATCCAGATTACCTTCTT

Glutatião-S-transferase P1 (GSTP1)

No estudo do gene da GSTP1 foram determinados dois polimorfismos, sendo um

deles (Ile105Val) responsável pela alteração da actividade da enzima e da sua

termoestabilidade [263]. O estudo destes polimorfismos foi realizado recorrendo à técnica

de PCR-RFLP.


- 73 -

O polimorfismo Ile105Val, resultado de uma transição de uma Adenina para uma

Guanina na posição 313, foi determinado amplificando a região que contém o exão 5.

Foram utilizados 10 ng de DNA genómico na presença de tampão PCR (50 mM Tris-HCL,

14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 20 mM de cada dNTP, 11 uM de cada primer (ver

Tabela XII) e 0,5 U Taq DNA polimerase. A reacção PCR foi realizada recorrendo aos

seguintes ciclos de temperatura: 1 ciclo de 95ºC 5 minutos; 35 ciclos de 95ºC 30 segundos,

58ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos; 1 ciclo de 72ºC durante 10 minutos. Foram

utilizados 10 ul do produto desta reacção para verificação da correcta amplificação,

utilizando para o efeito uma electroforese em gel de agarose a 2%. Após esta verificação, o

restante produto PCR foi digerido durante a noite a 37ºC com 1U da enzima Alw26I. A

determinação do genótipo foi realizada separando o produto da digestão por electroforese

em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultra-violeta.

A presença do nucleótido Adenina resulta em dois fragmentos com 329 e 104 pares de

base, enquanto a presença de uma Guanina resulta em três fragmentos com 222, 107 e 104

pares de base.

O outro polimorfismo estudado neste gene foi Ala114Val, resultado de uma transição

de uma Citosina para uma Timina na posição 341, tendo sido determinado amplificando a

região do gene que contém o exão 6. Foram utilizados 10 ng de DNA genómico na

presença de tampão PCR (50 mM Tris-HCL, 14 mM (NH4)2SO4, 1,75 mM MgCl2), 20 mM

de cada dNTP, 11 uM de cada primer (ver Tabela XII) e 0,5 U Taq DNA polimerase. A

reacção PCR foi realizada recorrendo aos seguintes ciclos de temperatura: 1 ciclo de 95ºC

5 minutos; 35 ciclos de 95ºC 30 segundos, 62ºC 30 segundos, 72ºC 30 segundos; 1 ciclo de

72ºC durante 10 minutos. Foram utilizados 10 ul do produto desta reacção para verificação

da correcta amplificação, utilizando para o efeito uma electroforese em gel de agarose a

2%. Após esta verificação, o restante produto PCR foi digerido durante a noite a 37ºC com

1U da enzima AciI. A determinação do genótipo foi realizada separando o produto da

digestão por electroforese em gel de agarose a 2%, corado com brometo de etídio e

visualizado sob luz ultra-violeta. A presença do nucleótido C resulta na obtenção de três

fragmentos com 247, 118 e 55 pares de base, enquanto a presença do nucleótido T resulta

em apenas dois fragmentos com 365 e 55 pares de base.


- 74 -

Tabela XII - Sequências oligonucleotídicas de primers utilizadas no estudo do gene do Glutatião S-transferase.

Primer Sequência forward 5’-3’ Sequência reverse 5’-3’

Ile105Val GTAGTTTGCCCAAGGTCTTC AGCCACCTGAGGGGTTTC

Ala114Val GGGAGCAAGCAGAGGAGTTA CAGGTTGTAGTCAGCGAAGCTC

Procedimentos no estudo do Stresse Oxidativo

Colheita e preparação do material biológico

Para avaliação dos parâmetros de stresse oxidativo foi colhida uma amostra de 10 ml

de sangue por punção venosa, para um tubo de polipropileno contendo heparina e outra

amostra de 10 ml de sangue venoso para um tubo com ACD 3,8%.

O sangue colhido com heparina foi submetido a uma centrifugação a 1000 rpm, a 4ºC

durante 15 minutos para obtenção de plasma rico em plaquetas (PRP).

A fracção de eritrócitos (sedimento da centrifugação anterior) foi lavada três vezes

com soro fisiológico (NaCl 0,9%), por centrifugação a 3500 rpm durante 10 minutos a 4ºC.

O concentrado eritrocitário foi dividido em cinco alíquotas para determinação de

vitamina E, malonildialdeído (MDA), glutatião reduzido e oxidado (GSH e GSSG) e

actividades das enzimas glutatião redutase (Glred) e glutatião peroxidase (Glpx), sendo

estas alíquotas posteriormente congeladas a -70ºC.

O PRP, recolhido em tubo de plástico, foi novamente centrifugado a 1000 rpm

durante 10 min à temperatura ambiente para completa remoção de eritrócitos e leucócitos

residuais e, em seguida, centrifugado a 3000 rpm durante 15 minutos, à temperatura

ambiente para evitar agregação plaquetar. O sobrenadante obtido foi aliquotado e

congelado a -70ºC para a determinação das concentrações plasmáticas de ácido úrico,

proteínas, colesterol total, GSH e GSSG, grupos carbonilo, vitaminas A e E e capacidade

antioxidante total (TAS).

Ao sangue colhido com ACD foi feita uma centrifugação a 900 rpm durante 15

minutos à temperatura ambiente. O plasma rico em plaquetas foi recolhido, adicionaram-se

100 µl de ACD 3,8% por ml de plasma e foi feita nova centrifugação a 900 rpm, durante


- 75 -

15 minutos à temperatura ambiente. O PRP foi novamente recolhido e centrifugado a 2500

rpm, durante 15 minutos à temperatura ambiente, após o que uma amostra de 1 ml de

sobrenadante desta última centrifugação foi submetido a filtração por centrifugação a 9000

rpm, durante 1 hora a 4ºC. O filtrado resultante foi congelado a -70ºC e posteriormente

processado.

O precipitado plaquetar foi lavado duas vezes com ACD diluído ½ e ressuspenderam-

se as plaquetas em 2 ml de ACD na mesma diluição com posterior divisão em duas

fracções. Uma destas fracções (1ml) foi subtmetida a estimulação com IL (4 ng/ml) e LPS

(Lipopolissacarídeo; 200 µg/ml). De cada uma das suspensões plaquetares (com e sem

estimulação) foram separados 500 µl para determinação dos níveis de nitratos e nitritos, e

congelados a -70ºC para posterior processamento.

Determinação dos níveis de antioxidantes não enzimáticos

Ácido úrico plasmático

O método enzimático colorimétrico utilizado para a quantificação do ácido úrico no

plasma é comercializado pela Randox e baseia-se na redução do ácido úrico a alantoína por

acção da enzima uricase, com libertação de peróxido de hidrogénio. A quantidade de H2O2

formada, proporcional ao teor em ácido úrico, é então avaliada espectrofotometricamente

pela formação de um composto corado.

Assim, adicionou-se a 10 µl de plasma 1 ml de tampão fosfato contendo ácido

dimetil-amino-benzóico (DMAB) 1 mM, peroxidase ≥1000 U/ml, uricase ≥40 U/ml, 4-

aminoantipirina 0,05 mM e azida de sódio 0,1 g/L como conservante. Após

homogeneização e incubação durante 5 minutos à temperatura ambiente procedeu-se à

leitura da absorvância a 550 nm, usando como branco o próprio reagente, num

espectrofotómetro Shimadzu UV-120-02. Simultaneamente foi determinada a absorvância

de um padrão comercial, contendo uma concentração conhecida de ácido úrico, fornecido

com o kit, o que permitiu calcular a concentração de ácido úrico das amostras, bem como a

do controlo ensaiado em simultâneo.


- 76 -

Colesterol total

O colesterol total plasmático foi quantificado por um método colorimétrico

enzimático utilizando o kit comercializado pela Randox sob a designação de “Cholesterol

– enzymatic colorimetric test CHOD-PAP”.

Realizaram-se os ensaios padrão, controlo, branco e amostra, pipetando para os

respectivos tubos 10 µl de solução padrão, controlo, H2O e plasma. Adicionou-se 1 ml do

tampão que contém colesterol esterase 0,16 U/ml, colesterol oxidase 0,11 U/ml, peroxidase

5,5 U/ml, fenol 25 mM e 4-amino antitripirina 0,25 mM. Homogeneizou-se e incubou-se

durante 10 minutos à temperatura ambiente.

O colesterol e os ésteres de colesterol são libertados das lipoproteínas e, por acção da

colesterol esterase são hidrolisados. As colesterol oxidase e peroxidase contidas no

reagente vão originar a formação de peróxido de hidrogénio e do subsequente composto

corado cuja absorvância é mensurável ao comprimento de onda de 505 nm. A leitura foi

realizada num espectrofotómetro Shimadzu UV-120-02 e foi calculada a concentração

plasmática de colesterol das amostras e do controlo.

Glutatião reduzido (GSH) e oxidado (GSSG)

Para a determinação dos níveis plasmáticos e eritrocitários de GSH e GSSG, foi

utilizado um método fluorimétrico que usa o o-ftladeído (OPT) como reagente fluorescente

e a N-etilmaleimida (NEM) como bloqueador da forma reduzida do glutatião, impedindo a

sua participação no ensaio enzimático [264, 265].

Assim, para a determinação de GSH, juntaram-se num tubo de ensaio 100 µl do

sobrenadante anteriormente obtido / padrão, 1,8 ml de tampão e 100 µl de OPT 1 mg/ml.

Incubaram-se as soluções à temperatura ambiente durante 15 minutos.

Para a determinação de GSSG, num tubo de ensaio juntaram-se 500 µl de

sobrenadante e 200 µl de NEM 0,04M e incubaram-se as soluções à temperatura ambiente

durante 30 minutos. No final deste tempo retiraram-se 140 µl da solução anterior/padrão e

juntaram-se 1,76 ml de hidróxido de sódio 0,1 M e 100 µl de OPT.


- 77 -

A fluorescência foi medida ao comprimento de onda de 420 nm sob excitação a 350

nm, durante 5 segundos.

A incubação da GSH/GSSG com NEM (potente inibidor da glutatião redutase)

impede a formação do fluoróforo após a adição do OPT. A determinação de GSH é

efectuada a pH inferior a 8 (tampão fosfato-EDTA). Acima de pH 10 a GSH é

parcialmente oxidada, sendo a determinação de GSSG efectuada a pH 12. Aqui o valor de

pH não é tão crítico, não devendo contudo baixar de 10.

O glutatião reage especificamente com o OPT (outros aminoácidos reagem muito

pouco sob estas condições), a pH=8, formando um produto altamente fluorescente que

activado a 350 nm emite um pico a 420 nm.

A intensidade de fluorescência do produto OPT-GSH ou OPT-GSSG é directamente

proporcional às concentrações de GSH ou GSSG, sendo a correlação linear para valores

entre 10 ng - 2 µg e 5 ng – 2 µg, respectivamente.

Vitaminas A e E plasmáticas

O doseamento destas duas vitaminas foi realizado por HPLC em fase reversa pelo

método descrito por Milne em 1986 e modificado por Zaman em 1993 [266-268].

O primeiro passo desta determinação consiste na desproteinização e extração da

fracção lipídica da amostra. Para isso misturaram-se 200 µl de plasma com 200 µl de

solução I (etanol/n-hexano contendo 1,2 mg/L de δ-tocoferol como padrão interno)

fornecida pela BioRad no kit “Vitamin A/E by HPLC”. Homogeneizou-se durante um

minuto no vortex.

Para se efectuar a separação de fases foram adicionados 200 µl da solução II (sulfato

de amónio 100 mM em metanol). Após agitação durante 1 minuto em vortex, centrifugou-

se a 5000 rpm durante 3 minutos. O sobrenadante límpido foi recolhido e utilizado no

processo cromatográfico. Assim, foram injectados 20 µl de amostra no sistema HPLC

equipado com coluna analítica Spherisorb ODS 1-5 µm, 250 x 4,6 mm e detector

UV/Visível. A separação cromatográfica ocorre em sistema isocrático a 45ºC por eluição

com solução aquosa de metanol a 90%, ao fluxo de 2,5 ml/min.


- 78 -

A detecção espectrofotométrica da vitamina A foi feita ao comprimento de onda de

340 nm e, decorridos 3 minutos, o selector de comprimentos de onda foi comutado para

295 nm, sendo então detectado o padrão interno e a vitamina E.

A quantificação pode então ser efectuada por avaliação da altura dos picos e a

padronização feita com soluções contendo retinol e α-tocoferol, sendo as concentrações

plasmáticas de vitamina A e E expressas em µg/dl e µM, respectivamente.

Vitamina E eritrocitária

A fracção lipídica contendo vitamina E foi obtida pelo método descrito por Burton

em 1985 [269]. A 500 µl de suspensão de eritrócitos, com concentração de hemoglobina

previamente aferida a cerca de 100 g/L, foram adicionados 1,5 ml de dodecil sulfato de

sódio (SDS) 10 mM e 2 ml de etanol absoluto. A mistura foi homogeneizada no vortex

durante 1 minuto e novamente durante mais 3 minutos após a adição de 2 ml de n-hexano.

O extracto foi então centrifugado a 2000 rpm durante 5 minutos e 1 ml da fase superior (n-

hexano) foi removido, evaporado à secura sob corrente de azoto e armazenado a -70ºC

sempre que o processamento não tenha sido imediato.

Este extracto lipídico foi retomado com 250 ml de n-hexano imediatamente antes de

ser analisado por HPLC em fase reversa. Foram injectados 20 µl de amostra, tendo o

processo ocorrido em coluna Spherisorb S10 w (250 x 4,6 mm) eluída com n-hexano

modificado com 0,9% de metanol a fluxo constante de 1,5 ml/minuto. A detecção

espectrofotométrica ocorreu na gama dos ultravioletas a 287 nm.

A quantificação baseou-se na comparação das alturas dos picos da amostra e dos

padrões obtidos com soluções de α-tocoferol em n-hexano. Os níveis de vitamina E foram

expressos em µmol/L e nmol/g hemoglobina.

Capacidade antioxidante total do plasma (TAS)

Para a avaliação da capacidade antioxidante do plasma foi utilizado um kit (Total

Antioxidant Status) comercializado pela Randox. A metodologia baseia-se na capacidade

plasmática de inibição da formação do catião radical ABTS+ (2,2’-azino-di[3-

etilbenzotiazolina sulfonato]) de cor azul-esverdeada, cuja absorvância é mensurável a 600


- 79 -

nm. Na presença de antioxidantes plasmáticos, a absorvância diminui proporcionalmente

com a capacidade antioxidante do fluido.

Foram adicionados 20 µl de plasma a 1 ml de tampão fosfato 80 mM, pH 7,4,

contendo metamioglobina 6,1 µM e ABTS 610 µM. Homogeneizou-se e mediu-se a

absorvância inicial (Ai) a 600 nm num espectrofotómetro UVIKON 933-UV/Vis (Kontron

Instruments), termostatizado. Adicionaram-se de seguida 200 µl de substracto constituído

por H2O2 100 µM em tampão fosfato 48 mM, pH 7,4 e, após homogeneização,

monitorizou-se a variação da absorvância ocorrida a 37ºC durante 3 minutos.

Designando por Af o valor da densidade óptica ao minuto 3, a variação de

absorvância da amostra naquele período de tempo será ∆A=Af-Ai.

Foi efectuado um ensaio branco, substituindo o plasma por água ultra-pura, obtendo-

se um valor de ∆Abranco. O valor real de absorvância da amostra resulta da subtracção da

∆Abranco à ∆Aplasma.

Como padrão foi utilizada uma solução de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-

tetrametilcroman-2-carboxílixco) e os resultados expressos em unidades de actividade

TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity), convertidas em mmol de substâncias

antioxidantes/L, uma vez que uma unidade TEAC se define como a concentração de

Trolox com capacidade antioxidante equivalente a 0,1 mmol/L da substância solubilizada

sob investigação.

Determinação dos níveis de antioxidantes enzimáticos Peroxidase do Glutatião (GlPx)

A actividade enzimática da GlPx eritrocitária foi medida espectrofotometricamente

de acordo com o método descrito por Wendel [270].

Este método utiliza o tert-butilhidroperóxido como substracto, sendo a formação de

glutatião oxidado monitorizada por quantificação da oxidação do NADPH a NADP+ a 340

nm.

O concentrado eritrocitário (0,5 ml) foi hemolisado com 9,5 ml de água ultra-pura e

diluído na proporção 2:1 com uma solução contendo cianeto de potássio 4,5 mM,

ferrocianeto de potássio 0,45mM e dihidrogenofosfato de potássio 0,25 M.


- 80 -

Num banho a 37ºC foram misturados 100 µl do hemolisado (0,33 mg de proteína)

com 800 µl de mistura reaccional contendo fosfato de potássio 100 mM (pH=7,0), EDTA

0,1 mM, GSH 1 mM, 0,24 U de glutatião redutase e NADPH 0,25 mM em

hidrogenocarbonato de sódio 0,1%. A reacção foi iniciada por adição de tert-

butilhidroperóxido 1,2 mM e a variação de absorvância registada durante 5 minutos num

espectrofotómetro UVIKON 933-UV/Vis (Kontron Instruments), termostatizado.

A actividade enzimática da GlPx foi expressa em unidades internacionais de enzima

por grama de hemoglobina (U/g Hb).

Redutase do Glutatião (Glred)

A actividade enzimática da Glred eritrocitária foi medida espectrofotometricamente

de acordo com o método descrito por Goldberg [271].

O concentrado eritrocitário (0,5 ml; Hb aferida a 100 g/L) foi hemolisado com 500 µl

de água ultra-pura. Foram diluídos 100 µl deste hemolisado com 900 µl de soro fisiológico.

Num tubo juntaram-se 2,6 ml de tampão fosfato 0,12M; pH=7,2; 0,1 ml de EDTA 15

mM; 0,1 ml de GSSG 65,3 mM e 0,1 ml de plasma ou de água destilada (ensaio/branco).

Fez-se uma incubação a 37ºC durante 5 minutos, adicionando-se, no final da incubação, 50

µl de NADPH 9,6 mM. A oxidação do NADPH foi medida durante 2 minutos, a 37ºC,

num espectrofotómetro UVIKON 933-UV/Vis, termostatizado (Kontron Instruments) pela

variação da absorvância ao comprimento de onda de 340 nm.

Marcadores de oxidação Lipídica Malonildialdeído (MDA)

O doseamento plasmático e eritrocitário do malonildialdeído foi feito por um método

espectrofotométrico [272-275], que tem como fundamento o facto de que da hidrólise dos

lipoperóxidos a 100ºC com ácido fosfórico resulta a libertação de malonildialdeído

(MDA), que na presença de ácido tiobarbitúrico (TBA) origina complexos MDA-TBA de

cor amarela.


- 81 -

Assim, juntaram-se 250 µl de plasma ou suspensão eritrocitária, 250 µl de H2O, 500

µl de TBA 42 mM e 250 µl de ácido fosfórico 0,44 M. Após 1 hora em banho fervente

procedeu-se à precipitação das proteínas por adição a 500 µl da suspensão anterior, 500 µl

de metanol/NaOH 1 M (10:1). Agitou-se no vortex, centrifugou-se a 3000 rpm durante 10

minutos e, em seguida, injectaram-se 20 µl do sobrenadante em sistema isocrático HPLC

(Gilson), fluxo 1 ml/min, equipado com uma coluna analítica Spherisorb 5 µm ODS2

(4,6x250 mm), detector UV-Vis e injector automático de amostras. A fase móvel usada,

mistura de 400 ml de metanol com 600 ml de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH= 6,8,

foi previamente desgaseificada e filtrada sob vácuo através de uma membrana

Schleicher&Schuell NC-20, Ø 47 mm e dimensão de poro = 0,2 µm.

A quantificação do MDA foi feita por extrapolação da área do pico numa curva de

calibração traçada com padrões de 1,1,3,3-tetraetoxipropano (TEP) de concentrações entre

0,5 e 10 µM, sujeitos a tratamento idêntico ao das amostras.

Marcadores de oxidação Proteica

Grupos carbonilo

O doseamento dos grupos carbonilo proteicos em amostras de plasma foi feito

através de um método espectrofotométrico [276].

Foram adicionados 200 µl de plasma a dois tubos de polipropileno. Num dos tubos

juntou-se 1 ml de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) 10 mM (ensaio) e, no outro tubo, foi

adicionado 1 ml de ácido clorídrico (HCL) 2M (ensaio branco). As misturas foram

incubadas durante 90 minutos a 37ºC. Após esta incubação procedeu-se ao arrefecimento

das soluções.

Com as soluções já à temperatura ambiente foi adicionado 1 ml de ácido

tricloroacético (TCA) 28%. Após esta adição homogeneizaram-se as soluções e

centrifugaram-se 10 minutos a 3000 rpm. Após a centrifugação, o sobrenadante foi

rejeitado e ressuspendeu-se o precipitado em 1 ml de etanol/acetato de etilo (1:1) e agitou-

se a mistura. Realizou-se uma nova centrifugação durante 10 minutos a 3000 rpm,

rejeitando-se o sobrenadante no final da mesma. Repetiu-se o processo de lavagem e

ressuspendeu-se o precipitado em 1,5 ml de guanidina-HCL 6M. Agitou-se o tubo e


- 82 -

procedeu-se a nova centrifugação nas mesmas condições da atrás descrita. Transferiu-se o

sobrenadante do branco para uma cuvete e realizou-se a leitura espectrofotométrica num

espectrofotómetro UVIKON 933-UV/Vis, termostatizado (Kontron Instruments) a 360 nm.

Procedeu-se da mesma forma para o ensaio respectivo.

Metabolitos do monóxido de azoto

A concentração de nitratos e nitritos presentes nas amostras em estudo foram

determinadas através de um procedimento que envolve duas fases (Reacção de Griess para

determinação de nitratos e nitritos). Os nitratos são primeiro convertidos enzimaticamente

a nitritos (usando a redutase do nitrato dependente de NADPH), seguindo-se então a

medição dos nitritos totais por uma reacção estequiométrica com um reagente de Griess

que dá origem a um azo-produto corado. A concentração original de nitritos pode ser

determinada separadamente numa amostra que não tenha sido submetida à conversão dos

nitratos, permitindo assim a quantificação dos nitratos por subtracção.

Uma modificação deste método inclui a inclusão de um sistema regenerador de

NADPH glicose-6-fosfato/glicose-6-fosfatase desidrogenase, para prevenir a possível

interferência de elevadas concentrações de NADP+ no desenvolvimento de cor pela

reacção de Griess.

Assim, para a determinação dos nitritos, pipetaram-se 100 µl de amostra (plasma

filtrado/plaquetas previamente sonicadas), padrões (nitrito de sódio 0,5; 1; 5; 10 e 25 µM)

ou branco (água), em duplicado para uma microplaca de 96 poços.

Adicionaram-se 40 µl de tampão de conversão (sem redutase do nitrato), 10 µl de

NADPH, 100 µl de reagente de Griess e foi feita uma incubação durante 15 minutos à

temperatura ambiente. A leitura da absorvância foi feita a 450 nm (filtro de referência a

620 nm) e a concentração de nitritos foi determinada por extrapolação da curva de

calibração.

Para a determinação dos nitritos + nitratos pipetaram-se 100 µl de amostra (plasma

filtrado/plaquetas previamente sonicadas), padrões (nitrito de sódio 0,5; 1; 5; 10 e 25 µM)

ou branco (água), em duplicado para uma microplaca de 96 poços.


- 83 -

Adicionaram-se 40 µl de tampão de conversão (com nitrato redutase) e 10 µl de

NADPH. Agitou-se a placa e incubou-se 1 hora à temperatura ambiente para ocorrer a

conversão de nitratos em nitritos.

Juntaram-se 100 µl de reagente de Griess e foi feita uma incubação durante 15

minutos à temperatura ambiente. A leitura da absorvância foi feita a 450 nm (filtro de

referência a 620 nm) e a concentração de nitritos + nitratos foi determinada por

extrapolação da curva de calibração.

A concentração de nitratos foi determinada por subtracção da concentração de nitritos

medida na ausência de enzima à concentração de nitritos + nitratos totais determinada.

Os resultados foram representados em função da concentração de proteína presente

nas amostras e do número de plaquetas.

Determinação da concentração de proteínas totais

A determinação da concentração de proteínas totais foi realizada segundo o método

do biureto (Randox Laboratories). Neste método os iões cobre, presentes no meio alcalino,

reagem com as ligações peptídicas resultando na formação de um complexo corado. A 50

ul de soro são adicionados 2,5 ml de reagente de biureto, a mistura é homogeneizada no

vórtex e deixada a incubar à temperaura ambiente durante 30 minutos. De seguida

procedeu-se à leitura da densidade óptica num espectrofotómetro Shimadzu UV-120-02,

comparando os valores com um padrão fornecido no kit. Os resultados são expressos em

g/l.

Quantificação de hemoglobina na suspensão de eritrócitos

A 20 ul da suspensão de eritrócitos, foram adicionados 5 ml de reagaente de Drabkins

(Sigma Diagnostics). Após agitação no vórtex e dez minutos de incubação à temepratura

ambiente, procedeu-se à leitura da densidade óptica num espectrofotómetro Shimadzu UV-

120-02. Por comparação com um padrão de hemoglobina 100 g/l (Sigma) calculou-se a

concentração de hemoglobina na amostra, sendo os resultados expressos em g/l.


- 84 -

Análise Estatística

Para a caracterização da amostra são utilizadas as medidas de tendência central e

dispersão e os resultados expressos como média e desvio padrão dos valores determinados

para cada parâmetro analisado.

As comparações de médias registadas nos diversos parâmetros analisados foram

efectuadas através do teste de t de Student.

A comparação da frequência dos genótipos estudados nos diferentes grupos foi

realizada recorrendo ao teste de Chi quadrado.

A análise estatística foi processada com Statistical Package for the Social Sciences

(SPSS) versão 10.0 Windows.


- 85 -

Resultados


O estudo dos mecanismos genéticos tem dois objectivos finais, por um lado realizar

análises de associação entre a amostra total de doentes e a amostra total de controlos, por

outro lado procurar alterações em genes previamente associados à doença de Parkinson

num grupo de doentes com início precoce da doença ou história familiar positiva.

Na análise das características clínicas dos grupos em estudo, verifica-se que o grupo

de indivíduos com forma esporádica da doença apresenta uma maior prevalência de

demência (13%) do que os indivíduos com história familiar positiva para D.P. (7,1%). Por

outro lado, no que diz respeito à presença de distonia, verifica-se que os indivíduos com

história familiar positiva apresentam uma prevalência superior (39,3%) àquela apresentada

pelo grupo com forma esporádica da doença (19%). Quanto às idades dos indivíduos

pertencentes a estes grupos verifica-se que o grupo de indivíduos com forma familiar da

doença apresenta uma média de idades de 65 ± 7,8 anos enquanto o grupo com forma

esporádica da doença apresenta uma média de 67,1 ± 11 anos de idade, não sendo esta

diferença entre grupos estatisticamente significativa (p=0,609). Também no que concerne

às idades de início nestes dois grupos não foi encontrada qualquer diferença significativa

(54 ± 10 vs 57,7 ± 13) (p=0,222).

O subgrupo de indivíduos sobre o qual recaiu o estudo de genes associados à D.P.

apresenta características clínicas semelhantes às já descritas para a totalidade dos doentes.

A idade média neste subgrupo é de 59,5 ± 10 anos enquanto a idade de início é de 43,5 ±

10,1 anos de idade.

No que diz respeito às idades dos indivíduos com doença e os indivíduos

pertencentes ao grupo controlo, verifica-se que os primeiros apresentam uma idade média

de 66,9 ± 10,4 anos de idade enquanto os segundos apresentam uma idade média de 67,9 ±

14,4, não sendo esta diferença estatisticamente significativa (p=0,549).

Quanto ao sexo dos indivíduos em estudo, verifica-se que no grupo dos doentes há

47,7% de indivíduos do sexo masculino e 52,3% de indivíduos do sexo feminino. Já no

grupo de indivíduos controlo a diferença é um pouco maior, existindo 31,7% de indivíduos

do sexo masculino e 68,3% de indivíduos do sexo feminino.


- 86 -

Alfa-sinucleína

No estudo deste gene não foram encontradas quaisquer alterações. Foi feita a

pesquisa das três mutações pontuais previamente descritas, foi feita uma pesquisa em todo

o gene para novas mutações pontuais e foi feita a pesquisa de alteração do número de

cópias dos diferentes exões e de todo o gene. Todas estas análises se revelaram negativas.

Parkina

Foi encontrada uma mutação pontual no exão dois do gene num indivíduo com

história familiar positiva para a doença de Parkinson. Esta mutação (256delA), uma

delecção de um par de bases encontrada em estado de homozigotia no indivíduo em

estudo, é uma mutação frameshift e acaba por introduzir um novo codão stop no início

deste exão a cerca de 30 pares de bases da posição da mutação.

Um dos progenitores deste indivíduo, falecido com neoplasia gástrica aos 60 anos de

idade, apresentava D.P. diagnosticada há vários anos, no entanto, não foi colhida amostra

para estudo genético. A representação da família encontra-se na Figura 7.

Figura 7 - Representação da família onde foi encontrada a mutação 256delA


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O indivíduo I-2, embora nunca tendo sido avaliado pela equipa de especialistas do

serviço, apresenta uma história de tremor essencial tendo falecido aos 80 anos de idade. O

indivíduo I-1 não tem história de doença de Parkinson ou de qualquer forma de

parkinsonismo. O indivíduo II-1 não apresentou qualquer forma de parkinsonismo até à

data em que lhe foi administrado um antidepressivo, altura em que desenvolveu um grave

discinésia oro-mandibular. Tanto o indivíduo II-3 como o indivíduo III-1 não apresentam

história de alteração neurológica ou qualquer forma de parkinsonismo. O indivíduo IV-1

apresenta uma forma de distonia cervical desde os 14 anos, enquanto o indivíduo IV-2 não

apresenta qualquer tipo de fenótipo da doença.

A Figura 8 apresenta a sequência de uma pequena parte do exão 2 do gene da parkina

do indivíduo III-2 e de outros dois indivíduos controlo. É evidente a delecção de uma

adenina na forma homozigótica. Para confirmação de que esta mutação se encontra, de

facto, na forma homozigótica ao invés de se encontrar em apenas um dos alelos, tendo o

outro sofrido uma delecção exónica, o que daria origem a um cromatograma idêntico, foi

feito um ensaio de dosagem génica a este exão neste doente. Não foi encontrada qualquer

delecção exónica o que confirma que a mutação existe neste doente na forma

homozigótica.

Figura 8 - Cromatogramas da sequência de parte do exão 2 do gene da parkina. O segundo cromotograma refere-se ao indivíduo III-2.


- 88 -

Para um estudo mais aprofundado desta mutação nesta família, foram estudados do

ponto de vista genético cinco indivíduos: II-1, II-3, III-1, IV-1 e IV-2. Com a excepção do

indivíduo III-1, todos os outros quatro indivíduos possuem esta mutação na forma

heterozigótica. A Figura 9 representa o cromatograma dos indivíduos III-3 e IV-1, sendo

idêntico para os indivíduos II-1 e IV-2, em comparação com um indivíduo sem a mutação.

Verifica-se que existindo uma delecção na forma heterozigótica a sequência de um dos

alelos “recua” uma posição, enquanto a sequência do outro alelo se mantém idêntica, o que

origina a duplicação dos picos apresentada.

Figura 9 - Cromatogramas da sequência de parte do exão 2 do gene da parkina. O primeiro cromatograma refere-se ao indivíduo III-3, o segundo ao indivíduo IV-1, os últimos dois referem-se a indivíduos com sequência sem alteração.

Como forma de confirmar estes resultados, foi desenvolvido um ensaio de screening

rápido por PCR-RFLP, utilizando os primers descritos na secção de Materiais e Métodos e

a enzima de restrição BstF5I. A presença de mutação origina dois fragmentos com 273 e

29 pares de base, enquanto a ausência de mutação origina apenas um fragmento com 302

pares de base. A Figura 10 representa o resultado da electroforese desta análise,

confirmando os resultados previamente obtidos.


- 89 -

Figura 10 - Resultado de electroforese em agarose do produto da digestão do exão 2 na família em estudo com enzima BstF5I. Coluna 1: marcador de peso molecular, coluna 2: indivíduo II-1, coluna 3: indivíduo II-3, coluna 4: indivíduo III-1, coluna 5: indivíduo IV-1, coluna 6: indivíduos IV-2, coluna 7: indivíduos III-2, coluna 8: marcador de peso molecular.

Ainda no estudo do gene da parkina foi encontrada outra mutação caracterizada pela

transição de uma guanina para uma adenina no exão 11, o que origina a transição de um

aspartato para uma asparagina na posição 394 da sequência de aminoácidos. Esta mutação

foi encontrada em heterozigotia como representado na Figura 11.

Figura 11 - Cromatograma da sequência de parte do exão 11 do gene da parkina. O segundo cromatograma apresenta uma mutação heterozigótica com a transição de uma guanina para uma adenina.

200 pb 300 pb

1 2 3 4 5 6 7 8


- 90 -

O indivíduo com 57 anos apresenta doença de Parkinson desde os 45 anos de idade.

Foi considerado pela equipa médica como uma forma familiar, embora o indivíduo

afectado, um dos progenitores, nunca tenha sido observado por esta equipa de

especialistas, mas tenha uma história consistente de tremor. O indivíduo em estudo tem

uma forma de apresentação da doença tremórica, sem qualquer deterioração cognitiva ou

qualquer forma de distonia. A Figura 12 representa a família deste indivíduo.

Figura 12 - Representação da família onde foi encontrada a mutação Asp394Asn.

O indivíduo I-2 faleceu nos seus 80 anos, vítima de uma acidente vascular cerebral,

tal como o indivíduo I-1. O indivíduo II-1 faleceu aos 67 anos de idade também vítima de

um acidente vascular cerebral sem que tenha apresentado qualquer forma de fenótipo

relacionado com parkinsonismo. Os restantes indivíduos desta família não apresentam

qualquer forma de alteração neurológica ou sinal de parkinsonismo. O indivíduo em estudo

(II-4) tem dois descendentes com 29 e 35 anos, ambos saudáveis.

Ainda no exão 11 do gene da parkina foi encontrada outra mutação pontual noutro

indivíduo. Neste caso foi encontrada uma transição de um glutamato para um codão stop.

Esta mutação foi encontrada na forma de homozigotia, como pode ser visualizado na

Figura 13.


- 91 -

Figura 13 - Cromatograma da sequência de parte do exão 11 do gene da parkina. O segundo cromatograma apresenta uma mutação homozigótica com a transição de uma guanina para uma timina.

Este indivíduo com 68 anos de idade apresenta doença de Parkinson desde os 53

anos, com uma forma tremórica e sem deterioração cognitiva. Trata-se de um

parkinsonismo com 15 anos de evolução, lentamente progressivo. Apresenta flutuações

motoras (on-off) com off matinal. A família apresenta outros dois indivíduos com doença

de Parkinson, mas, por serem emigrantes em França, não foi possível colher amostra para

realizar estudo genético. A representação da família encontra-se na Figura 14.

Figura 14 - Representação da família onde foi encontrada a mutação Glu395Stop.

Ainda no gene da parkina foi encontrada uma duplicação heterozigótica do exão 8

por análise de dosagem génica com PCR em Tempo-Real. Este indivíduo com 42 anos de

idade não apresenta qualquer história familiar positiva para doença de Parkinson e teve o


- 92 -

início da doença aos 33 anos. Não apresenta distonia, tremor essencial ou qualquer forma

de demência.

PINK1

No estudo do gene PINK1 foi encontrado apenas um indivíduo apresentando mutação

pontual. Este, com 41 anos de idade, apresenta uma forma esporádica da doença sem

distonia, tremor essencial ou demência, tendo no entanto, uma idade de início muito baixa

de 20 anos de idade.

Neste indivíduo foram encontradas duas mutações pontuais, sendo por isso um

heterozigótico composto. As mutações encontradas foram Gly193Val e Met220Ile, ambas

no exão 1 e ilustradas nas Figuras 15 e 16.

Figura 15 - Cromatograma da sequência de parte do exão 1 do gene PINK1. O segundo cromatograma apresenta uma mutação heterozigótica com a transição de uma guanina para uma timina.

Embora se tenham encontrado as duas mutações, é necessário determinar se estas se

encontram em cis ou em trans, ou seja, se se encontram no mesmo alelo ou em alelos

diferentes, tendo cada uma das possibilidades consequências distintas quer a nível de

fenótipo quer a nível de mecanismos moleculares responsáveis pelo início da doença. Após

determinação por PCR-RFLP, verificou-se que as mutações se encontram em alelos

diferentes e, portanto, em trans.


- 93 -

Figura 16 - Cromatograma da sequência de parte do exão 1 do gene PINK1. O segundo cromatograma apresenta uma mutação heterozigótica com a transição de uma guanina para uma timina.

Na análise de dosagem génica deste gene foi encontrada uma delecção heterozigótica

do exão 1 num indivíduo com 60 anos e 47 anos de idade de início. Este indivíduo

apresenta história familiar positiva para doença de Parkinson como demonstrado na Figura

17, não apresentado demência nem tremor essencial, mas com uma distonia muito dolorosa

não suportando doses elevadas de agonista dopaminérgico por desenvolver fortes

discinésias.

Figura 17 - Representação da família onde foi encontrada uma delecção heterozigótica do exão 1 do gene PINK1.


- 94 -

Ainda na análise deste gene foi encontrada uma delecção de todo o exão 2 noutro

indivíduo. Este doente com 56 anos e com idade de início aos 50 anos apresenta uma

história familiar positiva para doença de Parkinson. Não apresenta tremor essencial nem

qualquer forma de demência, mas apresenta desde muito cedo distonia.

Noutro indivíduo foram encontradas delecções dos exões 1 e 2 do mesmo gene.

Neste indivíduo, que também apresenta história familiar positiva para doença de

Parkinson, a idade de início é de 54 anos tendo na altura da colheita 68 anos de idade. Não

apresenta demência, distonia ou tremor essencial.

Desta forma, foram encontradas alterações genéticas responsáveis por 8 casos de

doença de Parkinson, o que origina um total de 6,25% dos casos estudados, a serem

devidos, pelo menos em grande parte, a uma componente genética. No que diz respeito a

formas familiares, foram encontradas 6 mutações neste grupo de indivíduos o que origina

21,4% dos casos familiares estudados a apresentarem uma componente genética.

No que diz respeito ao estudo de associação entre doentes e indivíduos controlo,

foram feitas subdivisões do grupo de doentes. Determinaram-se dois subgrupos de doentes:

um deles incluindo todos os indivíduos com forma esporádica da doença de Parkinson e

outro incluindo apenas os indivíduos com forma esporádica e com idade de início superior

a 55 anos de idade. Este último grupo, embora tenha um número de indivíduos claramente

inferior ao desejável, pretende simular um grupo de doentes de Parkinson idiopáticos, com

a idade de início mais frequente e características mais comuns.

Quanto aos resultados obtidos para o polimorfismo no exão 29 do gene da nNOS,

estes estão apresentados na Tabela XIII.

Na análise da totalidade da amostra de indivíduos com D.P. não foi encontrada

nenhuma diferença estatisticamente significativa para estes polimorfismos, quer a nível de

genótipo quer a nível de frequência alélica. No entanto, a totalidade de indivíduos contém

tanto indivíduos com forma esporádica da doença, como com forma familiar, pelo que é

possível que os indivíduos com formas familiares da doença tenham a causa do

desenvolvimento da sua doença noutro tipo de alteração génica. Assim, sendo o grupo de


- 95 -

indivíduos em estudo foi dividido em doentes com forma esporádica e posteriormente em

indivíduos com forma esporádica e idade de início da doença superior a 55 anos de idade.

Tabela XIII - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo estudado no exão 29 do gene da nNOS.

Genótipo Frequência alélica Grupo

CC CT TT p C T p

Total

Doentes (n=132) 50 (0,38) 68 (0,52) 14 (0,11) 0,359 0,64 0,36 0,8088

Esporádicos Doentes (n=94) 32 (0,34) 56 (0,60) 6 (0,06) 0,0302 0,64 0,36 0,6921

Esp. >55 I. I. Doentes (n=54) 15 (0,28) 38 (0,70) 1 (0,02) 0,0016 0,63 0,37 0,9484

Controlos (n=123) 50 (0,41) 54 (0,44) 19 (0,15) 0,63 0,37

São representados os valores absolutos e as percentagens obtidas para os genótipos estudados, as frequências alélicas correspondentes a estes polimorfismos e o respectivo valor de significância estatística. p<0,05 é considerado estatisticamente significativo. Esp. – Esporádicos; I.I. – Idade de Início

A Tabela XIV apresenta os resultados obtidos no estudo do polimorfismo no exão 18

do gene da nNOS. Aqui não foram encontradas diferenças significativas em nenhum dos

grupos estudados, sendo que, a diferença mais significativa surgiu na análise da totalidade

da amostra, como demonstrado pelo valor de significância (p=0,0773). Da mesma forma,

não foram encontradas diferenças significativas, no que diz respeito à distribuição alélica

deste polimorfismo nos grupos estudados, quando comparados com o grupo de indivíduos

controlo.


- 96 -

Tabela XIV - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo estudado no exão 18 do gene da nNOS.


CC CT TT p C T p

Total

Doentes (n=132) 54 (0,4) 64 (0,48) 16 (0,12) 0,0773 0,64 0,36 0,1671

Esporádicos

Doentes (n=94) 41 (0,44) 45 (0,48) 8 (0,09) 0,1104 0,68 0,32 0,4390

Esp. >55 I. I.

Doentes (n=54) 23 (0,43) 27 (0,50) 4 (0,07) 0,1192 0,68 0,32 0,6625

Controlos (n=123) 65 (0,53) 42 (0,34) 16 (0,13) 0,70 0,30


A Tabela XV apresenta os resultados obtidos para o polimorfismo estudado no exão

22 do gene da isoforma indutível do gene da NOS. Não foram encontradas diferenças

estatisticamente significativas de genótipos entre nenhum dos grupos de doentes e o grupo

de indivíduos controlo. De igual forma, as distrinuições alélicas entre estes grupos também

não apresentaram qualquer diferença significativa.


- 97 -

Tabela XV - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo estudado no exão 22 do gene da iNOS.


AA AG GG p A G p

Total

Doentes (n=132) 20 (0,15) 67 (0,49) 49 (0,36) 0,3309 0,39 0,61 0,6697

Esporádicos

Doentes (n=94) 15 (0,16) 47 (0,50) 32 (0,34) 0,2450 0,41 0,59 0,3536

Esp. >55 I. I.

Doentes (n=54) 9 (0,17) 30 (0,56) 15 (0,28) 0,0892 0,44 0,56 0,1627

Controlos (n=123) 21 (0,17) 48 (0,39) 54 (0,44) 0,37 0,63


As Figuras 18 e 19 representam os resultados da electroforese após digestão com

enzima de restrição dos polimorfismos estudados no exão 29 do gene da nNOS e no exão

22 do gene da iNOS.

Figura 18 - Electroforese do produto de digestão do exão 29. Coluna 1: marcador de peso molecular; coluna 2: heterozigótico; coluna 3: heterozigótico; coluna 4: homozigótico T; coluna 5: homozigótico C; coluna 6 heterozigótico.

1 2 3 4 5 6


- 98 -

Figura 19 - Electroforese do produto de digestão do exão 22 do gene da iNOS. Coluna 1: marcador de peso molecular; coluna 2: heterozigótico; colunas 3, 4 e 5: homozigótico G; coluna 6:homozigótico A; colunas 7 e 8: heterozigótico; coluna 9: homozigótico A.

No que diz respeito a diferenças entre sexo nos indivíduos estudados, verifica-se que

não existem diferenças estatisticamente significativas. Realizando a análise no grupo de

indivíduos com forma esporádica da doença, obtemos um grupo de indivíduos do sexo

masculino com 46 indivíduos, enquanto no subgrupo de indivíduos do sexo feminino o

total é de 48 indivíduos. Os resultados do genótipo do polimorfismo estudado no exão 29

do gene da isoforma neuronal da NOS, não são estatisticamente diferentes entre estes

grupos (p=0,3347), da mesma forma não são significativas as diferenças entre alelos

(p=0,2543). No estudo do polimorfismo no exão 18 deste gene, verificou-se que os

genótipos dos indivíduos destes dois grupos não apresentam diferenças estatisticamente

significativas (p=0,7771), à semelhança do que acontece com a análise dos alelos

(p=0,5640).

Também no estudo do polimorfismo no exão 22 da isoforma indutível do mesmo

gene (Tabela XV) se verifica que os genótipos não são estatisticamente diferentes

(p=0,6816) entre estes grupos, sendo as diferenças entre alelos também idênticas

(p=0,4532).

O estudo do gene HFE foi realizado de modo idêntico, ou seja, o grupo de indivíduos

com doença de Parkinson foi dividido de forma a serem obtidos apenas os indivíduos com

forma esporádica da doença e, posteriormente, foram ainda seleccionados os indivíduos

que apresentaram idade de início da doença após os 55 anos de idade. A Tabela XVI

apresenta os resultados do estudo da mutação H63D nos diferentes grupos de indivíduos.

1 2 3 4 5 6 7 8 9


- 99 -

Verifica-se que não existem diferenças estatisticamente significativas nos genótipos

apresentados pelos grupos de indivíduos doentes e controlos. De igual forma, a distribuição

alélica é idêntica entre os subgrupos estudados e os indivíduos controlo.

Tabela XVI - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo H63D estudado no gene da HFE no grupo de doentes e no grupo de controlos.


CC CG GG p C G p

Total

Doentes (n=132) 88 (0,67) 39 (0,30) 5 (0,04) 0,4570 0,81 0,19 0,9680

Esporádicos

Doentes (n=94) 64 (0,68) 26 (0,28) 4 (0,04) 0,3382 0,82 0,18 0,8701

Esp. >55 I. I.

Doentes (n=54) 38 (0,70) 15 (0,28) 1 (0,02) 0,7054 0,84 0,16 0,5028

Controlos (n=123) 79 (0,64) 42 (0,34) 2 (0,02) 0,81 0,19


Figura 20 - Resultado da electroforese dos produtos de digestão da mutação H63D no gene HFE.

O estudo da mutação C282Y produziu os resultados apresentados na Tabela XVII,

sendo a Figura 21 o resultado da genotipagem desta mutação. Não se encontraram

quaisquer indivíduos com genótipo AA para esta mutação, o que é normal uma vez que


- 100 -

esta é uma mutação muito rara. No que diz respeito à distribuição dos genótipos, não se

verificaram diferenças significativas entre os diferentes subgrupos de indivíduos doentes e

o grupo controlo. Já no que concerne a distribuição alélica, verificaram-se diferenças

significativas em qualquer um dos dois subgrupos criados, quando comparados com o

grupo controlo, o que sugere uma sobrerepresentação de um dos alelos nestes subgrupos

quando comparado com o grupo de indivíduos controlo.

Tabela XVII - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo C282Y estudado no gene da HFE no grupo de doentes e no grupo de controlos.


GG GA AA p G A p

Total

Doentes (n=132) 120 (0,91) 12 (0,09) 0 0,1664 0,95 0,05 0,0848

Esporádicos

Doentes (n=94) 84 (0,89) 10 (0,11) 0 0,2020 0,95 0,05 0,0467

Esp. >55 I. I.

Doentes (n=54) 46 (0,85) 8 (0,15) 0 0,4190 0,93 0,07 0,0096

Controlos (n=123) 109 (0,96) 4 (0,04) 0 0,98 0,02


Figura 21 - Resultado da electroforese dos produtos de digestão da mutação C282Y no gene HFE.


- 101 -

O estudo do polimorfismo Ile105Val no exão 5 do gene da transferase-S do glutatião

produziu os resultados apresentados na Tabela XVIII. Verificou-se existirem diferenças

estatisticamente significativas na distribuição dos genótipos, quando foram comparados a

totalidade dos doentes e o subgrupo de doentes esporádicos com o grupo de indivíduos

controlo. Não se verificaram diferenças significativas entre o subgrupo de doentes

esporádicos com idade de início superior a 55 anos e o grupo controlo. De forma idêntica,

não se verificaram quaisquer diferenças significativas na distribuição alélica entre os

grupos estudados.

Tabela XVIII - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo Ile105Val estudado no gene da GSTP.


GG GA AA p G A p

Total

Doentes (n=132) 46 (0,34) 72 (0,53) 19 (0,14) 0,0366 0,60 0,40 0,7842

Esporádicos

Doentes (n=94) 30 (0,32) 48 (0,52) 15 (0,16) 0,0327 0,58 0,42 0,9073

Esp. >55 I. I.

Doentes (n=54) 18 (0,33) 28 (0,52) 8 (0,15) 0,0969 0,59 0,41 0,9142

Controlos (n=123) 27 (0,25) 75 (0,68) 8 (0,07) 0,59 0,41


O estudo do polimorfismo Ala114Val no exão 6 produziu os resultados apresentados

na Tabela XIX. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas em

qualquer um dos grupos estudados. No entanto, verificou-se um subrepresentação, ainda

que não significativa, do alelo T nos grupos de indivíduos doentes quando comparados


- 102 -

com o grupo controlo, diferença esta que quase atingiu valores significativos no subgrupo

de doentes eporádicos e com idade de início superior a 55 anos (p=0,0549).

Tabela XIX - Valores absolutos e percentagens obtidas para o genótipo do polimorfismo Ala114Val estudado no gene da GSTP.


CC CT TT p C T p

Total

Doentes (n=132) 124 (0,90) 14 (0,10) 0 0,4912 0,95 0,05 0,3986

Esporádicos

Doentes (n=94) 87 (0,93) 7 (0,07) 0 0,3604 0,96 0,04 0,1613

Esp. >55 I. I.

Doentes (n=54) 52 (0,96) 2 (0,04) 0 0,1739 0,98 0,02 0,0549

Controlos (n=123) 102 (0,87) 14 (0,12) 1 (0,01) 0,93 0,07



Os mecanismos de stresse oxidativo foram analisados com o objectivo de realizar

análises de associação entre a amostra de indivíduos com D.P. e a amostra de indivíduos

saudáveis. Com a realização deste objectivo pretende-se determinar se algum dos

marcadores de stresse oxidativo estudados poderá ser utilizado como biomarcador para a

D.P..


- 103 -

No que diz respeito à caracterização das amostras em estudo, verifica-se que ambos

os grupos em estudo possuem idades semelhantes, sendo a média de idades do grupo de

indivíduos com D.P. de 65,8±11,1 anos, enquanto a média de idades do grupo de

indivíduos controlo é de 63,3±15 anos de idade. Quanto à distribuição por sexo, o grupo de

indivíduos com D.P. é constituído por 43,7% de indivíduos do sexo masculino, enquanto o

grupo de indivíduos controlo contém 29,2% de indivíduos deste sexo.

Para uma melhor análise deste estudo, o grupo de indivíduos com D.P. foi

subdividido em dois grupos. O primeiro grupo de doentes apresenta idades de início da

doença inferior a 55 anos enquanto que o outro grupo apresenta idades de início acima

desta idade.

Níveis de antioxidantes não enzimáticos

A Figura 22 apresenta os resultados obtidos para a concentração de ácido úrico no

plasma do grupo de indivíduos com D.P. e indivíduos controlo.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

Ác.

úric

o m

M

Doentes

Controlos

Figura 22 - Valores de ácido úrico obtidos nos grupos de indivíduos com D.P. e indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.

Na comparação do grupo de indivíduos com idade de início da doença inferior a 55

anos de idade, não foi encontrada diferença estatisticamente significativa no que diz

respeito a este parâmetro. Os resultados obtidos para o grupo de indivíduos com idade de

*


- 104 -

início superior a 55 anos de idade são apresentados na Figura 19. A Tabela XX apresenta

os resultados de ácido úrico nos quatro grupos estudados.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60Á

c. ú

rico

mM

Doentes I.I.>55Controlos

Figura 23 - Valores de ácido úrico obtidos nos grupos de indivíduos com idade de início da doença superior a 55 anos de idade e indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.

Tabela XX - Valores de concentração de ácido úrico nos grupos de indivíduos estudados.

Médias (mM) ± Desv. Padrão

Doentes de Parkinson 0,31±0,16 *

Doentes de Parkinson Início < 55 anos 0,28±0,15

Doentes de Parkinson Início > 55 anos 0,33±0,17 *

Controlo 0,26±0,10

São apresentadas as médias ± desvio padrão. * representa valores de p<0,05 considerados estatisticamente significativos.

Foram analisados os valores da concentração plasmática de colesterol e,

adicionalmente, da razão Vit.E/colesterol. Não foram encontradas diferenças

estatisticamente significativas em nenhuma destas análises. A Tabela XXI apresenta os

valores médios e desvio padrão obtidos, assim como o valor de p.

*


- 105 -

Tabela XXI - Valores da concentração plasmática de colesterol e da razão da concentração de vitamina E e colesterol obtidos nos grupos estudados.

Colesterol Vitamina E/Colesterol

Média ± d.p. Média ± d.p.

Doentes de Parkinson 5,58±1,5 7,73±6,39

Doentes de Parkinson Início < 55 anos 5,59±1,44 9,23±9,22

Doentes de Parkinson Início > 55 anos 5,40±1,08 6,84±2,43

Controlo 5,25±1,00 7,26±2,26


A Figura 24 apresenta os valores obtidos para a concentração plasmática de vitamina

E no grupo de indivíduos com idade de início da doença inferior a 55 anos e do grupo

controlo. A Tabela XXII apresenta os valores médios obtidos na totalidade dos grupos

estudados.

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

Con

cent

raçã

o de

Vit.

E no

pla

sma

uM

Doentes I.I.<55Controlos

Figura 24 - Valores de vitamina E plasmática obtidos nos grupos de indivíduos com idade de início da doença inferior a 55 anos de idade e indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.

*


- 106 -

Tabela XXII - valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração plasmática de vitamina E nos grupos de indivíduos estudados.

Médias (uM) ± Desv. Padrão

Doentes de Parkinson 40,68±14,64

Doentes de Parkinson Início < 55 anos 45,85±15,82 *

Doentes de Parkinson Início > 55 anos 37,68±11,99

Controlo 38,04±12,69


No que diz respeito aos valores de concentração plasmática obtidos para a vitamina

A, estes foram encontrados estatisticamente diferentes entre o grupo de indivíduos com

idade de início da doença superior a 55 anos de idade e o grupo controlo. Estes resultados

são representados na Figura 25. A Tabela XXIII apresenta os valores médios e desvio

padrão deste parâmetro na totalidade dos grupos estudados.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Con

cent

raçã

o de

vita

min

a A

pla

smát

ica

ug/d

l Doentes I.I.>55Controlos

*

Figura 25 - Valores de vitamina A plasmática nos grupos de indivíduos com idade de início da doença superior a 55 anos e indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.


- 107 -

Tabela XXIII - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração plasmática de vitamina A nos grupos de indivíduos estudados.

Médias (ug/dl) ± Desv. Padrão




Controlo 1,92±0,44


Ainda sob o ponto de vista das defesas antioxidantes não enzimáticas, no que diz

respeito ao ciclo do glutatião, não foram encontradas diferenças estatisticamente

significativas entre nenhum dos grupos estudados e o grupo de indivíduos controlo, quando

foram avaliados estes parâmetros no plasma. Foram determinados os níveis de glutatião

reduzido e oxidado, assim como a razão entre estes. De forma semelhante, e ao contrário

do que acontece a nível plasmático, a concentração de vitamina E nos eritrócitos não se

demonstrou estatisticamente diferente entre os grupos estudados e o grupo de indivíduos

controlo.

No que diz respeito aos doseamentos a nível eritrocitário dos componentes não

enzimáticos do ciclo do glutatião, foram encontradas algumas diferenças significativas

entre os grupos estudados e o grupo controlo. Estes resultados encontram-se representados

na Figura 26. É notória uma diminuição, neste caso estatisticamente significativa, nos

valores de GSH eritrocitária nos indivíduos doentes quando comparados com os controlos,

à semelhança do que acontece com os indivíduos com forma esporádica da doença e idade

de início superior a 55 anos de idade. Verifica-se também, um aumento do glutatião

oxidado nos indivíduos esporádicos com idade de início superior a 55 anos quando

comparados com os controlos. A razão glutatião reduzido/oxidado encontra-se diminuída

neste grupo de doentes quando comparados com os controlos.


- 108 -

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

Con

cent

raçã

o de

GSH

gv

(nm

ol/g

Hb)

Doentes

Controlos

A

*

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

Con

cent

raçã

o de

GSH

gv

(nm

ol/g

Hb)

Doentes Início<55

Controlos

B

*

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

Con

cent

raçã

o de

GSS

G g

v

Doentes inicio >55

Controlos

C

*

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

Raz

ão G

SH/G

SSG

gv

Doentes inicio >55

Controlos

D

*

Figura 26 - Resultados obtidos significativos para o ciclo do glutatião. A – concentração de GSH eritrocitário no grupo de doentes de Parkinson e controlos. B - concentração de GSH eritrocitário no grupo de doentes com idade de início inferior a 55 anos e controlos. C – concentração de GSSG eritrocitário no grupo de doentes com idade de início superior a 55 anos de idade e controlos. D – valores da razão GSH/GSSG no grupo de indivíduos com idade de início superior a 55 anos e controlos. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.

Os valores médios e desvio padrão destes resultados nestes grupos de doentes

encontram-se nas Tabelas XXIV, XXV e XXVI.

Foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nos valores de GSH

eritrocitário quando se realizou a comparação do grupo total de doentes de Parkinson com

o grupo controlo, assim como do grupo de doentes com idade de início inferior a 55 anos

de idade quando comparados com o grupo controlo. Em ambas as situações, os valores

obtidos no grupo controlo são superiores aos grupos de doentes (Tabela XXIV).


- 109 -

Tabela XXIV - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração GSH eritrocitário nos grupos de indivíduos estudados.

Médias (mmol/g Hb) ± Desv. Padrão




Controlo 3,83±1,45


No que diz respeito à concentração de GSSG eritrocitário foi encontrado um aumento

estatisticamente significativo no grupo de indivíduos doentes com idade de início superior

a 55 anos de idade quando comparados com o grupo de indivíduos controlo (Tabela XXV).

Tabela XXV - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração GSSG eritrocitário nos grupos de indivíduos estudados.

Médias ± Desv. Padrão




Controlo 0,57±0,19


No que diz respeito à razão GSH/GSSG, verificou-se uma diminuição

estatisticamente significativa nos valores obtidos para o grupo de doentes com idade de

início inferior a 55 anos quando comparados com o grupo controlo (Tabela XXVI).


- 110 -

Tabela XXVI - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a razão GSH/GSSG eritrocitária nos grupos de indivíduos estudados.





Controlo 7,35±3,56


O estado antioxidante total dos indivíduos foi, também, determinado encontrando-se

os resultados obtidos representados na Figura 27 e na Tabela XXVII. Sendo evidente uma

diminuição estatisticamente significativa nos valores obtidos para o estado antioxidante

total nos indivíduos controlo, quando comparados com qualquer um dos subgrupos de

indivíduos doentes


- 111 -

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

Doent es

Cont rolos

A

*

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

TAS

(mM

)

Doentes I.I.<55

Controlos

B

*

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

TAS

(mM

)

Doentes I.I.>55Controlos

C

*

Figura 27 - Valores de TAS nos grupos estudados. A – doentes vs controlos; B – doentes com idade de início inferior a 55 anos vs controlos; C - doentes com idade de início superior a 55 anos vs controlos. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.

Tabela XXVII - valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para TAS nos grupos de indivíduos estudados.

Médias (mM) ± Desv. Padrão




Controlo 0,85±0,28



- 112 -

Níveis de antioxidantes enzimáticos

Foram avaliadas as actividades das enzimas antioxidantes reductase do glutatião e

peroxidase do glutatião.

Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos

estudados no que diz respeito à enzima peroxidase do glutatião. Os resultados obtidos para

a enzima reductase do glutatião encontram-se na Figura 28 e na Tabela XXVIII, sendo

evidente uma diminuição significativa nos indivíduos com idade de início superior a 55

anos comparativamente com os controlos.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

Act

ivid

ade

da e

nzim

a G

lRed

(U/g

Hb)

Doentes início >55Controlos

*

Figura 28 - Valores médios de actividade da enzima reductase do glutatião no grupo de indivíduos com idade de início superior a 55 anos e indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos.

Tabela XXVIII - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a actividade da enzima GlRed nos grupos de indivíduos estudados.

Médias (U/g Hb) ± Desv. Padrão




Controlo 6,40±1,70



- 113 -

Grau de lipoperoxidação

O grau de lipoperoxidação foi avaliado pela determinação dos níveis de concentração

plasmática e eritrocitária de malonildialdeído (MDA) nos grupos de doentes e controlos.

Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na comparação dos níveis

de MDA eritrocitário entre qualquer um dos grupos de doentes com o grupo controlo, tal

como é representado na Tabela XXIX.

Tabela XXIX - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração de MDA eritrocitário nos grupos de indivíduos estudados.

Médias (nmol/g Hb) ± Desv. Padrão




Controlo 22,55±20,80


Foram, no entanto, encontradas diferenças estatisticamente significativas nos valores

de MDA plasmático entre os grupos de doentes esporádicos com idade de início superior a

55 anos e o grupo controlo.

Tabela XXX - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração de MDA plasmático nos grupos de indivíduos estudados.

Médias (uM) ± Desv. Padrão




Controlo 1,67±0,67


A Figura 29 apresenta os resultados significativos para os níveis de MDA entre o

grupo de indivíduos com idade de início superior a 55 anos e indivíduos controlo. É

evidente uma diminuição, no caso, estatisticamente significativa, nos valores de MDA


- 114 -

plasmático nos indivíduos com doença esporádica e idade de início superior a 55 anos,

quando comparados com os indivíduos controlo.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Con

cent

raçã

o de

MD

A p

lasm

átic

o (u

M)

Doentes início >55Controlos

*

Figura 29 - Valores médios de concentração de MDA no grupo de indivíduos com idade de início superior a 55 anos e no grupo de indivíduos controlo. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos

Grau de oxidação proteica

O grau de oxidação proteica foi determinado através do doseamento dos grupos

carbonilo nos grupos indivíduos estudados. Não foram encontradas diferenças

significativas entre os grupos de indivíduos doentes e o grupo de indivíduos controlo. Estes

resultados encontram-se representados na Figura 30.


- 115 -

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

400,00

450,00

Con

cent

raçã

o do

s gr

upos

car

boni

lo

DoentesDoentes início <55Doentes início >55Controlos

Figura 30 - Valores médios de concentração de grupos carbonilo em todos os grupos de indivíduos estudados. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos

A Tabela XXXI apresenta os valores médios, desvio padrão e valores de significância

estatística da concentração de grupos carbonilo nos grupos de indivíduos estudados.

Tabela XXXI - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração de grupos carbonilo nos grupos de indivíduos estudados.





Controlo 280,93±128,25


Metabolitos do monóxido de azoto

Na avaliação da produção de metabolitos do monóxido de azoto foram determinados

os níveis de nitratos e nitritos no plasma. No que diz respeito aos níveis de nitratos não

foram encontradas diferenças significativas entre os grupos de indivíduos doentes e o


- 116 -

grupo de indivíduos controlo. Os resultados dos níveis de nitratos apresentam-se na Tabela

XXXII.

Tabela XXXII - Valores médios e desvio padrão dos resultados obtidos para a concentração de nitratos nos grupos de indivíduos estudados.





Controlo 1,99±1,53


A Figura 31 e a Tabela XXXIII apresentam os níveis médios de nitritos nos grupos

estudados. Foram encontrados valores com diferenças estatisticamente significativas entre

o grupo de indivíduos esporádicos com idade de início superior a 55 anos e o grupo

controlo.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

Con

cent

raçã

o de

nitr

itos

DoentesDoentes início <55Doentes início >55Controlos

*

Figura 31 - Valores médios de concentração de nitritos em todos os grupos de indivíduos estudados. Valores de * p<0,05 são considerados estatisticamente significativos


- 117 -

Tabela XXXIII - Valores médios de concentração de nitritos em todos os grupos de indivíduos estudados.





Controlo 0,94±0,69



- 118 -

Discussão

Considerações metodológicas

Está descrita uma enorme variedade de estudos de associação entre casos/controlos

no que diz respeito à doença de Parkinson, tanto na vertente da análise de casos familiares,

como na análise de casos esporádicos. Apesar das vantagens óbvias de um estudo que

compare parâmetros entre estes dois grupos nestas condições, existem certas questões

metodológicas que devem ser tidas em atenção, com o objectivo de obter resultados tão

verdadeiros e fiáveis quanto possível. Entre estas questões sobressaem a população em

estudo, o desenho do estudo, o diagnóstico dos casos e a recolha da informação relevante

para a determinação da história familiar.

No que diz respeito aos estudos em formas familiares da doença, muitas vezes, tal

como no trabalho aqui apresentado, os casos são seleccionados de forma consecutiva, à

medida que se vão apresentando na consulta de neurologia para serem observados pelo

médico especialista. Neste tipo de estudo, uma selecção consecutiva de casos pode levar a

um enviesamento da amostragem, uma vez que, os familiares de indivíduos com doença de

Parkinson, normalmente, procuram assistência médica para a doença com maior frequência

do que a média de indivíduos.

Neste trabalho os indivíduos controlo foram seleccionados por dois métodos, sendo o

primeiro de forma aleatória na população, enquanto indivíduos neurologicamente

saudáveis que procuravam assistência médica, e o segundo método enquanto familiares em

segundo grau de indivíduos afectados, tendo, em qualquer um dos casos, havido

observação por parte do médico especialista.

Ainda no que concerne aos indivíduos com doença de Parkinson, a nossa amostra é

representativa de toda a população da região centro de Portugal, uma vez que, o serviço de

Neurologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra é o principal centro de estudo e

tratamento destes indivíduos nesta região do país. A grande maioria dos doentes de

Parkinson nesta região vai, em determinada altura, ser referenciado para este serviço para

se proceder a um correcto diagnóstico ou tratamento da doença. Assim sendo, este estudo

fornece, muito provavelmente, uma correcta estimativa populacional dos doentes de

Parkinson da região centro de Portugal.


- 119 -

Diferenças na distribuição por sexo e idade são factores que podem, também,

complicar a análise de associação entre casos e controlos. A probabilidade de desenvolver

doença de Parkinson aumenta com a idade [277] e está descrita como sendo duas vezes

mais elevada em indivíduos do sexo masculino [278]. No presente trabalho as distribuições

por sexo e por idade em ambos os grupos estudados verificaram-se como sendo

semelhantes.

A validação da história familiar foi um aspecto considerado como muito importante

neste estudo, uma vez que, apenas com esta correcta informação se poderia inferir sobre os

eventuais efeitos de genes associados à doença. Foi verificado, após uma primeira análise

deste parâmetro, que existia um elevado número de falsos negativos através dos

testemunhos de familiares. Sempre que possível a equipa médica observou todos os

indivíduos susceptíveis de serem classificados como falsos positivos ou falsos negativos

após o relato dos familiares.

A variabilidade do diagnóstico, causada pelo facto de vários especialistas observarem

os indivíduos com doença, foi grandemente reduzida, uma vez que, todas as entrevistas e

observações foram feitas pelos mesmos médicos. Sempre que necessário foram realizadas

entrevistas telefónicas em detrimento de questionários presenciais, de forma a obter

informações mais detalhadas de familiares e também para obter uma taxa de participação

mais elevada.

A precisão do diagnóstico é também um desafio em estudos epidemiológicos da

doença de Parkinson. O Sistema de Saúde Português oferece uma vantagem neste campo,

uma vez que, o diagnóstico na maioria dos casos é feito por médicos neurologistas. Todos

os doentes incluídos neste estudo foram observados por especialistas, tendo sido incluídos

apenas os indivíduos diagnosticados como doença de Parkinson e não como outras formas

de Parkinsonismo.

A influência de factores ambientais no desenvolvimento da doença de Parkinson é,

hoje em dia, tida como muito provável. Vários trabalhos tentaram determinar quais os

factores ambientais que poderiam desempenhar um papel na etiologia da doença, mas até

agora não tem havido relatos suficientemente consistentes nesta área. Entre estes factores,

os pesticidas, traumatismos cranianos, café e o tabaco parecem ser os mais importantes,

reunindo maior consenso na comunidade científica. Não caiu no âmbito do presente

trabalho fazer um estudo dos factores ambientais eventualmente relacionados com a


- 120 -

doença de Parkinson, podendo, por isso, haver um certo enviesamento de alguns resultados

eventualmente influenciados por este tipo de factores.

O nosso estudo genético não encontrou mutações no gene da alfa-sinucleína, o

primeiro gene a ser relacionado com o desenvolvimento da doença de Parkinson. O facto

de apenas ter participado neste estudo um pequeno número de famílias com um reduzido

número de membros, não nos permite excluir o envolvimento deste gene nas formas

familiares da doença de Parkinson em Portugal. No entanto, mutações no gene da alfa-

sinucleína parecem ser uma causa rara da doença. Scott et. al. num trabalho publicado em

1999 encontrou uma única mutação no gene da alfa-sinucleína em apenas 1 de 186 famílias

afectadas com doença de Parkinson, originando uma frequência de 0,5% para esta mutação

[279]. Para encontrar um gene que desempenhe um papel importante na doença de

Parkinson seria muito vantajoso se fosse possível estudar famílias grandes com vários

indivíduos afectados, através de análises de linkage.

Uma das grandes dificuldades nos estudos de associação, mais concretamente, nos

estudos de associação genética, tem sido a utilização de diferentes análises estatísticas

[280]. Assim sendo, neste trabalho utilizámos o mínimo de testes possíveis, e apenas os

testes mais consensuais neste tipo de análises [280].

Mecanismos genéticos

Alfa-sinucleína

Não foram encontradas alterações genéticas neste gene, à semelhança de outros

trabalhos publicados até à data [281]. Este facto não significa que alterações no gene da

alfa-sinucleína não estejam envolvidas no desenvolvimento da doença de Parkinson, mas

antes, que desempenham um papel menor, uma vez que, a sua frequência é

reconhecidamente muito baixa [114, 279]. No trabalho aqui apresentado, o estudo deste

gene foi realizado de forma a procurar todas as alterações já conhecidas neste gene, assim

como procurar novas alterações ainda não descritas. Até à data estão descritas três

mutações pontuais [23, 91, 94], e a duplicação e triplicação de todo o gene [112, 116]. Os

eventuais efeitos da alteração do número de cópias são, de certa forma, relativamente

fáceis de prever, pelo menos em comparação com os eventuais efeitos das mutações


- 121 -

pontuais. A alfa-sinucleína é o principal componente dos corpos de Lewy, agregados

proteicos, principal característica patológica da doença de Parkinson [282]. Um aumento

da quantidade desta proteína, como é sugerido pelo aumento do número de cópias do gene,

é de supor que incapacite o sistema de degradação proteica envolvido na degradação desta

proteína, levando à sua rápida acumulação e eventualmente depósito nos corpos de Lewy

[115]. Os mecanismos através dos quais as mutações pontuais no gene levam à acumulação

da alfa-sinucleína não são ainda conhecidos na sua plenitude, embora estudos in vitro

tenham demonstrado que estas formas da proteína tenham maior propensão em agregar

[108, 283]. As vias de agregação são, no entanto, diferentes para as duas mutações

pontuais inicialmente descritas. A mutação A30P acelera a formação de agregados

amorfos, enquanto que a mutação A53T aumenta a formação de fibrilas [284]. A

interacção/resposta desta proteína à presença de pesticidas foi também estudada por vários

autores, tendo sido encontradas diferenças nesta resposta por parte das diferentes formas de

proteína – a forma mutada A30P é muito susceptível à presença de pesticidas, agregando

com grande rapidez [105].

O facto de não termos encontrado alterações no gene da alfa-sinucleína não significa,

de forma alguma, que esta não possa exercer um efeito na etiopatogenia da doença de

Parkinson na nossa amostra de indivíduos com a doença. As funções concretas desta

proteína não são, ainda, completamente conhecidas, embora estejam descritas várias

funções putativas. Está descrito que a alfa-sinucleína interage com a proteína tau de forma

a regular a interacção desta com os microtúbulos [285], está também descrita a interacção

com a proteína cinase c na regulação da viabilidade celular, com o ácido fosfatídico na

inibição da libertação de neurotransmissores e regulação da plasticidade sináptica, entre

outras funções [82]. Uma das primeiras moléculas a ser descrita como agente de interacção

com a alfa-sinucleína foi a sinfilina-1 [286]. Embora também neste caso não seja

conhecido o produto final desta interacção, crê-se que a sinfilina-1 sirva como ponte de

ligação entre a alfa-sinucleína e outras proteínas, uma vez que esta também é componente

dos corpos de Lewy, como demonstrado por estudos imunohistoquímicos, o que sugere

uma forte ligação entre ambas as proteínas [82, 83].

Assim sendo, e existindo uma miríade de processos nos quais a alfa-sinucleína estará

eventualmente envolvida, é de supor que alterações noutros genes que com ela interajam,

ou nas cascatas de processos nos quais ela estará envolvida, levem a alterações de


- 122 -

funcionamento do gene/proteína da alfa-sinucleína, culminando em modificações

patológicas.

Embora não tenha recaído no âmbito deste trabalho o estudo aprofundado deste gene

e proteína, seus mecanismos e eventuais efeitos adversos que contribuem para a origem da

doença de Parkinson, a alfa-sinucleína não deixa de ser uma peça fundamental em todo

este processo, na qual estarão, eventualmente, uma grande parte das respostas para as

questões biológicas colocadas hoje em dia, no âmbito desta doença.

Parkina

No que diz respeito ao estudo do gene da parkina, foram encontradas algumas

alterações, incluindo alterações não descritas até à data.

Desde 1998 que se sabe que este gene é responsável por um subtipo de doença de

Parkinson, a doença de Parkinson Autossómica Recessiva Juvenil (AR-JP) [119]. O gene

da parkina é um gene relativamente extenso com 12 exões contendo cerca de 500 mil pares

de bases [128]. Este gene codifica uma proteína, com o mesmo nome, com 465

aminoácidos, caracterizada por possuir um domínio ubiquitin-like no seu terminal amínico,

dois domínios RING finger e um domínio IBR (In Between RING-finger) [287].

No final da década de 90 foi sugerido que a parkina teria uma função semelhante à

dos membros da família ubiquitina, e que uma alteração neste gene poderia interferir na

cascata proteolítica mediada pela ubiquitina, culminando na morte dos neurónios da

substância nigra [119]. Foi, no entanto, só no ano de 2000 que foi demonstrado que a

parkina está envolvida no processo de degradação proteica funcionando como uma

proteína-ubiquitina ligase em colaboração com a proteína UbcH7 [288]. O domínio RING

finger presente na parkina é conhecido em várias outras proteínas que têm função como E3

ligases no processo de degradação pelo proteassoma. Este facto desde cedo sugeriu esta

função para a proteína, mas apenas foi confirmado mais tarde [137, 288]. Formas wild-type

desta proteína rapidamente ubiquitinam as suas proteínas substrato, marcando-as para

degradação pelo proteassoma e, de forma inversa, formas mutadas da proteína não exibem

a sua actividade E3, indicando uma correlação inversa entre a actividade enzimática e o

fenótipo da doença [289]. Desta forma, um defeito genético no gene da parkina levará a


- 123 -

que o substrato desta proteína não seja degradado, acumulando-se e, eventualmente

conduzindo a doença de Parkinson [290].

Nesta altura está descrita uma enorme variedade de mutações e polimorfismos no

gene da parkina, entre delecções e inserções exónicas ou pontuais, mutações sinónimas,

missense ou nonsense [121]. Até agora a grande maioria das mutações descritas

encontram-se localizadas nos domínios RING-IBR-RING, sugerindo que esta região é uma

região chave no funcionamento desta proteína. Em dois estudos independentes realizados

por Lucking et. al. e por Abbas et. al. verificou-se que mutações na parkina são causa de

doença de Parkinson em cerca de 30% de famílias com formas autossómicas recessivas de

parkinsonismo [122, 291]. Mais recentemente foi verificado que alterações no gene da

parkina podem ser responsáveis por cerca de 50% de formas familiares e 10-20% de

formas com história familiar negativa, revelando a sua importância no que diz respeito ao

estudo desta doença [292].

No que diz respeito à correlação entre a mutação ou o tipo de mutação e

características clínicas, até agora não foi encontrada qualquer tipo de relação. Não foi

encontrada nenhuma diferença clínica entre doentes com delecções exónicas, mutações

missense ou truncating, o que sugere que as mutações pontuais afectam aminoácidos

cruciais no funcionamento e, muito provavelmente, levam à completa perda de função da

proteína [291].

Outra função relevante da proteína parkina prende-se com o seu eventual papel na

agressão oxidativa que se sabe estar acentuada na doença de Parkinson [293]. A expressão

de formas mutadas de parkina afecta a função do proteassoma, e como está descrito que a

inibição do proteassoma aumenta o nível de stresse oxidativo, é de supor que a parkina

desempenha um papel a nível do aumento da agressão oxidativa quando são expressas

formas mutadas da proteína [294].

O primeiro resultado obtido neste trabalho relativamente à parkina foi a observação

de uma mutação previamente descrita no exão 2 do gene. Esta mutação, uma delecção de

um par de bases (255delA), origina uma mutação frameshift que insere um codão Stop

prematuro a cerca de 30 pares de base [122].

Esta mutação foi encontrada sob a forma de homozigotia num indivíduo com história

familiar positiva e início precoce da doença, o que está de acordo com o fenótipo descrito

para mutações no gene da parkina [295]. O indivíduo em estudo apresenta uma idade de


- 124 -

início da doença de 30 anos, tendo um dos progenitores sido diagnosticado com doença de

Parkinson e falecido posteriormente por causas não relacionadas. Nenhum outro familiar

apresenta doença de Parkinson ou qualquer outro tipo de parkinsonismo. A mutação

presente neste indivíduo é, de certa forma, explicativa do funcionamento da proteína neste

caso particular. Existindo um codão Stop no exão 2 de um gene que possui 12 exões,

significa que a maior parte da informação contida no gene não é traduzida para proteína. É

de assumir que neste indivíduo não existe proteína parkina, embora não tenham sido

efectuados ensaios de quantificação de mRNA. A idade de início da doença apresentada é

extraordinariamente precoce, o que está de acordo com uma função chave da parkina no

processo neurodegenerativo apresentado pelos doentes de Parkinson em geral, e por este

indivíduo em particular.

No que diz respeito à restante família, o progenitor afectado pela doença faleceu

antes do início deste estudo, pelo que não foi possível realizar análise genética neste

indivíduo, o que seria importante para verificar se este possuía a mutação em estado de

homo ou heterozigotia. No entanto, todos os outros membros mais próximos foram

analisados, mesmo que não tenham qualquer tipo de fenótipo associado à doença de

Parkinson. Dos indivíduos analisados fazem parte descendentes, cônjuge, progenitor e

familiar em segundo grau por parte do progenitor falecido. Os resultados obtidos são

esclarecedores quanto à importância desta proteína. Com a excepção do cônjuge, todos os

outros membros da família possuem a mutação em estado de heterozigotia, sem nunca

terem desenvolvido fenótipo de doença de Parkinson. Este facto poderia levar a considerar

que uma cópia apenas do gene seria suficiente para um normal funcionamento da proteína,

no entanto, verificou-se que quando um dos familiares foi submetido a terapêutica com

antidepressivos, este desenvolveu graves discinésias, o que leva a outra conclusão: uma só

cópia do gene da parkina não causa doença de Parkinson, mas funciona como factor de

risco para o desenvolvimento de parkinsonismo. Esta conclusão quanto ao gene da parkina

sugere que esta talvez esteja sujeita a um processo de haploinsuficiência, ou seja, a

presença de apenas uma cópia do gene não é suficiente para realizar a totalidade das

funções requeridas a essa proteína. Tal conceito foi já aplicado a outros genes envolvidos

na doença de Parkinson [110].

A história familiar desta família, após o estudo genético, sugere que nalgum ponto

tenha existido consanguinidade, uma vez que, ambos os progenitores do indivíduo em


- 125 -

estudo possuíam a mesma mutação genética, mutação esta que é rara na população [122].

Embora um dos progenitores não tenha sido estudado do ponto de vista genético, a

probabilidade é de que este possuísse a mutação em homozigotia, uma vez que, caso a

possuísse em heterozigotia, muito provavelmente não teria desenvolvido doença de

Parkinson, mas apenas um fenótipo sugestivo de parkinsonismo, e apenas se tivesse sido

sujeito a factores ambientais que o colocassem em risco para o desenvolvimento desse

mesmo fenótipo.

A não existência de parkina leva a uma alteração do sistema do proteassoma que

culmina, provavelmente, na acumulação das proteínas substrato da parkina. Embora não se

conheçam em detalhe todos os substratos da parkina [296], esta ideia está de acordo com a

acumulação proteica encontrada no tecido cerebral dos doentes de Parkinson.

No que diz respeito aos mecanismos de stresse oxidativo neste indivíduo, no qual

seria de esperar encontrar alterações dos marcadores de agressão oxidativa, tal não

acontece. O facto deste indivíduo não expressar parkina não faz aumentar os níveis dos

marcadores de agressão oxidativa estudados, nomeadamente a actividade de enzimas

antioxidantes, à semelhança do que foi já descrito [294]. Ao contrário de outros estudos

[294, 297], não foi possível encontrar alterações significativas nos níveis de GSH, ou dos

marcadores de oxidação proteica ou lipídica, ou nos níveis de nitratos e nitritos, quando

comparando este indivíduo com o restante grupo de doentes ou com o grupo de controlos.

Outro resultado deste trabalho foi a descrição de outra mutação, esta desconhecida

até à data, no exão 11 do gene da parkina. Neste caso foi encontrada a transição de um

Glutamato para um codão Stop na posição 395 da sequência aminoacídica. A consequência

directa desta mutação é o facto de o resto do exão 11 e todo o exão 12 do gene não serem

traduzidos e, portanto, não fazerem parte da proteína. A informação genética contida no

exão 11, ainda faz parte da informação necessária para codificar um RING finger, pelo que

este indivíduo não terá uma proteína completamente funcional. De acordo com o

cromatograma obtido para a sequenciação deste exão, a mutação existe em homozigotia.

No entanto, foi necessário confirmar este resultado, uma vez que podíamos estar perante

uma mutação pontual num alelo, existindo no outro alelo uma delecção exónica, o que

daria um cromatograma idêntico ao obtido, mas consequências moleculares e,

eventualmente, clínicas absolutamente distintas. Assim sendo, foi feita uma análise de


- 126 -

dosagem génica ao exão 11 do gene da parkina neste indivíduo. O resultado deste ensaio

indicou que não existe alteração do número de cópias deste exão, o que confirma a

presença da mutação em homozigotia.

Este indivíduo apresenta uma idade de início de 53 anos, o que está de acordo com as

características clínicas do efeito de mutações no gene da parkina, e apresenta também uma

história familiar positiva, com dois irmãos afectados com doença de Parkinson, não

havendo relatos de fenótipo sugestivo nos progenitores. Este indivíduo apresenta uma

forma tremórica da doença sem que tenha desenvolvido demência.

No que diz respeito aos efeitos desta alteração genética nos mecanismos de stresse

oxidativo, uma vez mais não se encontram alterações significativas nos marcadores

estudados quando comparando com o restante grupo de doentes. Há, no entanto, uma

ligeira elevação nos níveis de MDA plasmático, o que sugere um aumento nos níveis de

lipoperoxidação neste indivíduo, embora não seja fácil estabelecer uma relação de

causalidade directa entre a alteração genética e este facto.

Foi ainda encontrada uma mutação polimórfica no exão 11 de outro indivíduo com

história familiar positiva. Esta mutação, que se caracteriza pela transição de um Aspartato

para uma Asparagina na posição 394 da sequência aminoacídica, dificilmente poderá ser

considerada como a causa da doença neste indivíduo, uma vez que está descrita como

existindo em cerca de 7% de indivíduos saudáveis [122, 298], embora não tenha sido

encontrada em nenhum dos indivíduos controlo da nossa amostra. Não foi encontrada

qualquer outra alteração nos genes estudados neste indivíduo.

Como resultado do estudo de dosagem génica do gene da parkina, apenas um

rearranjo foi encontrado na nossa amostra. O rearranjo encontrado foi uma duplicação

heterozigótica do exão 8 do gene em apenas 1 indivíduo. Este indivíduo apresenta uma

forma esporádica da doença, com uma idade de início de 33 anos e 9 anos de evolução.

Apresenta uma forma tremórica da doença, sem presença de demência ou distonia. Embora

estejamos perante o caso de uma alteração heterozigótica, esta reveste-se de particular

importância, uma vez que, o exão 8 do gene se encontra na região codificante do domínio

RING-IBR-RING. Mais concretamente, o exão 8 possui informação de parte do primeiro

RING finger e de toda a região que separa este domínio do domínio IBR [299]. Assim

sendo, é de esperar que uma duplicação desta região, que se sabe ser fundamental no

funcionamento da proteína, tenha consequências ao nível da sua função, causando, muito


- 127 -

provavelmente, perda de função da mesma. A mutação aqui descrita não é uma nova

mutação, tendo já sido encontrada por dois outros grupos [148, 300], num total de 10

indivíduos afectados. Na primeira descrição desta mutação, foram estudadas 47 famílias

com doença de Parkinson tendo alterações no exão 8 sido encontradas em 19 destas

famílias, ou seja, em mais de 40% dos indivíduos, o que leva a crer que este seja um local

particularmente propenso à ocorrência de mutações, especialmente a alterações do número

de cópias [148]. Nos indivíduos afectados pela duplicação heterozigótica do exão 8 do

gene, não foi encontrada qualquer outra mutação no gene da parkina, em nenhum dos

estudos realizados, incluindo no trabalho aqui apresentado. Existe, no entanto, uma enorme

variabilidade no que diz respeito às características clínicas destes indivíduos, uma vez que,

por exemplo, a idade de início da doença varia entre os 33 e os 65 anos de idade, e os casos

variam entre esporádicos e formas familiares com três ou mais indivíduos afectados por

família. Esta variabilidade sugere, provavelmente, um de dois cenários: ou existem

alterações noutros genes que não foram estudados, alterações essas responsáveis por esta

variabilidade; ou estas alterações têm consequências muito diversas dependendo de

características ambientais a que os indivíduos sejam sujeitos. Não existem, até hoje,

estudos que possam estabelecer uma relação entre factores ambientais e algumas das

mutações genéticas mais frequentes no gene da parkina, o que poderia explicar, pelo

menos parcialmente, a complexa variabilidade fenotípica apresentada pelos indivíduos

afectados por mutações neste gene [66, 301].

Várias das mutações no gene da parkina que foram descritas até à data ocorrem em

heterozigotia, o que tem causado alguma controvérsia [146, 295, 302, 303]. No entanto não

é possível, com certeza, determinar se estes indivíduos são verdadeiramente

heterozigóticos, ou se são heterozigóticos compostos, apresentando, neste caso, uma

mutação não encontrada no outro alelo. Tal evento pode suceder no trabalho aqui

apresentado sem que seja detectado, basta para isso que a mutação se encontre no promotor

ou num intrão do gene. É, por isso, possível que estes indivíduos apresentem mutações que

não tenham sido encontradas, sendo nesse caso, heterozigóticos compostos, o que facilita a

compreensão deste gene como causa da doença nestes indivíduos [300].

No que diz respeito aos marcadores de stresse oxidativo neste indivíduo que

apresenta este rearranjo no gene da parkina, não foram encontradas diferenças


- 128 -

significativas nos marcadores estudados, quando comparado com o restante grupo de

indivíduos com doença de Parkinson.

PINK1

Este trabalho incidiu, também, no estudo do gene PINK1 (PTEN induced kinase-1).

O estudo deste gene pretendia, à semelhança do realizado para o gene da parkina, procurar

mutações pontuais e alterações do número de cópias do gene.

A função real da proteína codificada pelo gene PINK1 não é ainda conhecida [304],

mas através de informações obtidas pela localização celular e estrutura do gene, é possível

especular quanto à sua eventual função. Na primeira publicação sobre este gene, que

através de ensaios de genome wide linkage foi considerado como causa da doença de

Parkinson nos indivíduos estudados, foi também descrito que a localização celular da

proteína coincide com aquela da mitocôndria [173]. Esta foi uma descoberta relevante,

uma vez que, o papel da mitocôndria na doença de Parkinson há muito que vem sendo

debatido. Como confirmação desta co-localização celular, surgiu a descrição, pelo mesmo

grupo, que o terminal amínico da PINK1 contém um domínio de ligação mitocondrial.

Para além deste domínio, a proteína possui outro que se assemelha a um domínio de

proteína cinase [173]. Os substratos da PINK1 não são ainda conhecidos, no entanto, em

ensaios de cultura celular verificou-se que formas wild-type da PINK1 protegem as células

do stresse induzido pela disfunção mitocondrial, o que não acontece com formas mutadas

da proteína [173, 174].

São já várias as descrições de casos de doença de Parkinson causada por mutações

pontuais no gene PINK1, embora não estejam descritos, até à data, rearranjos no gene

[174, 177, 178].

Na nossa amostra encontrámos um indivíduo que possui duas mutações não descritas

neste gene. Ambas as mutações são missense, acontecendo uma na posição 193 da cadeia

aminoacídica, causando a transição de uma Glicina para uma Valina, e a outra na posição

220, originando a troca de uma Metionina por uma Isoleucina. Embora tenhamos

encontrado duas novas mutações missense no gene, faltava determinar se estaríamos

perante um indivíduo heterozigótico composto ou um indivíduo heterozigótico para ambas

as mutações, ou seja, se as mutações se encontram em trans, alelos diferentes, ou em cis,


- 129 -

mesmo alelo, o que teria consequências moleculares e, eventualmente, fenotípicas

absolutamente distintas. Após digestão do DNA com enzima de restrição e sequenciação

do fragmento não digerido, concluiu-se que as mutações se encontram em alelos diferentes,

tratando-se, por isso, de um indivíduo heterozigótico composto.

O indivíduo em causa apresenta a idade de início mais baixa de toda a nossa série de

doentes – 20 anos de idade com outros 20 de evolução da doença. A forma da doença é

esporádica, não apresentando demência ou distonia.

Ambas as mutações encontradas neste indivíduo se localizam no domínio de proteína

cinase, o que sugere, no mínimo uma alteração da função, mas muito provavelmente

ocorrerá uma perda da função da proteína codificada.

Não foram encontradas outras mutações pontuais na nossa amostra, no entanto, foram

detectados três indivíduos com rearranjos, mais concretamente com delecções

heterozigóticas de diferentes exões do gene – mutação esta não descrita até à data. Todos

estes três indivíduos apresentam características clínicas semelhantes, embora possuam

mutações distintas. A idade de início da doença é semelhante, entre 47 e 54 anos, nenhum

apresenta demência e todos apresentam história familiar positiva para doença de Parkinson.

O primeiro caso apresenta uma delecção heterozigótica do exão 1 do gene PINK1.

Este exão codifica o domínio de ligação mitocondrial da proteína, pelo que, na sua

ausência é natural admitir que a proteína não esteja presente na mitocôndria. Este indivíduo

apresenta história familiar positiva, tendo dois irmãos afectados, embora não tenha sido

possível a análise deste gene nestes indivíduos. A idade de início neste caso é de 47 anos e

a forma de apresentação da doença foi tremórica. Apresenta distonia muito dolorosa com

boa resposta a L-Dopa. Dos três indivíduos nesta família, este apresenta a forma mais

grave da doença.

O segundo caso apresenta uma delecção heterozigótica do exão 2 do gene. A

apresentação clínica da doença é em tudo semelhante ao caso anterior, sendo uma forma

familiar de início tremórico e com distonia, a idade de início é de 50 anos. Embora o exão

2 não faça parte do domínio de ligação mitocondrial, é de supor que a sua ausência tenha

algum efeito nesta ligação, uma vez que o fenótipo apresentado é semelhante ao do

indivíduo anterior.

O terceiro indivíduo afectado apresenta uma delecção heterozigótica de ambos os

exões 1 e 2. A história familiar neste indivíduo é, também, positiva tendo como idade de


- 130 -

início da doença 54 anos. As características clínicas deste indivíduo são semelhantes às dos

anteriores, o que sugere que a falta de apenas um dos primeiros exões tenha o mesmo

efeito que a falta de ambos, o que pode significar que tenham funções interdependentes.

Num trabalho paralelo realizado em simultâneo pelos autores, verificou-se que o

indivíduo com a forma de doença mais grave possui, também, uma mutação no gene lrrk2

[203], gene este descrito recentemente e no qual mutações são causa frequente da doença

de Parkinson [197-199]

GST

As glutatião transferase são um grupo de enzimas destoxificantes envolvidas no

metabolismo de pesticidas e outras toxinas. Têm actividade antioxidante e estão, também,

envolvidas no metabolismo da dopamina [305]. Tem sido descrito que a actividade da

glutatião transferase é normal no cérebro de indivíduos com doença de Parkinson [306].

Embora não exista até à data qualquer associação entre esta patologia e os polimorfismos

na glutatião transferase, a distribuição do genótipo deste gene difere significativamente

entre doentes e controlos que tenham sido expostos a pesticidas [307]. Assim sendo, a

glutatião transferase, que é expressa na barreira hemato-encefálica, pode influenciar a

resposta a neurotoxinas e pode explicar a susceptibilidade de determinados indivíduos aos

efeitos de certos pesticidas [305].

Estão descritas duas alterações nucleotídicas neste gene que resultam nas trocas

aminoacídicas Ile105Val e Ala114Val [308]. O local polimórfico no resíduo 105 tem sido

associado com a estabilidade da enzima e com a sua preferência do substrato [263], pelo

contrário, o polimorfismo no local 114 não está descrito como tendo alteração na função da

enzima.

Neste trabalho foi realizada a análise de associação entre cada um destes

polimorfismo e os diferentes grupos de indivíduos estudados sob o ponto de vista genético.

Assim sendo, foi realizada a análise destes polimorfismos na totalidade da amostra de

indivíduos com doença de Parkinson, posteriormente apenas no subgrupo de indivíduos

com forma esporádica da doença e, por fim, no subgrupo de indivíduos com início

esporádico e com idade de início superior a 55 anos de idade. Este último grupo tinha


- 131 -

como objectivo estudar a forma da doença idiopática, ou seja, a forma mais comum

apresentada pelos doentes.

Desta forma, ao realizar a análise dos genótipos do polimorfismo Ile105Val na

totalidade dos indivíduos doentes, verificou-se existirem diferenças significativas entre os

grupos. Os resultados obtidos indicam uma diferença estatisticamente significativa

(p=0,0366) com o aumento do genótipo AA no grupo de indivíduos doentes. Este genótipo

codifica a enzima com actividade e especificidade de substrato alteradas. A segunda

análise foi feita no subgrupo de indivíduos com forma esporádica da doença. Esta

subdivisão do grupo de indivíduos visa subtrair os casos que sejam devidos a outras causas

genéticas, como por exemplo, a alterações em genes previamente associados à doença de

Parkinson. Neste caso foi verificada, também, uma diferença estatisticamente significativa

entre os grupos (p=0,0327), sendo inclusivamente, uma diferença mais significativa do que

no caso anterior. No entanto ao analisar os resultados do subgrupo com forma esporádica e

com idade de início superior a 55 anos, verificou-se não existirem diferenças significativas

(p>0,05). Com a análise deste conjunto de resultados, verifica-se que, nesta amostra, a

presença do genótipo que codifica uma alteração na função da enzima é um factor de risco

para o desenvolvimento da doença de Parkinson, sendo-o inclusivamente num subgrupo de

indivíduos com forma esporádica da doença. No entanto, para esta análise ser

absolutamente correcta, seria necessário realizar o estudo tendo em conta a variável

pesticidas, uma vez que, os estudos realizados nesta patologia com os polimorfismos desta

enzima apresentam resultados significativos apenas quando feita a análise de factores

ambientais [305]. Provavelmente é devido a este parâmetro que não são encontradas

diferenças significativas no último subgrupo estudado. De qualquer forma, estes resultados

permitem inferir que a presença da forma 105Val é, de facto, um factor de risco para o

desenvolvimento da doença de Parkinson em indivíduos sem qualquer história familiar

para esta patologia, e, neste contexto, deveria ser utilizado como marcador de diagnóstico e

de determinação de factor de risco para esta doença.

Ainda no gene da transferase do glutatião foi estudada a transição Ala114Val,

alteração esta que não é conhecida como causa de alteração da função da enzima, embora

seja uma mutação missense. Neste caso não foram encontradas diferenças estatisticamente

significativas entre os genótipos apresentados pelos indivíduos pertencentes aos grupos

estudados, sendo que a maior diferença existiu ao comparar o subgrupo de indivíduos com


- 132 -

forma esporádica da doença e idade de início superior a 55 anos. Da mesma forma, a

análise de alelos não revelou qualquer diferença significativa, tendo-se, no entanto, este

último subgrupo aproximado da significância estatística (p=0,05), tendo como origem uma

maior prevalência do alelo mutado nos indivíduos pertencentes ao grupo controlo. Existe,

neste caso, uma maior percentagem de indivíduos com o genótipo homozigótipo wild-type

apresentando a doença, quando comparados com os indivíduos controlo, não sendo no

entanto, uma diferença significativa. Assim sendo, a mutação Ala114Val não se apresenta

como um bom marcador de factor de risco para o desenvolvimento para a doença de

Parkinson, nem parece estar de alguma forma envolvida na patogénese desta.

NOS

A molécula de monóxido de azoto é um mensageiro biológico com uma grande

variedade de funções fisiológicas. No entanto, o NO é, também, um radical livre que se

pode combinar com aniões superóxido para formar peroxinitrito, composto citotóxico.

Estão descritas três isoformas da sintetase do monóxido de azoto (NOS): isoforma

neuronal (nNOS), isoforma endotelial (eNOS) e isoforma indutível (iNOS) [309]. Das três

isoformas, a nNOS e a iNOS são particularmente relevantes no que diz respeito a

potenciais implicações na neurodegeneração e na resposta glial que ocorre na doença de

Parkinson [310, 311]. Estão descritas várias possibilidades de envolvimento do NO e da

NOS na etiologia da doença de Parkinson, tanto em humanos como em modelos animais

da doença. Em particular, a inibição da nNOS e da iNOS, usando fármacos ou ratinhos

knock-out, previne a destruição de neurónios dopaminérgicos em modelos MPTP da

doença de Parkinson [312-314].

Assim sendo, nós pretendemos determinar se polimorfismos nos genes da nNOS e da

iNOS estão associados ao desenvolvimento de doença de Parkinson na nossa amostra de

indivíduos com a doença. Para tal, foram estudados dois polimorfismos no gene da nNOS,

um localizado no exão 18 e o outro no exão 29, e um polimorfismo no gene da iNOS,

localizado no exão 22 [261].

Quanto ao primeiro polimorfismo, localizado no exão 18 do gene da nNOS, não

foram encontradas quaisquer diferenças significativas entre os grupos de doentes e o grupo

de indivíduos controlo. À semelhança do que foi realizado no gene da GST, o grupo de


- 133 -

indivíduos com doença de Parkinson foi subdividido em mais dois grupos, um com a

totalidade de indivíduos com forma esporádica da doença, incluindo idades de início

inferior a 55 anos, e outro de indivíduos com forma esporádica mas com idades de início

da doença superior a 55 anos de idade. Em nenhum destes grupos foi encontrada diferença

significativa quando comparados com o grupo de indivíduos controlo, nem no que diz

respeito à distribuição de genótipos, nem no que diz respeito à distribuição alélica. Assim

sendo, podemos inferir destes resultados que o polimorfismo no exão 18 do gene da iNOS

não desempenha um papel no desenvolvimento da doença de Parkinson na nossa amostra

de indivíduos.

Ao observar os resultados obtidos para o exão 29 do mesmo gene, verifica-se que não

existe uma associação na distribuição dos genótipos quando se compara a totalidade do

grupo de indivíduos com a doença com o grupo de indivíduos controlo. Da mesma forma,

a distribuição alélica não apresenta diferenças entre estes dois grupos. Quando são

comparados os grupo de indivíduos com forma esporádica da doença e o grupo de

indivíduos controlo, verifica-se que existe uma diferença estatisticamente significativa na

distribuição de genótipos (p=0,03). No entanto, a distribuição alélica não difere

significativamente entre estes dois grupos. Quando a comparação de distribuição de

genótipos é feita entre o grupo de indivíduos com forma esporádica da doença e idade de

início superior a 55 anos e o grupo de indivíduos controlo, o valor de significância é, ainda,

mais pequeno indicando uma associação mais forte (p=0,0016). No entanto, ao comparar a

distribuição alélica, não são encontradas diferenças significantes.

No que diz respeito ao estudo do polimorfismo no exão 22 do gene da isoforma

iNOS, não foram encontradas diferenças significativas entre nenhum dos grupos estudados.

Uma vez que este polimorfismo é um polimorfismo silencioso, ou seja, não altera a

sequência aminoacídica, podemos concluir que esta alteração neste gene não está

relacionada com o desenvolvimento da doença de Parkinson na nossa amostra de

indivíduos.

No estudo do gene da NOS, a única associação encontrada foi ao analisar os

resultados do polimorfismo no exão 29 do gene da nNOS em indivíduos com, apenas

forma esporádica, ou mesmo com forma esporádica e com idade de início superior a 55

anos. Uma vez que a funcionalidade deste polimorfismo não é conhecida, permanece por

determinar se esta alteração é um evento inicial na susceptibilidade para a doença de


- 134 -

Parkinson em indivíduos sem história familiar para esta patologia. Outra possibilidade é de

que este polimorfismo esteja em linkage disequilibrium com um outro polimorfismo

funcional ou com outro gene na sua proximidade. Este polimorfismo está localizado num

exão na região não traduzida 5’ (5’UTR) [315]. Esta região é frequentemente associada

com a regulação de transcriptos e com a estabilidade do mRNA. Assim sendo, este

polimorfismo pode mediar este efeito, tendo consequências na quantidade final de proteína

produzida [316].

De qualquer forma, os resultados aqui apresentados sugerem que o polimorfismo

estudado no exão 29 do gene da nNOS é um factor de risco para o desenvolvimento da

doença de Parkinson, devendo ser realizados estudos para determinar a sua funcionalidade.

HFE

Níveis elevados de ferro têm sido encontrados nas células da substância nigra de

cérebros de indivíduos com doença de Parkinson, tanto em análises por ressonância

magnética como em análise post-mortem [317, 318]. A acumulação e deposição de ferro

no cérebro, pode causar uma superprodução de radicais livres e culminar em formas de

parkinsonismo [319]. A hemocromatose é uma desordem hereditária de acumulação de

ferro, onde a maioria dos casos se deve a duas mutações no gene HFE [244, 320]. A

mutação C282Y é muito penetrante e leva a uma rápida sequestração de ferro [245], tendo

a outra mutação uma penetrância inferior e actuando como factor de risco para o

desenvolvimento da hemocromatose. Assim sendo, o papel do gene HFE no metabolismo

do ferro, tornam-no um potencial gene candidato para o desenvolvimento da doença de

Parkinson. Resultados recentes do papel das mutações no gene HFE na D.P. variam de um

efeito protector da heterozigotia C282Y até à ausência de qualquer efeito de qualquer uma

das mutações [248, 249].

No trabalho aqui apresentado relativo à mutação C282Y, verificou-se não existir

qualquer associação entre a distribuição dos genótipos e o desenvolvimento da doença de

Parkinson, quando comparando qualquer um dos grupos de indivíduos doentes com o

grupo de indivíduos controlo. No entanto, ao realizar a análise da distribuição alélica os

resultados são distintos. Embora não tenha sido obtida uma associação significativa com a

totalidade do grupo de doentes, ao analisar os subgrupos de indivíduos com forma


- 135 -

esporádica e com idade de início superior a 55 anos verificou-se existir associação

estatisticamente significativa (p=0,0467 e p=0,0096 respectivamente). Destes resultados

pode-se concluir que o genótipo da mutação C282Y não actua como um factor de risco

nesta amostra de indivíduos, no entanto, a presença de um determinado alelo pode exercer

alguma influência na susceptibilidade destes indivíduos à doença de Parkinson, mais

concretamente de indivíduos sem história familiar para a doença e com idade de início

superior a 55 anos de idade.

No que diz respeito à mutação H63D, não foram encontradas associações

significativas em nenhum dos grupos estudados, nem no que concerne à distribuição dos

genótipos, nem no que concerne à distribuição alélica, sugerindo, por isso, que esta

mutação não desempenha um papel no desenvolvimento da doença de Parkinson.

Stresse Oxidativo

A existência de um estado persistente de stresse oxidativo em doentes de Parkinson

tem sido demonstrada desde há longos anos [217, 293]. Neste trabalho foi proposto realizar

um estudo de associação entre indivíduos com doença de Parkinson e indivíduos controlo

no que diz respeito a uma série de marcadores biológicos de stresse oxidativo.

O grupo de indivíduos com doença foi subdividido, à semelhança da subdivisão

realizada no estudo genético, com a obtenção de três grupos de indivíduos: com o total de

doentes, doentes com idade de início precoce (<55 anos de idade) e início tardio (>55 anos

de idade).

No que diz respeito às defesas antioxidantes não enzimáticas, foram encontradas

algumas alterações entre indivíduos doentes e indivíduos controlo. O ácido úrico, defesa

antioxidante, foi encontrado mais elevado em indivíduos doentes do que em indivíduos

controlo, tanto no grupo com a totalidade de indivíduos como no subgrupo de indivíduos

com início tardio da doença. Esta elevação de um antioxidante em indivíduos doentes pode

significar uma resposta adaptativa à agressão oxidativa. Por outro lado, diferenças

metabólicas e de sexo, assim como algumas condições patológicas (doença renal, doenças

metabólicas) [321, 322], dieta [321, 323] e exercício intenso [324] podem estar associadas

a um aumento da concentração plasmática de ácido úrico, introduzindo factores de

variabilidade nos resultados. Foi encontrado um aumento no TAS (estado antioxidante


- 136 -

total), cujo principal componente é o ácido úrico, em ratinhos aos quais tinha sido

administrada uma dieta rica em etanol. Este aumento no TAS foi explicado pelo aumento

no ácido úrico devido à degradação das purinas induzida pelo etanol [325]. Assim sendo, o

efeito tóxico do consumo crónico de etanol resultou num aumento paradoxal da capacidade

antioxidante total do plasma. Resultados idênticos foram obtidos por Mackinnon e

colaboradores em indivíduos com disfunção renal, nos quais se verificou um aumento da

concentração de ácido úrico e concomitantemente da capacidade antioxidante total [326].

Outro parâmetro estudado enquanto defesa antioxidante não enzimática foi o TAS.

Também aqui foram encontradas diferenças significativas, estando, neste caso, presentes

em todos os subgrupos. Existe um aumento do estado antioxidante total nos indivíduos

com a doença de Parkinson o que, de certa forma, é contrário ao conceito da existência de

um aumento da agressão oxidativa nestes indivíduos. Este resultado, aparentemente

paradoxal, pode ser explicado segundo diferentes perspectivas. A primeira prende-se com

o método de armazenamento da amostra antes da realização da análise. Está descrito que

após um armazenamento de apenas 4 horas se verifica uma modesta diminuição do TAS,

seguido de uma rápida e severa diminuição após três dias de armazenamento a -80ºC [327].

Assim sendo, o teste de TAS deve ser executado imediatamente após a colheita, para que

as consequências da curta semi-vida dos compostos antioxidantes não se façam sentir.

Outra explicação para este facto, quiçá a mais provável, prende-se com o facto de a

determinação do TAS no plasma ser baseada numa combinação do efeito de vários

antioxidantes, incluindo os grupos tiol de proteínas e do ácido úrico. Assim sendo,

resultados contraditórios podem ocorrer, por exemplo, sendo a concentração de ácido úrico

no plasma muito elevada, ela contribui substancialmente na determinação do TAS. Como o

ácido úrico se encontra elevado em várias condições clínicas em que existe a implicação do

stresse oxidativo (p.e. falha renal, doenças metabólicas), pode ocorrer um aumento nos

níveis de TAS, embora fosse esperado um resultado absolutamente contrário [326-328].

Como nestes indivíduos os valores da concentração de ácido úrico se encontram elevados,

é possível que ocorra este artefacto, aumentando os níveis de TAS, sem que o estado

antioxidante total seja de facto superior.


- 137 -

O estudo dos níveis de glutatião reduzido, um dos antioxidantes mais eficazes,

revelou diferenças estatisticamente significativas no que diz respeito à sua componente

eritrocitária. Foi encontrada uma diferença na concentração de GSH a nível dos eritrócitos

quando foi comparado a totalidade do grupo de indivíduos com doença com o grupo de

indivíduos controlo, tendo sido obtido um resultado idêntico ao realizar a comparação do

grupo de indivíduos controlo com os indivíduos com início precoce da doença. Foi

evidente uma diminuição da concentração de GSH eritrocitária nos grupos de indivíduos

com doença mencionados, o que está de acordo com o conceito da existência de uma

depleção de GSH na doença de Parkinson, o que confirma o estado persistente de stresse

oxidativo [329]. Ainda no que diz respeito ao ciclo do glutatião, foi encontrado um

aumento, a nível dos controlos, da razão GSH/GSSG quando comparados com o grupo de

indivíduos com início precoce da doença. Esta diferença é secundária, como é evidente, à

diminuição de GSH nos indivíduos com a doença. No que diz respeito à totalidade de

indivíduos com a doença, esta razão não é estatisticamente diferente, mas o seu valor

aproxima-se da significância (p=0,057). No grupo de indivíduos com início tardio da

doença verificou-se um aumento da concentração de glutatião oxidado, o que está de

acordo com um estado de stresse oxidativo que leva à oxidação do glutatião reduzido

originando este glutatião oxidado. Também neste caso há uma diminuição do valor da

razão GSH/GSSG neste grupo de indivíduos com início tardio da doença, que, embora não

atinja valores estatisticamente significativos, se aproxima (p=0,055).

No que diz respeito à vertente enzimática do ciclo do glutatião, foram estudadas duas

enzimas: a reductase do glutatião e a peroxidase do glutatião. Apenas foram encontradas

diferenças significativas no que diz respeito à Glred no grupo de indivíduos com início

tardio da doença quando comparados com o grupo de indivíduos controlo. Foi encontrada

uma diminuição da actividade desta enzima nos indivíduos com doença, sugerindo uma

falha no sistema de regeneração do glutatião, o que pode facilitar um aumento do estado

oxidativo. Nos tecidos biológicos o anião superóxido pode ser convertido em peróxido de

hidrogénio quer por meios enzimáticos, quer por meios não enzimáticos [330, 331]. O

peróxido de hidrogénio, por si só, não é um radical e, portanto, não apresenta qualquer

efeito nocivo, no entanto, na presença de metais de transição pode ser convertido na

espécie altamente reactiva – radical hidroxilo ( OH). Por outro lado, este peróxido de


- 138 -

hidrogénio pode ser convertido em água pelas enzimas catalase ou peroxidase do glutatião

[332, 333]. Nesta reacção catalisada pela peroxidase do glutatião, o glutatião reduzido é

oxidado originando GSSG. Este glutatião oxidado pode ser novamente reduzido, de forma

poder utilizado novamente nesta reacção, pela acção da enzima reductase do glutatião num

processo que utiliza NADPH [334, 335]. Existindo uma diminuição da actividade da

enzima reductase do glutatião, uma menor quantidade de glutatião oxidado é reconvertida

em glutatião reduzido e, portanto, seria de esperar uma diminuição dos níveis de GSH

nestes indivíduos. Tal não acontece, sendo uma possível causa o facto de, nestes doentes,

existir um estado persistente de stresse oxidativo, funcionando como resposta biológica o

aumento da produção de GSH. Desta forma, uma diminuição da actividade da enzima não

terá efeitos tão nefastos a nível celular.

No que diz respeito aos níveis de outro antioxidante não enzimático, a vitamina E, foi

encontrado um aumento significativo da concentração plasmática desta no grupo de

indivíduos com início precoce da doença quando comparados com o grupo controlo. No

entanto, os resultados obtidos neste parâmetro devem ser analisados, tendo em

consideração que os indivíduos não foram controlados quanto à ingestão de fontes de

vitamina E. Assim sendo, é possível que tenha existido um aumento de vitamina E devido

a factores externos, levando a este aumento da concentração desta vitamina. Os resultados

obtidos no que diz respeito a este parâmetro têm sido divergentes, apontando alguns para

um papel da vitamina E enquanto antioxidante importante na doença de Parkinson [336],

enquanto outros não lhe oferecem qualquer papel na patogénese desta doença [337].

Não foram encontradas diferenças deste parâmetro em qualquer outro dos grupos.

No entanto foi observada uma diminuição significativa de vitamina A plasmática no

grupo de indivíduos com início tardio da doença. Uma vez que esta vitamina tem função

como antioxidante, servindo de quencher a singletos de oxigénio, uma diminuição da sua

concentração indica uma menor capacidade de resposta à agressão oxidativa, o que é

contrário a estudos publicados nesta matéria [338].

No que diz respeito aos marcadores de lipoperoxidação, foi encontrada uma

diminuição dos níveis de MDA plasmático no grupo de indivíduos com início tardio da

doença. Este facto está contra o conhecimento actual de um aumento do grau de

lipoperoxidação existente em indivíduos com doença de Parkinson, tendo inclusivamente


- 139 -

os níveis de MDA sido encontrados cerca de dez vezes mais elevados na substância nigra

de indivíduos com doença de Parkinson quando comparados com controlos [339-341].

Embora existam também estudos que revelam não existir qualquer tipo de associação entre

os níveis deste marcador de lipoperoxidação e a doença de Parkinson [342]. No entanto

factores que influenciam o resultado da análise de MDA foram já descritos, em 1996 Wei

et. al. descreveram que os níveis de MDA aumentam de forma dependente da idade [343].

Por outro lado a presença de níveis de ferro elevados nos tecidos analisados pode levar a

um aumento artificial do nível de MDA [228, 340, 344]. Assim sendo, uma diminuição dos

níveis de MDA podem não significar a ausência de lipoperoxidação nos indivíduos com

doença de Parkinson.

Não foram encontradas diferenças nos níveis eritrocitários deste parâmetro, da

mesma forma que não foram encontradas diferenças em nenhum dos outros grupos

estudados neste parâmetro.

Quanto aos metabolitos do monóxido de azoto, foi encontrado um aumento

significativo dos nitritos no grupo de indivíduos com início tardio da doença. As espécies

reactivas de azoto, incluindo o monóxido de azoto, parecem desempenhar papéis de

importância crucial no cérebro. Entre estes papéis destacam-se processos fisiológicos como

a neuromodulação, neurotransmissão e plasticidade sináptica e processos patológicos como

a neurodegeneração e a neuroinflamação [345]. O monóxido de azoto pode desempenhar

diversos papéis nos processos patológicos que conduzem à neurodegeneração, no entanto,

o mecanismo através do qual o NO destrói células, particularmente neurónios, não é ainda

completamente conhecido [346]. O monóxido de azoto em si mesmo é uma molécula

relativamente não tóxica que, na ausência de anião superóxido, não causa morte celular

mesmo em concentrações extremamente altas. No entanto, na presença do anião

superóxido, o monóxido de azoto é uma potente neurotoxina. A reacção do NO com o

anião superóxido é extraordinariamente rápida, resultando na formação do potente

oxidante ONOO- (peroxinitrito) [347]. De forma análoga, o NO pode reagir com O2 para

produzir NO2, que posteriormente reage com NO para produzir N2O3 [348]. Enquanto o

peroxinitrito é comummente considerado como a espécie de nitrogénio mais reactiva, o

NO2 e o N2O3 podem também contribuir para alguma toxicidade [349, 350]. O peroxinitrito

pode exercer a sua toxicidade através de reacções químicas que levam à geração de outras


- 140 -

espécies nocivas. Ao pH fisiológico, o ONOO- existe em equilíbrio com o seu ácido

conjugado, ONOOH. Dependendo do ambiente celular, o ONOOH pode ser decomposto

em espécies citotóxicas, como por exemplo o radical hidroxilo e o dióxido de nitrogénio,

ou em espécies relativamente inertes como os nitritos e os nitratos [349, 351].

Adicionalmente, o ONOO- pode reagir com o CO2, formando ONOOCO2, uma espécie

ainda mais reactiva do que o próprio peroxinitrito [352]. Uma vez que em sistemas

aquosos o NO reage com o oxigénio para formar nitritos e posteriormente nitratos, a

determinação dos nitritos é um bom método para determinar a produção de NO [350, 351].

Na nossa amostra verificámos um aumento estatisticamente significativo da concentração

de nitritos no subgrupo de doentes com início tardio da doença, tendo, os outros grupos

demonstrado resultados superiores aos controlos, embora não tenham atingido valores de

significância estatística. Assim sendo, estes resultados demonstram um aumento da

produção de monóxido de azoto na nossa amostra de indivíduos com doença de Parkinson,

tal como havia sido já previamente descrito [353, 354].


- 141 -

Conclusões Gerais

• Na nossa amostra não se verificaram alterações no gene da alfa-sinucleína, o que

confirma que as formas de doença causadas por mutações neste gene são muito raras

na população portuguesa;

• Verificamos a existência de quatro mutações no gene da parkina, em indivíduos com

e sem história familiar positiva, o que confirma um papel deste gene no

desenvolvimento da doença, mesmo em formas esporádicas;

• Encontrámos quatro mutações no gene PINK1, confirmando o seu papel no processo

de desenvolvimento da doença de Parkinson, tendo mesmo encontrado alterações do

número de cópias de determinados exões do gene, algo que não está descrito até à

data;

• Na nossa amostra de doentes de Parkinson, tendo resultados apenas dos genes

estudados, que não são todos os conhecidos, verificamos que causas genéticas são

responsáveis por cerca de 6% dos casos;

• Não é possível confirmar o aumento de stresse oxidativo, pelos marcadores

estudados, nos indivíduos com mutações nos genes da parkina e PINK1, o que está

em desacordo com resultados in vitro;

• O polimorfismo estudado no exão 29 do gene da NOS verificou-se estatisticamente

diferente entre os doentes e os controlos, tornando-o um bom marcador de risco para

a doença de Parkinson;

• O polimorfismo estudado no exão 5 do gene da GST mostrou-se estatisticamente

diferente entre o grupo de doentes e o grupo de controlos, indicando actividades

distintas da enzima nestes grupos e tornando-o um bom marcador genético de risco

para o desenvolvimento da doença de Parkinson;

• A distribuição alélica do gene HFE demonstrou diferenças significativas entre

grupos, o que torna a presença de um dos alelos um factor de risco para o

desenvolvimento da doença;

• Na sua totalidade as evidências obtidas pelos marcadores estudados de stresse

oxidativo não confirmam um estado de stresse oxidativo persistente nos doentes de

Parkinson, uma vez que, apenas o glutatião reduzido nos glóbulos vermelhos se

demonstrou reduzido nos doentes quando comparado com controlos.


- 142 -

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